JPH09220093A - イノシトール−１−リン酸合成酵素をコードするｄｎａ、それを含む組換えｄｎａ、形質転換体およびそれを用いたイノシトールの製造方法 - Google Patents
イノシトール−１−リン酸合成酵素をコードするｄｎａ、それを含む組換えｄｎａ、形質転換体およびそれを用いたイノシトールの製造方法Info
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- JPH09220093A JPH09220093A JP8028355A JP2835596A JPH09220093A JP H09220093 A JPH09220093 A JP H09220093A JP 8028355 A JP8028355 A JP 8028355A JP 2835596 A JP2835596 A JP 2835596A JP H09220093 A JPH09220093 A JP H09220093A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】微生物のイノシトール生産能を向上させる。
【解決手段】イノシトール−１−リン酸合成酵素をコー
ドするＤＮＡにより微生物を形質転換する。
ドするＤＮＡにより微生物を形質転換する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】イノシトールは、高等動物に
おいてビタミンの１種として重要な物質で、栄養食品、
飼料添加物、医薬品などに利用される。このイノシトー
ルの生合成においてグルコース−６−リン酸からイノシ
トール−１−リン酸への反応をつかさどる酵素がイノシ
トール−１−リン酸合成酵素である。本発明は、該酵素
をコードするＤＮＡと、そのＤＮＡを含む組み換えＤＮ
Ａ並びに形質転換体に関するものであり、イノシトール
の微生物による生産能を向上させるために有効な技術で
ある。
おいてビタミンの１種として重要な物質で、栄養食品、
飼料添加物、医薬品などに利用される。このイノシトー
ルの生合成においてグルコース−６−リン酸からイノシ
トール−１−リン酸への反応をつかさどる酵素がイノシ
トール−１−リン酸合成酵素である。本発明は、該酵素
をコードするＤＮＡと、そのＤＮＡを含む組み換えＤＮ
Ａ並びに形質転換体に関するものであり、イノシトール
の微生物による生産能を向上させるために有効な技術で
ある。
【０００２】
【従来の技術】従来イノシトールは、米糠、コーンステ
ィープリカーなどからの抽出（特開昭６１−５６１４
２）、パン酵母を培養して製造する方法（Ｅｕｒ．Ｐａ
ｔ．５０６２８９（１９９２））などが知られている。
またパン酵母ではイノシトール−１−リン酸合成酵素遺
伝子を用い、イノシトール蓄積濃度を向上させることが
できることを明かにしている。
ィープリカーなどからの抽出（特開昭６１−５６１４
２）、パン酵母を培養して製造する方法（Ｅｕｒ．Ｐａ
ｔ．５０６２８９（１９９２））などが知られている。
またパン酵母ではイノシトール−１−リン酸合成酵素遺
伝子を用い、イノシトール蓄積濃度を向上させることが
できることを明かにしている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】米糠、コーンスティー
プリカーなどから抽出する方法は、イノシトール以外の
不純物が多く、精製が困難であり、経済的に問題があ
る。また、パン酵母を培養して製造する方法は、生産性
が低く、やはり経済的に問題がある。また、パン酵母以
外にはイノシトールを菌体外に生産する微生物は、知ら
れていない。
プリカーなどから抽出する方法は、イノシトール以外の
不純物が多く、精製が困難であり、経済的に問題があ
る。また、パン酵母を培養して製造する方法は、生産性
が低く、やはり経済的に問題がある。また、パン酵母以
外にはイノシトールを菌体外に生産する微生物は、知ら
れていない。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記問題
点を解決するため、パン酵母以外にイノシトールを生産
する潜在能力を持つ微生物を探索し、イノシトールを菌
体外に分泌する微生物を広く検討した結果、キャンディ
ダ属に属する微生物の変異株がイノシトールを菌体外に
分泌することを見出した。さらに一連のイノシトール生
合成反応の中から、イノシトール−１−リン酸合成酵素
が律速反応であると推定し、該酵素をコードするＤＮＡ
を単離し、イノシトールを分泌しないキャンディダ属ボ
イディニイ種に属する微生物を形質転換したところ、著
量のイノシトールを分泌することがわかった。
点を解決するため、パン酵母以外にイノシトールを生産
する潜在能力を持つ微生物を探索し、イノシトールを菌
体外に分泌する微生物を広く検討した結果、キャンディ
ダ属に属する微生物の変異株がイノシトールを菌体外に
分泌することを見出した。さらに一連のイノシトール生
合成反応の中から、イノシトール−１−リン酸合成酵素
が律速反応であると推定し、該酵素をコードするＤＮＡ
を単離し、イノシトールを分泌しないキャンディダ属ボ
イディニイ種に属する微生物を形質転換したところ、著
量のイノシトールを分泌することがわかった。
【０００５】
【発明の実施の形態】本発明においてＤＮＡの供与微生
物は、キャンディダ属ボイディニイ種に属する微生物が
好ましく用いられ、特に、樹液からメタノールを唯一の
炭素源として利用できる微生物として単離され、本発明
者らの研究室で保存していた、キャンディダ・ボイディ
ニイ（Candida boidinii）ＴＲ−１（FERM BP-5076）か
らイノシトールを分泌する変異株として取得されたキャ
ンディダ・ボイディニイ（Candida boidinii）DGR1-14
（FERM BP-5070）のようなイノシトールを分泌する微生
物であることが好ましい。他に、薬剤に対する耐性、栄
養要求性などの性質があってもよく、キャンディダ属ボ
イディニイ種に属する微生物はすべて本発明に含まれる
ものである。なおキャンディダ・ボイディニイ（Candid
a boidinii）ＴＲ−１（FERM BP-5076）がキャンディダ
属ボイディニイ種に属する微生物であることは特願平６
−１７５３１７に記載されている。
物は、キャンディダ属ボイディニイ種に属する微生物が
好ましく用いられ、特に、樹液からメタノールを唯一の
炭素源として利用できる微生物として単離され、本発明
者らの研究室で保存していた、キャンディダ・ボイディ
ニイ（Candida boidinii）ＴＲ−１（FERM BP-5076）か
らイノシトールを分泌する変異株として取得されたキャ
ンディダ・ボイディニイ（Candida boidinii）DGR1-14
（FERM BP-5070）のようなイノシトールを分泌する微生
物であることが好ましい。他に、薬剤に対する耐性、栄
養要求性などの性質があってもよく、キャンディダ属ボ
イディニイ種に属する微生物はすべて本発明に含まれる
ものである。なおキャンディダ・ボイディニイ（Candid
a boidinii）ＴＲ−１（FERM BP-5076）がキャンディダ
属ボイディニイ種に属する微生物であることは特願平６
−１７５３１７に記載されている。
【０００６】一方キャンディダ・ボイディニイ由来のイ
ノシトール−１−リン酸合成酵素をコードするＤＮＡを
大腸菌で機能する制御遺伝子に接続して、大腸菌に導入
したところ、著量のイノシトールを分泌することが明か
となった。従って、キャンディダ・ボイディニイ由来の
イノシトール−１−リン酸合成酵素をコードするＤＮＡ
を大腸菌で機能する制御遺伝子に接続して、大腸菌に導
入した形質転換体によるイノシトールの製造も本発明に
含まれる。
ノシトール−１−リン酸合成酵素をコードするＤＮＡを
大腸菌で機能する制御遺伝子に接続して、大腸菌に導入
したところ、著量のイノシトールを分泌することが明か
となった。従って、キャンディダ・ボイディニイ由来の
イノシトール−１−リン酸合成酵素をコードするＤＮＡ
を大腸菌で機能する制御遺伝子に接続して、大腸菌に導
入した形質転換体によるイノシトールの製造も本発明に
含まれる。
【０００７】本発明のＤＮＡの単離法について説明す
る。キャンディダ属ボイディニイ種（以下Candida boid
iniiと記す）の染色体ＤＮＡの取得法は、パン酵母の方
法と同様であり、たとえば名取俊二（新生化学実験講座
１７微生物実験法ｐ２４５−２４６）の方法が例として
あげられる。イノシトール−１−リン酸合成酵素をコー
ドするＤＮＡの単離法は、パン酵母のイノシトール−１
−リン酸合成酵素をコードするＤＮＡの一部および全体
をプローブとした、コロニーハイブリダイゼーション法
が好ましい。具体的には、Candida boidiniiの染色体Ｄ
ＮＡを適当な制限酵素で切断したＤＮＡと、パン酵母の
イノシトール−１−リン酸合成酵素をコードするＤＮＡ
の一部および全体をプローブとした、サザンハイブリダ
イゼーションを行い、ハイブリダイズする分子量のＤＮ
Ａをあつめ、大腸菌用の適当なベクターにつなぎ込み、
適当な大腸菌を形質転換し、この形質転換体とパン酵母
のイノシトール−１−リン酸合成酵素をコードするＤＮ
Ａの一部および全体をプローブとした、コロニーハイブ
リダイゼーションにより、目的のＤＮＡをもった形質転
換株を取得する。
る。キャンディダ属ボイディニイ種（以下Candida boid
iniiと記す）の染色体ＤＮＡの取得法は、パン酵母の方
法と同様であり、たとえば名取俊二（新生化学実験講座
１７微生物実験法ｐ２４５−２４６）の方法が例として
あげられる。イノシトール−１−リン酸合成酵素をコー
ドするＤＮＡの単離法は、パン酵母のイノシトール−１
−リン酸合成酵素をコードするＤＮＡの一部および全体
をプローブとした、コロニーハイブリダイゼーション法
が好ましい。具体的には、Candida boidiniiの染色体Ｄ
ＮＡを適当な制限酵素で切断したＤＮＡと、パン酵母の
イノシトール−１−リン酸合成酵素をコードするＤＮＡ
の一部および全体をプローブとした、サザンハイブリダ
イゼーションを行い、ハイブリダイズする分子量のＤＮ
Ａをあつめ、大腸菌用の適当なベクターにつなぎ込み、
適当な大腸菌を形質転換し、この形質転換体とパン酵母
のイノシトール−１−リン酸合成酵素をコードするＤＮ
Ａの一部および全体をプローブとした、コロニーハイブ
リダイゼーションにより、目的のＤＮＡをもった形質転
換株を取得する。
【０００８】取得したＤＮＡの制限酵素地図、塩基配列
などの決定は通常行われている方法にしたがう。
などの決定は通常行われている方法にしたがう。
【０００９】次にCandida boidiniiを形質転換する方法
について説明する。宿主としては、該菌株のURA3遺伝子
欠損株などをマーカーとした株を用いる。ベクターとし
ては該菌株用のものでＵＲＡ３遺伝子などを保持したも
のが用いられ、例えばｐＮＯＴｅＲＩ（図２)が用いら
れる。このようなベクターの適当な制限酵素切断部位
に、上記のように取得したイノシトール−１−リン酸合
成酵素をコードするＤＮＡを挿入し、形質転換用ＤＮＡ
を調製する。形質転換は細胞融合法、リチウム酢酸法な
ど通常の方法が用いられるが、阪井らの方法（遺伝子発
現実験マニュアル（講談社サイエンティフィク）ｐ１０
８−１１０、石田功・安東民衛編）が最も効率的方法と
して用いられる。
について説明する。宿主としては、該菌株のURA3遺伝子
欠損株などをマーカーとした株を用いる。ベクターとし
ては該菌株用のものでＵＲＡ３遺伝子などを保持したも
のが用いられ、例えばｐＮＯＴｅＲＩ（図２)が用いら
れる。このようなベクターの適当な制限酵素切断部位
に、上記のように取得したイノシトール−１−リン酸合
成酵素をコードするＤＮＡを挿入し、形質転換用ＤＮＡ
を調製する。形質転換は細胞融合法、リチウム酢酸法な
ど通常の方法が用いられるが、阪井らの方法（遺伝子発
現実験マニュアル（講談社サイエンティフィク）ｐ１０
８−１１０、石田功・安東民衛編）が最も効率的方法と
して用いられる。
【００１０】取得した形質転換株についてはサザンハイ
ブリダーゼーション法（プローブとしては該菌株のＵＲ
Ａ３遺伝子など）で、遺伝子導入の確認を行い、更にJ.
E.G.Bannett, R.E.Brice and D.L.Corina の方法（Bioc
hemical Journal １１９ ｐ１８３−１８６(１９７
０)）でイノシトール−１−リン酸合成酵素活性を測定
する。
ブリダーゼーション法（プローブとしては該菌株のＵＲ
Ａ３遺伝子など）で、遺伝子導入の確認を行い、更にJ.
E.G.Bannett, R.E.Brice and D.L.Corina の方法（Bioc
hemical Journal １１９ ｐ１８３−１８６(１９７
０)）でイノシトール−１−リン酸合成酵素活性を測定
する。
【００１１】発酵法における培養方法について説明す
る。イノシトール生産用の培地は、炭素源、窒素源、無
機イオンおよび必要に応じてその他の有機微量成分を含
有する通常の培地である。
る。イノシトール生産用の培地は、炭素源、窒素源、無
機イオンおよび必要に応じてその他の有機微量成分を含
有する通常の培地である。
【００１２】炭素源としては、グルコース、フラクトー
ス、でんぷんおよびセルロースの加水分解物、糖蜜など
の糖類、フマール酸、クエン酸、コハク酸のごとき有機
酸、メタノール、エタノール、グリセロールのごときア
ルコール類などを１〜１５％、窒素源として、酢酸アン
モニウムのごとき有機アンモニウム塩、硫酸アンモニウ
ム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、硝酸アン
モニウム、のごとき無機アンモニウム塩、アンモニアガ
ス、アンモニア水、尿素等を０．１〜４．０％、有機微
量成分としては、ビオチン等の被要求性物質が０．００
０００１％〜０．１％、また必要に応じて、コーンステ
ィープリカー、ペプトン、酵母エキス等０〜５％をそれ
ぞれ適当に含有する培地が用いられる。これらの他に、
リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウム、
塩化ナトリウム、硫酸亜鉛、硫酸銅、硫酸第１鉄、等が
微量成分として添加される。また好ましくは消泡剤など
も添加し、培養条件の安定化をはかる。またこれらの成
分を適当に含有した市販の培地を用いることもできる。
ス、でんぷんおよびセルロースの加水分解物、糖蜜など
の糖類、フマール酸、クエン酸、コハク酸のごとき有機
酸、メタノール、エタノール、グリセロールのごときア
ルコール類などを１〜１５％、窒素源として、酢酸アン
モニウムのごとき有機アンモニウム塩、硫酸アンモニウ
ム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、硝酸アン
モニウム、のごとき無機アンモニウム塩、アンモニアガ
ス、アンモニア水、尿素等を０．１〜４．０％、有機微
量成分としては、ビオチン等の被要求性物質が０．００
０００１％〜０．１％、また必要に応じて、コーンステ
ィープリカー、ペプトン、酵母エキス等０〜５％をそれ
ぞれ適当に含有する培地が用いられる。これらの他に、
リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウム、
塩化ナトリウム、硫酸亜鉛、硫酸銅、硫酸第１鉄、等が
微量成分として添加される。また好ましくは消泡剤など
も添加し、培養条件の安定化をはかる。またこれらの成
分を適当に含有した市販の培地を用いることもできる。
【００１３】培養は好気条件で行う。培養の間、培地の
ｐＨ３〜８に、温度は２０〜３５℃に調節し、２４〜９
６時間振とうまたは通気撹拌培養すれば好ましい結果が
得られる。
ｐＨ３〜８に、温度は２０〜３５℃に調節し、２４〜９
６時間振とうまたは通気撹拌培養すれば好ましい結果が
得られる。
【００１４】一方適当な培地を用いて培養した菌体を用
い、グルコースあるいはグルコース−６−リン酸を基質
とした菌体反応でもイノシトールを製造することがで
き、このような反応によるイノシトールの製造も本発明
に含まれる。
い、グルコースあるいはグルコース−６−リン酸を基質
とした菌体反応でもイノシトールを製造することがで
き、このような反応によるイノシトールの製造も本発明
に含まれる。
【００１５】培養液あるいは反応液からイノシトールを
採取するには公知の方法で可能である。例えば、菌体を
遠心分離などで除去した後、カチオンおよびアニオン交
換樹脂でイオン性の物質を除き、濃縮すればイノシトー
ルの結晶を取得することができる。
採取するには公知の方法で可能である。例えば、菌体を
遠心分離などで除去した後、カチオンおよびアニオン交
換樹脂でイオン性の物質を除き、濃縮すればイノシトー
ルの結晶を取得することができる。
【００１６】
１．遺伝子の取得 （１）プローブＤＮＡの調製 Saccharomyces cerevisiae ATCC14893から染色体ＤＮＡ
の取得を名取俊二（新生化学実験講座１７微生物実験法
ｐ２４５−２４６）の方法により行なった。一方M.Dean
-Johnson and S.A.Henry（Journal of Biological Chem
istry２６４ｐ１２７４−１２８３(１９８９)）の報告
に基づき、Saccharomyces cerevisiaeのＩＮＯ１遺伝子
の一部、５’末端側の塩基配列、３’末端側の塩基配列
に制限酵素BamHIで切断される塩基配列および適当な３
塩基を接続したものをプライマー（プライマーＡおよび
Ｂ）とし、荒井健樹、土師秀隆の方法（蛋白質核酸酵素
３５ｐ３１６４−３１７０）に従いSaccharomyces cere
visiae ATCC14893から染色体ＤＮＡを鋳型とし、ポリマ
ーチェイン反応（ＰＣＲ）を行ない、合成したＤＮＡを
ベクターｐＵＣ１１９（宝酒造社製）を制限酵素Ｂａｍ
ＨＩで切断したものに接続した（ｐＹＳＩ０２）。必要
に応じ、ｐＹＳＩ０２から導入部分（約１．２ｋｂｐ）
を制限酵素ＢａｍＨＩで切り出し、アガロースゲル電気
泳動で精製して、後に示すサザンハイブリダイゼーショ
ンおよびコロニーハイブリダイゼーションにプローブと
して用いた。
の取得を名取俊二（新生化学実験講座１７微生物実験法
ｐ２４５−２４６）の方法により行なった。一方M.Dean
-Johnson and S.A.Henry（Journal of Biological Chem
istry２６４ｐ１２７４−１２８３(１９８９)）の報告
に基づき、Saccharomyces cerevisiaeのＩＮＯ１遺伝子
の一部、５’末端側の塩基配列、３’末端側の塩基配列
に制限酵素BamHIで切断される塩基配列および適当な３
塩基を接続したものをプライマー（プライマーＡおよび
Ｂ）とし、荒井健樹、土師秀隆の方法（蛋白質核酸酵素
３５ｐ３１６４−３１７０）に従いSaccharomyces cere
visiae ATCC14893から染色体ＤＮＡを鋳型とし、ポリマ
ーチェイン反応（ＰＣＲ）を行ない、合成したＤＮＡを
ベクターｐＵＣ１１９（宝酒造社製）を制限酵素Ｂａｍ
ＨＩで切断したものに接続した（ｐＹＳＩ０２）。必要
に応じ、ｐＹＳＩ０２から導入部分（約１．２ｋｂｐ）
を制限酵素ＢａｍＨＩで切り出し、アガロースゲル電気
泳動で精製して、後に示すサザンハイブリダイゼーショ
ンおよびコロニーハイブリダイゼーションにプローブと
して用いた。
【００１７】プライマーＡ：５ CGCGGATCCATGACAGAAAA
TATTGCTCC ３′ プライマーＢ：５′ CGGGATCCGTCCATTGCGACTTTTGAGTCC
CC ３′ （２）サザンハイブリダイゼーション Candida boidinii DGR1-14(FERM-P)からSaccharomyces
cerevisiaeと同様の方法で染色体ＤＮＡを取得した。こ
のＤＮＡを各種制限酵素で切断し、アガロースゲル電気
泳動を行ない、常法どおりナイロンメンブレンフィルタ
ーにＤＮＡをトランスファーし、ＤＩＧ法（ベーリンガ
ー社キット使用）（野村慎太郎、稲澤譲治の方法（細胞
工学別冊９ 脱アイソトープ実験プロトコール１ ＤＩ
Ｇハイブリダイゼーションｐ３５−４３）に従う）でハ
イブリダイゼーションを行なった。
TATTGCTCC ３′ プライマーＢ：５′ CGGGATCCGTCCATTGCGACTTTTGAGTCC
CC ３′ （２）サザンハイブリダイゼーション Candida boidinii DGR1-14(FERM-P)からSaccharomyces
cerevisiaeと同様の方法で染色体ＤＮＡを取得した。こ
のＤＮＡを各種制限酵素で切断し、アガロースゲル電気
泳動を行ない、常法どおりナイロンメンブレンフィルタ
ーにＤＮＡをトランスファーし、ＤＩＧ法（ベーリンガ
ー社キット使用）（野村慎太郎、稲澤譲治の方法（細胞
工学別冊９ 脱アイソトープ実験プロトコール１ ＤＩ
Ｇハイブリダイゼーションｐ３５−４３）に従う）でハ
イブリダイゼーションを行なった。
【００１８】（３）コロニーハイブリダイゼーション サザンハイブリダイゼーションの結果に基づき、Candid
a boidinii DGR1-14(FERM-P)の染色体ＤＮＡを制限酵素
ＨｉｎｄＩＩＩで切断し、アガロースゲル電気泳動を行
ない、分子量５．０ｋｂｐ近辺のＤＮＡを抽出し、ベク
ターｐＵＣ１１９（宝酒造社製）を制限酵素ＨｉｎｄＩ
ＩＩで切断したものに接続した（ｐＹＳＩ１０５）。こ
のＤＮＡを用い、大腸菌ＪＭ１０５を形質転換し、出現
したコロニーについてＤＩＧ法（ベーリンガー社キット
使用）（野村慎太郎、稲澤譲治の方法（細胞工学別冊９
脱アイソトープ実験プロトコール１ ＤＩＧハイブリダ
イゼーションｐ３１−３４）に従う）でコロニーハイブ
リダイゼーションを行ない、ポシティブクローンを取得
した(菌株名：Echerichia coli SNINO1(工業技術院生命
工学工業技術研究所に寄託) ）。
a boidinii DGR1-14(FERM-P)の染色体ＤＮＡを制限酵素
ＨｉｎｄＩＩＩで切断し、アガロースゲル電気泳動を行
ない、分子量５．０ｋｂｐ近辺のＤＮＡを抽出し、ベク
ターｐＵＣ１１９（宝酒造社製）を制限酵素ＨｉｎｄＩ
ＩＩで切断したものに接続した（ｐＹＳＩ１０５）。こ
のＤＮＡを用い、大腸菌ＪＭ１０５を形質転換し、出現
したコロニーについてＤＩＧ法（ベーリンガー社キット
使用）（野村慎太郎、稲澤譲治の方法（細胞工学別冊９
脱アイソトープ実験プロトコール１ ＤＩＧハイブリダ
イゼーションｐ３１−３４）に従う）でコロニーハイブ
リダイゼーションを行ない、ポシティブクローンを取得
した(菌株名：Echerichia coli SNINO1(工業技術院生命
工学工業技術研究所に寄託) ）。
【００１９】（４）制限酵素地図の作成 ｐＩＳＩ１０５を各種制限酵素で切断し、図１に示した
ような制限酵素地図を作成した。
ような制限酵素地図を作成した。
【００２０】（５）塩基配列およびアミノ酸配列決定 取得ＤＮＡを必要に応じて制限酵素で切断し、ベクター
としてはｐＵＣ１１９、宿主としては大腸菌ＪＭ１０５
を用い、サブクローニングし、塩基配列の決定を行なっ
た。手法としてはサンガー法を用い、装置としてはＤＮ
Ａシークエンサー（Applied Biosystems社373S）を用い
て行なった。そのイノシトール−１−リン酸合成酵素を
コードしている、オープンリーディングフレームのアミ
ノ酸配列および塩基配列を配列表１および２に示した。
としてはｐＵＣ１１９、宿主としては大腸菌ＪＭ１０５
を用い、サブクローニングし、塩基配列の決定を行なっ
た。手法としてはサンガー法を用い、装置としてはＤＮ
Ａシークエンサー（Applied Biosystems社373S）を用い
て行なった。そのイノシトール−１−リン酸合成酵素を
コードしている、オープンリーディングフレームのアミ
ノ酸配列および塩基配列を配列表１および２に示した。
【００２１】（６）パン酵母での機能確認 Saccharomyces cerevisiae ATCC14893(ＩＮＯ１遺伝子
欠損(イノシトール要求性))をＮＴＧで変異処理し、J.
D.Boeke, F.LaCroute and G.R.Finkの方法（Molecular
General Genetics１９７ｐ３４５−３４６(１９８４）
に従い、５−フルオロオロチン酸耐性の性質を指標にＵ
ＲＡ３遺伝子欠損株を取得し、宿主とした（Saccharomy
ces cerevisiae FOAR88（ＩＮＯ１， ＵＲＡ３遺伝子
欠損）（イノシトール、ウラシル両要求性）。なおＵＲ
Ａ３遺伝子の産物であるオロチジン−５−カルボン酸脱
炭酸酵素活性をA.Yoshimoto, K.Umezu, K.Kobayashi an
d K.Tomitaの方法（Method in Enzymology５１ｐ７４−
７９(１９７８))に従い測定し、ＵＲＡ３遺伝子欠損株
であることを確認した。
欠損(イノシトール要求性))をＮＴＧで変異処理し、J.
D.Boeke, F.LaCroute and G.R.Finkの方法（Molecular
General Genetics１９７ｐ３４５−３４６(１９８４）
に従い、５−フルオロオロチン酸耐性の性質を指標にＵ
ＲＡ３遺伝子欠損株を取得し、宿主とした（Saccharomy
ces cerevisiae FOAR88（ＩＮＯ１， ＵＲＡ３遺伝子
欠損）（イノシトール、ウラシル両要求性）。なおＵＲ
Ａ３遺伝子の産物であるオロチジン−５−カルボン酸脱
炭酸酵素活性をA.Yoshimoto, K.Umezu, K.Kobayashi an
d K.Tomitaの方法（Method in Enzymology５１ｐ７４−
７９(１９７８))に従い測定し、ＵＲＡ３遺伝子欠損株
であることを確認した。
【００２２】一方ｐＹＳＩ１０５を制限酵素ＨｉｎｄＩ
Ｉで切断し、導入部分をアガロースゲル電気泳動で精製
した後、大腸菌パン酵母のシャトルベクターであるｐＲ
Ｓ４２６（Stratagene社製）を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ
で切断したものと接続し（ｐＲＳ４２６０１（ＵＲＡ３
遺伝子保持））た。
Ｉで切断し、導入部分をアガロースゲル電気泳動で精製
した後、大腸菌パン酵母のシャトルベクターであるｐＲ
Ｓ４２６（Stratagene社製）を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ
で切断したものと接続し（ｐＲＳ４２６０１（ＵＲＡ３
遺伝子保持））た。
【００２３】ｐＲＳ４２６０１を用い、Saccharomyces
cerevisiae FOAR88（ＩＮＯ１，ＵＲＡ３遺伝子欠損）
をH.Ito, Y.Fukuda, K.Murata and K.Kimuraの方法（Jo
urnal of Bacteriology ｐ１６３−１６８(１９８３))
に従い形質転換したところ、イノシトール、ウラシル両
非要求性株が出現した。このことから取得遺伝子にはIN
O1遺伝子としての機能があることが確認された。
cerevisiae FOAR88（ＩＮＯ１，ＵＲＡ３遺伝子欠損）
をH.Ito, Y.Fukuda, K.Murata and K.Kimuraの方法（Jo
urnal of Bacteriology ｐ１６３−１６８(１９８３))
に従い形質転換したところ、イノシトール、ウラシル両
非要求性株が出現した。このことから取得遺伝子にはIN
O1遺伝子としての機能があることが確認された。
【００２４】（７）Candida boidiniiへの導入 取得したＩＮＯ１遺伝子のオープンリーディングフレー
ム部分の両端の塩基配列にＮｏｔＩで切断されるような
塩基配列を加えたプライマーを合成し、先に示したＰＣ
Ｒ法により遺伝子を合成し、制限酵素ＮｏｔＩで切断し
たベクターｐＮＯＴｅＲＩ（大腸菌Ｃａｎｄｉｄａ ｂ
ｏｉｄｉｎｉｉシャトルベクター）と接続した。（図
２）（ｐＹＳＩ３０８−８）宿主Ｃａｎｄｉｄａ ｂｏ
ｉｄｉｎｉｉ ＴＫ６２（ＵＲＡ３欠損株）をｐＹＳＩ
３８０−８を用いて阪井らの方法（遺伝子発現実験マニ
ュアル（講談社サイエンティフィク）ｐ１０８−１１
０、石田功・安東民衛編）により形質転換した。その結
果形質転換株Candida boidinii TF1株（工業技術院生命
工学工業技術研究所に寄託）を得た。
ム部分の両端の塩基配列にＮｏｔＩで切断されるような
塩基配列を加えたプライマーを合成し、先に示したＰＣ
Ｒ法により遺伝子を合成し、制限酵素ＮｏｔＩで切断し
たベクターｐＮＯＴｅＲＩ（大腸菌Ｃａｎｄｉｄａ ｂ
ｏｉｄｉｎｉｉシャトルベクター）と接続した。（図
２）（ｐＹＳＩ３０８−８）宿主Ｃａｎｄｉｄａ ｂｏ
ｉｄｉｎｉｉ ＴＫ６２（ＵＲＡ３欠損株）をｐＹＳＩ
３８０−８を用いて阪井らの方法（遺伝子発現実験マニ
ュアル（講談社サイエンティフィク）ｐ１０８−１１
０、石田功・安東民衛編）により形質転換した。その結
果形質転換株Candida boidinii TF1株（工業技術院生命
工学工業技術研究所に寄託）を得た。
【００２５】（８）形質転換の確認 Candida boidinii TF1株から阪井らの方法（遺伝子発現
実験マニュアル（講談社サイエンティフィク）ｐ１１０
−１１２、石田功・安東民衛編）に従い、染色体ＤＮＡ
を取得し、ＵＲＡ３遺伝子をプローブとしてサザンハイ
ブリダイゼーションをおこなったところ、非形質転換株
とは異なる分子量のハイブリダイズするＤＮＡを検出
し、Candida boidinii TF1株が形質転換体であることを
確認した。
実験マニュアル（講談社サイエンティフィク）ｐ１１０
−１１２、石田功・安東民衛編）に従い、染色体ＤＮＡ
を取得し、ＵＲＡ３遺伝子をプローブとしてサザンハイ
ブリダイゼーションをおこなったところ、非形質転換株
とは異なる分子量のハイブリダイズするＤＮＡを検出
し、Candida boidinii TF1株が形質転換体であることを
確認した。
【００２６】（９）形質転換体のイノシトール−１−リ
ン酸合成酵素活性 Candida boidinii TF1株および宿主のイノシトール−１
−リン酸合成酵素活性について、J.E.G.Bannett, R.E.B
rice and D.L.Corina の方法（Biochemical Journal １
１９ｐ１８３−１８６(１９７０))に従い活性測定を行
なったところ、表１の様な結果を得た。明らかにイノシ
トール−１−リン酸合成酵素活性が高くなっていること
がわかった。
ン酸合成酵素活性 Candida boidinii TF1株および宿主のイノシトール−１
−リン酸合成酵素活性について、J.E.G.Bannett, R.E.B
rice and D.L.Corina の方法（Biochemical Journal １
１９ｐ１８３−１８６(１９７０))に従い活性測定を行
なったところ、表１の様な結果を得た。明らかにイノシ
トール−１−リン酸合成酵素活性が高くなっていること
がわかった。
【００２７】（10）形質転換体のイノシトール分泌生産 Candida boidinii TF1株および宿主Candida boidinii T
K62株について、下記組成の培地を用い培養を行ない、
培養上清のイノシトール分泌量を定量したところ表２に
示した結果を得た。
K62株について、下記組成の培地を用い培養を行ない、
培養上清のイノシトール分泌量を定量したところ表２に
示した結果を得た。
【００２８】前培養：グルコース０．１％、硫酸アンモ
ニウム０．０５％、Yeast nitrogenbase without amino
acid(DIFCO社製）０．０１７％ ５ml／１８mmF試験管 本培養：メタノール０．１５％、硫酸アンモニウム０．
０５％、酵母エキス０.０５％、Yeast nitrogen base w
ithout aminoacid(DIFCO社製）０．０１７％、前培養液
１０％ ５０ ml／５００ml坂口フラスコこのようにイ
ノシトールを全く分泌しない宿主に対して、形質転換体
では著量のイノシトールを分泌することを確認した。
ニウム０．０５％、Yeast nitrogenbase without amino
acid(DIFCO社製）０．０１７％ ５ml／１８mmF試験管 本培養：メタノール０．１５％、硫酸アンモニウム０．
０５％、酵母エキス０.０５％、Yeast nitrogen base w
ithout aminoacid(DIFCO社製）０．０１７％、前培養液
１０％ ５０ ml／５００ml坂口フラスコこのようにイ
ノシトールを全く分泌しない宿主に対して、形質転換体
では著量のイノシトールを分泌することを確認した。
【００２９】
【発明の効果】本発明に示した様な遺伝子組み換えによ
り、イノシトールの蓄積濃度が向上した、菌株を取得で
き、そのような組み換え株を用い、既存の方法と比較
し、より経済的なイノシトールの生産が可能となる。
り、イノシトールの蓄積濃度が向上した、菌株を取得で
き、そのような組み換え株を用い、既存の方法と比較
し、より経済的なイノシトールの生産が可能となる。
【００３０】
配列番号：１ 配列の長さ：５２６ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド（タンパク質） 配列 Met Thr Tyr Gln Phe Val Pro Thr Val Lys Val Asp Asn Asp Asn 1 5 10 15 Cys Thr Tyr Thr Asp Ser Glu Leu Val Thr Lys Tyr Thr Tyr Lys 20 25 30 Asn Ser Val Val Thr Lys Glu Ser Asn Gly Ser Phe Ser Ile Lys 35 40 45 Pro Lys Thr Glu Asp Tyr Glu Phe Lys Val Asp Leu Lys Val Pro 50 55 60 Lys Leu Gly Val Met Leu Val Gly Leu Gly Gly Asn Asn Gly Thr 65 70 75 Thr Phe Cys Ala Ala His Phe Ala Asn Lys His Asn Ile Glu Phe 80 85 90 Asn Thr Lys Glu Gly Val Val Lys Pro Asn Tyr Tyr Gly Ser Val 95 100 105 Thr Gln Ser Ala Thr Ile Lys Leu Gly Ile Asp Glu Glu Gly Leu 110 115 120 Asp Val Tyr Ala Pro Phe Asn Ser Leu Leu Pro Phe Thr Asn Pro 125 130 135 Asn Asp Phe Val Ile Ser Gly Trp Asp Ile Ser Gly Ile Asn Gln 140 145 150 Tyr Asp Ala Met Val Arg Ala Glu Val Leu Glu Tyr Asp Leu Gln 155 160 165 Gln Lys Leu Lys Pro Tyr Met Glu Thr Ile Lys Pro Leu Pro Ser 170 175 180 Ile Tyr Tyr Pro Asp Phe Ile Ala Ala Asn Gln Asp Gly Arg Ala 185 190 195 Asp Asn Cys Tyr Asn Arg Lys Gly Asn Glu Pro Ala Ser Thr Lys 200 205 210 Asp Lys Trp Ala His Val Glu Gln Ile Arg Lys Asp Ile Arg Glu 215 220 225 Phe Lys Lys Ser Asn Asn Leu Asp Lys Val Ile Val Leu Trp Thr 230 235 240 Ala Asn Thr Glu Arg Tyr Cys Asp Leu Ile Glu Gly Val Asn Asp 245 250 255 Thr Ala Asp Asn Leu Val Asn Ala Ile Lys Asn Asp His Ala Glu 260 265 270 Val Ser Pro Ser Thr Val Phe Ala Ile Ala Ser Ile Leu Glu Asn 275 280 285 Thr Pro Tyr Ile Asn Gly Ser Pro Gln Asn Thr Phe Val Pro Gly 290 295 300 Leu Leu Glu Leu Ala Glu Lys Glu Asn Thr Phe Ile Gly Gly Asp 305 310 315 Asp Phe Lys Ser Gly Gln Thr Lys Phe Lys Ser Val Ile Ala Gln 320 325 330 Phe Leu Val Asp Ala Gly Ile Arg Pro Ile Ser Ile Ala Ser Tyr 335 340 345 Asn His Leu Gly Asn Asn Asp Gly Tyr Asn Leu Ser Ser Pro Lys 350 355 360 Gln Phe Arg Ser Lys Glu Ile Ser Lys Ala Ser Val Val Asp Asp 365 370 375 Ile Ile Lys Ser Asn Glu Ile Leu Tyr Asn Asp Lys Thr Gly Arg 380 385 390 Lys Val Asp His Cys Ile Val Ile Lys His Met Ser Ala Val Gly 395 400 405 Asp Ser Lys Val Ala Met Asp Glu Tyr Tyr Ser Glu Leu Met Leu 410 415 420 Gly Gly His Asn Arg Ile Ser Cys His Asn Val Cys Glu Asp Ser 425 430 435 Leu Leu Ala Thr Pro Leu Ile Ile Asp Leu Ile Ile Met Thr Glu 440 445 450 Phe Phe Ser Arg Val Ser Tyr Lys Lys Ala Glu Asp Asn Ala Ser 455 460 465 Ala Tyr Asp Lys Met Tyr Ser Val Leu Ser Phe Leu Ser Tyr Trp 470 475 480 Leu Lys Ala Pro Leu Thr Arg Pro Gly Tyr Glu Ala Ile Asn Gly 485 490 495 Leu Asn Lys Gln Arg Ala Gly Val Asp Asn Phe Leu Arg Leu Leu 500 505 510 Ile Gly Leu Pro Ala Leu Asp Glu Leu Arg Phe Glu Glu Arg Leu 515 520 525 Lys 526
【００３１】配列番号：２ 配列の長さ：１５７８ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：キャンディダ ボイディニイ 株名：ＤＧＲ１−１４ 配列の特徴 特徴をあらわす記号：ｍａｔ ｐｅｐｔｉｄｅ 存在位置：１．．１５７８ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 ATGACTTACC AATTTGTTCC AACTGTTAAA GTCGATAACG ACAACTGTAC TTATACTGAC 60 TCTGAGTTAG TCACTAAGTA TACTTATAAA AACAGTGTTG TTACCAAGGA AAGTAATGGT 120 TCATTCTCGA TTAAACCAAA GACAGAAGAT TATGAGTTTA AAGTTGATTT AAAAGTTCCA 180 AAATTAGGTG TTATGCTTGT CGGTTTAGGT GGTAACAATG GTACTACTTT CTGTGCTGCT 240 CATTTTGCTA ATAAACATAA TATTGAATTC AATACGAAAG AAGGTGTTGT TAAACCAAAT 300 TATTATGGTT CTGTTACTCA GTCTGCTACT ATTAAATTAG GTATTGATGA AGAAGGTTTG 360 GATGTTTATG CCCCATTTAA CTCTCTTTTA CCATTCACTA ACCCAAATGA TTTTGTTATT 420 TCTGGTTGGG ATATTAGCGG TATTAACCAA TACGATGCTA TGGTTAGAGC TGAAGTCTTA 480 GAATATGACT TACAACAAAA ATTAAAGCCA TACATGGAAA CTATTAAACC ATTACCATCA 540 ATCTACTATC CAGATTTCAT TGCTGCCAAC CAAGATGGAA GAGCTGATAA TTGTTACAAC 600 AGAAAGGGTA ATGAACCAGC TTCTACCAAG GATAAATGGG CCCATGTTGA ACAAATTAGA 660 AAAGATATCA GAGAATTCAA GAAATCTAAT AATTTAGATA AAGTCATTGT CTTATGGACT 720 GCCAATACTG AAAGATATTG TGATCTTATT GAAGGTGTTA ATGATACCGC TGATAATTTA 780 GTCAATGCCA TAAAGAATGA TCATGCTGAA GTTTCACCAT CTACTGTCTT TGCCATTGCT 840 TCAATTTTAG AAAACACTCC ATATATCAAT GGTTCTCCAC AAAACACTTT TGTTCCAGGT 900 CTCTTAGAAT TAGCCGAAAA GGAAAATACT TTTATTGGTG GTGATGATTT TAAGAGTGGT 960 CAAACCAAAT TTAAATCTGT TATTGCTCAA TTTTTAGTTG ATGCTGGTAT TAGACCAATT 1020 TCCATTGCTT CATACAACCA TTTAGGTAAC AATGATGGTT ATAACTTAAG TTCTCCAAAA 1080 CAATTCAGAT CTAAGGAAAT TTCCAAGGCT TCTGTTGTTG ATGATATCAT TAAATCAAAC 1140 GAAATTTTAT ACAACGATAA GACAGGAAGA AAAGTTGATC ATTGTATTGT CATTAAGCAC 1200 ATGAGTGCTG TTGGTGATTC TAAAGTTGCC ATGGATGAAT ATTATTCTGA ATTAATGCTT 1260 GGCGGTCATA ACAGAATTTC ATGTCATAAC GTTTGTGAAG ATTCTTTATT AGCAACACCA 1320 TTAATTATTG ATTTAATTAT TATGACTGAA TTTTTTTCTA GAGTTTCTTA TAAGAAAGCT 1380 GAAGATAATG CATCTGCATA TGATAAGATG TATTCTGTAT TATCATTCCT TTCTTATTGG 1440 TTGAAGGCAC CATTAACTAG ACCAGGTTAT GAAGCCATCA ATGGTTTAAA CAAACAACGT 1500 GCTGGTGTTG ACAATTTCTT AAGATTATTA ATTGGTTTAC CAGCACTTGA TGAGTTAAGA 1560 TTTGAAGAAA GATTAAAA 1578
【図１】 イノシトール−１−リン酸合成酵素をコード
するＤＮＡの制限酵素切断地図を示す図である。
するＤＮＡの制限酵素切断地図を示す図である。
【図２】 キャンディダ・ボイディニイ形質転換用遺伝
子の調製を示す図である。
子の調製を示す図である。
【手続補正書】
【提出日】平成８年２月２３日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１７】プライマーＡ：５ CGCGGATCCATGACAGAAAA
TATTGCTCC ３′ プライマーＢ：５′ CGGGATCCGTCCATTGCGACTTTTGAGTCC
CC ３′ （２）サザンハイブリダイゼーション Candida boidinii DGR1-14(FERM BP-5070)からSaccharo
myces cerevisiaeと同様の方法で染色体ＤＮＡを取得し
た。このＤＮＡを各種制限酵素で切断し、アガロースゲ
ル電気泳動を行ない、常法どおりナイロンメンブレンフ
ィルターにＤＮＡをトランスファーし、ＤＩＧ法（ベー
リンガー社キット使用）（野村慎太郎、稲澤譲治の方法
（細胞工学別冊９ 脱アイソトープ実験プロトコール１
ＤＩＧハイブリダイゼーションｐ３５−４３）に従
う）でハイブリダイゼーションを行なった。
TATTGCTCC ３′ プライマーＢ：５′ CGGGATCCGTCCATTGCGACTTTTGAGTCC
CC ３′ （２）サザンハイブリダイゼーション Candida boidinii DGR1-14(FERM BP-5070)からSaccharo
myces cerevisiaeと同様の方法で染色体ＤＮＡを取得し
た。このＤＮＡを各種制限酵素で切断し、アガロースゲ
ル電気泳動を行ない、常法どおりナイロンメンブレンフ
ィルターにＤＮＡをトランスファーし、ＤＩＧ法（ベー
リンガー社キット使用）（野村慎太郎、稲澤譲治の方法
（細胞工学別冊９ 脱アイソトープ実験プロトコール１
ＤＩＧハイブリダイゼーションｐ３５−４３）に従
う）でハイブリダイゼーションを行なった。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１８】（３）コロニーハイブリダイゼーション サザンハイブリダイゼーションの結果に基づき、Candid
a boidinii DGR1-14(FERM BP-5070)の染色体ＤＮＡを制
限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで切断し、アガロースゲル電気泳
動を行ない、分子量５．０ｋｂｐ近辺のＤＮＡを抽出
し、ベクターｐＵＣ１１９（宝酒造社製）を制限酵素Ｈ
ｉｎｄＩＩＩで切断したものに接続した（ｐＹＳＩ１０
５）。このＤＮＡを用い、大腸菌ＪＭ１０５を形質転換
し、出現したコロニーについてＤＩＧ法（ベーリンガー
社キット使用）（野村慎太郎、稲澤譲治の方法（細胞工
学別冊９脱アイソトープ実験プロトコール１ ＤＩＧハ
イブリダイゼーションｐ３１−３４）に従う）でコロニ
ーハイブリダイゼーションを行ない、ポシティブクロー
ンを取得した(菌株名：Echerichia coli SNINO1(工業技
術院生命工学工業技術研究所寄託第１５４２７号）。
a boidinii DGR1-14(FERM BP-5070)の染色体ＤＮＡを制
限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで切断し、アガロースゲル電気泳
動を行ない、分子量５．０ｋｂｐ近辺のＤＮＡを抽出
し、ベクターｐＵＣ１１９（宝酒造社製）を制限酵素Ｈ
ｉｎｄＩＩＩで切断したものに接続した（ｐＹＳＩ１０
５）。このＤＮＡを用い、大腸菌ＪＭ１０５を形質転換
し、出現したコロニーについてＤＩＧ法（ベーリンガー
社キット使用）（野村慎太郎、稲澤譲治の方法（細胞工
学別冊９脱アイソトープ実験プロトコール１ ＤＩＧハ
イブリダイゼーションｐ３１−３４）に従う）でコロニ
ーハイブリダイゼーションを行ない、ポシティブクロー
ンを取得した(菌株名：Echerichia coli SNINO1(工業技
術院生命工学工業技術研究所寄託第１５４２７号）。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２４】（７）Candida boidiniiへの導入 取得したＩＮＯ１遺伝子のオープンリーディングフレー
ム部分の両端の塩基配列にＮｏｔＩで切断されるような
塩基配列を加えたプライマーを合成し、先に示したＰＣ
Ｒ法により遺伝子を合成し、制限酵素ＮｏｔＩで切断し
たベクターｐＮＯＴｅＲＩ（大腸菌Ｃａｎｄｉｄａ ｂ
ｏｉｄｉｎｉｉシャトルベクター）と接続した。（図
２）（ｐＹＳＩ３０８−８）宿主Ｃａｎｄｉｄａ ｂｏ
ｉｄｉｎｉｉ ＴＫ６２（ＵＲＡ３欠損株）をｐＹＳＩ
３８０−８を用いて阪井らの方法（遺伝子発現実験マニ
ュアル（講談社サイエンティフィク）ｐ１０８−１１
０、石田功・安東民衛編）により形質転換した。その結
果形質転換株Candida boidinii TF1株（工業技術院生命
工学工業技術研究所寄託第１５４２８号）を得た。
ム部分の両端の塩基配列にＮｏｔＩで切断されるような
塩基配列を加えたプライマーを合成し、先に示したＰＣ
Ｒ法により遺伝子を合成し、制限酵素ＮｏｔＩで切断し
たベクターｐＮＯＴｅＲＩ（大腸菌Ｃａｎｄｉｄａ ｂ
ｏｉｄｉｎｉｉシャトルベクター）と接続した。（図
２）（ｐＹＳＩ３０８−８）宿主Ｃａｎｄｉｄａ ｂｏ
ｉｄｉｎｉｉ ＴＫ６２（ＵＲＡ３欠損株）をｐＹＳＩ
３８０−８を用いて阪井らの方法（遺伝子発現実験マニ
ュアル（講談社サイエンティフィク）ｐ１０８−１１
０、石田功・安東民衛編）により形質転換した。その結
果形質転換株Candida boidinii TF1株（工業技術院生命
工学工業技術研究所寄託第１５４２８号）を得た。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:72） (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:72） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/90 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/90 Ｃ１２Ｒ 1:72）
Claims (12)
- 【請求項１】 制限酵素切断地図が図１に示すようなイ
ノシトール−１−リン酸合成酵素をコードするＤＮＡ。 - 【請求項２】 翻訳されるアミノ酸配列が配列番号１に
示すアミノ酸配列であるイノシトール−１−リン酸合成
酵素をコードするＤＮＡ。 - 【請求項３】 配列番号２に示す塩基配列またはそれに
相補的な塩基配列を有する請求項１または２記載のイノ
シトール−１−リン酸合成酵素をコードするＤＮＡ。 - 【請求項４】 配列番号１のアミノ酸配列をかえること
なく、配列番号２に示す塩基配列の１個または２個以上
を他の塩基で置換した請求項１または２記載のイノシト
ール−１−リン酸合成酵素をコードするＤＮＡ。 - 【請求項５】 キャンディダ属ボイディニイ種に属する
酵母に由来する請求項１〜４のいずれか１項記載のイノ
シトール−１−リン酸合成酵素をコードするＤＮＡ。 - 【請求項６】 請求項１〜５のいずれか１項に記載のＤ
ＮＡと自立複製可能なベクターを含んでなる複製可能な
組換えＤＮＡ。 - 【請求項７】 請求項１〜５のいずれか１項に記載のＤ
ＮＡとキャンディダ属ボイディニイ種に属する酵母の染
色体ＤＮＡに組み込むことが可能なベクターを含んでな
る、染色体に組み込み可能な組換えＤＮＡ。 - 【請求項８】 請求項１〜５のいずれか１項に記載のＤ
ＮＡと自立複製可能なベクターを含んでなる複製可能な
組換えＤＮＡを適宜宿主に導入してなる形質転換体。 - 【請求項９】 宿主が大腸菌である請求項８記載の形質
転換体。 - 【請求項１０】 請求項１〜５のいずれか１項に記載の
ＤＮＡとキャンディダ属ボイディニイ種に属する酵母の
染色体ＤＮＡに組み込むことが可能なベクターを含んで
なる、染色体に組み込み可能な組換えＤＮＡを適宜宿主
に導入してなる形質転換体。 - 【請求項１１】 宿主がキャンディダ属ボイディニイ種
に属する酵母である請求項１０記載の形質転換体。 - 【請求項１２】 請求項８〜１１のいずれか１項に記載
の形質転換体を用いたイノシトールの製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8028355A JPH09220093A (ja) | 1996-02-16 | 1996-02-16 | イノシトール−１−リン酸合成酵素をコードするｄｎａ、それを含む組換えｄｎａ、形質転換体およびそれを用いたイノシトールの製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8028355A JPH09220093A (ja) | 1996-02-16 | 1996-02-16 | イノシトール−１−リン酸合成酵素をコードするｄｎａ、それを含む組換えｄｎａ、形質転換体およびそれを用いたイノシトールの製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09220093A true JPH09220093A (ja) | 1997-08-26 |
Family
ID=12246310
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8028355A Withdrawn JPH09220093A (ja) | 1996-02-16 | 1996-02-16 | イノシトール−１−リン酸合成酵素をコードするｄｎａ、それを含む組換えｄｎａ、形質転換体およびそれを用いたイノシトールの製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH09220093A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013073483A1 (ja) | 2011-11-14 | 2013-05-23 | 旭化成ケミカルズ株式会社 | ミオイノシトール及びミオイノシトール誘導体の製造方法 |
| WO2013115012A1 (ja) | 2012-02-02 | 2013-08-08 | 旭化成ケミカルズ株式会社 | シロ‐イノシトールの製造方法 |
| WO2013125666A1 (ja) * | 2012-02-23 | 2013-08-29 | 株式会社日本触媒 | イノシトール高生産微生物およびそれを用いたイノシトールの製造方法 |
| WO2018004307A1 (ko) | 2016-06-30 | 2018-01-04 | 씨제이제일제당 (주) | 고농도 마이오-이노시톨의 효소적 제조방법 |
-
1996
- 1996-02-16 JP JP8028355A patent/JPH09220093A/ja not_active Withdrawn
Cited By (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013073483A1 (ja) | 2011-11-14 | 2013-05-23 | 旭化成ケミカルズ株式会社 | ミオイノシトール及びミオイノシトール誘導体の製造方法 |
| JP2014057602A (ja) * | 2011-11-14 | 2014-04-03 | Asahi Kasei Chemicals Corp | ミオイノシトール及びミオイノシトール誘導体の製造方法 |
| KR20140048334A (ko) | 2011-11-14 | 2014-04-23 | 아사히 가세이 케미칼즈 가부시키가이샤 | 미오이노시톨 및 미오이노시톨 유도체의 제조 방법 |
| EP2921558A1 (en) | 2011-11-14 | 2015-09-23 | Asahi Kasei Chemicals Corporation | Method for producing myo-inositol and myo-inositol derivative |
| US9365603B2 (en) | 2011-11-14 | 2016-06-14 | Asahi Kasei Chemicals Corporation | Method for producing myo-inositol and myo-inositol derivative |
| US9994871B2 (en) | 2011-11-14 | 2018-06-12 | Asahi Kasei Chemicals Corporation | Method for producing myo-inositol and myo-inositol derivative |
| WO2013115012A1 (ja) | 2012-02-02 | 2013-08-08 | 旭化成ケミカルズ株式会社 | シロ‐イノシトールの製造方法 |
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