JPS6336151A - 微粒子の螢光強度測定による定量方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、物質同志の特異的な結合、例えば抗原・抗体
反応を利用した定早ー力法に関する。

（従来の技術） 医療分野における微叶分析の手法として免疫学的反応を
利用した４１１１定法は、すでに定，１７シており、そ
の中でもＬ流はラジオ・ｒム／アンセイ（ＲＩ　Ａ）で
ある。ＲＩＡは、１９５９年バーンン、ヤロウらによっ
て、インスリンの測定法として開発されたのが最初であ
り、その後爆発的に普及した。しかしラジオアイソトー
プの取り扱い、専用の設備、廃棄の際の安全性、あるい
は標識化合物の寿命等の問題も従来からクローズアップ
されており、ＲＩＡの代替として非放射性の標識法につ
いての研究がさかんに行われてきた。感度的に匹敵する
ものとして１９７１年にエンザイムイムノア。

セイ　（Ｅ　Ｉ　Ａ）が登場し、ＲＩＡに代わるものと
して注目を浴びてきた。確かに測定項目によってはＲＩ
Ａと同程度、あるいはそれ以−４二の感度を持つことが
報告されているし、ＲＩＡとは違い抗原抗体結合型と遊
離型との分離、いわゆるＢ／Ｆ分離の必要かないホモジ
ニアスな系での４１１１定も可能であるという特長があ
るが、生物学的反応を用いるといった不安定な要素や、
相対的に見た感度。

煩雑さなどの問題もあり、今一つＲＩＡＩことって代わ
るだけのものがないのが現状であろう。ラジオアイソト
ープの代わりに螢光プローブを用いたのが螢光イムノア
ッセイ（Ｆ　Ｉ　Ａ）である。感度的には、ＲＩＡに今
−歩およばないが、安全性の点で問題がなくＲＩＡと同
様の１＋７理で使用できる上に、Ｂ／Ｆ分蕩の必要がな
いホモジニアスな系での３１１１定も可能なため、欧米
諸国では非常によく利用されている。

医療分野において、疾病の発生、進行１＝　、治療効果
等を知る上での特定の生体内物質（マーカー）の変化は
非常に重要な意味を持つ。例えば腫瘍マーカーならば、
ＣＡ　−１２５、ＣＡ　−１９−９、ＡＦＰ、ＣＥＡな
どを始めとして、かなりの数が知られているが、すべて
の腫瘍に共通で、しかも１？−期発見の手助けとなるよ
うなマーカーは現在までに知られていない。したがって
、検査する際、腫瘍存在のｉｉ（能性、発生部位等を正
確に把握するためには、多項目のマーカーについて検査
し、総合的に拘断するしかてたてがない。ところが現状
では、複数のデーターが知りたい場合、その数だけ測定
を行うしかなく、採血の際の患者の苦痛、検査のために
要する手間５時間が増大するばかりであった。

（発明が解決する問題点） 本発明は、上記問題点を解決するためになされたもので
あり、これまでのＦＩＡでは困難であった、検体中の被
Ｘ１ｌｌ定物質量の高感度かつ同時多項目ｘｌｌ＋定法
を提供することをｌ］的とする。

（問題点を解決するための手段及び作用）本発明は固相
を用いたＦＩＡのいわゆるサンドウィッチ法の改善であ
り、固相として均−粒径微粒子群を用い、その粒子一つ
一つの螢光活性を分析することを特徴としており、その
要旨は検体中に含まれているｎ種の被測定物質のそれぞ
れの量を、被Ｘ１ｌ定物質のそれぞれと特異的に結合す
るｎ種の感応物質を担持させた微粒子を担体として利用
してＡｌ１１定する方法であって、粒径の大きさによっ
て及び／又は螢光物質による標識づけによってｎ種に判
別できる該微粒子を担体として用い、各々の種類の１目
体にそれぞれの被Ｘ１ｌｌ定物質と特異的に結合する前
記ｎ種の感応物質をそれぞれ拘持させたものを試薬とし
、ｎ種の被測定物質を含む検体と混合し、反応を十分行
なわせたのち、担体上に結合した被測定物質に螢光活性
を持たせ個々の微粒子の螢光強度をΔＩＩ＋定すること
により被Ｘｌｌ定物質の定量を行なうことを特徴とする
微粒子の螢光強度１＋１１定による定量方法を提供する
ことにある。

ここで、ｎは、自然数であるが１２以上の自然数の場合
に特に顕著な効果を発揮する。

粒子」二の感応物質と被測定物質の間の特異的な反応、
さらに、粒子」二に結合した被Ｍ１６定物質に螢光活性
を持たせるための特異的な結合反応の代表的なものは抗
原抗体反応であるが、それ以外でもホルモンとレセプタ
ー、糖とレクチン、アビジンとビオチン、　ＩｇＧ分画
とＰｒｏｔｅｉｎ　Ａなどの反応も利用が可能である。

抗原抗体反応を例にとり、さらに詳しく説明する。Ａ（
１１定対象が抗原となり得るもの（ハブテン等も含む）
であれば、それに対応する抗体を微粒子に担持させてお
く。′測定対象によっては、抗原・抗体が逆の組み合わ
せでもよい。

本発明では、複数の物質を、同時に定量する為に微粒子
（１〜１００座程度の粒径のそろったもの）を予め、複
数のグループに判別できるよう（こ構成しておく。その
方法の一つは、粒径を複数のレベルにそろえておくこと
である。また粒子を螢光１勿質で標識づけする場合、螢
光物質の有・無又は濃度、螢光の種類などにより、複数
のグループに判別できる。そして、両者を組み合わせる
ことにより、さらに多くの粒子群の判別が可能である。

微粒子としては、例えば赤血球などの細胞、金属、リボ
ソームなどのマイクロカプセル、ポリスチレン等のラテ
ックス粒子等で、粒径１〜１００　用程度のものが利用
できる。

微粒子に所定の感応物質、例えば抗体を担持させるには
物理的に吸着させる方法、微粒子上の官能基を利用して
化学的に結合させる方法などが知られている。

理解を容易にするため、まずｎ＝１を例にとって説明す
る。

均一粒径の微粒子に特定の抗体Ｂを担持する。

Ｂは被測定特質Ａと特異的に結合するものとする。一方
で、やはりＡと特異的に結合する抗体（以下第２抗体と
いう）を螢光標識したちのＢ“を作製しておく。

Ｂを担持した試薬とＡを含有するサンプルを混合する。

ＡとＢの反応により、結果的に粒子」−にＡが結合する
。さらに第２抗体Ｂ゛を反応させることにより、粒子」
−にＡの量に応じたＢｏが結合することになる。したが
ってサンプル中にある被Ｗｌｌ定物質の敬に応じた螢光
活性が粒子に与えられることになるわけである。

被測定物質が複数（ｎ個）の場合、ｎ種の区別し得る粒
子各々にＡビ・・・・・Ａｎに対する抗体Ｂ１・・・・
・・Ｂｎを別々に担持する。そして、Ａ１・・・・・・
Ａｎに対する螢光標識抗体即ち第２抗体Ｂ゛ビ・・・・
・Ｂ’　ｎを作製しておく。ただし、この際Ａビ・・・
・・ＡｎとＢビ−−−−・Ｂ　ｎあるいはＢｏビ・−・
Ｂ’　ｎは各々免疫学的交叉反応がないことが必要であ
る。操作は前述のｎ＝１の時と同様であり、最終的にｎ
種の各粒子の螢光強度を測定することにより、Ａ１・・
・・・・Ａｎの定量ができるわけである。

なお、本発明については、粒子どうしの非特異的な凝集
、あるいは抗原抗体反応による凝集を極力防がねばなら
ず、そのために単クローン性抗体を用いるか、機械的な
刺激によって簡単に分散するような比較的大きな粒子を
用いるとか、或いは粒子濃度を稀薄にしておくことが好
ましい。

微粒子のグループの判別法、螢光強度のΔ１１定法には
、顕微鏡測光なども利用できるが、好ましい実施態様の
一つとしては、これらの粒子を一つずつ、フローサイト
メトリー法で測定する方法を挙げることができる。

フローサイトメトリー法とは、主として光学機器分析に
関するものであり粒子を１個ずつ流し、粒子にレーザー
光などをあてて、その散乱光をＡ１１定することにより
、粒子の大きさ、色、或いは、予め粒子を螢光物質等で
標識づけしておき、その螢光強度Ｗｌｌ！定等により粒
子の形質を測定するものである。又、いわゆるコウルタ
ーの原理により、粒子の容址（コウルターポリウムとい
う）を電気的にＪ１１定する方法によるもの、これと光
学Ｘ＋１定とを合わせたものも利用されている。

粒子をｎ個のグループへ判別するには、例えば粒子径で
３グループ、螢光色素を付着したものとさせない粒子と
を調整すれば合計６グループの粒子を調整できる。この
場合、６種の抗体を各グループの粒子にそれぞれ担持さ
せた試薬を、検体と接触させ、サンドウィッチ方式によ
りさらに前記螢光物質とは異った種類で標識された６種
のｆｐ”ｆ、　２抗体を、各グループの粒子へ別々に結
合させた測定液をコウルターポリウムａｌｌｌ定機能と
螢光強度Ｍ１１定能とを併せもった公知のフローサイト
メーターで測定すると、粒子径と粒子につけた螢光の有
無とにより粒子のグループ分けが出来る。

被４１１１定物質の量は、第２抗体を標識づけした螢光
物質の螢光強度′Ａ１１定により行われる。両螢光物質
は、螢光強度Ｘ１ｌｌ定の波長を選定することにより区
別され、Ａ１の濃度が、微粒子のクループ毎即ち被４１
１１定物質ごとに測定できる。

尚、このグループ分けには、特願１看Ｇｏ−１３０８８
２に示されている方法が利用できる。

（実施例１） ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈｃＧ）の定量（１）試薬
の調整 ポリスチレンビーズ（平均粒径し］）固型分として２０
ｍｇをリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳｐＨ７，４）で２回洗
浄する。それに、抗ｈｃｃモノクローナル抗体（ａｎｔ
ｉ　ｈＣＧ　Ｍａｂ）　　２００μｇ／　ｍｌを２ｍ文
加え、３７°Ｃで１時間ゆるやかに撹拌した後４°Ｃで
１晩放置する。ＰＢＳで遠心分離にて２回洗浄した後、
保護コロイドとして１％の牛血情アルブミン（ＢＳＡ）
を含むＰＢＳ５ｍ父に懸濁し、固型分０．４％のラテッ
クス試薬として試験に供す。

（２）検量線の作成 」−記の試薬３０ｇｆｌに異なる濃度のｈｃＧを含む標
準液を１００ｇ父加えよく混合する。１時間室温で振盪
した後、ウサギの抗ｈｃＧ血清（ＩｇＧ分画）　　ＩＯ
Ｑｇｇ／　ｆｆ１ｌ　　５０ｇＱを加え混合する。再び
１時間室温で振盪した後。

ＦＩＴＣ標識したヤギの抗つサキ　ＩｇＧ血情（ＩｇＧ
分画）　　２００ｔＬｇ／　ｍｆ）−を５０ｇ、ｕ加え
、混合し、さらに１時間室温で振盪する。得られた反応
液をＰＢＳで約１０倍に希釈した後フローサイトメトリ
ー法によって分析する。得られた検１を線を第１図に示
す。

（実施例２） ヒトｉｇＧ、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の同時Ｗｌ
ｄ定 （１）試薬の調整 ａ）ヒト　ＩｇＧ分析用試薬 ポリスチレンビーズ（平均粒径？ｇｍ　）固型分として
１０ｍｇをリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳｐＨ７，４）で２
回洗浄する。それにアフィニティー精製した抗ヒ）　　
ＩｇＧ抗体（ヤギ２００μｇ／　ｍｌ）５ｍ文を加え、
３７°Ｃで１．５時間ゆるやかに撹拌する。　　ＰＢＳ
を用いて遠心分離にて２回洗浄した後、保護コロイドと
して１％のＢＳＡを含むＰＢＳ　５　ｍｌに懸濁し固型
分０．２％のラテックス試薬を得る。

ｂ）　ＩＳＡ分析用試薬 ポリスチレンビーズ（平均粒径１０ｐｍ）固型分として
ｌ０ｍｇと、ヤギの抗Ｈ３Ａ抗体（ｒｇｃ分画）２００
ｇｇ／　ｍｌを用いて、ａ）と同様の操作を行い、０．
２％のラテックス試薬を得る。

Ｃ）混合試薬 ｄ）、ｂ）の等量混合物（各々０．１％）を同時２項目
測定用試薬として試験に供する。

（２）検量線の作成 異なる濃度のＩｇＧ、　　ＨＳＡを含む標準液１００８
Ｌｌと上記混合試薬１００．！；ｌを混合し、室温で１
時間ゆるやかに撹拌する。その後ＦＩＴＣ−標識抗血清
（抗Ｈ３Ａ、ＩｇＧともに抗体換算で１１００ｐＬ／ｆ
ｆ１文）　　Ｉｏｏ、Ｍを加え混合した後、１時間室温
でゆるやかに撹拌する。得られた反応液をＰＢＳで５倍
希釈し、フローサイトメトリー法によって分析する。得
られた検量線を第２図に示す。

（効果） ２に発明の方法により、検体中に含まれる１又は複数の
被測定物質を同時に高感度で１１１１定できる。

この分析の好ましい実施態様は微粒子の大きさ、螢光活
性の同時測定をする機能をもつフローサイトメトリー（
ＦＣＭ）の利用である。　ＦＣＭを利用することによっ
て、粒径の差、粒子自体に持たせた螢光色素の種類、量
の差、等により微粒子を区別し、その各々について、螢
光活性を′Ａｌｌ定することが可能になり、１種又は２
種以上の被Ｗｉｌｌ定物質のｒｉＹを同時に高感度で測
定できる。

こうして同時複数項目のＸＩ一定が可能になると、総合
的な診断をする上で大きな手助けになり、偽陽性、偽陰
性のような誤診断の減少、また各疾患の早期発見などに
大きく寄与−する。

【図面の簡単な説明】

第１図はｈＣＧの濃度と螢光強度との関係、第２図は、
　ＩｇＧ及びＩＳＡの濃度と螢光強度との関係を示すΔ
１１１００グラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、検体中に含まれているｎ種の被測定物質のそれぞれ
   の量を、被測定物質のそれぞれと特異的に結合するｎ種
   の感応物質を担持させた微粒子を担体として利用して測
   定する方法であって、粒径の大きさによって及び／又は
   螢光物質による標識づけによってｎ種に判別できる該微
   粒子を担体として用い、各々の種類の担体にそれぞれの
   被測定物質と特異的に結合する前記ｎ種の感応物質をそ
   れぞれ担持させたものを試薬とし、ｎ種の被測定物質を
   含む検体と混合し、反応を十分行なわせたのち、担体上
   に結合した被測定物質に螢光活性を持たせ個々の微粒子
   の螢光強度を測定することにより被測定物質の定量を行
   なうことを特徴とする微粒子の螢光強度測定による定量
   方法。 ２、担体上に結合した被測定物質に螢光活性を持たせる
   手段として、被測定物質と特異的に結合する感応物質の
   螢光標識体を用いることを特徴とする特許請求の範囲第
   １項記載の方法。 ３、担体上に結合した被測定物質に螢光活性を持たせる
   手段として、まず感応物質を反応させ、さらにその感応
   物質と結合するもう１つの感応物質の螢光標識体を用い
   ることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方法。 ４、特異的な結合が抗原・抗体反応であることを特徴と
   する特許請求の範囲第１項記載の方法。 ５、微粒子の螢光強度を、フローサイトメトリーによっ
   て測定することを特徴とする特許請求の範囲第１項又は
   第２項記載の方法。