JPH02124902A - 血液凝固抑制剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、直鎖β−１，３−グルカン誘導体の硫酸エス
テルおよびその用途に関する。

従来の技術 血栓症は悪性腫瘍、動脈硬化症、糖尿病等の疾患に伴っ
て起る場合が多い。近年、これらの疾患の増加に伴って
血栓症は増加傾向にある。

現在血栓症の治療に有効な薬剤としては、デキストラン
硫酸あるいはヘパリン等が知られている。

動物組織中に存在するムコ多糖類の１種であるヘパ１フ
ンは強い抗血液凝固作用を有しているが、製品の品質が
一定でなく、また構造が複雑で単離力法も煩雑である。

また、最近になり、通常のヘパリンよりも出血性および
血小板減少の危険性が少ないとされている低分子量のへ
バリンを得るために、ヘパリンの分画およびそれらの断
片化物を取得する試みがなされているが、さらに精製が
類９ｆｆｆｌ化している。

カードラン（「加熱凝固性多糖類ＰＳＪとしても知られ
ている）は、アルカリ土類金属もしくはアグロバクテリ
ウム属に属する微生物菌株が生産する直鎖β−１，３−
結合のみを有する水不溶性、加熱凝固性のグルカンとし
て知られている［特公昭４３−７，０００号、特公昭４
８−３２．６７３号、特公昭４８−３２，６７４号各公
報］。

カードランの生産菌であるアルカリゲネス・フェカリス
・バラエティ・ミクソゲネス （Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　　ｆａｅｃａｌｉｓ　　ｖ
ａｒ、　ｍｙｘｏｇｅｎｅｓ　）ＮＴＫ−ｕ株、アグロ
バクテリウム・ラジオバクタ（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ　　ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）株およびアグロバク
テリウム・ラジオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ
＋ｎｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）Ｕ　　ｌ　９株はそれぞ
れＡＴＣＣ−２１６８０、−６４６６および−２１６７
９としてアメリカン・タイプ・カルチュア・コレクショ
ン・カタログ・オブ・ストレインズ（ＡＴＣＣ・Ｃａｔ
ａｌｏｇｕｅ　　ｏｆ　５ｔｒａｉｎｓ）　ｔ　＋第１
５版、１９８２に記載されているリスト収載株である。

カードランの部分加水分解物の性状およびその製造法は
、既に特開昭５５−８３７９８号公報に詳細に記載され
ている。

発明が解決しようとする課題 本発明者らは、カードランの各種誘導体の生理学的性質
について検討する過程において、これらのスルホン化物
（硫酸エステル）が強力な血液凝固抑制作用を有するこ
とを見い出し、さらに鋭意研究を重ね本発明を完成する
に至った。

課題を解決するための手段 本発明は、直鎖β−１，３−グルカンの硫酸エステルを
含有してなる血液凝固抑制剤、およびカードランの部分
加水分解物の硫酸エステルを提供するものである。

本発明に用いられる水不溶性、加熱凝固性の直鎖β−１
，３−グルカン（天然型）は上記文献に詳述されている
通り、アルカリ土類金属もしくはアグロバクテリウム属
に属する菌の培養によって生産され、カードランとして
知られているものである。また、直鎖β−１，３−グル
カンの低重合体は培養によって得られたβ−１，３−グ
ルカンの加水分解によって製造されるもので同じく直鎖
β−１，３−グルカン構造を有している。

すなわち、本発明における直鎖β−１，３−グルカンは
式 ［式中、ｎは４〜約１０００の整数を示す］で表わされ
る化合物であり、本発明に用いられる直鎖β１．３−グ
ルカンの硫酸エステルは、これらの化合物の中間の単糖
の３つの水酸基および両端の単糖の水酸基がスルホン化
されたものであり、その平均の置換度（ＤＳ：　Ｄｅｇ
ｒｅｅ　ｏｒＳｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）が各単糖当た
り０．５〜３のものが通常用いられ、好ましくはＤＳが
１〜２のものが有利に用いられる。

また、上記β−１，３−グルカンとしては、平均重合度
（ＤＰ：　Ｄｅｇｒｅｅ　　ｏｆ　　Ｐｏｌｙｍｅｒｉ
ｚａｔｉｏｎ）約１０００以下のものであればいずれで
もよいが、とりわけその部分加水分解物であるＤＰが６
〜約３００のもの、とりわけ１５〜約２００のものが有
利である。

なお、式（１）におけるｎと叶は、ＤＰ−２＝ｎの関係
にある。

本発明における直鎖β−１，３−グルカンの硫酸エステ
ルは、その塩としても用いることができ、例えばアンモ
ニウム塩、アルカリ金属塩（ナトリウム塩、カリウム塩
など）などの塩基性無機物との塩が挙げられる。

化合物（１）の硫酸エステルの製造法について以下に述
べる。

加水分解手段としては、従来からよ（知られている酸加
水分解法、アルカリ加水分解法もしくはβ−１，３−グ
ルカナーゼによる酵素分解法などが挙げられる。

反応混合物からβ−１，３−グルカン低重合体を分離す
るには、多糖類、寡糖類の精製や分画に用いられる種々
の手段、たとえば酸性における沈澱法、エタノール添加
による沈澱法、ゲルろ適法などを用い得る。このような
手段により所望の平均重合度を持つ各種の低重合体を分
離することができる。なお、β−１，３−グルカンおよ
びその低重合体の平均重合度は、マナーズらの方法［カ
ーボハイドレート・リサーチ（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔ
ｅ　　Ｒｅｓ、）。

土７，１０９．（１９７１）］によって求めることがで
きる。

β−１，３−グルカン（天然型）の平均重合度は３００
−８００の場合が多く、低重合体の平均重合度はその反
応条件を変えることによって、６〜約３００のものを製
造することができる。

直鎖β−１，３−グルカンおよびその低重合体はピリジ
ンホルムアミドまたはジメチルホルムアミドの存在下に
、硫酸化剤たとえばクロルスルホン酸、無水硫酸などを
作用させるか、無水硫酸と有機塩基たとえばピリジン、
ジメチルホルムアミド　トリメチルアミン　ジメチルア
ニリン等との複合体を反応させることによって硫酸化す
ることができる。［ジャーナル・オブ・バイオロジカル
ケミストリー（Ｊ、　　Ｂｉｏｌ、　　Ｃｈｅｍ、）、
　２３９　、２９８６（１９６４年）］。

反応生成物はアルコールまたはアセトンなどの有機溶媒
を反応液に添加して生ずる沈澱を分取するか、セファデ
ックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ　　２５などによるゲル
ろ適法または透析法などの方法によって精製、取得する
ことができる。

なお上記した直鎖β−１，３−グルカンの硫酸エステル
のうち、天然型直鎖β−１，３−グルカン（カードラン
）の部分加水分解物の硫酸エステルは、文献未載の新規
物質である。

作用 直鎖β−１，３−グルカンの硫酸エステルの血液凝固抑
制能をフィブロメーター（アメリカ、ＢＢ、Ｌ社）を用
いて測定した。

（１）材料 （ａ）ＳＤう、トの血漿 （ｂ）フィブリノーゲン溶液二６５％凝固のウシフィブ
リノーゲン（生化学工業）を０５％になるように緩衝液
に溶解して用いた。

（ｃ）トロンビンＦｊｉ（１：ウシトロンビン（１００
０Ｕ／バイアル、持出製薬）を４ｕ／ｄになるように生
理食塩水に溶解して用いた。

（ｄ）試料溶液：各直鎖β−１，３−グルカンの硫酸エ
ステルを緩衝液に種々の濃度となるように溶解して用い
た。

（ｅ）緩衝液：０．０２Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐ＋−
１７，４）−生理食塩水 （２）測定法 あらかじめ３７°Ｃに保温した反応チューブに試料溶液
５０μｅ、う、ト血漿５０μＱおよびフィブリノーゲン
溶液２００μＣを添加して３７°Ｃで２分間保温したの
ち、１００μＱのトロンビン溶液を添加してフィブリン
が析出するまでの時間をフィブリノメーターにより測定
した。試料の血液凝固抑制活性は、試料溶液の代わりに
緩衝液を添加した時の凝固時間を２倍に延長させるに必
要な直鎖β−１，３−グルカンの硫酸エステルの濃度（
μｇ／ｄ）で示した。結果を第１表に示す。

直鎖β−１，３−グルカン　　　　血液凝固抑制活性５
４０（天然型）：１ １３　に１．４６ ６８：１．６１ ４５二１．４１ ２６：１．２２ ２．２ １．６ ２．１ ２．７ 本発明で用いられる直鎖β−１，３−グルカンの硫酸エ
ステルは、このように強力な血液凝固抑制作用を有して
いるので、血液凝固抑制剤として静脈炎、肺塞栓症や播
種性血管凝固症候群等の１ｍ血液凝固係る症状（血栓症
）の予防あるいは治療を目的として使用できる。さらに
、体外系ぐ腎の血液透析など）における血栓予防にも使
用できる。

本発明の血液凝固抑制剤は経口的または非経口的に投与
可能である。本発明における硫酸エステルは、所望によ
り錠剤、カプセル、散剤、頚拉剤、トローチ、串刺等の
剤型とすることが可能であり、注射剤、懸濁注射剤等の
剤型でも使用しうる。

本発明の直鎖β−１，３−グルカン硫酸エステルの投与
量は、有効に血液凝固を抑制し得る量であればよく、治
療される疾患の程度、患者の体重、投与経路および剤型
などにより変動し？ｌる。たとえば、静脈炎の治療のた
めには成人１日当たり０１ないし２０　ｍｇ／　ｋｇと
なる量を注射により投与する。投与回数は１日１回ない
し６回の範囲で適宜選択される。

本発明の直鎖β−１，３−グルカン硫酸エステルは、水
に対する溶解性が高く、低毒性であり、かつ相対的な血
液凝固抑制活性が高いので、有利に医薬品等として用い
ることができる。

実施例 以下に参考例および実施例を挙げて本発明をさらに具体
的に説明するが、本発明はこれらによって制限されるも
のではない。

参考例１ 平均重合度５４０のβ−１，３−グルカン（カードラン
）２．５ｇを１００ｄのジメチルホルムアミドに懸濁さ
せたのち、クロルスルホン酸１３．５ｇとトリエチルア
ミン１１．７ｇから合成した１２゜５ｇのトリエチルア
ミン−スルホン酸を添加Ｌ、氷水中で２４時間撹拌させ
ながら反応させた。反応液を０．５Ｍの重炭酸アンモニ
ウムに対して充分透析及凍結乾燥し、４．４ｇの目的物
を得た。得られたβ−１，３−グルカン硫酸エステルア
ンモニウム塩の平均置換度（ＤＳ）は１．０４であった
（硫黄含量１２．７％）。

実施例１ 平均ｆｆｉ合度５４０のβ−１，３−グルカンの８５％
ギ酸による部分加水分解（８０’Ｃ，３０分）によって
得られたβ−１，３−グルカン低重合体（平均重合度１
３１）２．５ｇを１００−のジメチルホルムアミドに懸
濁させたのち、１２．５ｇのトリエチルアミン−スルホ
ン酸を添加し、氷水中で２４時間撹拌させながら反応さ
せた。反応液を０，５Ｍの重炭酸アンモニウムに対して
充分透析及凍結乾燥して、３．９ｇのβ−１，３−グル
カン硫酸エステルアンモニウム塩を得た。得られた目的
物のＤＳは１．４６であった（硫黄含量１５．４％）。

実施例２ 平均重合度５４０のβ−１，３−グルカンの４Ｎ硫酸に
よる部分加水分解（６０°Ｃ，４時間）によって得られ
たβ−１，３−グルカン低重合体（平均型６度６８）２
．５ｇを１００ｄのジメチルホルムアミドに懸濁させた
のち、１２．５ｇのトリエチルアミン−スルホン酸を添
加し、氷水中で２４時間撹拌しながら反応させた。反応
液を０．０２Ｍ重炭酸アンモニウムで平衡化Ｌ　タ２　
、５　（１（Ｄ　５ｅｐｈａｄｅｘＧ２５　（ｆｉｎｅ
）カラムに負荷しゲルろ過を行った。

溶出液中の糖含量をフェノール硫酸法で分析し、糖両分
を集めて凍結乾燥し、４．０ｇのβ−１，３グルカン硫
酸エステルアンモニウム塩を得た。

得られた目的物のＤＳは１．６１であった。（硫黄含量
１６．２％）。

実施例３ 平均重合度５４０のβ−１，３−グルカンの８５％ギ酸
による部分加水分解（８５°Ｃ１３０分）によって得ら
れたβ−１，３−グルカン低重合体（平均重合度４５）
２．５ｇを１ｏｏｄのジメチルホルムアミドに懸濁させ
た後、１２．５ｇのトリエチルアミン−スルホン酸を添
加し、氷水中で２４時間撹拌しながら反応させた。反応
液を０．０２Ｍ重炭酸アンモニウムで平衡化した２、５
ａの５ｅｐｈａｄｅｘＧ　　２５　（ｆｉｎｅ）カラム
に負荷しゲルろ過を行った。

溶出液中の糖含量をフェノール硫酸法で分析した。

糖画分を集めて凍結乾燥し、２．７ｇのβ−１，３グル
カン硫酸エステルアンモニウム塩を得た。

得られた目的物のＤＳは１．４１であった（硫黄含量１
５．１％）。

実施例４ 平均重合度５４０のβ−１，３−グルカンの９０％ギ酸
による部分加水分解く９０°Ｃ１４０分）によって得ら
れたβ−１，３−グルカン低重合体（平均重合度２６）
２．５ｇを１５０ｄのジメチルホルムアミドに懸濁させ
た後、５０ｇのトリエチルアミン−スルホン酸を添加し
、氷水中で２４時間撹拌しながら反応させた。反応液を
実施例２と同様に処理し、６．１ｇのβ−１，３−グル
カン硫酸エステルアンモニウム塩を得た。得られた目的
物の面は１．２２であった（硫黄含量１４．０％）。

実施例５ 平均重合度５４０のβ−１，３−グルカンの９０％ギ酸
による部分加水分解（９５°Ｃ１４０分）によって得ら
れたβ−１，３−グルカン低重合体く平均重合度６）２
．５ｇを１５０〆のジメチルホルムアミドに懸濁させた
後、５０ｇのトリエチルアミン−スルホン酸を添加し、
氷水中で２４時間攪拌しながら反応させた。反応液を実
施例２と同様に処理し、５．６ｇのβ−１，３−グルカ
ン硫酸エステルアンモニウム塩を得た。得られた目的物
のＤＳは１．１２であった（硫黄素！ｊｔ１３．３％）
。

実施例６ 実施例２で得られたβ−１，３−グルカン硫酸エステル
アンモニウム塩１００　ｍｇ、塩化ナトリウム９ｇおよ
びベンジルアルコール９ｇを注射用蒸留水に溶解して全
量を１０００１１とする。この溶液を孔径０．２μｍの
メンブレンフィルターを用いて無菌ろ過し、無菌操作で
内容量５１のバイヤルに充てんしてゴム施栓を行ないア
ルミキャップて巻じめをして注射剤を作製する。

発明の効果 本発明の直鎖β〜１，３−グルカンの硫酸エステルは強
力な血液凝固抑制作用を持ち、血栓症の予防・治療に用
いることができる。

代理人　　弁理士　　岩　１）　　弘

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）直鎖β−１，３−グルカンの硫酸エステルを含有
   してなる血液凝固抑制剤。
2. （２）カードランの部分加水分解物の硫酸エステル。