JPH023944B2 - - Google Patents

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JPH023944B2
JPH023944B2 JP57029306A JP2930682A JPH023944B2 JP H023944 B2 JPH023944 B2 JP H023944B2 JP 57029306 A JP57029306 A JP 57029306A JP 2930682 A JP2930682 A JP 2930682A JP H023944 B2 JPH023944 B2 JP H023944B2
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JP
Japan
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electrode
enzyme
porous membrane
membrane
glucose
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JP57029306A
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JPS58146847A (ja
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Shiro Nankai
Akihiro Imai
Mariko Nakatsuka
Takashi Iijima
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Panasonic Holdings Corp
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Matsushita Electric Industrial Co Ltd
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    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/001Enzyme electrodes

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  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
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  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
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  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、基質の特異的触媒作用を受ける基質
に対して電気化学的活性を有し、基質の濃度を迅
速かつ簡便に測定することが可能で、しかも繰り
返し使用することのできる酵素電極に関する。さ
らに詳しくは、被検液中の基質濃度を酵素反応で
生成する過酸化水素の酸化電流により測定すする
際に、この被検液中に含まれ、電気化学的検知を
妨害する種々の妨害物質の影響を除去することの
できる酵素電極に関する。
基質濃度を、酵素反応によつて生成する過酸化
水素(H2O3)のアノード酸化により測定する一
例として、グルコースの場合について以下に述べ
る。
(1)式に示す様に、グルコースオキシダーゼの作
用によりグルコースが酸化されてH2O2が生成し、
次にこのH2O2を(2)式の様に白金電極などを用い
て酸化し、この時得られる酸化電流値から基質で
あるグルコースの濃度を知ることができる。
グルコース+O2グルコースオキシダーゼ ―――――――――――→ グルコノラクトン+H2O2 ………(1) H2O2白金電極 ――――→ 2H++2e+O2 ………(2) この原理を応用して繰り返し使用可能な基質濃
度測定用の酵素電極を構成するには、例えば上記
例では、水溶性であるグルコースオキシダーゼを
白金電極などの集電体上又はその近傍に固定化す
る必要がある。酸素の固定化法としては、アセチ
ルセルロースなどの有機高分子膜を固定化担体と
する方法など、種々の方法が知られており、これ
らの固定化酸素膜を白金電極に重ね合わせるなど
の方法により酵素電極が構成されている。
一方、上記の様な酵素電極を用いて基質濃度を
測定するにあたつては、被検液中に含まれる妨害
物質の問題がある。例えば、血液中のグルコース
を測定する際には、その中に含まれる尿酸、アス
コルビル酸など各種の共存物質が電極上で直接電
解酸化される。すなわち、先の(2)式で示した
H2O2の電極上での酸化の際に、これら共存物質
が同時に酸化されるため、得られる電流値に誤差
を与えることになる。これら妨害物質に対する対
策を施した酵素電極の従来例としては、2つの白
金アノードを使用し、一方にのみ酵素を固定化
し、両方の電流値を差し引くことにより妨害物質
の影響を補償する方法がある(米国特許第
3539455号)。しかし、この方法は2つの電極(白
金アノード)の応答性をうまく釣り合わせるのが
大変困難であるという欠点を有する。
他方、セルロースアセテート、シリコーンゴム
などからなる膜を白金アノードの被検液側に配置
することにより、尿酸、アスコルビン酸などの白
金極への拡散を阻止しようとする例として、米国
特許第3979274号、第4240889号がある。この例に
述べられている方法の妨害物質に対する効果は、
上記例のH2O2と妨害物質に対する選択性に依存
しており、完全に妨害物質を阻止することは困難
である。ある程度の膜厚を大きくすれば効果も大
きくなるものと考えられるが、逆に反応電流の低
下(感度の低下)や応答速度の低下を招くことに
なる。
本発明は、以上に述べた諸点について改良した
優れた特性を有する酵素電極を提供するものであ
る。
本発明の酵素電極は、第1の電極と第2の電極
の2つの電極から構成される。すなわち、第1の
電極は酵素反応に関連して生成されるH2O2を検
知するためのものであり、第2の電極は第1の電
極におけるH2O2の検知を妨害する物質、例えば
尿酸、アスコルビン酸を予め電気化学的に酸化す
るためのものである。これら2つの電極は、それ
ぞれが多孔質膜の両面上に直接形成される。
第1図に本発明の酵素電極について、一実施例
を拡大断面模式図で示す。図中1は担体となる多
孔質膜であり、膜の一方の側にH2O2を検知する
ための第1の電極2を形成し、他方の側には妨害
物質を電解除去するための第2の電極3を形成し
ている。さらに酵素を多孔質膜の孔4中および第
1の電極側に一体固定化し、固定化酵素層5を形
成し、全体として薄膜状の酵素電極としている。
第1の電極および第2の電極については、多孔質
膜上へ白金などの電極材料を蒸着、スパツタリン
グなどの方法により形成する。また両電極の位置
関係については、被検液中の妨害物質が第1の電
極で酸化されるのを防止するために、第2の電極
は第1の電極に対して被検液側になるように配置
する。例えば、グルコース濃度の測定においては
被検液中にアスコルビン酸が共存する場合、第2
の電極電位をアスコルビン酸の十分な酸化電位に
設定しておくことにより、事前に電解酸化するこ
とができる。グルコースは直前電解を受けにくい
ため、第2の電極を通過して固定化酵素層5(こ
の場合はグルコースオキシダーゼ)に達し、酵素
反応によりH2O2を生ずる。生成したH2O2は第1
の電極上で酸化され、最終的に被検液中のグルコ
ース濃度に依存した電流が得られる。この様に、
本発明の酵素電極においては、電気化学的検知を
妨害する物質を電気化学的手段で除去することが
でき、合理的でかつその効果は大きい。
酵素の固定化位置としては、上記からも明らか
であるが、第2の電極側を除く場所、すなわち、
多孔質膜の孔中および第1の電極側に固定化する
のが最も望ましい。
本発明の酵素電極においては、多孔質膜の両面
に直接2つの電極を形成し、それぞれ独立した電
極系としているため、両電極が短絡しない様に構
成する必要がある。この点からは、第1の電極お
よび第2の電極のうち、少なくともいずれか一方
を多孔質膜の周辺部より内側に形成するのがよ
い。その一例として、円形の多孔質膜に2つの電
極を形成した場合について第2図及び第3図に示
す。図中1は多孔質膜、2は第1の電極、3は第
2の電極であり、この場合は第1の電極を多孔質
膜の周辺部より内側に形成している。もちろんこ
の例とは逆に、第2の電極の方を多孔質膜の周辺
部より内側に形成してもよいし、あるいは両方の
電極をともに周辺部より内側に形成してもよい。
いずれの場合も、第1の電極と第2の電極が短絡
しない様な構造とするという目的に合致するもの
である。
また、多孔質膜および膜上に形成された電極の
形状は上記の例に示した円形に限られることはな
く、使用目的に合つた任意の形状とすることがで
きる。さらに、多孔質膜の周辺部とこの内側に形
成された電極の外周部との間隔については、2つ
の電極を短絡させないという目的に合致すればよ
く、特に限定されるものではない。
以下、本発明の実施例について説明する。
担体として孔径2000Å、膜厚10μm、孔密度3
×108個/cm2のポリカーボネート多孔質膜を用い
た。この膜の片側面にスパツタリングにより表面
の抵抗が10〜20Ωの白金層を形成しこれを第2の
電極とした。次に、反対側の面については、直径
9mmの穴を有するマスクを重ね合わせて上記と同
様にスパツタリングにより、10〜20Ωの表面抵抗
を有する白金層を形成し、これを第1の電極とし
た。得られた膜を、第1の電極とする白金面につ
いて同心円状に直径11mmに切断した。この様にし
て得られた膜の構造の概略は前述の第2〜3図に
示した通りであり、両電極間の抵抗値は10MΩ以
上であつた。
次に、上記の膜の第1の電極側に酵素としてグ
ルコースオキシダーゼの100mg/ml水溶液を10μ
/cm2の割合で展開した。この操作により酵素液
は膜の孔中に浸透する。次にこの膜を乾燥させた
後、二官能性架橋試薬としてのグルタルアルデヒ
ド蒸気中にて、25℃で1時間架橋反応を行わせて
固定化した。反応終了後、水で十分に洗浄した。
この酸素電極をAとする。
比較のため、上記と同様にして白金層を形成
し、切断して得られた膜を、グルコースオキシダ
ーゼ水溶液(100mg/ml)中に浸漬し、引き上げ
た後に乾燥させ、次に上記同様に固定化、洗浄し
た。この様にして得られた酵素電極は、両電極面
上および孔中を含めて固定化グルコースオキシダ
ーゼ層を有する。これをBとする。
上記の酵素電極を装着した円筒形の電極ホルダ
ーの断面と電極系について、第4図に示す。図中
6は酵素電極であり、第1の電極の白金層が電極
ホルダーの内側になる様に樹脂製の外とう管7で
樹脂製の本体8に装着されており、第1の電極の
白金層は白金リード9に、第2の電極の白金層は
白金リード10にそれぞれ接している。また、第
1の電極に対するAg/AgCl参照極11と対極1
2を電極ホルダー内部に、第2の電極に対する
Ag/AgCl参照極13と対極14は電極ホルダー
の外側に配置して電極系を構成している。また電
極ホルダー内はPH5.6のリン酸緩衝液15で満た
されている。
上記の電極系をPH5.6のリン酸緩衝液中に浸漬
し、グルコースあるいはアスコルビン酸を添加し
て、その濃度変化に伴うA,B各酵素電極につい
ての電流変化を測定した。グルコース濃度と第1
の電極の電流増加量との関係を第5図に示す。図
中、A,B各々について第1の電極の電位および
第2の電極の電位をともに+0.60V(vs.Ag/
AgCl)とした場合を実線で示し、第1の電極の
電位を+0.60V(vs.Ag/AgCl)とし第2の電極
には全く電位を印加せずに回路を切つた場合を破
線で示した。図より明らかなように、本発明によ
る酵素電極Aにおいては、第2の電極のオン、オ
フにかかわらず良好な直線関係が得られた。これ
に対しBにおいては、第2の電極をオフにした場
合にはAとほぼ同等の性能を示したが、オンの場
合にはほとんど応答が得られなかつた。これは、
第2の電極上にもグルコースオキシダーゼが固定
化されているため、この場所でグルコースが反
応、消費され、生成したH2O2も第2の電極で酸
化されることによる。Aにおいては、膜の孔中お
よび第1の電極側に酵素を固定しているため、B
の様に応答が低下することはない。
グルコースの場合と同様にして、アスコルビン
酸濃度と第1の電極の電流増加量との関係を第6
図に示す。実線、破線はそれぞれ第5図と同じ測
定条件を意味する。図より明らかなように、第2
の電極を作動させることにより、効果的にアスコ
ルビン酸の影響を除去できることがわかる。また
第2の電極の設定電位としては+0.60V(vs.Ag/
AgCl)以上であれば十分な効果が得られた。
実施例においては、アスコルビン酸の場合につ
いて示したが、これ以外の尿酸、グルタチオン、
ビリルビン等をはじめとする種々の還元性物質に
ついても、上記と同様の良好な除去効果が得られ
た。
本発明の酸素電極は、2つの電極と固定化酵素
層が多孔質膜上に一体化され、全体として薄膜状
となつているため、実施例においてもグルコース
の添加後、約5秒で定常電流が得られるなど優れ
た高速応答性を示した。また、以上に述べた応答
諸特性については、繰り返し使用、連続使用にお
いても長期にわたつて安定した性能が得られた。
使用可能な多孔質膜としては、実施例に示した
ものに限られることはなく、本発明の主旨に合致
するものであればよい。
実施例においては、酵素としてグルコースオキ
シダーゼを用いた場合について示したが、これに
限定されることはない。本発明の主旨に合致する
ものであれば同様に適用することができる。また
この場合、複数の酵素反応が関与するものであつ
てもよい。
第1の電極および第2の電極の材料としては、
実施例に示した白金に限定されることはなく、本
発明の主旨に合致するものであればよい。
【図面の簡単な説明】
第1図は本発明の酵素電極の一実施例を示す断
面模式図、第2図は多孔質膜とこの膜上に形成さ
れた電極の位置関係を示す平面図、第3図は同側
面図、第4図は酵素電極を装着した電極ホルダー
および電極系を示す模式図、第5図はグルコース
について濃度と電流増加量の関係を示す図、第6
図はアスコルビン酸について濃度と電流増加量の
関係を示す図である。 1……多孔質膜、2……第1の電極、3……第
2の電極、4……孔、5……固定化酵素層。

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. 1 少なくとも、酸素と、多孔質膜と、過酸化水
    素を検知するための第1の電極と、第1の電極に
    よる検知を妨害する物質を電解除去するための第
    2の電極からなり、前記多孔質膜の一方の側に第
    1の電極を、他方の側に第2の電極をそれぞれ有
    し、かつ少なくとも一方の電極を多孔質膜の周辺
    部より内側に形成してなり、前記酵素を多孔質膜
    の孔中および第1の電極側に固定化したことを特
    徴とする酵素電極。
JP57029306A 1982-02-25 1982-02-25 酵素電極 Granted JPS58146847A (ja)

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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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KR970001146B1 (ko) * 1993-07-16 1997-01-29 엘지전자 주식회사 가스측정용 바이오센서 및 그 제조방법

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