JPH0326965A - 表面水酸基を有する膜を用いるクラミジア抗原の測定のための診断用試験キット及び方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、クラミジア閑の測定のための診断用試験キッ
ト及び方法に関する。より詳細には、表面水酸基を有す
るポリアミド微多孔性膜を利用するキット及び方法に関
する。

〔従来の技術〕

近年、イムノアッセイは感染症の存在を検出するのに使
用されている。このアッセイが有用なものであるために
は、特定の閑を高度の信頼性をもって検出しなければな
らない。ほとんどの場合、単離及び菌に特異的な抗原を
対応する抗体と反応させることが必要である。試験が商
品として或功するためには、比較的安価で、長期保存性
で使用するのが簡単で迅速であることもまた必要である
。

イムノアッセイにより検出することができるその微生物
種の１つであるトラコーマ・クラミジア（Ｃｈｌａｍｙ
ｄｉａ　ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）　（本明細書中では
Ｃ，　ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）である。トラコーマ、
封入体（性）結膜炎、性病性リンパ肉芽腫、非淋菌性尿
道炎及び直腸炎をはじめとする数多くのヒト眼性及び生
殖器疾病の原因であるこの菌種の血清型は１５種類以上
ある。トラコーマ・クラミジアからの感染が一般住民に
蔓延しているので非淋菌性尿道炎だけでも毎年何百万の
症例があると信じられている。

これらの疾病が蔓延しているため、迅速、簡易かつ信頼
できるクラミジア菌検出用試験をもつことにかなりの関
心がもたれている。固体支持体を用いて行うトラコーマ
・クラミジア用のアッセイについては米国特許第４．　
４９７，　８９９号明細書に記載されている。この記載
されているアッセイは、菌から抗原を抽出しついで裸固
体支持体上にそれを塗布することにより行われる。塗布
された抗原は、次に１種又は２種の抗体で検出されるが
、その１つは適切に標識されている。このアッセイの特
徴は、何らかの物質を用いた処理又は塗布がされていな
い固体支持体を付着のために用いていることのようであ
る。抗原の付着は、明らかに、塗布された支持体を、抗
原がその上に吸着されるのに十分な長時間インキユベー
トすることにより達成される。米国特許第４，　４９７
，　８９９号明細書に記載されているアッセイ全体では
それを完遂するのに少なくとも３時間かかる。

高い信頼性を有ししかも室温で実施することができる更
にはるかに迅速なクラミジア菌試験は、１９８９年１０
月６日出願の特願平１　−２６０３６７号明細書に記載
されかつ特許請求されている。イオン性（特に陽イオン
性）荷電支持体がクラミジア抗原を引きつけてその抗原
を迅速に感度良く検出することを可能ならしめているこ
とを本発明者らの同僚が見出した。

クラミジア・アッセイに界面活性剤を塗布した非荷電膜
を使用することを記載している、１９８９年１０月６日
出願の特願平第１　−２０６３６５号明細書には更に改
良されたものが記載されている。この発明によれば、全
血、粘液又はそれらの或分を大量に含む生物学的試験試
料中の抗原を迅速にしかも感度よく検出することが可能
である。

〔発明が解決しようとする課題〕

クラミジア・アッセイの大部分の市場としては、試験キ
ットの冷凍容量が限定されている医者のオフィスが意図
されている。従って、上記発明は当該技術分野において
重大な進歩をもたらすものではあるが、アッセイ中の感
度及び低バックグラウンドを保持しながら、使用前に冷
凍することなしに長時間貯蔵することができる試薬及び
試験キットをもつことが更に必要である。

コダック（Ｋｏｄａｋ）から’／ｘアセル（Ｓｕｒｅｃ
ｅｌｌ１商品名）として市販されている現在出まわって
いる製品は市場で全く肯定的に受け入れられている。

これは、界面活性剤塗布パイオダイン（Ｂｉｏｄｙｎｅ
，商品名〉ポリアミド膜を含有する使い捨て試験具を利
用するものである。そのキット中の試薬の貯蔵保管性を
高め、そしてアッセイ中のバックグラウンドを低く保つ
ことが強く望まれている。このことは、長期冷凍の必要
性なしに行うことを必要とする。

〔課題を解決するための手段〕

Ａ．クラミジア菌を含有すると予想される試験試料から
抽出されたクラミジア抗原を、複数個の水酸基をその表
面上に有しかつ細孔の平均寸法がｌ〜ＩＯ−のポリアミ
ド微多孔性濾過膜と、抽出された抗原を膜に結合させる
のに十分な時間接触させるごと、 Ｂ．膜に結合したクラミジア抗原を、免疫学的複合物を
膜上に形成するようにクラミジア抗体と接触させるごと
、ついで Ｃ，試験試料中のクラミジア菌の存在の目安として、膜
上の複合物の存在を測定することを含んでなるクラミジ
ア抗原の測定方法により上述の必要とされる改良方法が
提供される。

本発明は、複数個の水酸基をその表面上に有しかつ細孔
の平均寸法が１〜１０−であるポリアミド微多孔性濾過
膜を含んでなる、クラミジア抗原の測定に有用な診断用
試験キットもまた提供する。

〔実施態様〕

本発明は、任意の適切な医学的又は診断的技法を用いて
患者から得た生物学的試験試料中のトラコーマ・クラミ
ジア（又は他のクラミジア種）の存在を測定する方法を
含んでなる。かかる試験試料としては、例えば、患者の
頚部、尿道、咽喉又は肛門から得たスワブ試験試料、及
び滑液又は病巣からの液体のような体液が挙げられる。

そのようにして得られた生物学的試験試料は、測定すべ
きクラミジア抗原（又はその混合物）を含んでなる細菌
生菌体を含有すると予想される。試験試料は特に全血又
は粘液を含むことがあり、時には両者を大量に含む。

アッセイは、もとのままのクラミジア菌からの抗原を検
出するために行うことができるが、アッセイの感度を高
めるには、生菌体から抗原を抽出することが通常望まし
い。例えば、溶媒希釈もしくは高ｐＨ溶解溶液、酵素処
理、超音波もしくは遠心のような物理的撹拌及び加熱を
はじめとする標準技法が生菌体を溶解して抗原を解放す
るために使用することができる。陰イオン性洗浄剤又は
塩、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム及びデオキシコレ
ートの使用も当該技術分野において公知である。

好ましい実施態様においては、本発明を、クラミジア・
リポ多糖類（糖質質基）抗原を検出するのに用いること
ができる。他の実施態様においては、検出抗原は、総結
合外層膜蛋白質の６０％を占める、生菌体のクラミジア
・メジャー外層膜蛋白質であってもよい。ある場合には
これらのクラミジア抗原の混合物が本発明を用いて検出
されるであろう。

好ましい抽出組或物について、例と関連づけて以下に詳
細に説明する。組或物の主な特徴は、アルコールアミン
又はそれらの塩の存在及びその高ｐＨである。

更に、全血及び粘液を破壊するための抽出操作において
プロテアーゼを用いることが望ましいかもじれない。有
用なプロテアーゼを以下に例と関連づけて記載する。

いったん抗原が生菌体から抽出されると、必須ではない
が、更に処理する前に、細胞破砕片、微粒子物体及び他
の望ましくない物質を除去するために試験試料を予備濾
過することが望ましい。予備濾過はあるタイプのフィル
ターを有する適切な容器中で行うことができる。

抽出は、抗原抽出のために特にデザインされた装置をは
じめとする任意の適切な容器中で行うことができる。米
国特許第４，　７４６．　６１４号明細書をはじめとし
て、当該技術分野において有用な装置が知られている。

抽出抗原は、細孔の平均寸法が１〜１０１１ｍの高分子
！Ｉ［多孔性膜と接触させる。膜は、高分子主鎖に繰り
返しアミド基を有する長鎖合或ポリマーである、ポリア
ミドから製造される。それらは、一般にジアミンとジカ
ルボン酸のコボリマーであるか又はアミノ酸のラクタム
のホモポリマーである。

代表的な物質としては、ポリへキサメチレンドデカンジ
アミン（ナイロン６１２）　、ポリヘキサメチレンアジ
バミド（ナイロン６６）、ボリーε一カブ口ラクタム（
ナイロン６）、ポリへキサメチレンセバカミド（ナイロ
ン６ｌＯ）及びポリ−７−アミノへブタノアミド（ナイ
ロン７）、及びそれらの混合物が挙げられるが、これら
に限定されるものではない。ポリヘキサメチレンアジバ
ミド（ナイロン６６）　が好ましい。

膜材は、複数個の水酸基をその表面上にもたせるように
何らかのやり方で改変されている。表面上のかかる基の
数は限定的ではないが、しかしながら、アッセイのバッ
クグラウンドを低く保ち、そして試験キットにおける試
薬の持続性を改良するためには十分な数のものが存在す
べきである。

水酸基が存在しない場合のものと対照的に、水酸基含有
膜によりもたらされる改良についての理由ははっきり分
らない。

１つの実施態様においては、高分子膜は、膜形戒の前又
は後に化学的に改変されて懸垂水酸基をもたらすことが
できる材料からなる。しかしながら、好ましくはポリア
ミドは、水酸基を与える第２の高分子物質で処理又は改
変する。この第２の高分子物質は、ポリアミド膜を形成
した後、又はそれと同時に提供されてもよい。これはポ
リアミドに共有結合で結合することもできるし、又はあ
る他の適切な方法で結び付けることもできる。

般には、かかる第２の高分子は、その少なくとも１つは
水酸基を与える重合性モノマーからなる。

例えば、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、２−ヒ
ドロキシアクリレート、１−ヒドロキシ２−　（５−２
−アクリルオキシー３一オキサベンチル）一ナフタミド
、２−　（１−ヒドロキシ−２−ナフトイルア゜ミノエ
チル）一アクリルアミド、２−（２−ヒドロキシ−４−
ｍ＆ｐ−ビニルベンジルオキシフエニル）ペンゾトリア
ゾール、Ｎヒドロキシメチルジアセトンアクリルアミド
、ｍ＆ｐ−ヒドロキシメチルスチレン、Ｎ　（ｍ−ヒド
ロキシフェニル）メタクリルアミド、Ｎ−（２ヒドロキ
シブ口ピル〉メタクリルアミド、Ｎメチロールアクリル
アミド、Ｎ．Ｎ−ジメチル−Ｎ−　（２−ヒドロキシプ
口ビル）アミノ　メタクリルアミド、■−グリセリルメ
タクリルアミド、ｌ，１−ジヒドロキシメチル−２−ヒ
ドロキシエチルアクリルアミド及び２−（３．５−ジヒ
ドロキシベンジルオキシエチル）エチルメタクリレート
をはじめとする、多くのかかるモノマーが当該技術分野
において知られている。

水酸基一含有モノマーは標準技法を用いて重合させてホ
モポリマテを生或することもできるし、又それらは同様
に１個又は複数個のコモノマー例えば、スチレンもしく
はその誘導体、アクリル酸エステル及びメタクリル酸エ
ステル、アクリルアミド、メタクリルアミド並びに得ら
れる共重合体が水酸基に悪影響を与えない限り任意のビ
ニル付加コモノマー・ど共重合してもよい。

表面水酸基を有する膜の例及びそれらの作製についての
詳細な教示はヨーロッパ特許公開第０　１７３　５００
号公報に与えられている。必要な多孔性及び表面水酸基
を有する、特に有用な微多孔性膜はロブログイン（Ｌｏ
ｐｒｏｄｙｎｅ、商品名）ｍ多孔性漠である。

膜は、抗原捕捉に用いられるかもしれない、高分子粒子
のような微粒状物質を実質的に含まない。

本発明の実施に当っては、例えば、特願平１−２０６３
６５号明細書〈先述）に記載されているように、適切な
非イオン性界面活性剤を塗布することにより膜を更に処
理することができるが、かかる界面活性剤塗布は用いな
いのが好ましい。

本明細書に述べた膜は、アッセイを行うために他の備品
（びん、試験管、スワプ、ビーカー又はコップ）と組合
せて使用することができる。あるいはそして好ましくは
、アッセイを行うことができかつすべての液体を収容で
きる使い捨て試験具にそれを固定する。試験具の有用な
形状は、米国特許第３，　８２５．　４１０号、米国特
許第３．　８８８．　６２９号、米国特許第３，　９７
０．　４２９号、米国特許第４．　４４６，　２３２号
、米国特許第４．　８３３，　０８７号及び特願平６３
−２３４６９２号（１９８８年９月１８日出願）明細書
をはじめとする先行技術において知られている。

接触は、抗原が膜と直接結合するのに十分な時間行われ
る。一般には、抗原を塗布膜と接触させるとほとんど直
ちに、抗原はそれと結合する。抗原は他の蛋白質、細胞
或分、全血もしくは粘液又は試験試料中又はアッセイに
使用する試薬中に存在するかもしれない他の破砕片に対
するのとは対照的に、優先的に膜と結合する。

一般には、接触１０分以内、好ましくは１〜５分以内、
支持体に結合した免疫学的複合物を形成するように、結
合抗原を、クラミジア抗体を含んでなる反応性組或物と
接触させる。同時に、液体及び非結合物質を迅速に除去
してもよい。使い捨て試験具を用いてアッセイを行うな
らば、試験試料中の液体及び非結合物質（例えば、全血
戊分及び粘液戒分）を、抗原が膜に結合する間に、膜を
介して流動させ次いで適切な区画室に収集する。

このアッセイに使用される抗体は、１種以上のクラミジ
ア血清型（どんな生菌体が興味の対象であるかによって
）に対して特異的な免疫反応性を有する。抗体はポリク
ローナルであってもモノクローナルであってもよい。も
しボリクローナルならば、それは市販されているか又は
検出されるべき生菌体の菌株に共通の抗原を使用し公知
技法を用いて種々の動物により調製される。単一抗体又
はそれらの混合物を使用することができる。例えば、ク
ラミジアのリボ多糖類に対する抗体もしくはメジャー外
層膜蛋白質抗原に対する抗体、又は両抗原に対する抗体
をアッセイに使用することができる。好ましくは、これ
らの抗体は、市販されているか又は標準ハイブリドーマ
技法を用いて調製されたモノクローナルである。

一実施態様においては、抗原に対する抗原は検出のため
に標識化される。有用な標識は当該技術分野において知
られており、適切な操作及び装置を用いて直接に検出可
能な化学化合物又は生物学的化合物、並びに検出可能種
をもたらす更なる化学的結合反応又は特異的パインデイ
ング反応を介して検出できる化合物が挙げられる。有用
な標識の例としては、放射性同位体、酵素、蛍光或分、
化学ルミネセンス成分、燐光或分、ビオチンもしくはそ
の誘導体、アビジンもしくはその誘導体、フェリチン、
磁気化可能粒子、染料化粒子、金のゾル、色素のゾル、
着色黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　
ａｕｒｅｕｓ）結胞及び当業者に容易に明らかな他のも
のが挙げられる。放射性同位体又は酵素が好ましい標識
である。標識は公知技法を用いて抗体に結合させること
ができる。標識が直接検出可能でない場合には、反応又
は特異的パインデイング生戊物を検出可能にするために
更なる試薬又は化合物が必要である。例えば、標識がビ
オチンならば、酵素と結合して検出可能種をもたらすア
ビジンと反応させることが可能である。

標識が酵素、例えば、グルコース・オキシダーゼ、ウリ
アーゼ、ベルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ及
び他のものである場合、呈色組成物中には基質もまた必
要である。

特に好ましい実施態様においては、標識がベルオキシダ
ーゼであり、アッセイのある時点で過酸化水素及び適切
な呈色組底物を添加して検出可能な色素を生或させる。

例えば、有用な呈色試薬としては、ロイコ染料、例えば
、トリアリールイミダゾールロイコ染料、又は反応する
とベルオキシダーゼ及び過酸化水素の存在下で色素を生
じる他の化合物が挙げられる。

好ましい実施態様においては、クラミジア抗体は標識さ
れておらず、そして形成されかつ膜にパインデイングさ
れた抗体一抗原複合物の検出は、未標識抗体に特異的で
ありかつ適切に標識化されている第２の抗体（下記）を
用いて行われる。

クラミジア抗体は、支持体上の非特異的相互作用を減少
させる１種又は複数の蛋白質を更に含んでなる試薬組或
物（ブロッキング組戊物としても知られている〉の状態
で提供することができる。

有用な蛋白質は周知であり、例えば、カゼイン、α一カ
ゼイン、ウシ胎児血清、及びブタＴ−グロプリンが挙げ
られる。下記の例と関連づけて記載されているように、
特に有用な試薬組或物は蛋白質及び両性界面活性剤を含
んでなる。

パインデイングされた抗原をいったんクラミジア抗体と
接触させると、パインデイングされた免疫複合物が膜上
に形威される。この複合物形成を早めるためには、抗体
及び抗原は一般に１５〜３０℃の温度で１０分間までイ
ンキユベートする。

インキュベーション後及び一般に抗体一抗原接触１０分
以内に、パインデイングされた複合物を１回又は腹数回
、通常ｐＨが７〜１２の洗浄溶液で洗浄する。この溶液
は好ましくは、未パインデイング物質をパインデイング
された複合物から分離するのに役立つ１個又は複数個の
界面活性剤を含有する。特に有用な界面活性剤は、以下
の例と関連して記載しているように、陽イオン性界面活
性剤である。

クラミジア抗体が標識されている場合の上記実施態様に
おいては、洗浄後のアッセイ操作は、適切な試薬の添加
後直接又は間接的に標識を検出することである。このこ
とは、パインデイングされた複合体の洗浄後比較的迅速
に、すなわち一般には１０分以内に行われる。所望の場
合には、標識検出は試薬がそれを許すならばインキユベ
ーションで促進することができる。標識を次に標準装置
及び操作を用いて検出する。好ましい実施態様において
は、クラミジア抗体は標識されず、パインデイングされ
た複合物の洗浄後、その未標識抗体に対する抗体と接触
させる。この第２抗体（すなわち、抗一抗体）は、上記
標識のいずれかで適切に標識されている。抗体はモノク
ローナル又はポリクローナルであってもよく、購入する
か又は公知技法を用いて調製することができる。クラミ
ジアのアッセイにおいては、抗一抗体は、リポ多糖類又
はメジャー外層膜蛋白質抗体のいずれかと反応性がある
ポリクローナル抗体であることが好ましい。

この接触の後、得られた、塗布膜にパインデイングして
いる抗原一抗体一抗体複合物を１０分までの間、１５〜
３０℃の温度でインキユベートする。

更に洗浄を行って未複合化物質を除去し、次いで適切な
酵素基質又は他の必要な試薬を添加して検出可能種を生
じさせる。パインディングされた抗原一抗体一標識化抗
体複合物は次に膜上で標準的な放射能測定法、色測定法
、蛍光測定法又は他の検出法を用いて検出される。

本発明の診断用試験キットは、本明細書に記載した膜及
びアッセイを実施するための、ｌ種又は複数の他の或分
組成物、溶液又は装置を含んでなる。例えば、キットは
、クラミジア抗原に対する抗体く標識化又は未標識化）
を含んでなる試薬組或物を一般に含む。

キット中に更に場合によって含まれてもよい物質として
は、洗浄溶液、呈色組底物、標識化抗一抗体組或物、抽
出組或物、抽出装置、スワブ又は他の試験試料収集手段
、使い捨て試験具及び当業者に公知の他のものが挙げら
れる。好ましくは、キットは使い捨て試験具の１部とし
て備えられた膜を含む。

〔実施例〕

次の例は本発明を説明するために与えられるものであっ
て、その範囲を限定するものではない。

すべてのバーセントは特に断らない限り重量％である。

側料 アソセイに用いたシュアセル（Ｓｕｒｅｃｅｌｌ，　商
品名）試験具は５Ｉａの微多孔性濾過膜を含有した。

本発明のアッセイに用いた試験具は塗布されていないロ
ブログイン（Ｌｏｐｒｏｄｙｎｅ　、商品名）膜を含有
し、一方対照アッセイに用いた試験具はバイオダイン（
Ｂｉｏｄｙｎｅ）　Ａ膜を含有し、いくつかはゾニル（
Ｚｏｎｙｌ　，商品名）ＦＳＮ非イオン性界面活性剤で
塗布されており、使用された他のものは塗布されていな
かった。

妨害溶液は全血（２５Ｉ１１〉、ブタ粘液（リン酸緩衝
溶液に１２５ｍｇ／　ｍｉ’のもの２０ｉｄ）　、ＨＬ
６０細胞（５メ、５　ＸＩＯ’細胞／ｍｉ’リン酸緩衝
溶液、ｐＨ　７．　２　）を含有した。全容量は５０ｄ
であった。

用いタ予備フィルターは１０ｊ−　Ｈ　Ｄ　Ｃフィルタ
ーであった。

米国特許第４．　７４６．　６１４号明細書（先述）に
記載されたもののような抽出装置を使用した。それは２
つの別々の乾燥塗布物：　〈１〉チメロザール防腐剤（
０．０１％〉を含むトリス（ヒドロキシメチル〉アミノ
メタン緩衝液（１．６５モル濃度溶液の２０〃由来、ｐ
Ｈ１１．１）　、及び（２）２−　（Ｎ−モルホリノ）
エタンスルホン酸緩衝溶液（１０　ミＩＪモル濃度、ｐ
Ｈ６）、アジ化ナトリウム（１．　５４ミリモル濃度）
、エチレンジアミン四酢酸（５．４ミリモル濃度）、ジ
メドン（２１、４ミリモル濃度）及びボリ　（アクリル
アミド”）　　（６．３５％）の溶液（５０ｊ＝１）由
来のジチオスレイトール（０．　１８８モル濃度）の混
合物を含有した。

抽出組戊物は、エタノールアミン塩酸塩（０．　４７モ
ル濃度〉、塩化ナトリウム（０．２７モル濃度）、防腐
剤（３０ミリモル濃度〉、エチレンジアミン四酢酸二ナ
トリウム（４５ミリモル濃度）、エムコール（［Ｅｍｃ
ｏｌ　，商品名”）　ＣＣ−３６陽イオン界面活性剤（
１０％のメタノール溶液からの０．４５％、ポリブロボ
キシーｔ−アミン混合物の四級塩化アンモニウム）、ア
ジ化ナトリウム（０．　０２７モル濃度）並びに水酸化
ナトリウム（０．　６６モル濃度、ｐＨ１３）を含んで
なるものであった。

抗原の調製：セロバ−（Ｓｅｒｏｖａｒ　，血清型）Ｊ
抗原精製基本小体を使用した。抗原溶液（２９００ｎｇ
の抗原／ｔｄを含有する５ｄ）をリン酸緩衝溶液（０．
　１　ｍｇ／ｍｌ，　ｐＨ　７．　２　）中の仔ウシ血
清アルブミンを用いて希釈して５００ｐｇの最終濃度を
得たが、これは通常各試験ウエルに添加される量であっ
た。

クラミジアのリポ多糖類に対するマウスモノクローナル
抗体を標準ハイブリドーマ技法及びマウス細胞株を用い
て産生しついでアジ化ナトリウム（０．０１％）を含有
するリン酸緩衝溶液（ｐＨ　７．　２　）の溶液中に保
存した。抗体溶液の試料（１９−ｊ）を、ブロッキング
蛋白質としてのカゼイン（０．５％）及びロンザイン（
Ｌｏｎｚａｉｎｅ，商品名）Ｃ両性界面活性剤（０．０
１％）を含有するリン酸緩衝溶液（希釈１：８００）へ
添加することより抗体試薬組或物を調製し、次に０．　
２２７−のフィルターを介して濾過して使用液を得た。

使用した標識化ポリクローナル抗体は、西洋ワサビペル
オキシダーゼに結合したヤギ抗一マウスＩｇＧ抗体であ
った。この結合体を、カゼイン（０．５％）及びロンヂ
インＣ両性界面活性剤（０．０１％）を含有するリン酸
ａ１ｋ溶液中で１＝１０００まで希釈し、次に０．　２
２ｐｍのフィルタを介して濾過して使用液を得た。

プロテアーゼ溶液は、２−（Ｎ−モルホリノ〉エタンス
ルホン酸緩衝液（１０ミリモル濃度、ｐＨ　６　）、塩
化ナトリウム（５０ミリモル濃度）、塩化カルシウム（
５ミリモル濃度）、１．２−ブロバンジオール（１０％
　Ｗ／Ｖ）及び防腐剤（０．０１％〉中にアミデック（
Ａｍｉｄｅｃｋ　，商品名）プロテアーゼ（　４　ｆｆ
ｌｇ／ｒｄ、１７０単位／ｍｇ　）を含有した。

別の溶液は、過酸化水素（水中に１２％）、ジエチレン
トリアミンペンタ酢酸（１０マイクロモル濃度）及び防
腐剤（０．０１％）を含有した。

洗浄溶液は、３−シクロヘキシルアミノ−２一ヒドロキ
シ−１−ブロバンスルホン酸緩衝液（０．０５モル濃度
、ｐＨ１０）　、エムコ−ル（Ｅｍｃａｌ、商品名）Ｃ
Ｃ−９１１イオン界面活性剤＜０．７５％）及び防腐剤
（０．０１％）を含んでなった。

対照試薬溶液は、リン酸緩衝溶液（ｐＨ　７．　２　）
中のクレアチンキナーゼーＭＢ抗体（５躍／ｒｎｌ！＞
、カゼイン（０．５％）、ロンザインＣ両性界面活性剤
（０．０１％）及び防腐剤（０．０１％）から調製され
た。

呈色組底物は、２−　（４−ヒドロキシ−３−メトキシ
フエニル）−４．５−ビス（４−メトキシフエニル）イ
ミダゾールロイコ染料（０．　００８％）、ポリ　（ビ
ニルビロリドン）　　（１％）、り酸ナトリウム（１０
ミリモル濃度、ｐＨ６．８）、ジエチレントリアミンベ
ンタ酢酸（１０マイクロモルａｌ！＞、４’ーヒドロキ
シアセトアニリド（２ミリモル濃度）及び過酸化水素（
ＩＯミ！Ｊモル濃度）を含有した。

本例は、本発明の実施を、従来技術の膜を含む使い捨て
試験具を用いる、トラコーマ・クラミジア用アッセイと
比較したものである。非塗布バイオダインＡ膜の２つの
異った試料及びロプロダインの２つの異った試料を試験
具申で試験した。

プロテアーゼ溶液（約２８０４＃）をいくつかの抽出装
置に添加し、続いて種々の濃度の基本小体溶液試料（２
５／’）、又はリン酸緩衝溶液だけを含有する対照（２
５−ｊ）を添加した。混合後、装置を室温で３分間保持
し、次いで抽出組或物（２８０／’）を各々に添加し、
続いて更に室温で３分間インキスベートした。過酸化水
素溶液（２８０Ｉｄ）を次に添加し、ついでインキユベ
ーションを更に３分間続けた。

得られた混合物（ウェル当り１６０ｐ１）を抽出装置か
ら取り出し、ついで必須膜を有するシュアセル使い捨て
試験具で予備濾過した。ウェルに添加した基本小体の最
終濃度は０　（対照）、１００、２５０、及び５ｏｏｐ
ｇであった。

ウェルを２回（各１６０ｌｄ）洗浄しついで抗一クラミ
ジア抗体組或物（８０ｉｄ）を試料及び各試験具の陽性
対照のみに添加し、一方抗−クレアチンキナーゼ−ＭＢ
抗体組底物（８０−７）を各試験具の陰性対照ウェルに
添加した。室温で２分間のインキュベーションの後、ウ
ェルを再び２回洗浄した。

ベルオキシダーゼー標識化抗一抗体組或物（８０ｐＩ）
を次にすべてのウェルに添加し、続いて室温で５分間イ
ンキュベーションを行った。各参千＃會４各ウェルを更
に２回洗浄後、呈色組或物（８０ｄ）をすべてのウェル
に添加し、続いて室温で５分間インキュベーションを行
った。

膜上のロイコ染料、過酸化水素及びベルオキシダーゼの
反応から得られる呈色は目視で０〜１０のスケールでラ
ンク付けした（０は呈色が全くなく、１０は最高濃度）
。第１図にグラフで示した結果によれば、試験具にロブ
ログイン膜を使用すると受容可能な検出限度及び感度は
維持しながらバックグラウンドを低下させる結果になる
ことが示された（基本小体の０レベルを参照されたい）
例２：室温保持試験後のアッセイにおける種々の膜の効
果 本例は、試験キットを室温で１０週間貯蔵した後、例１
のように行ったアッセイの結果を比較するものであり、
この室温でＩＯ週間の貯蔵は従来技術による生或物につ
いての正常保持限度の約２倍である。

アッセイは１つの濃度の基本小体（５００ｐｇ）だけを
用いて実施し、ついで妨害溶液の試料を含有せしめた。

第２図にグラフで示した結果によれば、バックグラウン
ドレベル（ランク４）は、パイオダインＡ膜を用いるア
ッセイについては受容されず、しかし本発明のアッセイ
については受容される。更に、本発明のアッセイはフレ
ッシュ試薬を用いる対照と比較して、感度低下が全く示
されなかった。

例３：試薬の促進保持後の試験キットの比較本例は、種
々の温度で１４日間保持された、標識化抗一抗体を用い
るＳゾニル（Ｚｏｎｙｌ−，商品名）ＦＳＮ非イオン性
界面活性剤を塗布したパイオダインＡ膜を使用して実施
されたアッセイと、本発明のアッセイを比較するもので
ある。

アッセイは、１４日間、０℃、３５℃及び４２℃（室温
で約６０日と等価〉に保持したベルオキシダーゼー標識
化ヤギ抗一マウスを用いる、例１に述べたプロトコルを
用いて実施された。リン酸緩衝溶液をバックグラウンド
対照として用い、すべてのアッセイの基本小体濃度は５
００ｐｇであった。

アッセイの結果を第３図にグラフで示す。この結果によ
れば、抗体結合体をより高温で保持するにつれ、アッセ
イのバックグラウンドは、パイオダインＡ膜を使用した
場合は増加した。本発明のアッセイは４２℃でさえ低バ
ックグラウンドを示した。

例４：種々の試薬の促進保持後の、種々の膜を用いての
比較 この比較は、未標識化抗一クラミジア抗体及び抗−クレ
アチンキナーゼ−ＭＢ試薬を４２℃で７日間保持した以
外は例３のものと同様である。バックグラウンド対照の
ためにリン酸ａｌ’ｌ溶液、５０（ｌｐｇ基本小体及び
妨害溶液を用いてアッセイを行った。

第４図に示した結果は、パイオダインＡ膜の両試料を用
いるアッセイにおいてバックグラウンドは受容できない
が、ロブログイン膜を用いるアッセイにおいては高度に
望ましいものであることを示している。

〔発明の効果〕

本発明のアッセイは、使用するのに迅速で信頼性があり
かつ簡単である。一般には、所望の場合は室温で２５分
未満で行うことができる。抽出クラミジア抗原、特にト
ラコーマ・クラミジアから抽出したリポ多糖類抗原を検
出するのに極めて信頼性が高い。特願平第１−２０６３
６５号明細書く先述）において記載され特許請求されて
いる発明を用いてもまたこれらの利点が達或される。

しかしながら、本発明は、長期保存後でさえも高感度及
び低減バックグラウンドを維持する診断用試験キット及
びアッセイを提供するので、追加の利点を達或する。か
かる利点は、特願平１−２０６３６５号明細書く先述）
の界面活性剤一塗布非イオン性膜とは反対に、複数個の
表面水酸基を有する微多孔性ポリアミド膜を用いてアッ
セイが行われるために得られる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、界面活性剤一塗布又は普通の非改質ナイロン
膜を用いるアッセイと比較して、本発明のアッセイにお
ける感度及びバックグラウンドの差異を示す棒グラフで
ある。図示しかデータは上記例１において更に詳細に検
討している。 第２図は、上記例３において述べたアッセイについて、
室温保持における差異を示す棒グラフである。 第３図は、上記例４の比較アッセイについて、バックグ
ラウンドレベルに対する高温保持の影響を示す棒グラフ
である。 第４図は、上記例５のアッセイに使用した試薬に対する
高温保持の影響を示す棒グラフである。 食塩水対照 基本小体蛋白質 Ｆ５００ｐｏ　ｌ 妨害溶液 米パイ７ダインＡ一試料１ 図バイ万ダインＡ一試料２ ロロプログイン試料１ 第２図 基本小体蛋白質濃度（ρｇ） 虎パイオダイン八一試料１ ■バイオダイン八一試料２ 口Ｏプロダイン試料］ ０ロプロダイン試料２ 第１図 ４●Ｃ食塩水溶液 ３５●Ｃ食塩水溶液 ４２０Ｃ食塩水沼液 ４”Ｃ　基本小体蛋白質（５００ｃ＋ｇ）第５図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、Ａ、クラミジア菌を含有すると予想される試験試料
   から抽出されたクラミジア抗原を、複数個の水酸基をそ
   の表面上に有しかつ細孔の平均寸法が１〜１０μｍのポ
   リアミド微多孔性濾過膜と、抽出された抗原を膜に結合
   させるのに十分な時間接触させるごと、 Ｂ、膜に結合したクラミジア抗原を、免疫学的複合物を
   膜上に形成するようにクラミジア抗体と接触させること
   、ついで Ｃ、試験試料中のクラミジア菌の存在の目安として、膜
   上の複合物の存在を測定すること、を含んでなるクラミ
   ジア抗原の測定方法。 ２、複数個の水酸基をその表面上に有しかつ細孔の平均
   寸法が１〜１０μｍのポリアミド微多孔性濾過膜を含ん
   でなる、クラミジア抗原の測定に有用な診断用試験キッ
   ト。