JPH02129550A - 固相指示薬の赤血球およびその調製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は一般に生体液における免疫反応の分野に関し１
％に生体液中の抗原および抗体の存在を検出する指示細
胞として使用する赤血球の調製に有用な方法および組成
物に関する。

〔従来の技術〕

従来から行われている血液、血清および唾液のような生
体液におけるＡＢＯ式血液型およびＲｈ式血液型の決定
法、抗体スクリーニング、抗体の同定および交差適合試
験法は凝集反応を介している。比較的最近まで、凝集試
験は手動的に行う必要があるために限定されてきた。手
動観察を必要とする第一の理由は、容易に職別できる終
点がないためである。凝集反応の感度および信頼性金高
めて少なくとも半自動化をさせるために現在種々の試薬
が利用されている。改良された技術をもってしても、凝
集反応はなお客観的な終点に欠けるという欠点に直面し
ている。この欠点を高性能の電子装置が部分的に補償し
ているが、かかる装置は高価であって多くの小さな研究
所には適さない。

受動凝集反応を利用して生体液中にイムノグロブリンお
よび抗イムノグロブリンが存在することを検出するには
赤血球の表面に抗体および抗原が吸収されることが長い
間知られてきた。タンパク質の抗原および抗体は、細胞
組織が変化しない、またはカップリング剤が使用されな
い限り赤血球へ免疫学的に付着しない。赤血球が一旦適
当に修飾されて、抗原や抗体が付着すると、得られた指
示薬の赤血球を利用して受動凝集反応を用いた生体液中
の抗原および抗体の存在を決定できることが知られてい
る。これらの反応は液相の検定に最もよ〈実施されてき
た。前記型の修飾された指示薬の赤血球を液相の検定に
用いても、従来の凝集反応に伴う同じ問題点のいくつか
１例えば低感度および終点決定の困難さに遭遇する。液
相の検定における免疫反応の指示薬として赤血球を利用
する方法は、次の本に詳細に検討されている：”Ｉｍｍ
ｕｎｏ　Ａｓ５ａｙｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　’８０ｓ＠ｂ
ｙ　Ａ、Ｖｏｌｌｅｒｅｔ　ａｌ、、　ｅｓｐｅｃｉａ
ｌｌｙ　Ｃｈａｐｔｅｒ　５　ｂｙ　Ｒ，Ｒ，Ａ。

Ｏｏｏｍｂｓ、　ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ　ｂｙ　Ｕｎｉｖ
ｅｒｓｉｔｙ　ＰｏｒｋＰｒｅｓｓ、　　Ｂａｌｔｉｍ
ｏｒｅ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ、　　１９８１．　　この
分野におけるクームスおよび他の先駆者の優れた方法を
オリ用しても、液相血清学に指示薬赤血球の使用は、明
確に識別できかつ客観的な終点がないためになお限定さ
れている。

血液型血清学の技術にかなりの進歩が、１９８１年６月
２５日付けのローゼンフイルド（Ｒｏｓｅｎｆｉｅｌｄ
）による米国特許第１．２７５．０５５号によって示さ
れている。この特許は固相における血液型血清学を行う
方法に関するものである。液相血球凝集試験の欠点並び
に固相における作業の利点が該特許に詳細に議論されて
いる。固相検定法の最大の利点は、抗原−抗体反応の検
出に血球凝集よりも免疫粘着を用いることである。これ
は１手動または自動記録に対して極めて客観的かつ識別
できる終点である。

生体液中の抗体および抗原の存在を決定するための固相
検定法におけるさらに進歩が、１９８６年８月２６日付
けのベイヤー（Ｂａｙｅｒ）、ブラシノ（ｐｌａｐｐ）
、シノール（Ｓｉｎｏｒ）　　らによる米国特許第ｋｌ
、６０１１（２１４６号に記載されている。このベイヤ
ーらの特許において、固相血液型血清学の広範囲の利用
法が記載されている。その方法は、前記Ｒｏｓｅｎｆｉ
ｅｌｄの特許に記載されている最初の考えよシも多くの
利点、＠えば広範囲の基質に適用できること、工程が少
ないこと、シェルフ・ライフが長いこと、試験時間が短
いことを与える。このＢａｙｅｒらの方法の顕著な特徴
は、赤血球に免疫反応を受けさせる前に赤血球を活性化
するタンパク質分解酵素を利用することである。

〔発明が解決しようとする課題〕

液相法において抗体を結合させて、指示薬細胞として赤
血球を利用するために、赤血球の組織を修飾する先行技
術を利用するときは、赤血球の修飾て利用された試薬は
赤血球を粘着性にさせる傾向にある。これらの指示薬で
ある赤血球が固相赤血球粘着検定法に使用されるとき、
この粘着性が陽性と陰性の結果の明確な区別を妨げる。

Ｂａｙｓ　ｒらの教示による酵素活性化法を利用しても
、指示薬赤血球の調製は時間がかかり、大量の抗体を必
要とし、指示薬赤血球のシェルフ・ライフ（貯蔵寿命）
が比較的短い。また、酵素処理並びに他の活性化法は若
干量の抗原を分解する。

本発明は、固定化剤の使用または赤血球の酵素処理をす
ることなく特定の抗体が付着されている指示薬の赤血球
を提供する。

本発明の第１の目的は、免疫反応に使用し、粘着性でな
く、従って固相検定用に適する指示薬の赤血球を提供す
ることである。

本発明の他の目的は、指示薬として使用する赤血球を活
性化するために赤血球の修飾や酵素の前処理を必要とし
ない指示薬の赤血球を提供することである。

本発明の極めて重要な目的は、粘着性を示さない、従っ
て終点が血球の凝集よりむしろ免疫粘着によって検出さ
れる免疫反応用に適する指示薬の赤血球を提供すること
である。

本発明の目的の１つは、固相検定法に適する種々の人工
的基質と併用できる前記目的を満たす指示薬の赤血球全
提供することである。

さらに本発明の目的は、活性化をさせる酵素で修飾また
は前処理をしないで、比較的長い貯蔵寿命を維持できる
指示薬の赤血球を提供することである。

また５本発明の目的は、活性化過程で指示薬赤血球上の
抗原が分解されない終点指示薬として免疫反応に使用す
るために活性化できる指示薬の赤血球を提供することで
ある。

本発明の他の目的は、細胞の修飾または酵素の予備活性
化の必要がなく、不完全な抗体と共に使用できる指示薬
の赤血球を提供することである。

以上の諸口的に付随することは、全ての生体、液と共に
使用することができる前記目的を溝たす指示薬の赤血球
を提供することである。

本発明のその他の目的は１以上の記載および特許請求の
範囲から明らかになるであろう。

〔諌題を解決するための手段〕

本発明による指示薬の赤血球を提供するために用いる赤
血球はヒトまたは動物１例えばウシやマウスから得る。

新しく収集した赤血球は等偏食塩水（又は塩類形ｇ、）
で６回洗浄して血液中に存在する他の成分を除去する。

最後の洗浄後にその赤血球は、等偏食塩水と赤血球容積
比５〜５％（Ｖ／’／）の溶液に懸濁させる。

指示薬細胞として使用するために赤血球を感作すると、
不完全な抗体を全て使用できる。これらはＩｊＧ、ＩＩ
ＩＡ、ＩｙＤおよびｒｐＫの類を含む。ある糧のＩｐＭ
は不完全であり、従って許容されない。特定の抗体の選
択は、特定の指示薬赤血球を使用して検出せんとする抗
原または抗体に依存する。

赤血球の感作に利用する抗体の量は不可逆凝集をするこ
となく赤血球に免疫活性を与えるのに十分であることが
重要である。指示薬赤血球の感度を最高にするために、
付着される抗体の量は赤血球上に利用できる抗原部位の
実質的に全てを免疫学的に結合させるのに十分な量にす
べきである。

特定の感作抗体に必要な実際の首は一般に経験的に決め
る。これは、不可逆凝集が生じるまで抗体を添加し、次
に陽性反応がもはや得られなくなるまでこの水準から滴
定量を下げることによって行うことができる。許容され
る滴定量はこれら２つの両極端の間である。感作抗体の
滴定量は、殆んどの種に対してｌ：１０〜１：５１２（
抗体：緩衝液）の範囲内にある。

一旦抗体が赤血球溶液に添加されたら、その混合体は２
０〜３７℃で５〜６０分間温置し湯漬抗体を赤血球へ免
疫学的に結合させる。湯漬期間の後、赤血球は再び等偏
食塩水（又は塩類溶液）で６回洗浄して未結合成分を除
去する。洗浄した赤血球は次に４％の赤血球容積比の等
偏食塩水に懸濁させる。

次に、赤血球に付着された第１の抗体に対して免疫特異
である第２の抗体を担持している赤血球に付着させる。

例えば、ＩｙＧ抗体が前記方法によって赤血球に付着さ
れた場合には、指示薬赤血球として使用するために赤血
球の調製における第２の工程として抗−ＩｊｌＧが付着
される。この段階で、抗体を担持した赤血球の実質的に
全てを免疫学的に結合させるべく十分な量の抗イムノグ
ロブリンを添加する必要がある。その量が少ないと。

これは指示薬赤血球の最終感度から後退する。抗イムノ
グロブリンの量を、被感作赤血球を不可逆的に凝集させ
るのに十分高くする場合はない。特定の抗イムノグロブ
リンに必要な実際の量は、−般に前記感作抗体に関して
述べた方法と同じ方法で経験的に決める。抗イムノグロ
ブリンの滴定量は、殆んどの種に対して１：１０〜１：
１２ｇ（抗イムノグロブリン：緩衝液）の範囲内である
。

−旦抗イムノグロプリンを赤血球溶液に添加したら、そ
の混合体Ｆｉ２０−３７℃において５〜６０分間渇置し
装、赤血球に前もって結合された抗体へ抗イムノグロブ
リンを結合させる。温室期間後。

それらの細胞に等偏食塩水で６回洗浄して未結合成分を
除去する。得られた指示薬赤血球は１次に赤血球栄養素
を含有する媒質中に０．１〜１％の赤血球容積比で懸濁
させる。適当な栄養素と保存薬の溶液は当業者には周知
である。懸濁された赤血球は解糖を受けるから、その媒
質はグルコースとアデノシンを含有する必要がある。生
成物の貯蔵寿命は、解糖が遅くてイーストおよび細菌の
成長が防止されると延びる。これは、約４℃のｓ度に貯
蔵することによって行うことができる。

以上１本発明は指示薬赤血球を提供するために赤血球に
結合される単一の抗体に関して説明されたけれども、さ
らに広いスクリーニングが望ましい場合にはグループの
抗体も免疫学的に結合できうろことを理解されたい。こ
の場合には、赤血球に前もって付着された感作抗体に長
時異的である抗イムノグロブリンが第２工程に使用され
る。

〔作用〕

本発明に従って調−された指示薬赤血球の第１の効用は
固相免疫試験に使用されることである。

固相反応を実施するために種々の型の固相基質が現在知
られている。適当な材料はポリスチレン、ポリビニル、
ナイロン、およびニトロ・セルロース膜を含む。本発明
の望ましい実施態様における基質は試料を受は入れるお
よび指示薬赤血球を堆積させるくぼみまたは凹部を有す
るミクロプレートである。一般的な方法は、当業者には
周知の方法を用いて抗原または抗体を固体表面へ付着さ
せる。次に、その固相は洗浄して未反応の抗原または抗
体を全て除去し、試験する未知試料を添加する。渇置後
、未反応抗原または抗体を洗浄によって除去する、指示
薬赤血球を添加する。指示薬の細胞に付着される抗体に
特異の抗原または抗体が存在すると、陽性反応が生じて
指示薬赤血球を固相支持体へ結合させる。ミクロプレー
トを使用する場合には、それらを遠心分離する必要があ
る。

しかる後に指示薬赤血球は固体表面に結合したまま残り
、固定化された抗原または抗体によって覆われた部分を
未知の試料から消す。基質によっては、遠心分離の代り
に単純な洗浄をする。指示薬赤血球に付着した抗体に特
異の抗体または抗原が未知試料に存在しない場合には、
指示薬赤血球の免疫粘着をさせるものがないから、指示
薬赤血球は固体表面に結合しない。遠心分離、洗浄また
はその両方の際に、指示薬赤血球は表面から洗い落され
る、またはつぶされてミクロプレートの凹部の底部でペ
レットになる。これは、陰性反応を明示することになる
。

〔実施例〕

この検定は、赤血球の表面上の抗原に特異の提供者また
は患者の流体（生体液）に見られる抗体を検出すること
を意図している。従って、固相は既知抗原組成物の固定
化赤血球単層からなる。検定はミクロプレート内で一滴
の血清または血漿を赤血球を塗ったミクロプレートのく
ぼみに添加することによって行う。血清または血漿はＬ
９％グリセンのような低イオン強度溶液（ｐ　Ｈ７，０
）で％〜騎に希釈して、抗原および抗体の反応速度を高
める。そのミクロプレートは３７℃に１０分間副装して
、食塩水で４回洗浄する。それぞれのミクロプレートの
凹部へ指示薬赤血球がα５％（Ｖ／’／）の懸濁液１滴
を添加した後、ミクロプレー１６００Ｘ＃で１分間遠心
分離にかける。陰性反応は、前述のような凹部キャビィ
ティ上の指示薬赤血球の消滅を特徴とする。陰性反応に
おいては、指示薬赤血球は遠心分離後に凹部の底に小さ
なりランプまたはボタンとして見られる。

この試験は、固相がミクロプレートの表面上に固定化さ
れた血小板からなることを除いて、赤血球抗原に対する
前記試験と実質的に同一である。

陽性および陰性反応は例１で示したものと同じ特徴を有
する。

この試験は、固相がミクロプレートの表面上に固定化さ
れた白血球からなることを除いて例１および２の試験と
実質的に同一である。種々の発願の白血球（例えば、Ｔ
−ヘルパー・リンパ球、Ｔ−サブレッサー・リンパ球、
ナチュラルキラー細胞）をこの検定に使用することがで
きる。陽性および陰性反応は例１で示したような特徴を
有する。

この検定においては、ＨＢｓＡＩＩウィルス粒子または
精製ＨＢｓＡｙ抗原がミクロプレートの表面に固定化さ
れる。その他の方法は例１と同一である。

提供者または患者の血清をミクロプレートの凹部へ添加
する。試料がＨＢＳＡＪ＋抗原に特異の抗体を含有する
と、それらは固定化されたＨＢｓＡｙへ免疫学的に結合
される。他の分子は洗浄除去される。

抗−ＨＢ８Ａ＃抗体を検出するために、指示薬赤血球を
添加する。そして陽性および陰性反応は例１に示したよ
うな特徴全有する。

この検定は、患者または提供者の血清におけるＨＴＬＶ
−１１ウイルスに対する抗体を検出するととを意図して
いる。ＨＴＬＶ−ｍウィルス粒子またはＨＴＬＶ−１１
１ウイルスの精製成分がミクロプレートの凹部上へ固定
化されることを除いて、実施例１で示した方法に従った
。提供者または患者の血清をミクロプレートの凹部へ添
加する。ＨＴＬＶ−■に特異の抗体が存在すると、それ
らは固定化されたＨＴＬＶ−７１７抗原へ免疫学的に結
合される。他の分子は洗浄して除去する。指示薬赤血球
全添加する。そして陽性および陰性反応は実施例１で示
した特徴を有する。

赤血球を添加する。陽性および陰性反応はこれまで示し
た実施例における特徴を有した。

以上記載した実施例は全て固相支持体としてミクロプレ
ートを利用している。上記試験は全て。

ニトロセルロース、ナイロン、または正に帯電したナイ
ロンを含む別の固相支持体についても実施することがで
きる。

体の検出

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、赤血球の供給品を提供する工程； 赤血球と既知の抗体とを接触させることに よつて該赤血球を感作させ、それによつて該赤血球およ
   び抗体の免疫粘着をもたらす工程；および 前記被感作赤血球に、前記抗体に対して免 疫原性を有する抗−イムノグロブリンを添加することに
   よつて、該抗−イムノグロブリンを前記抗体へ免疫学的
   に付着させる工程； から成ることを特徴とする、生体液に抗原および抗体が
   存在することを検出する指示薬赤血球の調製方法。 ２、前記感作抗体が不完全な抗体である請求項１記載の
   方法。 ３、前記感作工程は、赤血球と抗体との混合体を前記免
   疫粘着が生じるのに十分な時間温置することを含む請求
   項１記載の方法。 ４、前記感作工程は、前記赤血球を、該赤血球の不可逆
   凝集をさせることなく該赤血球に免疫活性を与えるのに
   十分な量の前記抗体と接触させることから成る請求項３
   記載の方法。 ５、前記添加工程は、感作赤血球と抗−イムノグロブリ
   ンの混合体を、前記免疫粘着が生じるのに十分な時間温
   置させることから成る請求項４記載の方法。 ６、前記添加工程は、十分な量の前記抗−イムノグロブ
   リンを添加して、前記赤血球へ免疫学的に付着される抗
   体の実質的に全てと免疫反応させることから成る請求項
   ５記載の方法。 ７、前記添加工程は、前記感作工程に利用される前記抗
   体の量に等しい量の前記抗−イムノグロブリンを添加す
   ることから成る請求項５記載の方法。 ８、前記感作工程は、前記赤血球を少なくとも２つの抗
   体と接触させることから成り、前記添加工程は前記抗体
   の全てに対して免疫原性を有するイムノグロブリンを添
   加することから成る請求項１記載の方法。 ９、赤血球の溶液を提供する工程； 前記溶液に、前記赤血球上の抗原部位の実 質的に全てと免疫学的に反応するのに十分な量であるが
   前記赤血球の不可逆凝集をさせるには不十分な量の既知
   不完全抗体溶液を添加する工程； 赤血球と不完全な抗体の混合体を２０〜３７℃において
   抗体および赤血球の免疫粘着をさせるのに十分な時間温
   置させる工程； 前記赤血球の溶液に、抗体を担持する赤血 球の実質的に全てと免疫反応するのに十分な量であるが
   赤血球の不可逆凝集をさせるには不十分な量において前
   記既知抗体に対して免疫原性を特徴とする抗−イムノグ
   ロブリンの溶液を添加する工程；および 赤血球と抗−イムノグロブリンの混合体を ２０〜３７℃において抗−イムノグロブリンおよび抗体
   担持赤血球の免疫粘着をさせるのに十分な時間温置させ
   る工程； から成ることを特徴とする、生体液中の抗原および抗体
   の存在を検出する指示薬赤血球の調製方法。 １０、前記温置工程の各々の後に、前記赤血球を塩類溶
   液中で洗浄して非付着抗体および抗−イムノグロブリン
   の全てを除去する工程を含む請求項９記載の方法。 １１、前記赤血球を赤血球容積比０．１〜１％（ｖ／ｖ
   ）の塩類溶液中に懸濁させる最終工程を含む請求項１０
   記載の方法。 １２、免疫学的に付着した抗体と、前記抗体に免疫学的
   に付着した抗−イムノグロブリンを有する赤血球の溶液
   から成ることを特徴とする、生体液中の抗体および抗原
   の存在の決定に使用する指示薬溶液。 １３、前記溶液中の抗体の量は、前記赤血球に免疫活性
   を与えるには十分であるが赤血球の不可逆凝集をもたら
   すには不十分である請求項１２記載の指示薬溶液。 １４、前記溶液は塩類溶液からなり、前記赤血球は約０
   ．１〜１％（体積／体積）の濃度で存在する請求項１３
   記載の指示薬溶液。 １５、少なくとも２つの異なる抗体は前記赤血球へ免疫
   学的に付着され、該異なる抗体に対して免疫原性を有す
   る抗−イムノグロブリンは前記抗体へ免疫学的に付着さ
   れる請求項１３記載の指示薬溶液。 １６、グルコースおよびアデノシンが含まれる請求項１
   ３記載の指示薬溶液。