JPH02128689A - カルバメート‐ヒドロラーゼを単離し引続き精製する方法、カルバメート‐ヒドロラーゼのＢｒＣＮ‐分解ペプチド、合成オリゴヌクレオチドの製法、カルバメート‐ヒドロラーゼ‐遺伝子の単離法及びアルトロバクター・オキシダンスの新規菌株 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 単離し、かつ特性化する方法に関する。この酵素は、ア
ルトロバクター・オキシダンスからのカルバメート−ヒ
ドロラーゼであり、これは、７エンメジ７アム（ＩＵＰ
ＡＣ−命名では６−ｍ−トリル力ルバモイルオキシフェ
ニルヵルバメート）の２つのフェニル核の間の一００Ｃ
−Ｎ−結合の分解に寄与する。

〔従来の技術〕

実際に、檀々の雑草の撲滅の九めＶｃＦｉ、簾々多くの
除草剤もＬ　＜は除草剤混合物金便用しなければならな
い。この問題は、遺伝子操作により変えられ、非選択性
除草剤に対する抵抗を有する植物により嘔けることがで
きる。

従って、除草剤相容性植物に関する要求は、今日、植物
保脛の前面に出ている。

除草剤相容性植物を得るためには、第１に、除草剤を代
謝により失活させることのできる酵素の単離及び引続く
精製のための方法及び第２に、活性酵素のコード化のた
めに寄与するＤＮＳ−配列を有する遺伝子＃素糸の特性
化の方法が必要である。

７エンメシ７アムを失活場せることのできる遺伝子−酵
素系の単離及び引続く特性化のこのような方法は従来未
知でおる。

〔発明が解決しようとするＩＩＪＩＩ：］本発明の課題
は、７エンメジフアムを失活化することのできる遺伝子
酵素系を即離し、引続き、特性化する方法？：開発する
ことである。

〔課題を解決するための手段〕

このためＶこ、ます、除草酌７エンメジファムを代謝に
より失活化させる能力を有する微生物を同定するために
微生物のスクリーニングを行なう。

ところで、土壌微生物例えばアルトロバクター・オキシ
ダンスから、フェンメジファムの２つのフェニル核の間
の−０００−Ｎ−結合の加水分解に関与するカルバメー
ト−ヒドロラーゼを単離できることを発見した。フエン
メジフアムの２つのフェニル核の間の−０００−Ｎ−結
合の加水分解は、次の反応により、除草剤失活化合物例
えはメチル−６−ヒトロキシフエニルーカルバメート及
びｍ−）ルイゾンを生せしめるニ アエンメゾ７アム　　　メチル−６−ヒド　ｍ−トルイ
ジンロキンーフェニル ーカル７寸メート 前記の反応によりフェンメゾ７アムを加水分解すること
のできる遺伝子−酵素系の単離及び引続く精製のために
、アルトロバクター・オキシダンスの微生物を栄養培地
中で培養する。７エンメジ７アムの分解に関与するカル
バメート−ヒドロラーゼを、超音波細胞崩解及び遠心分
離により単離し、アニオン交換体クロマトグラフィ、勾
配俗離、硫酸アンモニウム沈殿及びＦＰＬＣ−分離によ
り、電気泳動的な均一性に達するまで＊ａする。この精
製されたカルバメートにより決定することのできる２個
のペプチドを単離することができる。このペプチドの配
列情報に準拠して、交雑ゾンデ（Ｈｙｂｒｉｄｉｓｉｅ
ｒｕｎｇｓｓｏｎｄｅｎ　）　　としてカルバメート−
ヒドロラーゼ−遺伝子の検出のために使用されるオリゴ
ヌクレオチドを合成する。

土堪細鉋アルトロバクター・オキシダンスのすべての実
施されている単離物中で、＃Ｉ胞の分解及び核酸の抽出
の後に、プラスミドを検出することができる。

菌株アルトロバクター−オキシダンスｐ５２に関して、
カルバメート−ヒドロラーゼはプラスミドでコードされ
ることが明らかにすることができる。

プラスミドｐＨＰ　５２の欠損の場合に、この菌株はフ
ェンメゾファムを加水分解する特性を失なう。カルバメ
ート−ヒドロラーゼは、砲株ｐ５２のプラスミド不含の
誘導体中では生化学的に検出するｑとはできない。

このプラスミドｐＨ５２をｖ！４製的に単離し、制限工
／ドヌクレアーゼを書き入れる。電気泳動により生じる
制限フラグメントをメンブランフィルタ−上に移し、オ
リゴヌクレオチドと交雑嘔せる。プロットーハイブリダ
イセ゛−ジョン（Ｂｌｏｚ−Ｈｙｂｒｉｄｉｓｉｅｒｕ
ｎｇ）のデータから、このカルバメート−加水分解−遺
伝子は３．３　ｋｂの大きさのＰｓｚＩ−制限７ラグメ
ント上に局在することが明らかである。

調製的単離し、ベクターｐＵＣ１９ＣのＰｓｔＩ　−部
位に導入する（　Ｙａｎｉｇｈ−Ｐｅｒｒｏｎ　、　Ｃ
，Ｖｉｅｉｒａ。

Ｊ、＆Ｍｅａｓｉｎｇ　（１９８５）、Ｇｅｎ５３３．
１０３ｆｆ参照）。連結バッチを用いるＥ、コリーＤＨ
５αの形質転換の後に、２つの型の組換えＥ、コリーク
ローンが得られ（それぞれｐｐ５２Ｐａ　ｃ及びｐｐ　
５２　Ｐａｃ　）、これらは、ベクターのＬａｃ−プロ
モータに対する種々の配向でカルバメート−ヒドロラー
ゼ−遺伝子を含有する（第５図参照〕。

カルバメート−ヒドロラーゼを、インダクター　（Ｉｎ
ｄｕｃｃｏｒａ　）イソプロピル−β−Ｄ−チオがラク
トシトの存在で、Ｅ、コリーＤＨ５ｄ（ｐｐ　５２Ｐｓ
ｚ　）型のクローンの培養により機能的に表現石れうる
。Ｅ、コリーＤ）ｌ　５αＣ，ｐｐ　５２ｉｎｖ　）型
のクローンの蛋白質抽出物（これはＬａｃ−プロモータ
ーに対する逆の配向でカルバメート−ヒドロラーゼ−遺
伝子を含有する）中には、カルバメート−ヒドロラーゼ
−遺伝子の発現は検出できない。このことから、アルト
ロバクタープロモーターＦ′ｉＥ、コリーＲＮＡ−ポリ
メラーゼにより認識されないことが推考できる。

カルバメート−ヒドロラーゼ−遺伝子のヌクレオチド配
列はザンが−（Ｓａｎｇｅｒ　）　　等による方法（Ｓ
ａｎｇｅｒ、　Ｆ、　Ｎ１ｃｋｌｅｎ、　Ｓ、　＆　Ｃ
ｏｕｌｓｏｎ、　Ａ（１９７７）、Ｐｒｏｅ、　Ｎａｚ
ｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ７４．５４６６〜
５４６８）により蓚紹纒れる。

この次めに、クローン化された３、３ｋｂの長１のＰｓ
ｔ、ｌ−制限フラグメントから出発して、１５サブクロ
ーンは、−１鎖ＤＮＳ−バクテリオファージＭ　１３　
ｍｐ　１８及びｍｐ　１９に分けられる（　Ｍｅｓｑｉ
ｎｇ、　Ｊ。（１９８３）　、ＭｅｃｈｏｄｓｉｎＥｎ
ｚｙｍｏｌ、　　１０１．２０〜７８　）。第６図に、
配列決定法を明らかにするコード化帯域の正確な制限地
図を示す。

これから推論しうる蛋白質配列を有する烏総ヌクレオチ
ド〜二列金第７図に示す。双方のＴｈｋＢｒＣＮ−分解
ベゾチドのアミノ酸配夕１　（例４奈照）Ｖｉ−同じ絖
み忰（Ｌａ５ｅｒａｓ　ｃｅｒ　）　　内でＤＮＡ−面
上で同定することができる。この読み枠は、ＴＧＡ−翻
訳トポコドンで終結しく第７図、ヌクレオチド位置１７
８９〜１７９１）、ｐそらくＧＴＧ−出発コドンで開始
する（第７図、Ｎｕｋ：ｔｅｏｃｉａ−位置６４０〜３
４２）。合計で、１４７９４基対の絖み枠が生じる。推
定上の（）ＴＧ−スタートコドンの上流に、Ｅ、コリー
リポソーム結合位置に関するコンセンサス−配列に対し
て有意のホモロゾー金有する領域（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａ１
ｇａｒｎｏボックス）をａｍすることができる（第７図
８照、ヌクレオチド−位置２９８〜３０２）。

１９８７年８月２５日に、西ドイツ微生物寄託間（ＤＳ
Ｍ　）　（Ｇｏｕｔｉｎｇｅｎ　、西ドイツ在に、次の
微生物を寄託した（寄託番号）： アルトロバクター・オキシダンスｐ　１６／４／Ｂ　（
ＤＳＭ　４０３８　）、 アルトロバクター中オキ７ダンスｐ　６７　（ＤＳＭ４
０３９）、 アルトロバクターΦオキシダンスｐ　７５　（ＤＳＭ４
［）４０）、 アルトロバクター・オキシダンスｐＨ／１／−ｂ　（Ｄ
ＳＭ　４０４１　）、 アルトロバクター・オキシダンスｐ１５／４／Ａ　（Ｄ
ＳＭ　４０４５　）、 アルトロバクター・オキシダンスｐ２１／２ＣＤＳＭ　
４０４６　）、 ブ′ラスミドｐＨＰ　５２を含有するアルトロバクタ・
オキシダンスｐ５２（Ｄｓｕ４０４４　）。

図面の説明 略字 ＥＡＥ １’ｌ’ＰＬＯ Ｐ）（ ｂ −遠心カ ージエチルアミノエチル −（Ｆａａｔ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　／　Ｐｅｐｔｉｄ　／
　Ｐｏ１ｙｎ−ｕｋｌｅｏＺｉｄ　Ｌｉｑｕｉｄ　Ｃｈ
ｒｏｍａｔ、ｏｇｒａｐｈｙ：蛋白質、ペゾチド及びポ
リヌクレオ チドに関する高速液体クロマトグラ フィ） 一水累イオン濃度の負の常用対数 一ヤロ塩基 ＳＤＳ　　−ラウリル５Ｉ１．酸ナトリウムＤＴＴ　　
−ジチオヌレイトール １ｘＳＳＣ−ＮａＣＪ　Ｏ，１５Ｍ、クエン酸三ナトリ
ウム０．０１５　Ｍ　（絹７．０） １ＸＤｅｎ特徴ｒａｔ−牛血清アルブミン０．０２％（
ｗ／ｖ） （シグマ、７ラクンヨンＶ） フィニル（Ｆｉｃｏｌｌ）　４０００．０２％（ＷＡＦ
）ポリビニルピロリドン０．０２％ ＭＣ８−マルチグルクローニンク部位 （Ｍｕｌｔ；１ｐｌｅ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　ｓｉｃｅ）Ｂ
ｍ　＝　ＢａｍＨｌ　、　　Ｂｓ　＝　Ｂｓ１ＥＩｌ　
、　Ｃ１＝　Ｃ１ａｌ　。

ＥＶ　＝　ＥｃｏＲＶ　、Ｈ■＝　Ｈｌｎｄｌｌ、　Ｋ
ｐ　＝　Ｋｐｎｌ　。

Ｎｃ　＝Ｎｃｏｌ　　、　　　Ｎｄ＝：Ｎｄｅｌ　　Ｓ
　　Ｎｈ＝＝Ｎｈｅｌ　。

Ｐｓ　＝　Ｐｓｃｌ　　、　　　ｐｖｌ　＝　Ｐｖｕｌ
　、　　Ｐｖｕ　＝　Ｐｖｕｌ　、５ｃ＝Ｓａｃｌ　％
　　　８ｐ＝Ｓｐｈｌ　、　　　５ｃ＝Ｓｃｕｌ　。

ｘｂ　＝　Ｘｂａｌ　　。

図面 第１図は、アルトロバクター・オキシダンスからの７工
ンメゾフアム分解性カルバメートヒドロラーゼの単離及
び引続く精製法（例２）會示す系統図である。

第２図は、粗製エキス及び個々の精製工程の後に単離さ
れ、プールされた蛋白質７ラクシヨンの８ＤＳ−ポリア
クリルアミドデル上での電気泳動分離状態を示す図であ
り、ここで分子量に関するマーカーとして標準蛋白＊Ｃ
Ｓ　）ｔ−共に泳動させている。

Ａ：アルトロバクター・オキシダンスの超音波細胞崩壊
の遠心分離上澄みからの粗製エキス、 Ｂ　：　ＤＥＡＥ−セファセル−カラムでの勾配耐難の
後にプールてれた蛋白質クラクション、ＣＡＢからのフ
ラクションの硫酸アンモニウム沈殿 Ｄ：硫酸アンモニウム沈殿のデル痺過及び引続〈セファ
クリルＳ−３００カラム上での分離の後の蛋白質クラク
ション ＥＮＤからのプールされ次クラクションを匠」（アニオ
ン交換体−クロマトグラフィ）の分離後の蛋白質フラク
ション Ｆニア°−ルでれたクラクションＥのサブロース６−カ
ラムでの分離（例２）の後の蛋白質フラクション。

第６図は、カルバメート−ヒドロラーゼの至適ｐＨ（ｐ
Ｈ，！５．８）を得るための曲線図である。この至適Ｐ
ＨＦｉ、酵素活性（％）を−僅に対してプロットするこ
とにより確定することができる（例２）。第４図は、ア
ルトロバクター・オキシダンス（菌株ｐ５２）からのグ
ラスミドｐＨＰ５２の制限地図である。第５図は、カル
バメート−ヒドロラーゼ−遺伝子のクロー二ンダ法を示
す図である。概要を示すため、５′−及び６′−側面領
域を包含するオリゴヌクレオチＶと交雑性の遺伝子範囲
を壌土のプラスミｖ地図の下に拡大して示している。

組換えクロー７ｐｐ５２ｐ！３ｚ及びｐｐ５２　ｐｓｚ
ｉｎｖ、が線状で示ちれている。このＬａｃ　Ｚ’−遺
伝子の転写方向は矢印（−）で示括れている。

第６図は、カルバメート−ヒドロラーゼ−遺伝子の正確
な位置を示す（開始：ＧＴＧ＝開始コ図である。

この配列決定された範囲は、制限地図の下の矢印で示て
れている。矢印の長さから、それぞれの配列決定された
範囲の長さを読み取ることができる〇 例４に記載のオリゴヌクレオチドに対してホモロジー範
囲七有する制限フラグメントは、この地図から明らかで
ある（（）。

Ｍ１３クローンは次のように記載することができる。

クローン 導入フラグメント ′Ｍ１３ベクター （ｐＵｃ１９）〜５００ １２８９　ｂｐ 〜７００　ｂｐ ６４　ｂｐ （ｐＵＣ１９） 〜１０６０　ｂｐ ５８　ｂｐ ６４　ｂｐ ７６　ｂｐ ５６１　　ｂｐ ９７　ｂｐ ７６　ｂｐ ４５　ｂｐ ５８　ｂｐ １１００　ｂｐ ４５　ｂｐ Ｎｄａ　ｌ／Ｓａ　ｃ　Ｉ Ｎｄｅｌ／５ａｃＩ Ｐｖｕ　ｌ／Ｐｓ　ｚ　Ｉ ＰｖｕＩ／ＰｖｕＩ ＢａｍＨＩ／ＢａｍＨＩ ＢａｍＨ１／ＢａｍＨＩ Ｐｖｕｌ／Ｐｖｕｌ Ｐｖｕｌ／５ａｃｌ Ｃ１ａｌ／ＢａｍＨＩ Ｃ１ａｌ／ＢａｍＨＩ Ｐｖｕｌ／５ａｃｌ Ｋｐｎ　ｌ／Ｈｉ　ｎｄ　ＩＩ ＢａｍＨ１／ＢａｍＨＩ ＢａｍＨＩ／ＢａｍＨＩ Ｋｐｎｌ／）Ｔｉｎｄｌｌ 第７図ｔｉｓｌ−及び６′−側面範囲を包含するカルバ
メート−ヒドロラーゼ−遺伝子のヌクレオチド配列を示
す図である。

％　Ｋ　１．　ＧＴＧ−開始コドン、２．リボンマール
結合位１ｌｌｉｔ（Ｂｈｉｎｅ−／　Ｄａｌｇａｒｎｏ
　Ｂｏｘ　；　Ｓ　／　Ｄ　）、６、例４に記載のオリ
ゴヌクレオチドに対するホモロゾー領域（ｏｌｉｇｏ　
Ｉ　＆　ｌ　／　ｏｌｉｇｏ量）を明示している。

暗号化されたヌクレオチド配列を形式的にアミノ酸配列
に翻訳した。この絖み枠は、明らかに蛋白５ｉ！面匈定
アミノ醜部分配列により決定されている。

実施例 例１ 除草剤７エンメジ７アムを失活させる能力を有する微生
物の単離 フェンメゾ７アムを代謝により失活嘔せる能力を有する
微生物の同定のために、微生物のスクリーニング會実施
する。この微生物源として搾々の土地（フェンメゾファ
ムで数回処ｆＪ！キれた実験地）の土壌試料及び泄明ス
ライムをも使用する。カルバメート分解を実施すること
のできる微生物の同定のための遣択尺度として、次の特
定を採用する： ａ）特有の炭素源もしくは窒素源としての２エンメゾフ
アムを有する栄鵞培地上での生長ｂ）次の反応による７
エンメゾ７アムの木酢性化合物への分解： フェンメゾ７アム　　メチル−６−ヒド　　ｍ−トルイ
ゾンロキンーフェニル ーカル／ぐメート 土壌試料中に存在する、フェンメジファムを分解するこ
とのできる多くの微生物から、特に明白な分解を示す７
徳の代表ケ色択する。すべての代表がアルトロバクター
に輌し、この風向のオキシダンス株に属するこれら土壌
細ａｔ次の合成培地（Ｍ９−培地）′ｆ：：有する培養
液中で培宜する： ＮＨ，Ｃ１１，０１／　１ Ｍｇ５Ｏ４ｘ　７Ｈ２００，２５、！ｉｌ　／　ｌ！肚
２Ｐ０．　　　　　　３．０９　／　１Ｎａ２ＨＯ４Ｘ
　２Ｈ２０７，０１１／　ｌグルコース　　　　　　　
２．０　＆　／　ｌ及びＮａ（Ｊ　　　　　　　Ｏ，５
＆　／　ｌ）このＭ９−培地は、付加的にチアミン（ビ
タミンＢ１．＞１１１ｋ？／ｌ並ひに微少量元素を含有
しこれらは基幹浴液の形で（１ｙ　／　Ｍ　９−培地ｌ
）添加される。この微少員元素−基幹浴欣は、次のもの
金含有するニ ホウ酸　　　　　　　０．５　ｇ／　１ＣｕＳＯ４ｘ５
Ｈ７ｏ　　　Ｏ，０４ｊｌ　／　ｌＦｅＣ４３Ｘ６Ｈ２
００，２ｊｌ　／　ｌＭｎ５Ｏ４ｘ　７Ｈ２００，４ｇ
／　１ＺｎＣ４２０，４１１／　ｌ ＣＮＨ４）６ＭＯ７０２４Ｘ４Ｈ２００，２、！ｉ’　
／　ｌこの液体培地中での振動培養のために、この合成
培地はカサミノアンド（Ｃａｓａｍｉｎｏａｅｉｄｓ　
；Ｄｉｆｃｏ■）０．１％を補充する。

土壌動態をこのＭ９−培地中、２８°Ｃで、良好な通気
下に対数生長期の終りまでインキュベートする。酵素精
製のために、培地１０１に定常予備培養液１８１００を
接種する。

培養敵の）（ＰＬＣ−分析により、アルトロバクター・
オキシダンスの培養物中で、フェンメゾファムを分解し
て、除草活性のない生成物にすることが明らかにできた
。

例２ アルトロバクター・オキシダンスからのカルバメート−
ヒドロラーゼの＊馳及びＮ製カルバメート−ヒドロラー
ゼをｊｌ１し、引続ぎ電気泳動的に均一になる筐で精製
することは６エ程のａ教法により実施する。アルトロバ
クター・オキシダンス（ｐＨＰ　５２　）　（ＤＳＭ遅
４０４４）の鰹Ｐ対数培製物６１から、カルバメート−
ヒドロラーゼ０．５〜１履９を再現可能に単離すること
ができる。カルバメート−ヒドロラーゼの単離のために
、細胞を遠心（７０００ｘ１りにより叡得し、俗解緩衝
液（１０ｍＭ燐酸ナトリクムＰ）４６．８　／　１　ｍ
Ｍ　ＤＴＴ　）　　約４０ＩＬｌ中に再懸濁させる。細
胞懸濁液を超音波により崩壊石せ、同時にホモｒナイズ
する。

こうして得られた均−物を引続き４０００ｒ＆及び４°
Ｃの温度で４５分間遠心する。沈殿を捨て、上澄みをＤ
ＥＡＥ−セファセルカラム（１０ＱｍＭトリスーＨＣ２
、ｐ）１７．２　／　１００　ｍＭ　Ｎａ已／　１　ｍ
ＭＤＴＴで平衡化）上に装入する（カラム直径２．６ｎ
１デル床の高さ２０．５ｃｒＩＬ、カラム容積約１００
叡）。

この装入の前に、細胞抽出物を出発ｖｉｓａ（１００ｍ
Ｍトリス／１００ｍＭＮａ（Ｊ／ｉｍＭＤＴＴ　）で約
１：１０に稀釈する。引続き、結合していない物ａｔ除
去するために、カラムを出発緩衝液で洗浄する。仄いで
、カルバメート−ヒドロラーゼを、ＮａＣ２１００ｍＭ
　−ＮａＣｊ　５００凸の縁状勾配濃度（５×カラム容
積）で溶離させる。＃素活性フラクションをプールしく
集める）、固体硫酸アンモニワム（ＮＨ４）２ＳＯ４を
加えて、飽和溶液の６３％の最終濃度にする。この際に
生じる蛋白質沈殿を遠心により沈殿させ（２００００Ｘ
９７５０分）捨てる。上澄みに（ＮＨ４）ａ８０ｚ　（
固体）を加えて、飽和ｆ＃液の６０俤の最終酸度にし、
０℃で約１２時間攪拌する。

生じる蛋白質を遠心により集める（２００００Ｘ、９／
６０分）。この沈殿を出発緩衝液約ｉ　ＩＬｔ中に解か
し、１０　ｗ／ｖ％サッカロースを加え、セファクリル
Ｓ−３００カラム上に装入する。ゲル濾辿を２．５ｃＩ
ｔ／ｈの流速で実施する（浴ｌ＠緩衝液→出発緩＠ｆｆ
！Ｌ）。このカラムは、矢の寸法を有する：直径＝２．
６ｃｍ、ｈ＝９５ｃｍ、容積＝４７５都。＃素活注フラ
クションを引続ぎＦＰＬＣ−カラム（Ｍｏｎｏ　ＱＨＲ
５／　５　：アニオン父換体）を通し史に後処理する（
勾配容＠　：　ＮａＣＪｌ　００　ｍＭ　−ＮａＣｊ　
３００　ｍＭ　；　ｎ速：０．５１Ｕ／ｉ；装入鎗：２
Ｒｔ）。

結合しない蛋白質を、出発緩衝液１９ＩＬｔを用いるイ
ンクラティック溶離（１ｓｏｋｒａｔｉｓｃ特徴Ｅｌｕ
ｚｉｏｎ　）により除去する（勾配溶離ニドリス１００
　ｍＭ　／　ＨＣＩ　ｔ　ｐ’　７−２　／　ＤＴＴ　
１ｍＭ中２０β以内でのＮａ（Ｊ　１００　ｍＭ　−Ｎ
ａＣｊ　３００　ｍＭ　）。

酵素活性クラクションを電気泳動的な純度分析（Ｌｉｍ
ｎ１ｉによる５ＤＳ−ポリアクリルアミド−デル電気法
！に！］）の後に、限外濾過により濃縮さ（′Ｒ） せ（Ａｍ１ｃｏｎ　　　Ｃｅｎｚｒｉｃｏｎ　１０　Ｋ
ｏｎｚｅｎｚｒａｃｏｒ）、ＦＰＬＣ−デル認過カラム
（８ｕｐｅｒｏｌｌＩｅ　６、ＨＦＩ　１０／　３０　
、Ｐ特徴ｒｍａｃｉａ　）上に装入する（流速：Ｑ、　
２ｔｔｔｔ　／　ｍｉｎ　、　ｋ入量：　１００　ｐｉ
、展開剤：１００ｍＭトリス／　ＨＣｊ、ｐ）１７．２
／１０ｍＭＮａＣ，Ｌ　）。

この工程で生じる活性蛋白質クラクションは電気泳動的
に単一である。

この単離された＃累は、１１衝酊液（生化学で慣用の１
１衝漱、例えば燐酸塩緩衝液、トリス緩衝液等、ｐｉ（
６，８）中で活性である。コファクター又は全極イオン
は、この反応のために不必要であり、ＳＨ−収集に対す
る敏感性も同様に存在しない。この酵素の至適ＰＨ１−
ｃμｍ６．８である。

変性／解離条件（ＳＤＳ　−’ｌ”ルミ気泳動）下でも
自然の条件（デル濾過）下でも、このカルバメート−ヒ
ドロラーゼの分子量は５０〜６０ｋｄ有利に５６〜５７
　ｋｄの範囲内にある。このことから、このカルバメー
ト−ヒドロラーゼは、モノマーの蛋白質であると結論す
べきである。

カルバメート−ヒドロラーゼの等電点ＨｐＩ　＝６．２
である。

例３ カルバメート−ヒドロラーゼの検出性 蛋白質粗製抽出物の絹製の間の酵素活性を迅速かつ疑い
のない検出のために、拭験管内＃累テストを開発する。

このテストは、水中に難し容性の７エンメジフアムを可
俗性の加水分解生成物に変えるこの＃木の特性に基づく
。このために、固体７エンメジフアムを水中に懸濁させ
、超音波でマイクロ懸濁液させる。引続き、このマイク
ロ懸濁液を引続ぎ５０°Ｃで撹拌下にアがロース浴液中
に注ぎ、硬化の前にペトリシャーレ中に入れる。濁った
ゲルマトリックスが生じる。引続き、この酵素＃液を、
固体マトリックス中に導入されている押し抜き大中に入
れる。

６０℃で２〜４時間のテストプレートのインキュベート
の後に、＃素活性は、７エンメジフアムによる乳濁マト
リックス中の澄明帯域の現われにより示される。

例４ 交雑によるカルバメート−ヒドロラーゼ−遺伝子の％異
的検出のための２種のＢｒＣＮ−分解ペプチドのアミノ
酸配列の同定及びオリゴヌクレオチドの合成 精製されたカルバメート−ヒドロラーゼから出発して、
ＢｒＣＮ−分解により、その配列がエドマン−分解（Ｅ
ｄｍａｎ−Ａｂｂａｕ　）により部分的に確定すること
のできる２槙のベグチド七単離する。

ＢｒＣＮペグチド■： Ｈ２Ｎ−８ｅｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ａ
ｓｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−−Ａｒ　ｇ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−
Ｇｌｙ−Ｌｙｓ　−Ｐｒｏ　−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｓｐ
（Ｖａｌ）− −Ｇｌｙ（Ｈｌｇ）−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ
−Ａｌａ−Ｖａｌ−ＣｏｏＨＢｒＣＮペゾチド■： Ｎ２Ｈ−Ｇｌｕ−）ＪｉＢ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ（
Ｖａｌ）−Ａｓｎ（Ｇｌｙ）−Ｇｌｕ−Ａｒｇ（Ｃｙｓ
）− −Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｐｈｓ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−
Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−ＣＯＯＨ このペプチドの配列情報の割合に従って、交雑ゾンデと
してカルバメート−ヒドロラーゼ−遺伝子の検出のため
に使用されるオリゴヌクレオチドを合成する： オリゴヌクレオチド！　（１７＋ｎｅｒ混合試料）は、
−Ｘ鎖ＤＮ８−フラグメントとしてＢｒＣＮ−ペプチド
エアミノ酸　ｐｏｓ、　１０〜１５（相補重連＠）から
の配列情報を有する： オリゴヌクレオチドｎ　（４２ｍａｒ　）は−重鎖ＤＮ
Ｓ−７ラグメントとしてＢｒＣＮペプチドＩ　アミノ酸
ｐｏｓ、８〜２１からの配列情報（相補的連鎖）を有す
る。コドン選択は、グアニン（Ｇ）及ヒシトシンＣＣ）
−の多いＤＮＳ　−配列（トリプレットの第６の位置で
アデニン（Ａ）−及びチミン（Ｔ）−ヌクレオチドの前
のグアニン（Ｇ）４ひシトシン（Ｃ）−ヌクレオチドを
考慮する）の想定のもとに行なう。

オリゴヌクレオチドｌ は、−ｘ＠　ＤＮＳ　−７ラグメントとしてＢｒＣＮ−
ペプチド川からの配列情報（相補重連＊Ｊ　）を有する
： これらヌクレオチドの使用下に、ヘルビチダーゼー遺伝
子を交雑によりプラスミドｐＨＰ　５２内に局在化させ
ることができる。このためにこのプラスミド−ＤＮＳを
制限エンドヌクレアーゼを用いて切断させ、この際に生
じるフラグメントをアガロースデル電気泳動により分離
させ、引続き、Ｅ、　Ｍ、プずンの方法（Ｊ、　Ｍｏ１
．　Ｂｉｏｌ。

９８．５０６〜５１７（１９７５））により、−１ｋ鎖
形でメンブランフィルタ−上に移す（Ｇｅｎ　５ｃｒｅ
ｅｎ　ＰｌｕｓＴＭＨｙｂｒｉｄｉｓｉｅｒｕｎｇｓｍ
ｅｍｂｒａ−ｎｉｎ　、　Ｄｕ　Ｐｏｎｚ　ｄｅ　Ｎｅ
ｍｏｕｒｓ　／　ＮＥＮ−ＲｅｓｅａｒｃｈＰｒｏｄｎ
ｃｚａ　）。

オリコ９ヌクレオチド’ｋＴ４−ポリヌクレオチドキナ
ーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　）及
び［ｒ　３２−ｐ〕−アデノシン−５′−トリホスフェ
ート（＞５０００ｃｉ／ｍモル、Ｄｕ　Ｐａｎ５　ｄｅ
Ｎｅｍｏｕｒｓ　／　ＮＥＮ　−Ｒｅａｓａｒｃｈ　−
Ｐｒｏｄｕｃｚｓ　）の使用下に末端標識しく　Ｒ，Ｂ
、　Ｗａｌｌａｃｅ　ａｎｄ　Ｃ，Ｇ。

Ｍｉｒａｄａ　、Ｍｅｚｈｏｄｓ　　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍ
ｏｌｏｇｙ　１５２．４３２〜４４２　（１９８７））
、更に精製せずに交雑のために使用する。

この交雑（Ｈｙｂｒｉｄｉｓｉｅｒｕｎｇ　）は、標準
法（Ｐ、　Ｊ　、　Ｍａｓｏｎ　＆　Ｊ、　Ｇ、　Ｗｉ
ｌｌｉａｍｓｓのＮｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ　ｈｙｂｒｉ
ｄｉａａｚｉｏｎ　、　１３３〜１６０負（１９８５）
、Ｂ、　Ｄ、　Ｈａｍｅｇ　＆　Ｓ、　Ｊ、　Ｈｌｇｇ
ｉｎｇＨｒｓｇ、　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ　０ｘｆｏｒｄ
、　Ｗａｓｈｉｎｇｚｏｎ　Ｄ、　Ｃ，）の使用下に行
なうｏ　６　ｘ　Ｓａｃ　ｅ、　１０　ｘ　Ｄｓｎ特徴
−ｒｄｚ　’、　０．５％（ｗ／ｖ）　ＳＤＳ及び５−
ＲＮＡ　１００４／　ｔｓＡ　（Ｂｉｃｋｅｒｈｅｆｅ
　、　Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　）並
びに標識オリゴヌクレオチドＩ／ＩＩ／１１０ｎ９／Ｉ
Ｌｔの条件下で４１°Ｃ（≧６ｈ）で、特異的な交雑が
達成できる。雑種細胞（Ｈｙｂｒｉｄｓ　）の検出は、
オートラジオグラフィ（Ｔ、　ＭａｎｉａｚｉａＥ、　
Ｐ、　Ｆｒ１ｃｓｃｈ　＆　Ｊ、　Ｓａｍｂｒｏｏｋ、
　ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓ
ｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１
９８２））により行なう。

例５ アルトロバクター・オ卑シダンスからのプラスミドｐＨ
Ｐ　５２の単離及び特性化 アルトロバクターからプラスミドｐＨ５２を単離するた
め、Ｂｉｃｏｂｏｉｍ及びＤｏｌｙによるアルカリ抽出
法（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ　Ｈ，Ｃ，＆　Ｄｏｌｙ　、　Ｊ
。

（１９７９）　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄ、　Ｒｅｓ、　７
　、１５１３〜１５２３）で、Ｂｒ　ａｎｄｓ　ｃｈ及
びＤｅ　ｃ　ｋｅ　ｒの変法（Ｂｒａｎｇｃｈ、　Ｒ，
Ｄｅｃｋｅｒ、　Ｋ、　（１９８４）Ａｒｃｈ、　Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌ、　１３８　＋　１５〜１７）を用いる
。調製のために、バクテリアを次の成分：バクトートリ
ゾトン （Ｂａｃｚｏ−Ｔｒｙｐｚｏｎ　；　Ｄｉｆｃｏｏ）　
　　１０１１　／　ｌバクトーヘーフエーエキス （Ｄｉｒｃｏ　　）　　　　　　　　　　　　５　Ｍ　
／　ＩＮａ（Ｊ　　　　　　　　　　　　　　　１０１
１　／　１よりなるＬＢ−培地６１中で、細胞密度０Ｄ
５５０＝１．４になるまで培養し、引続ぎ、遠心分離に
より収穫する。

次いでこの細＠を、浴液１（５０ｒｎＭグルコース、１
０　ｍＭ　ＥＤＴＡ　、　　２５　ｍＭ　トリス／　Ｈ
Ｃｊ　ｐｉ”１８．０、リンチーＡ　１　ｑ／ａｇ　）
合計２１０Ｉｌｔ中忙再懸濁させ、室温で１時間インキ
ュベートする。

浴液ＩＩ　（Ｃ１，２Ｍ　ＮａＯＨ，１％５ＤＳ）３６
０ａｕの添加により分解を行なう。注意深い混合及び弓
続く室温での５分間のインヤユペーション及ヒ引続く５
分間の水冷の後に、混合物を浴液■（２Ｍ　トｌＪス／
ＨＣＪｐＨ７，０／　０．５ＭＫ（Ｊ）　１８０紅の添
加により中和する。氷上で１時間インキュベーションの
後に、不溶の沈殿を遠心により除去する。プラスミド−
ＤＮＳはインゾロパノール０．６容量係の添加により沈
殿させ澄明上澄みを得、室温で１５分間のインヤユベー
ションの後に遠心（１５０００Ｘ１！／３０分）Ｋｊリ
ペレット化する。プラスミド含有沈殿を真空中で乾燥さ
せ、引続き１０　ＸＴＥ　ｌｉｔ衝ｆＫ　（１００ｍＭ
　トリス／　ＨＣＪ−ｐ）１８．０　；　１０ｍＭ　Ｅ
ＤＴＡ　）　２４　ｔｅａ中Ｋｍかす。このプラスミド
含有＃！ｒａｔ−引続き等＠匿（ｉａｏｐｙｋｎｉｇｃ
ｈｅ　）　　塩化セシウム−密度勾配遠心により、臭化
エチジウムの存在下に、精製する（　Ｍａｎｉａｚｉｇ
　Ｔ、　Ｆｒ１ｚｓｃｈ　、　Ｅ、　Ｆ、　＆　８ｄｍ
ｂｒｏｏｋＪ、によるＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ　（１９８２）Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂ
ｏｒ　、Ｎ、Ｙ、）。

精製式れたプラスミド−ＤＮＳを、引続き制限エンドヌ
クレアーゼを用い、単一又は多重切断により、かつ引続
＜　０．８　（ｗ／ｖ）％アがロースジつル中での制限
フラグメントのゲル寛気泳動分合；ユにより分析する。

フラグメントの大きさ測定の九めに、ヌクレアーゼＢｉ
ｎｄ鳳並びにＨｉｎｄ　ｊ　ｓ”ＥＣｏＲＩで処理した
バクテリオファージλのＤＮＳｔ−標準として用いる。

この情翰を用いて、プラスミドｐＨＰ　５２のチは状制
限地図が得られる（第４図参照）。この：・″′プラス
ミド大きさは、４１　ｋｂの制限フラグメント長さの合
計として確認できる。

この例に記載のすべての方法は、標準法で冥施嘔れる（
　Ｍａｎｉａｚｉａ　Ｔ、　Ｆｒ１ｚａｃｈ　Ｅ、　Ｆ
、　＆ＳａｍｂｒＯＯｋ　Ｊ、によるＭｏ１ｅｃｕｌａ
ｒ　Ｃｏｌｏｎｉｎｇ　。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎ、　Ｙ、
　（１９８２）癖ｆ４ｔＡ’ｉ。

例６ オリゴヌクレオチドー父雛によ゛るカルバメ・トロヒド
ロラーゼー遺伝子のコード化領域の：・４ｒ　ｐ、−１
ｉ気泳動により現われ、メンブランフィルタ−上に移さ
れたシラスミドｐＨＰ　５２の制限７ラグメントと例４
に記載の３１１　ｐ−標識オリゴヌクレオチドとの交雑
により、プラスミドｐＨＰ５２の制限地図上のカルバメ
ート−ヒドロラーゼ−遺伝子のコード化領域の位ｒＩＬ
は明白に薙定することができる。第５図には、交雑範囲
が拡大して示されている。すべての３ｆＢＡのオリゴヌ
クレオチドは、３．３ｋｂの大きさのＰｓｚＩ−制限フ
ラグメントの中心部と交雑する。第６図には７ラグメン
ト内の又雑範囲の正確な位置を明らかにするフラグメン
トの訃細な制限地図が示されている。

９′Ｉｌ　７ Ｅ、コリー中のカルバメート−ヒドロラーゼ−遺伝子の
クローニング及びＬａｃ−プロモーター制限下における
遺伝子発現の検出 Ｅ、コリー中のカルバメート−ヒドロラーゼ−遺伝子の
クローニングのために、ベクターｐＵＣ１９（Ｙａｎｉ
ｓｈ−ｐｅｒｒｏｎ　、　　Ｃ，Ｖｉｅｉｒａ、Ｊ＋＆
Ｍｅａｓｉｎｇ、Ｊ、（１９８５）Ｇｅｎｅ３３　．１
０３３ｆｆ）を使用する。ＣのＴＩＴＪＣ１９ＤＮＳを
制限ヌクレアーゼＰｓｚｌを用いる切断により線状化し
アルカリ性ホスファターゼで処理する。プラスミドｐＨ
Ｐ　５２の３，３１ｃｂの長さのＰｓｚｆｉ−制限フラ
グメントのＤＮＳ　’ｚ　、Ｐｓｃ　Ｉ−を用いる野性
型シラスミド−ＤＮＳの切断の後に調製用アがロースデ
ル電気泳動により単離する。この線状化され、脱ホスホ
リル化されたベクターＤＮＳ及び６゜３　ｋｂの長さの
Ｐｓｃｌ−７ラグメントｔ１引絖ぎＴ　４　ＤＮＡ　＋
７が一ゼで連結６せる。この連結混合物で、Ｅ、コＩｊ
−ＤＨ５αは形質転換される。

この場合、２檜の型のクローンが得られ、これらは、そ
れぞれベクターｐＵＣ１９のＬａｃ　Ｚ’−因子の転写
方向に対するそれぞれ異なる方向で７ラグメ／トヲ含有
する。これは、クローンｐｐ５２及び１）Ｔ）　５２　
Ｐｓｃ　ｉｎｖ、でｂる。双方のクローンの匍」限地図
が第５図に水式れている。Ｅ。

コリーｐｐ５２Ｐ１１ｃｕのクローンは、インダクター
イソプロピル−β−〇−チオがラクトシトを培地に添加
の後に、カルバメート−ヒドロラーゼを発現する。クロ
ーンｐｐ　５２Ｐｓｃの対数培養物へのインダクター添
加なしに（１ａｅ−プロモータの未表現状態）、かつク
ローンｐｐ　５２ＰａＣ１ｎＶ、の未表現の（ｒｅｐｒ
ｉｍｉｅｒＺ　）及び誘導でれた対数培養物においては
、＃素工ヤス中で例６に記載の検を法により酵素活性は
立鉦できない。

このことは、ｐＴ）５２Ｐｓｃ型のクローン中のカルバ
メート−ヒドロラーゼ−遺伝子がベクターのＬａｃ　Ｚ
’内因子おけると同じ転写方向（５′−６′−配向）で
存在すること全意味する。アルトロバクタープロモータ
は明らかに、１１コリー中にＶ：Ｌ、認められない（か
つ又は不光分にのみ認められる）。

例８ アルトロバクター・オキシダンス（ｍａｐ５２）からの
カルバメート−ヒドロラーゼ−遺伝子のヌクレオチド虻
タリ及びこれから１１１！！帰された酵素の蛋白質配列 カルバメート−ヒドロラーゼ−遺伝子のヌクレオチド配
列をサンが−の方法で確認する（　Ｓａｎｇｅｒ、　Ｆ
、　Ｎ１ｅｋｌｅｎＩｌＳ、　＆　Ｃｏｕｌｓｏｎ、　
Ａ。

（１９７７）　ｐｒｏｅ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　
Ｓｃｉ、　ＵＳＡ７４．５４６３〜５４６８　）。

このために、クローンＥ、コリーｐｐ５２　Ｐ８ＺのＤ
ＮＳから出発し、−１鎮ＤＮＳ−バクテリオファージＭ
　１３　ｍｌ）　１８及びＭ　１３　ｍｐ　１９内で１
５クローンを構成する（　Ｍｅｓｓｉｎｇ、　Ｊ。

（１９８３）　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉ、ｎ　Ｅｎｚｙｎｎ
ｏｌ。１０１２０〜７８）。Ｅ、コリーＤＨ５αｙへの
トランスフェクションの後に−ｌ鎖組声えデソキシリボ
ヌクレイン酸の配列が確認される。

第６図には、カルバメート−ヒドロラーゼ−遺伝子の配
列決定法が水式れている。合計して１８６４塩基対の配
列が確認δれる（ストランド及び対向ストランド　第６
図参照）。

第７図には、こｔｌ、から誘導されるカルバメート−ヒ
ドロラーゼの蛋白員配列を有する確認ヌクレオチド配列
が水式れている。この読み枠は明らかに、例４に記載の
２個のＢｒＣＮ−切断ペプチドのアミノ酸部分配列によ
り定義される。この読み枠は、Ｔ（）Ａ−停止コドンで
終結している（第７図のヌクレオチド−位１ｉ１１７８
９〜１７９１）。翻訳開始コドンとしては、ＧＴＣ（ヌ
クレオチド位ａｍ３４０〜６４２）がこれに該当する。

これは、１４７９　ｂｐの最長の開放読み枠（会４９６
アミノ酸）を生じる。慣用のＡＴＧ開始コドンで開始す
るすべての開放読み枠は、蛋白質通過寸法（蛋白質の分
子１測定と比較）を生じない。

ＧＴＣ上の翻訳開始（位置６４０〜６４２）の固定は、
災に、推定ＧＴＧ−開始コｒンの７　ｂｐ上流の間隔で
、リボソマールＥ、コリー結合位置に関するコンセンサ
ス−配列に対して明らかなホモロゾー領域の存在により
支持される。

すべてのクローン化工程は、律準法で実施した（　Ｍａ
ｎｉａｃｉｓ　ｌ　’ｒ、　Ｆｒ１Ｚ８Ｃｈ、　Ｅ、　
Ｆ、　＆　ＳａｍｂｒｏｏｋＪ、（１９８２）によるＭ
ｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎ、　Ｙ、
　）　。この配列化反応は、［セクエナーゼ＠　ＤＮＡ
セクエンシングキッ　ト　（Ｂｅｑｕｅｎａｓｅ　ＲＤ
ＮＡ　　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　　Ｋｉｔｓ　　：Ｕｎ
ｉｚｅｄ　８ｉａｃｅｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃ
ｏｒｐｏｒａｚｉｏｎ　）の使用下に、製造者の指示に
従って実施される。

マークされた反応生成物の分離は、ポリアクリルアミド
６　（ｗ／ｖ）％／尿木デル中で行なった（　Ｍａｒａ
ｍ、　Ａ、　Ｍ、　＆　Ｇ１１ｂｅｒｃ、　Ｗ、　（１
９８０）Ｍｅｔｈｏｄ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　６５　＋　
４９７〜５５７　）。

【図面の簡単な説明】

第１図はアルトロバクター・オギンダンスから７工ンメ
シフアム分解性カルバメート−ヒドロラーゼを単離し、
引続き精製する方法を示す系統図であり、第２図は、粗
製エキス及び精製工程の後の単離嘔れ、プールされた蛋
白質フラクションの５Ｄ８−ポリアクリルアミドデル上
での電気泳動分離状態を示す（２）であり、第６図はカ
ルバメート−ヒドロラーゼの活性と一佃の間係を示す図
であり、第４図は、アルトロバクター・オキシダンス１
１株ｐ５２）からのプラスミドｐＨＰ　５２０制＠地図
であり、第５図は、カルバメート−ヒドロラーゼ−遺伝
子の１０−ユング法を示す図であり、第６図は、カルバ
メニトーヒドロラーゼー遺伝子の正確な位置（開始：（
）ＴＧ＝開始コドン、停止：ＴＡＧ＝停止コドン）を示
すクローン化された３、３　ｋｂ　Ｐｓｚ　Ｉ−制限フ
ラグメントの制限地図であり、第７図は、カルバメート
−ヒドロラーゼ−遺伝子のヌクレオチド配列を示す図で
ある。 図面の浄書（内容に変更なし） 第１図 活性 第３図 第５図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、フエンメジフアムの２つのフェニル核の間の−ＯＯ
   Ｃ−Ｎ−結合の分解に寄与するアルトロバクター・オキ
   シダンスからのカルバメートヒドロラーゼを単離し、引
   続き精製する方法において、アルトロバクター・オキシ
   ダンスの微生物を栄養培地中で培養し、引続き、カルバ
   メート−ヒドロラーゼを超音波−細胞崩壊及び遠心分離
   により単離し、アニオン交換体−クロマトグラフィ、勾
   配溶離、硫酸アンモニウム沈殿、ゲル濾過及びＦＰＬＣ
   −分離により電気泳動的な均一性に達するまで精製し、
   この際、カルバメート−ヒドロラーゼは、至適ｐＨ６．
   ８、５０〜６０ｋｄの範囲の分子量及び等電点ｐＩ＝６
   ．２を有することを特徴とする、除草剤フエンメジフア
   ムの失活化のための遺伝子−酵素系を単離し、引続き精
   製する方法。 ２、アミノ酸配列 ペプチド I ： 【遺伝子配列があります】 ペプチドII： 【遺伝子配列があります】 を有することを特徴とする、カルバメート−ヒドロラー
   ゼのＢｒＣＮ−分解ペプチド。 ３、配列 オリゴヌクレオチド I ： 【遺伝子配列があります】 オリゴヌクレオチドII： 【遺伝子配列があります】 オリゴヌクレオチドIII： 【遺伝子配列があります】 の合成ヌクレオチドを製造するため、請求項２に記載の
   ペプチド I 及びIIを使用することを特徴とする、合成
   オリゴヌクレオチドの製法。 ４、カルバメート−ヒドロラーゼ−遺伝子の単離のため
   に、請求項３に記載の合成オリゴヌクレオチドを使用す
   ることを特徴とする、カルバメート−ヒドロラーゼ−遺
   伝子の単離法。 ５、４１ｋｂの長さのプラスミドｐＨＰ５２を３．３ｋ
   ｂの長さのＰｓｔ−制限フラグメントと共に含有し、そ
   の上にカルバメート−ヒドロラーゼ−遺伝子が局在して
   いる、アルトロバクター・オキシダンスｐ５２（ｐＨＰ
   ５２）（ＤＳＭ４０４４）。 ６、カルバメート−ヒドロラーゼ−遺伝子は、１４７９
   塩基対のヌクレオチド配列を有するレーゼラスターより
   なる、請求項５記載のアルトロバクターオキシダンス。 ７、アルトロバクター・オキシダンスｐ１６／４／Ｂ（
   ＤＳＭ４０３８）。 ８、アルトロバクター・オキシダンスｐ６７（ＤＳＭ４
   ０３９）。 ９、アルトロバクター・オキシダンスｐ７５（ＤＳＭ４
   ０４０）。 １０、アルトロバクター・オキシダンスｐ１１／１／−
   ｂ（ＤＳＭ４０４１）。 １１、アルトロバクター・オキシダンスｐ１５／４／Ａ
   （ＤＳＭ４０４５）。 １２、アルトロバクター・オキシダンスｐ２１／２（Ｄ
   ＳＭ４０４６）。