JPH021261B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、酵素の特異的触媒作用を受ける基質
に対して電気化学活性を有し、基質の濃度を迅速
かつ簡便に測定することが可能で、しかも繰り返
し使用することのできる酵素電極に関するもので
ある。

酵素の有する特異的触媒作用を工業的に利用す
る試みの一例として、酵素反応系と電気化学反応
系を結びつけることにより、酵素と特異的に反応
する物質である基質の濃度を測定することが試み
られている。その一例として以下の(1)、(2)式に示
す様に、酸素を水素受容体とする酸化還元酵素、
例えばグルコースオキシダーゼの作用により、基
質例えばグルコースが酸化されてH₂O₂が生成し、
次にこのH₂O₂を白金電極などを用いて酸化し、
この時得られる酸化電流値からグルコースの濃度
を知ることができる。

グルコース＋O₂グルコースオキシダー
ゼ ―――――――――――→ グルコノラクトン＋H₂O₂ ……(1) H₂O₂→2H⁺＋2e＋O₂ ……(2) この原理を応用して繰り返し使用可能な基質濃
度測定用の酵素電極を構成するには、水溶性であ
る酵素を白金電極上またはその近傍に固定化する
必要がある。一方、この様な酵素電極を用いて基
質濃度を測定するにあたつては、被検物中に含ま
れる妨害物質が問題となる。例えば、血液中のグ
ルコースを測定する際には、その中に含まれる尿
酸、アスコルビン酸などの各種の共存物質が白金
電極上で直接電気化学的に酸化される。すなわ
ち、前記(2)式に示したH₂O₂の電極上での酸化の
際に、これら共存物質が同時に酸化されるため、
得られる電流値に誤差を与えることになる。

この様な妨害物質に対する対策の従来例として
は次のものがある。

(1) ２つの白金電極を使用し、一方の電極にのみ
酵素を固定化しておき、両方の電極で得られる
電流値を差し引くことにより、妨害物質の影響
を補償する。

(2) シリコーンゴム、セルロースアセテートなど
からなる妨害物質を阻止するための膜を白金電
極の前面（被検液側）に配置することにより、
尿酸、アスコルビン酸が白金電極へ拡散するの
を阻止する。

上記方法において、(1)では２つの白金電極の応
答性をうまく釣り合わせるのが大変困難であると
いう欠点を有する。また(2)の方法は簡単である
が、セルロースアセテートなどからなる膜そのも
のを使用するため、膜を使用しない場合と比較し
て、応答電流の低下（感度の低下）や応答速度の
低下は避けられないものであつた。

そこで、本発明者らは、以上に述べた諸点につ
いて改良すべく種々検討を重ねた結果、優れた特
性を有する酵素電極を見い出した。本発明の酵素
電極の特徴は、多孔質膜を用い、この膜の孔中あ
るいはさらに一方の膜面上にアセチルセルロース
層を形成し、他方の膜面上に直接白金等をコーテ
イングすることにより、過酸水素検知用電極を形
成し、他の膜面上に酵素を固定化した点にある。
すなわち、１枚の多孔質膜上に白金電極、固定化
酵素層、さらに尿酸、アスコルビン酸を阻止する
ためのアセチルセルロース層が各々形成されてい
る。

第１図に本発明の酵素電極の構成例を断面模式
図で示す。図中１は担体となる多孔質膜であり、
膜の孔中と膜面上にアセチルセルロース層２が形
成されている。膜面のアセチルセルロース層の上
に固定化酵素層３を形成し、反対側の膜面上に蒸
着、スパツタリングなどにより例えば白金などの
薄層４を形成し、全体として１枚の薄膜状として
いる。

この酵素電極を使用する際には、過酸化水素検
知用電極４に対して固定化酵素層３が被検液側に
なるように配置する。被検液中の基質は酵素の作
用でH₂O₂を生成し、このH₂O₂は膜中を拡散して
反対側の過酸化水素検知用電極４でアノード電流
として検出される。一方、尿酸、アスコルビン酸
などが共存する場合、これらの妨害物質の拡散
は、アセチルセルロース層の働きで阻止されるた
め、過酸化水素検知用電極まで到達するのは困難
である。

この様に、本発明の酵素電極は、妨害物質の影
響を効果的に減ずることができるとともに、過酸
化水素検知用電極を膜に直接形成しており、全体
として薄膜状であるので、応答速度、応答感度に
優れており、また使用中の膜の伸縮、変形等によ
つても応答特性はほとんど影響されず、安定した
応答を得ることができる。

使用する酵素は１種類に限定されることはな
く、酸素反応に際してH₂O₂を生成するものであ
れば複合酵素系であつても良い。また膜面上に形
成する過酸化水素検知用電極としては、白金以外
に、ルテニウムあるいはこれらの酸化物など、す
でに述べた目的に合う金属、金属酸化物であれば
良い。

担体として用いる多孔質膜としては、膜上に過
酸化水素検知用電極を形成することができ、水溶
液中での使用に際して、白金等との密着性が損な
われない様な材質のものが良い。この様な多孔質
膜としては、ポリカーボネート、ポリエチレン、
ポリプロピレン等の水に対して膨潤性を有しない
多孔質膜が最適である。

以下、本発明の実施例について説明する。

担体膜として、孔径2000Å、膜厚10μｍ、孔密
度３×10⁸個／cm²のポリカーボネート多孔質膜を
用いた。この膜の片側面をアセチルセルロースの
アセトン溶液に浸漬し、次に乾燥する。この操作
を数回繰り返すことにより、孔中と膜の片側面に
アセチルセルロース層を形成することができる。
得られた膜のアセチルセルロース層が形成されて
いない側の膜面上へ白金をスパツタし、数百〜数
千オングストロームの厚さの過酸化水素検出用電
極を形成した。次に、この白金形成面とは反対側
の膜面上に酵素としてグルコースオキシダーゼの
水溶液（濃度200mg／ml）を展開、乾燥し、グル
タルアルデヒド蒸気中にて固定化反応を行わせた
後、十分に水洗した。この様にして得られた本発
明による酵素電極をＡとする。

また比較のため、アセチルセルロース処理をせ
ずに、それ以外は上記Ａと同じ条件で作製した酵
素電極をＢとする。

上記の酵素電極を第２図に示す円筒形の電極ホ
ルダーに装着し、測定に供した。図中５は参照
極、６は対極、７は白金リードである。８は酵素
電極であり、膜の白金電極側はリード７に接して
おり、パツキン９を介してキヤツプ１０により樹
脂製の筒状本体１１に保持されている。また電極
ホルダー内は電解液１２で満たされている。

この電極ホルダーをPH5.6の緩衝液中に浸漬し、
酵素電極の電位を参照極に対しH₂O₂の十分な酸
化電位に設定した後、グルコースあるいはアスコ
ルビン酸を添加し、その濃度変化に伴う電流変化
（定常値）を測定した。Ａ，Ｂ各々の酵素電極に
ついて、電流増加量を第３図に示す。図中、実線
はグルコース濃度変化に対する応答特性、破線は
アスコルビン酸濃度変化に対する応答特性を示
す。図より明らかなごとく、本発明による酵素電
極Ａはアセチルセルロース処理なしの酵素電極Ｂ
に比較して、グルコースに対する応答性特性をほ
ぼ維持しており、かつアスコルビン酸の影響をほ
とんど受けないという特性を有することがわか
る。アスコルビン酸に対するこの様な優れた特性
は、尿酸、さらにはグルタチオンなどの妨害物質
に対しても同様であつた。また、本発明の酵素電
極においては、グルコースの添加後、H₂O₂の酸
化電流は10秒程度で定常値に達するなど、応答速
度においてもきわめて優れた特性を有するもので
あつた。

以上のごとく、本発明の酵素電極は優れた性能
を有するものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の酵素電極の構成例を示す断面
模式図、第２図は酵素電極を装着した電極ホルダ
ーを用いた電極系を示す縦断面図、第３図はグル
コースおよびアスコルビン酸について濃度と電流
増加量の関係を示す図である。 １……多孔質膜、２……アセチルセルロース
層、３……酵素、４……過酸化水素検知用電極。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 多孔質膜と、この多孔質膜の孔中あるいはさ
   らに一方の膜面上に形成したアセチルセルロース
   膜と、多孔質膜の前記一方の膜面上に固定化した
   酵素と、多孔質膜の他方の膜面上に形成した過酸
   化水素検知用電極とを有することを特徴とする酵
   素電極。 ２ 前記多孔質膜が、水に対して膨潤性を有しな
   いものである特許請求の範囲第１項記載の酵素電
   極。