JPH02124462A - 改良免疫測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野１ 本発明は、短い時間で高感度な測定ができる改良された
免疫測定法に関する。

本発明の方法は、医学や生命科学の基礎的研究やその応
用における各種試験に、また臨床検査、検疫１診断ある
いは食品検査等における各種試験に利用できる。

〔従来の技術Ｊ 現在法（利用されている酵素免疫測定法（ＥＩＡＩ。

ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、フルオロイムノアッ
セイ（ＦＩＡ　）などの高感度免疫測定法において、測
定時間を短縮することは、研究やルーチン業務の効率化
の上で極めて重要なことである。

免疫測定法の中で、抗原・抗体反応や標１化のための反
応に反応物の一方を固定した状態で行なうヘテロジニア
スな反応を利用する測定法（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｏｕｓ
　ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）は、感度等において優れた
方法であるが、同相上での反応に比較的長い時間を要す
るという欠点がある。

一方、　ＥＩＡやＦＩＡにおいて、例えば旧１ｅａｎ、
　Ｅ、Ｆ、　　ｅＬ　　ａｌ、　　Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏ
ｕｓ　　ｅｎｚｙｍｅ　　ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　　
ｆｏｒｔｈｙｒｏｘｉｎｅ、　　Ｃｌ１ｎ、　Ｃｈｅｗ
、、　２１．１ｕ１１．１９７５に開示されているよう
な比較的短時間での測定が可能な反応物を固定しないで
反応させるホモジニアスイムノアッセイも普及している
が、これらは低分子ハプテンの測定に適しているもので
あり、高分子物質の測定には適するものではない。

また、高分子物質の測定に用いるホモジニアスイムノア
ッセイも実用化に供されているが（Ｇｉｂｂｏｎｓ、　
１．　ｅｔ　ａｌ、　Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ　ｅｎｚ
ｙｍｅｉｓｕｗｕｎｏａｓｓａｙ　　ｆｏｒ　　ｐｒｏ
ｔｅｉｎｓ　　ｅｓｐｌｏｙｉｎｇ　　　β　−ｇａｌ
ａｃｔｏｓｉｄａｓｅ、　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｓ
、、　１０２，１６７．１９８０及びＡｓｈｉｈａｒａ
、　Ｙ、　ｅＬ　ａｔ、　Ｈｏａ＋ｏｇｅｎｅｏｕｓ　
ｅｎｚｙｍｅｉＩＩＩｍｕｎｏａｓｓａｙ　ｆｏｒ　ｍ
ａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎｔｉｇｅｎｓｕｓｉ
ｎｇ　　ｈｙｂｒｉｄ　　ａｎｔｉｂｏｄｙ、　　Ｊ、
　　Ｃｌ１ｎ、　　Ｌａｂ、　　Ａｎａｌ、。

１、７７、１９８７等）、何れもヘテロジニアスイムノ
アッセイと比較すると感度において大きく劣るものであ
り、ある種のホルモンや腫瘍マーカーのような超高感度
が要求されるハプテンや抗原の測定には適用できない。

［発明が解決しようとする課題１ 本発明の目的は、短い時間で高感度な測定が可能な改良
された免疫測定法を提供することにある。

本発明の他の目的は、低分子量物質のみならず高分子量
物質の測定においても、高感度で短時間の測定が可能な
改良された免疫測定法を提供することにある。

［課題を解決するための手段］ 上記の目的は、測定対象物と特異的に反応して複合体を
形成し得る測定対象物検出用試薬としての抗体を試料と
液相中で反応させる過程と、該反応で生じた測定対象物
と抗体試薬との複合体な固相に結合させた状態で標識を
利用して検出する過程とを組合わせた本発明の免疫測定
法により達成できる。

すなわち、本発明の免疫測定法は以下の過程を含む、 ａ）測定対象物を含む試料と、測定対象物と特異的に反
応し、かつ固体担体に固定し得る固定化用抗体を、測定
対象物と固定化用抗体の複合体を形成させるために反応
させる過程と、 ｂ）過程ａで生じた複合体を、該複合体に含まれる固定
化用抗体を利用して固体担体に固定する過程、及び Ｃ）固体担体に固定された複合体を標識を利用して検出
する過程。

本発明による改良点は、測定対象物に特異的な抗体と試
料とを反応させ、生成する測定対象物と抗体との複合体
を標識を利用して検出し、試料中の測定対象物を測定す
る免疫測定法において、測定対象物と抗体の反応を液相
中で行ない、かつ生成した測定対象物と抗体との複合体
を同相に固定して標識により検出することにある。

本発明の改良により、免疫測定法の高感度性をｊ（Ｉ持
しつつ測定時間を大幅に短縮することができる。

従って１本発明の改良法は、各種免疫測定法における抗
原・抗体反応及び標識を利用した検出の過程に適用でき
る。

すなわち、各種免疫測定法において、測定対象物に特異
的な抗体を同相に固定した状態で試料と反応させ、同相
上に形成された複合体を［１を利用して検出する過程を
、抗体と試料とを液相で反応させ、生成した抗体−測定
対象物複合体を同相に固定して、それを標識を利用して
検出する過程で置き換えることにより、検出感度を低下
させることなく測定時間を大幅に短縮することが可能と
なる。

本発明が適用できる測定対象物には、腫瘍マーカーであ
るＣＥＡ、　ＡＦＰ、　ＣＡ−５０など、ホルモンであ
るインシュリン、ＴＳ）１．　）ＩＣＧ、　ＧＨ，ＴＳ
、Ｔ４、ステロイドホルモンなどその分子量や構成成分
を問わず従来の免疫学的測定力で測定できる抗原あるい
はハプテンはすべて含まれるが、特にＣＥＡやＴＳＩＩ
等のように超高感度を要する微量物質に対して効果は著
しい。

本発明に使用されるマーカー（標識）としては、ペルオ
キシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、アルカリフォス
ファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼなどの各種ＥＩ
Ａ用マーカー酵素、１２５Ｉなどの各種ＲＩＡ用のラジ
オアイソトープ、フルオレッセイン、ローダミン、フィ
コエリスリンなどの蛍光物質、ルミノール、イソルミノ
ール、ルシゲニンなどの各種ＦＩＡ用の発光物質などが
利用できる。

本発明で用いる固定化用抗体は、測定しようとする測定
対象物と特異的に反応し、かつ固体担体に固定できる構
成を有するものである。

この固定化用抗体としては、ビオチン化抗体を好適なも
のとして挙げることができる。このビオチン化抗体は、
アビジンを結合した固体担体にアビジン−ビオチン結合
反応により容易に固定することができる。しかも、この
アビジン−ビオチン結合反応は短時間で行なうことがで
き、その結合定数も高い。例えば、固定化されている抗
体（または抗原）に抗原（または抗体）を結合させる場
合と比較して、アビジン−ビオチン結合は抗原・抗体反
応よりも約１．０００倍大きい結合定数を有する。

従って、アビジン−ビオチン結合を利用することにより
、短時間で確実な複合体の固体担体への固定化が可能と
なり、より短時間で、より高感度な免疫測定が可能とな
る。

またアビジンの代わりにより結合力の強いストレプトア
ビジンを使用することによってより好ましい結果を得る
ことができる。

ビオチン・アビジン結合を利用したシステムはイムノア
ッセイやとりわけ組織化学分野における酵素抗体検出法
に広（ｆす用されている。

しかし、これらの分野における使われ方は、抗体に酵素
を標識する手段として、一般に広く利用されている化学
的標識の代わりとして利用されているにすぎない。この
分野で使用されている主な理由としては化学的に結合さ
れた酵素標識抗体より非特異的吸青が少ない、即ちバッ
クグランドが低いことや酵素と抗体を直接結合標識する
ことよりもビオチンやアビジンを結合させることの方が
技術的に容易であることなどが考えられている。

本発明におけるビオチン・アビジン結合の利用は、従来
のビオチン・アビジンの使用概念から発想を転換し、抗
原抗体反応生成物の同相への固定化に利用するというア
イデアによるものである。

本発明においては、固定化用抗体を利用することで、試
料と固定化用抗体との反応を液相中で行なうことが可能
となった。

固体担体としては、固定化用抗体の固定のための構成に
応じて、通常用いられている種々のものから選択したも
のが利用できる。

アビジン・ビオチン結合を利用する場合には、ナイロン
、ポリスチレンなどの樹脂、ニトロセルロース及びガラ
スからなるものが利用できる。

また、抗体のビオチン化は常法により行なうことができ
る。本発明の方法は、例えばサンドイッチ法、競合法等
に好適に適用できる。

具体的には、サンドイツチ法に於いては固定化用抗体を
用い、この抗体と試料中の測定対象物およびマーカーで
標識された標識化抗体とを同時に、又は時間的に少しず
らしていずれかを先に反応チューブに加え反応させる。

この反応と同時に、又は少し遅らせてアビジン又はスト
レプトアビジンの結合した固体担体と反応させる。

以上の操作により、測定対象物を固定化用抗体と標識化
抗体とではさみ込んだサンドイッチ複合体が形成され、
それが固体担体に固定される。その際、未反応の標識化
抗体と複合体が分離される。この分離は１例えば複合体
が固定された担体を反応系から分離し、それを未反応の
標識化抗体を洗い流すことのできる適当な液体で洗浄す
ることにより行なえる。

次に、用いた標識の種類に応じた標識の検出を行なう。

すなわち、ＥＩＡに於いては酵素活性を。

ＲＩＡにおいては放射線活性を、またＦＩＡにおいては
蛍光強度を測定し、測定対象物の濃度を知ることができ
る。

一方、競合法においては、固定化用抗体と試料中の測定
対象としての抗原（またはハプテン）と１！４識化抗原
（またはハプテン）とを競争反応させた後、又は同時に
担体結合アビジン又はストレプトアビジンと反応させる
。反応物と未反応物とを分離した後、担体に固定された
マーカーを検出することによって上述のサンドイツチ法
と同様に、目的とする抗原（またはハプテン）を測定す
ることができる。

以上の測定法における具体的操作は、常法に従って行な
い得る。

【実施例１ 以下、本発明をさらに具体的に実施例及び参考例により
説明する０本発明はこれらの例によって限定されるもの
ではない。なお、その詳細が記述されていない各操作は
、常法に従って行なった。

実施例１ 癌胎児性抗原（ＣＥＡ　）の測定 ｌ）標準ＣＥＡの調製 原発性大腸癌の肝転移巣から抽出精製されたＣＥＡ　（
ケミコン社）を０．１Ｍ　ＮａＣ１，０，１％牛血清ア
ルブミン、０，０１％ＮａＮ５を含有する０、１Ｍリン
酸緩衝液、ｐＨ７，３（緩衝液Ａ）に溶解希釈し調製し
た。

２）ビオチン結合抗体の調製 精製されたＣＥＡに対するマウスモノクロナール抗体（
精製抗ＣＥＡ−ＭＣＡ）　１０ｍｇを５　ｍＩ２の０．
１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）に溶解し、５ｍｇのＳ
ｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ　６−（Ｂｉｏｔｉ
ｎａｍｉｄｏ）Ｈｅｘａｎｏｎａｔｅ（ピアス社）を加
え、室温、４時間インキュベートし、その後セファデッ
クスＧ−２５カラムに通して蛋白画分を分取し、ビオチ
ン結合抗体を得た。

使用時、緩衝液Ａを用い適切な濃度に希釈して使用した
。

３）アビジン結合ポリスチレンボール（アビジン−ＰＳ
Ｂ）の調製 精製アビジン（シグマ社）４ｍｇを１００ｍｆ２の０．
１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７、３に溶解し、ポリスチレン
ボール（ＰＳＢ、　ｐ　６．３ｍｍ）、８００個を加え
、３７℃、１６時間インキュベートした。インキュベー
ション後、同じリン酸緩衝液でＰＳＢを洗浄し、アビジ
ン−ｐｓｅを得た。

４）酵素標識抗体の調製 大腸菌由来β−Ｄ−ガラクトシダーゼと抗ＣＥＡ家兎抗
体Ｆａｂ’フラクションとの結合は、Ｓ、　Ｙｏｓｈｉ
ｔａｋｅらの方法（Ｓｃａｎｄ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ、、　１０；８１、１９７９）によった。

すなわち、抗ＣＥＡ家兎抗体（ダコー社）を精製し、Ｉ
ｇＧフラクションを得、更にペプシンで消化してＦ（ａ
ｂ’）ｚフラクションを得た。

このＦ　（ａｂ’）　ｚ　３　ｍｇを０．１Ｍリン酸緩
衝液、ｐＨ６，０に溶解し、２−メルカプトエチルアミ
ンを０．０１Ｍとなるように加え、３７℃、９０分分間
光した。

還元後、セファデックスＧ−２５カラムに通しＦａｂ’
を得た。

このＦａｂ’　フラクションにＮ、Ｎ’−ｏ−Ｐｈｅｎ
ｙｌｅｎｅｄｉｍａｌｅｉｍｉｄｅ　０．５ｍｇを加え
、３０℃、２０分反応させた後、Ｇ−２５カラムに通し
マレイミド化Ｆａｂ’を得、さらにｐＨを６．５に調整
した後、β−０−ガラクトシダーゼ（ベーリンガー社）
、９ｍｇを加え、４℃、２４時間インキュベーションし
た。

この反応液をセファローズ６Ｂカラムに通して精製し、
酵素標識抗体（β−Ｄ−ガラクトシダーゼ標識Ｆａｂ’
）を得た。使用時、緩衝液Ａを用い適切な濃度に希釈し
て使用した。

５）　ＣＥＡの測定 ガラス試験管（φ１０ｍｍ）に標準ＣＥＡ溶液又は検体
血清５０μβ、酵素標識抗体液５０μ℃及びビオチン結
合抗体１５０μａを加え、３７℃、２０分後にアビジン
−ＰＳＢ　１個を加え、更に８分間インキュベーション
した後、生食水２ｍβを加え吸引洗浄を３回繰り返した 最後の洗浄液を除いた後、基質液として０．ｌｏ＋Ｍの
４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシドを
含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）の０．：１ｍ
ｇを加え、３７℃、５分間インキュベートし、　０．１
ＭＧｌｙｃｉｎｅ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐｌ（１０，：ｌ
）　１ｓ＋４２を加え反応を浮化させた後、励起波長３
６０ｎｉｉ　、発光波長４２０ｎｍにて蛍光測定を行な
った。結果を表１に示す。

参考例１ ＣＥＡの従来技術による測定 ｌ）抗体−ＰＳＢの調製 実施例１の２）項で使用した精製抗ＣＥＡ−ＭＣＡを０
．１Ｍリン酸緩衝液、　ｐＨ７，：ｌに溶解し、　２８
０ｒ＋ｍにおける吸光度が０．０５となるように濃度を
調製した。この溶液ｌ００１１１１２の中にｐｓ口８０
ｏＷＡを入れ、実施例１と同様に３７℃、　１６時間イ
ンキュベートし、同緩衝液で洗浄して抗体−２８口を１
）た。

２）その他試薬 酵素標識抗体やけ準ＣＥＡ溶液は実施例１で示したもの
を使用した。

３）　ＣＥＡの測定 標準ＣＥＡ溶液又は検体血清５０μ℃、酵素標識抗体液
が５０μβ、緩衝液１５０μβ及び抗体−ＰＳＢ　１個
を試験管に加え３７℃、２時間インキュベートした。そ
の後実施例１と同様に洗浄、酵素反応、蛍光測定を行な
った。結果を表１に示す。

表１　実施例１及び参考例１における ＣＥＡ標準曲線 （蛍光強度、２重測定の平均） 表１の結果からも明らかなように本発明による実施例１
は、従来技術（参考例１）と比較して抗原抗体反応を２
時間から１０分間へと大幅に短縮したにもかかわらず測
定感度の面ではほぼ同等であった。

実施例２ 血中３．３°、５−Ｌ−トリョウドサイロニン（Ｔ、）
の測定 １）標準Ｔｓの調製 Ｔ３　（シグマ社）を０．０５Ｎ水酸化ナトリウムに溶
解し、Ｔ、フリー血清を用いて希釈し調整した。

２）ビオチン結合抗体の調製 精製されたＴ３に対する家兎抗体１０ｍｇを５ｍｊ２の
０．１Ｍリン酸緩衝液、ＰＨ７，５に溶解し、５ｍｇの
Ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ　６−（Ｂｉｏｔ
ｆｎａｍｉｄｏ）Ｈｅｘａｎｏｎａｔｅ（ピアス社）を
加え、室温、４時間インキュベートし、その後セファデ
ックスＧ−２５に通して蛋白画分を分取し、ビオチン結
合抗体（ビオチン−抗Ｔ。

抗体）を得た。使用時、０．１％牛血清アルブミン、０
．０１％８−＾ｎ１ｌｉｎｏ−１−ｎａｐｈｔａｌｅｎ
ｅ　５ｕｌｆｏｎｉｃａｃｉｄ、　０．０１％アジ化ナ
トリウムを含む０．１Ｍバルビタール緩衝液、ｐＨ８゜
６（緩衝液Ｂ）を用い適切な濃度に希釈して使用した。

３）酵素標識ハプテンの調製 Ｔｓ　４　ｍｇをジメチルホルムアミド２ｍ℃に溶解し
、Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ　４−（Ｎ−ｍａｌｅｉｍ
ｉｄｏｍｅｔｈｙｌ）ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−ｃ
ａｒｂｏｘｙｌａｔｅ　Ｏ，８ｍｇを加え、室温、９０
分インキュベート後ＩＭグリシン０．１ｍｇを加えた。

更に０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐｉ（７，３，４，０ｍｇ
に溶解した大腸菌由来β−トガラクトシダーゼ（ベーリ
ンガー　マンハイム社）６ｍｇを加え、３０℃、３０分
インキュベートした０反応液をセファデックスＧ−２５
に通して蛋白質画分を分取し、酵素標識ハプテン（β−
ガラクトシダーゼ標識Ｔ、）を得た。使用時、緩衝液Ｂ
を用い適切な濃度に希釈して使用した。

４）Ｔ３の測定 ガラス試験管（φｆｏｍｍ）に標準Ｔ、温溶液は検体血
清５０μβ、酵素標識ハプテン液１００μ４及びビオチ
ン結合抗体１５０μβを加え、３７℃、２分インキエベ
ートした。２分後に実施例１の３）項で調製したアビジ
ン−ＰＳＢ　１個を加え、更に８分間インキュベートし
た後、生理食塩水２ｍβを加え吸引洗浄を３回繰り返し
た。最後の洗浄液を除いた後、酵素基質液として０．１
ｍＭの４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクト
シドを含む０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７，０を０．３
＋＋＋Ｊ加え、３７℃、５分間インキュベートし、　０
．１Ｍグリシンナトリウム緩衝液（ｐＨ０，３）　１．
０ｍｇを加え反応を停止させた後、励起波長３６０ｎｍ
　、発光波長４２０正にて蛍光測定を行なった。結果を
表２に示す。

参考例２ Ｔ、の従来技術による測定 ｌ）抗体−ＰＳＢの調製 実施例２の２）項で使用した精製抗Ｔ、抗体を０．１Ｍ
リン酸緩衝液、ｐＨ７，３に溶解し、２８０ｎｍにおけ
る吸光度が０．００２となるように濃度を調整した。

この溶液１００ｍＪｉ中にＰＳＢ　８００個を入れ、３
７℃、１６時間インキュベートし、同緩衝液で洗浄して
抗体−ＰＳＢを得た。

２）その他試薬 酵素標識ハプテン、標準Ｔ３溶液は実施例２で示したも
のを使用した。

３）Ｔ、の測定 標準Ｔ３溶液又は検体５０μβ、酵素標識ハプテン１０
０μβ、緩衝液８１５０μβ及び抗体−ＰＳＢ　１個を
試験管に加え、３７℃で２時間インキュベートした。そ
の後実施例と同様に洗浄、酵素反応、蛍光測定を行なっ
た。結果を表２に示す。

表２　実施例２及び参考例２における丁、標準曲線（蛍
光強度、２重測定の平均） 〔発明の効果］ 本発明の免疫測定法では、測定対象物と抗体試薬との抗
原・抗体反応が液相中で行なわれるので、この反応が短
時間のうちに迅速に進む、その結果、試料と抗体試薬と
の反応に長時間を要しないため、全測定時間が大幅に短
縮され得る。

本発明の免疫測定法では、測定対象物と抗体試薬との反
応以外の抗原・抗体反応（ハプテンと抗体の反応も含む
）、例えば標識化抗体と測定対象物との反応、Ｐ４２化
抗原もしくはハプテンと抗体試薬との反応に液相中での
反応を必要に応じて更に利用することにより、上記と同
様の理由で、測定時間を更に短縮できる。

一方、従来のＥＩＡ、ＲＩＡ、　ＦＩＡ等のへテロジニ
アスイムノアッセイにおいて最も時間の要するステップ
、言い換えれば律速段階は固相に不溶化された抗体と、
抗原、ハプテンまたはそれらの複合体との反応である。

従って、この反応を速める必要があり、この目的のため
現在まで種々の工夫がなされてきた。例えば反応中に振
どう操作を加えることなどはその代表的なものである。

しかし、基本的に同相・液相間の抗原抗体反応には、そ
の反応速度に限界があり、同相・液相間での抗原・抗体
反応を用いる免疫測定法では、全測定時間の短縮に限界
があった。

本発明の免疫測定法では、１ｌＩ１１定対象物と抗体試
薬の複合体の標識を利用した検出が、複合体を同相に固
定し、未反応物を除いた状態もしくは未反応物の濃度を
効果的に減少させた状態で行なわれるので、標識を利用
した検出を高感度で行なうことができる。

本発明によれば、従来のへテロジニアスイムノアッセイ
の高感度性を効果的に応用し、かつ全測定時間が大幅に
短縮された免疫測定法を提供することができる。

本発明によれば、低分子量体のみならず高分子量体の短
時間で高感度な測定にも好適な免疫測定法が提供され得
る。

特許出願人　　三井東圧化学株式会社

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）ａ）測定対象物を含む試料と、測定対象物と特異的
   に反応し、かつ固体担体に固定し得る固定化用抗体を、
   測定対象物と固定化用抗体の複合体を形成させるために
   反応させる過程と、 ｂ）過程ａで生じた複合体を、該複合体に含まれる固定
   化用抗体を利用して固体担体に固定する過程と、 ｃ）固体担体に固定された複合体を標識を利用して検出
   する過程とを含む免疫測定法。 ２）測定対象物が抗原またはハプテンである請求項１に
   記載の免疫測定法。 ３）固定化用抗体が固体担体に結合したアビジンとの結
   合により担体に固定され得るビオチン化抗体である請求
   項１または２に記載の免疫測定法。 ４）標識が、酵素、蛍光物質、発光物質またはラジオア
   イソトープである請求項１〜３のいずれかに記載の免疫
   測定法。 ５）ａ）測定対象物を含む試料と、測定対象物と特異的
   に反応し、かつ固体担体に固定し得る固定化用抗体と、
   測定対象物と特異的に反応する標識化抗体とを反応させ
   る過程と、 ｂ）過程ａで生じた固定化用抗体−測定対象物−標識化
   抗体複合体を固体担体に固定化用抗体を利用して固定し
   、該複合体を未反応の標識化抗体と分離する過程と、 ｃ）固体担体に固定された複合体を該複合体に含まれる
   標識を利用して検出する過程と を含むことを特徴とする免疫測定法。 ６）測定対象物が抗原またはハプテンである請求項５に
   記載の免疫測定法。 ７）固定化用抗体が固体担体に結合したアビジンとの結
   合により固体担体に固定され得るビオチン化抗体である
   請求項５または６に記載の免疫測定法。 ８）標識化抗体が、酵素、蛍光物質、発光物質またはラ
   ジオアイソトープが結合した抗体である請求項５〜７の
   いずれかに記載の免疫測定法。 ９）複合体の形成が、試料と固定化用抗体を反応させ、
   得られた反応生成物に標識用抗体を反応させることによ
   り行なわれる請求項５〜８のいずれかに記載の免疫測定
   法。 １０）複合体の形成が、試料と標識化抗体とを反応させ
   、得られた反応生成物に固定化用抗体を反応させること
   により行なわれる請求項５〜８のいずれかに記載の免疫
   測定法。 １１）複合体の形成が、試料と標識化抗体と固定化用抗
   体とを同時に反応させることにより行なわれる請求項５
   〜８のいずれかに記載の免疫測定法。 １２）ａ）測定対象物に特異的に反応し、かつ固体担体
   に固定し得る固定化用抗体に対して、固定化用抗体に特
   異的に標識化抗原またはハプテンと測定対象物を含む試
   料とを競合反応させる過程と、ｂ）過程ａで生じた複合
   体を固体担体に固定することにより、未反応の標識化抗
   原またはハプテンを該複合体と分離する過程と、 ｃ）固体担体に固定された標識化抗原またはハプテンと
   固定化用抗体の複合体を該標識を利用して検出する過程 とを含むことを特徴とする免疫測定法。 １３）測定対象物が抗原またはハプテンである請求項１
   ２に記載の免疫測定法。 １４）固定化用抗体が、固体担体に結合したアビジンと
   の結合により固体担体に固定され得るビオチン化抗体で
   ある請求項１２または１３に記載の免疫測定法。 １５）標識化抗原またはハプテンが、酵素、蛍光物質、
   発光物質またはラジオアイソトープが結合した抗原また
   はハプテンである請求項１２〜１４のいずれかに記載の
   免疫測定法。