JPH02124091A - ヒト免疫不全ウイルスワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明はヒト免疫不全ウィルスのコア蛋白質遺伝子を
含有するＭｉ換えワクチニアウィルスおよびその製造方
法並びにそれを含有するワクチンに関する。

口従来の技術〕 ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）は、後天性免疫不全症
候群（ＡＩＤＳ）の原因となるウィルスである。感染か
ら発症まで通常数年の潜伏期が存在し、さらにその発症
は、一部の人に限定されるが、近年、ＡＩＤＳの、愚者
数は年々増加しており、ワクチンの開発が望まれる。

ワクチニアウィルスは、従来、種痘ワクチン用ウィルス
として使用されてきたが、今日ではワクチニアウィルス
に種々の病原体、特に病原ウィルスの抗原遺伝子を組み
込んで組換えワクチニアウィルスを作製し、この組換え
ワクチニアウィルスを生ワクチンとして使用する試みが
種々行われている。しかしながら、このような手法によ
る有効なヒト免疫不全ウィルスワクチンの開発はまだ行
われていない。

〔発明が解決しようとする課題］ 従って本発明は、後天性免疫不全症候群の予防または治
療のためのワクチンの成分として有用な、ヒト免疫不全
ウィルスの抗原遺伝子を含有する組換ワクチニアウィル
スを提供しようとするものである。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者等には上記の課題を解決するため種々研究を重
ねた結果、ヒト免疫不全ウィルスの抗原蛋白質をコード
する遺伝子の内、該ウィルスのコア蛋白質であるｌ蛋白
質の遺伝子をワクチニアウィルス遺伝子のチミジンキナ
ーゼ遺伝子領域に組み込んだ組換ウィルスを作製し、こ
のウィルスを動物に投与した場合１ｎ−ｖｉν０でヒト
免疫不全ウィルスのｌ蛋白質に対する抗体価が上昇する
ことを確認して本発明を完成した。

従って本発明は、ワクチニアウィルス遺伝子にヒト免疫
不全ウィルスのコア蛋白質遺伝子が組み込まれており、
ヒト免疫不全ウィルスのコア蛋白質を発現することがで
きる組換えウィルスを提供する。

本発明はさらに、ワクチニアウィルス遺伝子にヒト免疫
不全ウィルスの上遺伝子及びそれにリンクす剣」廷遺伝
子の少なくともプロテアーゼコード部分が組み込まれて
いる組換ウィルスであって、該ウィルスが感染した細胞
においてヒト免疫不全ウィルスの」１蛋白質を産生ずる
ことができる組換えウィルスを提供する。

本発明はさらに、前記第一の組換えウィルスの製造方法
であって、 （１）ワクチニアウィルス遺伝子由来のチミジンキナー
ゼ遺伝子を含有するＤＮＡ断片をクローニングベクター
に挿入してチミジンキナーゼ遺伝子含有ベクターを用意
し； （２）前記チミジンキナーゼ遺伝子含有ベクター中のチ
ミジンキナーゼ遺伝子中に、ヒト免疫不全ウィルスのコ
ア蛋白質遺伝子および該遺伝子の発現のためのプロモー
ターを挿入してヒト免疫不全ウィルスのコア蛋白質遺伝
子含有ベクターを調製し；そして （３）前記コア蛋白質遺伝子含有ベクター中のチミジン
キナーゼ遺伝子領域と、ワクチニアウィルス遺伝子のチ
ミジンキナーゼ遺伝子領域との間の相同性組換えにより
該ワクチニアウィルス遺伝子のチミジンキナーゼ遺伝子
領域に前記ヒト免疫不全ウィルスのコア蛋白質遺伝子を
該遺伝子のためのプロモーターと共に組み込む； 段階を含んで成る方法を提供する。

本発明はさらに、前記第二０組換えウィルスの製造方法
であって、 （１）ワクチニアウィルス遺伝子由来のチミジンキナー
ゼ遺伝子を含をするＤＮＡ断片をクローニングベクター
に挿入してチミジンキナーゼ遺伝子含有ベクターを用意
し； （２）前記チミジンキナーゼ遺伝子含有ベクター中のチ
ミジンキナーゼ遺伝子中に、ヒト免疫不全ウィルスの遺
伝子および該遺伝子の発現のためのプロモーターを挿入
してヒト免疫不全ウィルスの遺伝子を含有するベクター
を調製し；そして（３）前記コア蛋白質遺伝子含有ベク
ター中のチミジンキナーゼ遺伝子領域と、ワクチニアウ
ィルス遺伝子のチミジンキナーゼ遺伝子領域との間の相
同性１えにより該ワクチニアウィルス遺伝子のチミジン
キナーゼ遺伝子領域に前記ヒト免疫不全ウィルス遺伝子
を該遺伝子のためのプロモーターと共に組み込む： 段階を含んで成る方法を提供する。

本発明はさらに、前記のＭｉ換えウィルスを有効成分と
する、ヒト免疫不全ウィルス感染症の予防又は治療のだ
めのワクチンを提供する。

〔具体的な説明〕

ワクチニアウィルス遺伝子に外来遺伝子を挿入する方法
としては、挿入しようとする外来遺伝子の両端にワクチ
ニアウィルス遺伝子中の特定の部位の配列を連結し、こ
の部位とワクチニアウィルス遺伝子中の対応配列との間
の相同性組換えによる方法が一般に用いられ、本発明に
おいてもこの方法を用いることができる。このような外
来遺伝子挿入部位は、その挿入によりウィルスの増殖が
本質的な影♂を受けず、しかも外来遺伝子が挿入された
ウィルスの簡単な同定を可能にするような部位でなけれ
ばならない。この様な部位として、例えばワクチニアウ
ィルスのチミジンキナーゼ遺伝子中の部位、ヘマグルチ
ニン遺伝子中の部位等を使用することができる。このよ
うな部位の好ましい例として、本発明においてはチミジ
ンキナーゼ遺伝子中の部位を使用する場合について具体
的に記載する。チミジンキナーゼはワクチニアウィルス
の増殖のために必須ではなく、しかも外来遺伝子の挿入
によりチミジンキナーゼ遺伝子の機能が失われた場合、
そのようなワクチニアウィルスは５−ｂｒｏｍｏ−ｄｅ
ｏｘｙ−ｕｒｉｄｉｎｅ（ＢＵｄＲ）の培地で増殖する
ので同定することができるからである。なお、前記のチ
ミジンキナーゼ中の部位に代えて、ヘマグルチニン遺伝
子中の部位を使用することも可能であり、この場合、組
換えワクチニアウィルスを血球凝集機能の喪失により同
定することができ、この同定は、ニワトリ赤血球による
ウィルスプラークの染色により簡単に行うことができる
。

本発明においては、ヒト免疫不全ウィルスの抗原遺伝子
としてコア蛋白質遺伝子を使用する。このようなコア蛋
白を遺伝子として本発明においては且蛋白質をコードす
る遺伝子、すなわシヱ旦遺伝子について具体的に説明す
る。本発明において使用するコア蛋白質遺伝子は、該コ
ア蛋白質遺伝子とヒト免疫不全ウィルスの表面蛋白質遺
伝子、すなわち！遺伝子とを有する二価ワクチンの作製
における中間体としても使用することができる。

１遺転子は本来の（ｎａｔｉｖｅ）な状態においてはプ
ロテアーゼをコードしている」１遺転子とリンクして存
在している。そして、」■遺伝子の発現生成物である１
蛋白質が」１遺転子の発現生成物であるプロテアーゼに
よりプロセシングされ、それにより生ずる五組白質断片
が抗原として実際に機能すると予想される。従って、こ
のようなプロセシング機能を具えた組換ウィルスがワク
チンウィルスとして理想的であると予想される。しかし
ながら、この様な組換えウィルスは報告されていない。

組換ウィルス中の抗原遺伝子、又は抗原遺伝子とプロテ
アーゼ遺伝子を発現せしめるためには、これらの遺伝子
の上流にウィルスプロモーターを配置する必要がある。

このようなプロモーターとして、例えば７．５Ｋ蛋白質
遺伝子のプロモーター又は牛痘ウィルスのＡ型封入体（
ＡＴＩ）蛋白質遺伝子のプロモーター、あるいはこれら
のプロモーターの変異体等を使用することができる。本
発明においては、１例として７．５Ｋ蛋白質遺伝子プロ
モーターを使用する場合について記載する。

前記の構成要素、すなわち７．５Ｋ蛋白質遺伝子プロモ
ーターと１遺転子及びこれとリンクした」１遺転子又は
プロテアーゼをコードするその部分とがチミジンキナー
ゼ遺伝子中に挿入されているＵ換つィルスを作製するた
めには、まず、チミジンキナーゼ遺伝子を含有し、該チ
ミジンキナーゼ遺伝子中に前記プロモーター並びに−【
」遺伝子及びこれとリンクしたｇａｇ遺転子（又はその
部分）を含有している組換え用プラスミドを作製する。

この様なプラスミドは、例えば第１図に模式的に示すよ
うな構造を有する。この図に示すように、１遺転子の下
流側と」１」転子の上流側は部分的にオーバーラツプし
た状態でリンクしている。

この様なプラスミドの作製については、実施例において
具体的に説明する。

次に、前記のようにして作製した組換え用プラスミドを
用いて、これらのプラスミド中に存在する１遺転子及び
」１遺転子を該遺伝子のためのプロモーターと共にワク
チニアウィルス遺伝子のチミジンキナーゼ遺伝子領域に
組み込む。この組換えは、ワクチニアウィルス遺伝子の
チミジンキナーゼ遺伝子領域と、前記組換え用プラスミ
ド中の１遺転子及びｇａｇ遺転子の両端に存在するデミ
ジンキナーゼ遺伝子部分との間の相同性１１０によって
行われる。

このためのワクチニアウィルスとしては、種々のワクチ
ニアウィルス株を用いることができ、それらの若干の例
としてＷＲ株、ＬＯ−５株、ＬＣ１６ｍＯ株、ＬＣ１６
ｍ８株等を挙げることができる。ＬＣ１６ｍＯ株及びＬ
Ｃ１６ｍ８株は神経病原性の低い弱毒株としてＬＯ株か
ら得られたものであり、これらは次のような性質を有す
る。

第一一」−一一人 組換えは次のようにして行うことができる。すなわち、
ウサギ腎細胞を培養して単層を形成し、これに組換え用
ウィルスとしてのワクチニアウィルスｍ０株を感染せし
める。次に、リン酸カルシウム法により前記組換え用プ
ラスミドをトランスフェクトする。

次に、これらのサンプルからウィルスを回収し、単層１
４３細胞上に感染させ、ＢＵｄＲを含む培地で培養しプ
ラークを形成せしめる。目的とする組換えが生したワク
チニアウィルスはチミジンキナーゼを発現しないＴＫ（
−）のでＢＩＪｄｉ１存在下でもプラークを形成するが
、組換えを行わなかったワクチニアウィルスｍ０株はＴ
Ｋ（＋）であるためプラークを形成しない。これをマー
カーとして組換えワクチニアウィルスの候補株をｊπ訳
する。

次に、前記候補株、および対照としてのｍ０株ウィルス
をＲＫ１３細胞上にプレートし、プラークを形成させる
。それらを固定し、ヒト免疫不全症候群の患者血清を用
いて、蛍光抗体法により、ヒト免疫不全ウィルスコア蛋
白質を発現している組換えワクチニアウィルスを選択す
る。この過程を第２図に模式的に示す。

この様にして得られた組換ウィルスは第１図に示すよう
な構造を有すると推定される。但し、この図中器で示す
部分は組換ウィルス中のベクターワクチニアウィルスに
由来する部分である。

この様にして得られた組換えワクチニアウィルスの発現
生成物を確認するには、例えば、ウェスタンブロッティ
ングを用いることができる。すなわち、ウサギ腎細胞株
（ＲＫ１３細胞）に組換えつ・イルス又は対照としての
ウィルスｍ０株を感染せしめた後細胞を集め、この細胞
をＰＢＳで洗浄した後、超音波処理により細胞を破砕し
、これに１／４星の緩衝ン夜Ｃ３ＤＳ９．２％、グリセ
リン４０％、メルカプトエタノール２０％、ＢＰＢ　０
．００４％、０．２５ＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ６、
８）　〕を加えて１００”Ｃ加熱する。

このサンプルを５Ｏ５−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動により分離した後デュラボアフィルター（ミリポア社
製）にブロッティングし、−次抗体としての免疫不全症
患者の血清又は正常者の血清と免疫反応せしめる。次に
、二次抗体としてのパーオキシダーゼ結合−抗ヒト抗体
で処理して発色せししめる。この結果第３図に示すごと
く、正常血清で処理した場合発色が見られなかったが、
免疫不全患者の血清で処理した場合には分子量がおよそ
５１に、３８に、及び２４Ｋに相当する位置に発色ハン
ドが見られ、免疫不全ウィルス抗体と反応するこれらの
大きさのペプチドが生成していることが推定された。こ
のことから、組換ウィルスの」ｕｌｆｆ伝子の発現によ
ってまず約５１にの蛋白質が生成し、これより３８に蛋
白質が生じ、次にこの３８に蛋白質が、プロセシングさ
れて、免疫不全ウィルス愚者血清と反応性の２４にの抗
原蛋白質が生ずると推定される。これらのプロセシング
の一部又は全過程において組換えウィルス中の」１遺伝
子の発現生成物であるプロテアーゼが働いていると推定
される。この様子を第４図に模式的に示す。

本発明の組換ウィルスがｉｎ　ｖｉｖｏにおいて免疫不
全ウィルスに対する抗体価を上昇せしめることを、実施
例９において詳細に説明する。

次に、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。

以下の実施例においては、各種の酵素反応は次の緩衝液
を用いて、常法に従って行った。

（１）制限酵素緩衝溶液 （１）低塩）′１度緩衝溶液（ｐＨ７，５）ＫＣＩ　　
　　　　　　　　　　　１０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃ１１０ｍ
Ｍ ＭｇＣ１ｚ　　　　　　　　　　　　　７ｍ、’１ジチ
オスレイトール　　　　　　１ｍＭ（ＩＩ）生塩濃度緩
衝溶液（ｐＨ７，５）ＮａＣ１５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＣＩ　　　　　　　　　　　　１０ｍＭごｇ
ｃ１□　　　　　　　　　　　　１０ｍ門ジチオスレイ
トール　　　　　　１ｍＭ（ＩＩＩ）高塩濃度緩衝溶液
（ｐｌ＋　７．５　）ＮａＣ１１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃ１５０ｍＭ ＭｇＣ１ｚ　　　　　　　　　　　　　１０ｍＭジチオ
スレイトール　　　　　　１ｍＭ（ＴＶ）Ｓｍａｌ　緩
衝？容ｆｌ　　（ｐＨ８，０）ＫＣＩ　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　２０＋ｎＦＩＴｒｉｓ−Ｃ
Ｉ　　　　　　　　　　　　　　　　　１０ｍＭＭｇＣ
Ｉｚ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　７ｍＭジ
チオスレイトール　　　　　　ＩｍＭ（２）ライゲーシ
ョン緩衝溶液（ｐＨ７，６＞Ｔｒｉｓ−ＣＩ　　　　　
　　　　　　６６ｍＭ阿ｇｃ］□　　　　　　　　　　
　　５ｍＭジチオスレイトール　　　　　５１ 八ＴＰ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　１ｍ門（３）二ツクトランスレーションｌ、
Ｗ　Ｕｉ　？８　’ｔ（１（ｐ＋＋　７．２　） Ｔｒｉｓ−Ｃ１５０ｍＭ Ｍｇ５Ｏ＜　　　　　　　　　　　　　１０ｍＭジチオ
スレイトール　　　　０．１ｍＭウシ血清アルブミン　
　　　　５０■／　ｍｌ（４）　ｒ４ＤＮＡボ’Ｊ　ｌ
　ラーゼ１Ｍ　４１ｉ　ｉ容、夜（ｐｉ＋　７．９　）
Ｔｒｉｓ−アセテート　　　　　　３３ｍＭ酢酸カリウ
ム　　　　　　　　６６ｍＭ酢酸マグネシウム　　　　
　　１０ｍＭジチオスレイトール ウシ血清アルブミン Ｑ、５ｍＭ ０１１■／− チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子は、ワクチニアウィル
スＷＲ株のの遺伝子の旧ｎｄＩ［［Ｊ断片の左末端側に
位置し、この断片の制限酵素地図の一部が決定されてい
るＧ、Ｂａｊｓｚａｒ、　Ｂ、Ｍｏ５ｓ等、　Ｊｏｕｒ
ｎａｌｏｆ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　４５，６２−７２（１
９８３）　　、したがって、本発明においてはこの断片
を使用するのが便利である。

この断片を、ワクチニアウィルスのＤＮＡから、対応す
る制限酵素、ｌ１ｉｎｄｌｌｌにより切り出し、適当な
ベクター中にクローニングする。このようなベクターと
しては遺伝子操作において常用されている任意の細菌性
ベクター、たとえば、大腸菌（Ｅ。

ｃｏｌｉ）プラスミドを使用することができる。このよ
うなベクターとして、たとえば大腸菌プラスミドρＢｌ
？３２８を使用することができる。このプラスミドｐＢ
Ｉ１１３２８はクローニング用ベクターとして当業界に
おいて広く使用されており、容易に人手することができ
る。

ｐＢＲ３２８を旧ｎｄｌｌｌにより消化し、前記のチミ
ジンキナーゼ遺伝子を含有するワクチニアウィルスの１
１ｉｎｃｆ！］ＩＪ断片とを連結して、プラスミドＴＸ
−ｐＢＲ３２８を得た。このプラスミドを、Ｅ、ｃｏｌ
ｉ　１１８１０１株に形質転換することにより、目的と
するチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子を増幅した。なお
、ベクタープラスミドｐＢＲ３２８においてＥｃｏＲＩ
は開裂部位は、プラスミドｐＢＲ３２８をＥｃｏＲＩで
開裂せしめた後ＤＮＡポリメラーゼにフィルインして平
滑末端にし、再び連続することによりあらかじめ除去し
ておいた。

７゜５Ｋ蛋白質遺伝子の天然プロモーター（Ｐ　７．５
Ｎプロモーター）はすでに記載されでいるνｅｎｋｔｅ
ｓａｎ。

Ｓ３等、Ｃｅ１ｌ、２５，８０５−８１３（１９８１）
　、この記載に従ってプロモーターを含有するＤＮＡを
得、これをｐＵｃ１８に挿入することによりプラスミド
ｐ　２４０１を得た。

プラスミドｐ　２４０１の構造を第６図に示す。また、
プロモータ一部分の塩基配列を第７Ｍに示す。

プロモーターｐ　２４０１を中温濃度緩衝液中でＰｖｕ
■により消化した。他方、ワクチニアウィルスＷＲ株由
来のチミジンキナーゼ遺伝子を含有する約５Ｋｂの旧ｎ
ｄｌｌｌ断片を含有するプラスミドＴＫ−ｐＩＩＲ３２
８をＥｃｏＲＩにより消化し線状化した。この線状化さ
れたＴに−ｐＢＲ３２８と前記ｐ２４０１からの平滑端
断片を連結し、反応混合物を用いて大腸菌を形質転換し
た。得られたクローンからプラスミドを抽出し、制限酵
素で分析し、７．５Ｋプロモーターがチミジンキナーゼ
遺伝子中に正方向に挿入されているプラスミドを得、こ
れをＴＫ−ｐ７．５Ｎ−ｐＢＲ３２８と命名した。

ノＬ施］対」エ　ヒト　　　全ウィルスのコア　白ヒト
免疫不全ウィルスのゲノム遺伝子（ＬＴＲを除く）がプ
ラスミドｐＳＰ６５中に組み込まれたプラスミド（本明
細書においてプラスミドｐＮＫ５．２と称する）はすで
に作製されている。このプラスミドｐＮＫ５．２の構造
を第９図に示す。

このプラスミドを５ｓｔｌ及びにρｎｌにより消化し、
」バｇａｇ遺転子ζユ虹遺伝子の一部を含む、５ｓｔｌ
ＫｐｎＩ断片を得た。他方、市販されているプラスミド
ｐＵｃ１Ｂを５ｓｔｌ及びＫｐｎｌにより消化して線状
化し、大断片を得た。これらの両断片をＤＮＡ連続酵素
により連結してプラスミドＪ−ａＢ、−ｐＵ　Ｃ１８を
得た（第８図）。

プラスミドｇａｇ−ｐＵｃ１８を低塩濃度緩衝液中で５
ｓｔｌおよびＫｐｎ　Ｉで消化した。得られた遺伝子断
片をＴ４　ＤＮＡポリメラーゼおよびＫｌｅｎｏｗ断片
処理により末端を平滑化した。一方、実施例３において
得たプラスミドＴＫ−ｐ７．５Ｎ−ρＢＲ３２８を高塩
濃度緩衝液中でＳｍａ　Ｉにて消化した。両者をＴ４　
ＤＮＡリガーゼにて連結し、この反応生成物で大腸菌を
形質転換した。得られたクローンからプラスミドを抽出
し、これを各種制限酵素で分析し、７．５Ｋ蛋白質プロ
モーターの下流に、７．５Ｋ蛋白質プロモーターと同じ
方向で」バ」■遺伝子が組み込まれていることを確認し
た。このプラスミドをｇａｇ−ＴＫ−ｐ７．５ＮｐＢＲ
３２８（ＹＧ−７，５ＴＫ）　　と命名した。

このプラスミドを含有する大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａｃｏｌ　ｉ／ＹＧ−７，５Ｔには、工業技術院微生物
工業技術研究所に、徽工研菌等第　＋０：Ｉ’ｌ’？号
（ＦＥＲＭ　　ｐｏ：ｔｑ？　）として寄託されている
。

ウサギ腎細胞株１？に１３を面積２５ＣＩＩＩの培養ボ
１−ルにまいて、３７°Ｃ１５％ＣＯ□のもとで培養し
てモルレーヤーを形成した。次に、この培養細胞に、組
換え用ウィルスとしてのワクチニアウィルスｍ０株を、
ｍ、ｏ、ｉ、　　０．１の量で感染させ１時間置いた。

次に、実施例２において得たプラスミドｇａｇ−ＴＫｐ
７．５Ｎ−ｐＢＲ３２８をリン酸カルシウム法（Ｗｅｉ
ｒ、Ｊ、Ｐ。

等（１９８２）Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ
、ＵＳＡ、　　ヱ９，１２１０−１２１４　）によりト
ランスフェクトさせた。１８時間培養後、この培養物か
ら、凍結融解によりウィルスを培地に放出させ、ウィル
スを回収した。

１４３細胞を直径ＩＱｃｍのシャーレに収容したイーグ
ルのＭＥＭ培地中で３７°Ｃにて２４時間培養し、モル
レーヤーを形成させた。次に、この層上に、上記のよう
にして回収したウィルスをまき、ＢＵｄｌ？培地で２日
間インキユヘートしてＴＫ（−）プラークを拾った。

こうして、１０個の候補ウィルス株を得た。

実施例６において得た候補株ＩＯ株及びｇａｇ遺転子が
挿入されていないワクチニアウィルスｍ。

株について、培養細胞中で実際にＩＩＩＶ−ｇａｇを発
現しているかどうか調べるために、プラークアッセイを
行った。すなわち、ＲＫ１３細胞を４チヤンバーにまい
てモルレーヤーを形成させ、１０〜２０ＰＦＵ／チ中ン
ハーの量で組換えワクチニアウィルス候補株を感染させ
、１晩培養した。これらの細胞をメタノールで固定し、
次にＡＩＤＳ患者血清で処理した後、蛍光標識の抗ヒト
血清を加えて反応させた。それらのヂャンハーを蛍光顕
微鏡でプラーク部分の蛍光を観察した。

その結果、組換えワクチニアウィルス阻８がｇａｇ副用
をインビトロで発現させていることがわかった。

結果を第１０図に示す。この図の写真は前記ｕｌ換ワク
チニアウィルス階８が感染しているＲＫ１３中での」五
組白質の発現を示している。この写真から１蛋白質は主
として細胞質内において発現していることが示唆された
。

フで４缶」４１主　　　　生　　　の　　ｊ刀　（３４
）実施例７において得た組換ワクチニアウィルス階８株
をクローニングした後、対照としてのワクチェアウイル
スｍｏ株と共に動物細胞におけるその発現生成物を確認
した。ＲＫ１３細胞を直径６ｃｍのシャーレ内でモルレ
ーヤーを形成させ、１ｍｏｉの量で組換えワクチニアウ
ィルス株を感染させ、２４時間培養し、細胞を回収した
。この細胞をＰＢＳにより洗浄し、蒸留水に懸濁した後
、超音波処理により細胞を破砕した。これに１／４量の
緩衝液（ＳＤ５９．２％、グリセリン４０％、メルカプ
トエタノール２０％、ＢＰＢ　Ｏ，００４％、０．２５
Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＩＩｃＩ（ｐＨ６，８）　）を添えた後
１００°Ｃで加熱した。ＳＯＳポリアクリルアミドゲル
電気泳動により生成物を分離した後、デュラボアペーパ
ー（ミリポア社製）にブロッティングした。これを３％
ゼラチンによりブロッキング処理し後、免疫不全患者か
らの血清により処理し、次にパーオキシダーゼと接合せ
しめた抗−ヒト免疫グロブリンにより処理し、最後にパ
ーオキシダーゼの基質である４−クロロナフトールで処
理することにより発色せしめた。対照として、前記の患
者の血清に代えて正常者の血清を用いて同様の処理を行
った。

第３図にその結果を示す。この図から明らかな通り、正
常者の血清を用いた場合、及び１遺転子が挿入されてい
ないワクチニアウィルスｍ０株を用いた場合には発色が
見られないのに対して、１１−遺伝子を組み込んだ本発
明の組換えワクチニアウィルス階８を用い、患者血清で
処理した場合には、分子量がおよそ５１に、３８Ｋ、及
び２４Ｋに相当する位置に発色バンドが観察された。こ
のことから、免疫不全ウィルス感染患者血清と反応する
ことができ、これらの分子量を有する３種類の生成物が
生成していることが明らかになった。

これらの関係は第４図のように推定される。

体重約２．５　ｋｇのウサギ（日本内色種）３頭に前記
組換ウィルス隘８を１０’ＰＦＵ１０．５ｍｊ！／頭の
量で皮肉接種し、対照として３頭のウサギに１遺転子が
組み込まれていないワクチニアウィルスｍ０株を１０ｆ
ｌＰＦＬＩ１０．５ｍｊ／頭皮内接種した。各ウサギか
ら１週間に１回耳の静脈から採血し、これらのサンプル
の内免疫接種前の血液、並びに免疫接種後５週目及び２
１１週目血液について抗体価の上昇を調べた。

血液の分析は次の様にして行った。ウサギより採血した
血液を４“Ｃにて１晩放置後、１８００ｋｇ、１５分遠
心した上清を血清サンプルとした。血清中の抗体価の上
昇について、以下に示す免役沈降実験を行った。ＩＩＩ
ＶをＭＯＬＴ−４細胞に感染させた。

この時３５Ｓ−メチオニンを２５０μｃ　ｉ　／　ｍｌ
となる様に加えて２０時間培養した。２×１０６個の感
染細胞を溶解緩衝液（１％ＮＰ−４０，１％デオキシコ
ール酸、０．１％ＳＤＳ　Ｏ，１５Ｍ　Ｎａｃｌ　、２
ｍＭ　ＰＵＳＦ　、１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７，２）
にて可溶化した。この可溶化サンプルの１部を先のウサ
ギ血清（２００倍〜）と反応させた後、プロティンＡセ
ファロースを用いて抗原−抗体形成物を沈殿として回収
した。この沈殿をＳＯＳサンプル緩衝液（１６ページと
同じ）で処理後、その上清をＳＯＳポリアクリルアミド
ゲル電気泳動により分離後、オートラジオグラムを行っ
た（−８０℃、２日）。

結果を第１１図に示す。図中、７，８、及び９はウサギ
の個体番号であり、右端のレーン（ＩＩＩＶ）は、精製
されたヒト免疫不全ウィルスを接種したウサギの血液か
らの抗血清についての結果である。各個体についてＯは
０週（免疫接種前）、５は接種後５週間目、１５は接種
後２１凹間後に採血した血液から得られた結果である。

いずれのウサギにおいても、免疫後５週目及び２１ａ目
には、精製免疫不全ウィルスを接種して得られた抗体を
用いた場合と同じ位置にバンドが観察され、それが分子
ｆｆ１２４Ｋｂであることから抗ｇａｇ抗体の存在が示
唆された。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の組換え用プラスミド、及びＭｉ換え
ワクチニアウィルスの構造を模式的に示す図である。 第２図に、本発明の組換えワクチニアウィルスの作製過
程を模式的に示す図である。 第３図は、本発明の組換えワクチニアウィルスを動物細
胞に感染せしめた場合に生成する、ヒト免疫不全ウィル
ス感染徴者血清と免疫反応する生成物を示す電気泳動図
である。 第４図は、第３図に示される３種類の生成物の生成機作
を予想する図である。 第５図は、ワクチニアウィルスのチミジンキナーゼ（Ｔ
Ｋ）遺伝子のクローニングの過程を示す。 第６図は、７．５Ｋ蛋白質遺伝子の天然プロモーター（
Ｐヮ、、Ｎ）を含有するプラスミドＰ２４０１の構造を
示す。 第７図は、Ｐ　７．５Ｎプロモーター領域の塩基配列を
示す。 トＰ２４０１、及び韮−ｕＬｉｆｆ伝子を含転子るプラ
スミドｐＫＮ５．２から、本発明の組換え用プラスミド
ｇａｇ−ＴＫ−ｐ７．５Ｋ−ｐＢＲ３２８（ＹＧ−７，
５ＴＫ）を作製する過程を示す図である。 第９図はｌｌ−匪遺転子を含有するプラスミドｐＫＮ５
．２の構造を示す。 第１０図は、本発明の組換えウィルスを感染させたウサ
ギＲＫ１３細胞中での１蛋白質の発現を間接螢光抗体法
にて検出した写真であり、生物の形態を表す図面に代わ
る写真である。 第１１図は、本発明の組換えウィルスをウサギに接種後
に得た抗血清中に、」■蛋白質に対する抗体ができてい
ることを示す電気泳動パターンである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ワクチニアウィルス遺伝子にヒト免疫不全ウィルス
   のコア蛋白質遺伝子が組み込まれており、ヒト免疫不全
   ウィルスのコア蛋白質を発現することができる組換えウ
   ィルス。 ２、前記ヒト免疫不全ウィルスのコア蛋白質遺伝子が前
   記ワクチニアウィルス遺伝子のチミジンキナーゼ遺伝子
   領域に組み込まれている請求項１に記載の組換えウィル
   ス。 ３、前記ヒト免疫不全ウィルスのコア蛋白質遺伝子の上
   流に７．５Ｋ蛋白質遺伝子プロモーターを有する請求項
   １に記載の組換えウィルス。 ４、前記コア蛋白質遺伝子が￥ｇａｇ￥遺伝子である請
   求項１に記載の組換えウィルス。 ５、ワクチニアウィルス遺伝子にヒト免疫不全ウィルス
   の￥ｇａｇ￥遺伝子及びそれにリンクする￥ｐｏｌ￥遺
   伝子の少なくともプロテアーゼコード部分が組み込まれ
   ている組換えウィルスであって、該ウィルスが感染した
   細胞においてヒト免疫不全ウィルスの￥ｇａｇ￥蛋白質
   を産生することができる組換えウィルス。 ６、前記ヒト免疫不全ウィルスの遺伝子が前記ワクチニ
   アウィルス遺伝子のチミジンキナーゼ遺伝子領域に組み
   込まれている請求項５に記載の組換えウィルス。 ７、前記ヒト免疫不全ウィルスの遺伝子の上流に７．５
   Ｋ蛋白質遺伝子プロモーターを有する請求項５に記載の
   組換えウィルス。 ８、請求項１に記載の組換えウィルスの製造方法であっ
   て、 （１）ワクチニアウィルス遺伝子由来のチミジンキナー
   ゼ遺伝子を含有するＤＮＡ断片をクローニングベクター
   に挿入してチミジンキナーゼ遺伝子含有ベクターを用意
   し； （２）前記チミジンキナーゼ遺伝子含有ベクター中のチ
   ミジンキナーゼ遺伝子中に、ヒト免疫不全ウィルスのコ
   ア蛋白質遺伝子および該遺伝子の発現のためのプロモー
   ターを挿入してヒト免疫不全ウィルスのコア蛋白質遺伝
   子含有ベクターを調製し；そして （３）前記コア蛋白質遺伝子含有ベクター中のチミジン
   キナーゼ遺伝子領域と、ワクチニアウィルス遺伝子のチ
   ミジンキナーゼ遺伝子領域との間の相同性組換えにより
   該ワクチニアウィルス遺伝子のチミジンキナーゼ遺伝子
   領域に前記ヒト免疫不全ウィルスのコア蛋白質遺伝子を
   該遺伝子のためのプロモーターと共に組み込む； 段階を含んで成る方法。 ９、請求項５に記載の組換えウィルスの製造方法であっ
   て、 （１）ワクチニアウィルス遺伝子由来のチミジンキナー
   ゼ遺伝子を含有するＤＮＡ断片をクローニングベクター
   に挿入してチミジンキナーゼ遺伝子含有ベクターを用意
   し； （２）前記チミジンキナーゼ遺伝子含有ベクター中のチ
   ミジンキナーゼ遺伝子中に、ヒト免疫不全ウィルスの遺
   伝子および該遺伝子の発現のためのプロモーターを挿入
   してヒト免疫不全ウィルスの遺伝子を含有するベクター
   を調製し；そして（３）前記コア蛋白質遺伝子含有ベク
   ター中のチミジンキナーゼ遺伝子領域と、ワクチニアウ
   ィルス遺伝子のチミジンキナーゼ遺伝子領域との間の相
   同性組換えにより該ワクチニアウィルス遺伝子のチミジ
   ンキナーゼ遺伝子領域に前記ヒト免疫不全ウィルス遺伝
   子を該遺伝子のためのプロモーターと共に組み込む； 段階を含んで成る方法。 １０、請求項１又は５に記載の組換えウィルスを含んで
   成るヒト免疫不全ウィルス感染症に対するワクチン。