JPH0213384A - 組換え型欠損レトロウイルス、相応する野生型レトロウイルスによる感染可能な細胞培養ゲノム内への一定のたん白質に対する暗号付け配列の組込みに対するその応用、ならびにかかる組換え型レトロウイルスの製造用の組換え型ｄｎａ - Google Patents

組換え型欠損レトロウイルス、相応する野生型レトロウイルスによる感染可能な細胞培養ゲノム内への一定のたん白質に対する暗号付け配列の組込みに対するその応用、ならびにかかる組換え型レトロウイルスの製造用の組換え型ｄｎａ

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JPH0213384A
JPH0213384A JP1076892A JP7689289A JPH0213384A JP H0213384 A JPH0213384 A JP H0213384A JP 1076892 A JP1076892 A JP 1076892A JP 7689289 A JP7689289 A JP 7689289A JP H0213384 A JPH0213384 A JP H0213384A
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JP
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retrovirus
recombinant
sequence
promoter
gene
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JP1076892A
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Thierry Heidmann
チェリー・エドマン
Jean-Francois Nicolas
ジャン―フランソワ・ニコラス
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Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Institut Pasteur
Original Assignee
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Institut Pasteur
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
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    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
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    • C12N15/86—Viral vectors
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
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    • C12N2740/10011—Retroviridae
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、特に哺乳動物の真正種類の細胞系列特に野生
型レトロウィルスによる感染が可能な細胞系列の細胞ゲ
ノム内に一定のたん白質に対する暗号づけ配列を組込む
手段に関する。
さらに限定的に言うと、本発明は感染を受けたこれらの
細胞自体の中でこれらの暗号づけ配列が表現されうるよ
うな条件の下でのこれらの配列の組込みに関する。
本発明に基づ（手段はその最終的態様において、関係す
る細胞宿主を感染させることのできる野生型又は自生型
のレトロウィルスから誘導された組換え型欠損レトロウ
ィルスで、かかるレトロウィルスは、その中で野生型ウ
ィルスの「シスにて」作用し通常レトロウィルスの詰込
み、そのＤＮＡ分子への逆転写およびその宿主細胞ゲノ
ム内への組込みを行なう部分ならびにこのＲＮＡのポリ
アデニル化部位を含んでおり、さらに上述の自生型レト
ロウィルスによる感染が可能な細胞宿主のポリメラーゼ
により認識できるこのレトロ転位雑種配列の内部のプロ
モータの直接的制御の下で一定のポリペプチドに対して
暗号づけするＤＮＡ配列を含むレトロ転位雑種配列での
欠失部分における置換（なおこのレトロ転位雑種配列は
それ自体その外部にあり欠損レトロウィルスのゲノム内
に含まれているプロモータの制御下におかれている）、
ならびにレトロ転位雑種配列の外部の暗号づけ配列及び
外部プロモータの相対的位置は、前記組換え型レトロウ
ィルスに感染した細胞宿主内の内部プロモータの制御の
下で前記暗号づけ配列の転写及び表現が前記外部プロモ
ータの制御下での転位雑種配列の転写方向とは逆の方向
に行なわれうるようなものであること、を特徴とする組
換え型欠損レトロウィルスで構成されている。
このように定義づけられた組換え型欠損レトロウィルス
は上述の目的のため、相応する自生型レトロウィルスに
より感染可能な哺乳動物の細胞をこの組換え型レトロウ
ィルスに感染させる段階及び場合によってはその中で暗
号付は配列が表現された細胞の回収段階を含む方法によ
って使用される。
その欠損性のため本発明に基づく組換え型レトロウィル
スは、これらの細胞内においてそれに対するその感染性
を保ちながら自ら複製することができない、同様にこの
ウィルスは宿主細胞のゲノム内にプロウィルスの形で組
込まれつる。このときレトロ転位雑種配列内に含まれて
いる暗号づけ配列は、レトロ転位雑種配列の「内部プロ
モータ」の制御の下で表現されうる。
内部プロモータは、例えばヒト又はハムスタのような高
等哨乳動物の細胞系列（例えばＣＨ○細胞）に属する細
胞の場合、ＳＶ４０又はチミジンキナーゼのプロモータ
のように感染宿主のポリメラーゼにより認識されるあら
ゆるプロモータで構成されていてよい。
本発明の好ましい実施態様に従った組換え型欠損レトロ
ウィルスは、別の外部プロモータが相応するレトロウィ
ルスのＬＴＲ６′領域のものであることを特徴とする。
さらに限定的に言うと、このタイプの組換え型欠損レト
ロウィルスのゲノムは、連続的に次のものを含んでいる
ニ ー　詰込み領域が後に続いている、相応する野生型レト
ロウィルスのＬＴＲ”領域； −通常ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子により暗号づけ
されるウィルス性たん白質に相応するＲＮＡの開始部位
； −　これらのｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子を含むレ
トロウィルス領域の全て又は一部分に代わる、上に規定
されている方向性の再転位雑種配列。なお、このレトロ
転位雑種配列はレトロウィルスのゲノム内に含まれてい
る適当な外部プロモータ又場合によってはＬＴＲ”領域
自体の制御下におかれている； −相応する野生型レトロウィルスのポリアデニル化部位
に一致するＬＴＲ”領域。
本発明はさらに限定的に言うと、前記組換え型欠損レト
ロウィルスの生成を可能にする組換え型ＤＮＡ　（及び
組換え型ＤＮＡの一部分）ならびに上述の組換支架レト
ロウィルスの製造方法に関するものである。
前記組換え型欠損レトロウィルスの生成のために用いる
ことのできる野生型又は自生型のレトロウィルスからそ
れ自体誘導されている組換え型ＤＮＡ　（以下「組換え
型欠損レトロウィルスＤＮＡＪと呼ぶ）としては、特に
、野生型ウィルスの「シス」として作用し通常このレト
ロウィルスの詰込み、そのＤＮＡ分子への逆転写及びそ
の宿主細胞ゲノム内への組込みを行なう部分に相応する
部分ならびにこのＲＮＡのポリアデニル化部位を含むＤ
ＮＡを挙げることができる。なおこの組換え型レトロウ
ィルスのＤＮＡは特に、野生型又は自生型ウィルスのウ
ィルス性たん白質に対する暗号配列の全てとは言わない
までも少なくともその一部分に相応する領域の欠失を特
徴とし、欠失した部分はこの組換え型欠損レトロウィル
スのＤＮＡで形質転換された相応する有能な宿主細胞内
で生成されうる欠損レトロウィルスの複製を禁止できる
ほど充分大きいものである。又、この組換λ型欠損レト
ロウィルスは、以下□に規定されている構造をもち組換
え型レトロウィルスのＤＮＡ内に含まれてはいるがこの
組換え型遺伝子に対しては外側にある別のプロモータの
制御の下で転写されうるような組換え型遺伝子による欠
失部分における置換をその特徴としている。
この組換え型遺伝子はさらに、求められている一定のペ
プチドに対する暗号づけ配列を含んでいること（なおこ
の配列はこの組換え型遺伝子の内部において前記プロモ
ータにより課せられる転写方向内の内部プロモータより
下流に置かれている）、そして、前記プロモータと前記
暗号づけ配列の間には、それ自体前記転写を遮断するこ
とのできる配列を含む雑種フラグメントが介在している
こと、（なおかかる遮断配列自体には、この雑種フラグ
メントの中でその相反する２つの端部にて一方では暗号
づけ配列の側面に継ぎ合せ供与部位が又他方では前記プ
ロモータの継ぎ合せ受容部位が添えられている。従って
前記部間要素は前述の内部プロモータの制御の下で暗号
配列の転写を禁止している６反対に、この組換え型遺伝
子が全体的に前述のものとは別の外部プロモータの制御
下におかれている場合、この組換え型遺伝子が（中断コ
ドンが無い状態で）内部プロモータにより刻み込まれる
方向とは反対方向（逆方向）で転写されうるような条件
の下で、能力細胞宿主内において、組換え型遺伝子全体
が外部プロモータの制御下で内部プロモータと暗号づけ
配列の間の部間領域すなわちその相反する２つの端部で
前記継ぎ合せ供与部位と受容部位が添えられている遮断
配列を含む領域を切除する伝令ＲＮＡに転写されること
になる。得られた伝令ＲＮＡにおいては、一定のポリペ
プチドに対する暗号付は配列に相当するＲＮＡ配列は、
このとき内部ブロモーク領域に相応する領域の直接的制
御下に置かれている。
かかる組換え型遺伝子は、一方ではレトロウィルスＤＮ
Ａ内のこの遺伝子の方向性又他方ではこの組換え型遺伝
子と外部プロモータの相対的位置が、この外部プロモー
タの制御下でのかかる遺伝子の転写が宿主細胞内で行な
われ、前述の部間配列により妨げられていない場合に求
められているペプチドに対する暗号づけ配列の転写が行
なわれる方向とは反対の方向にこうして構成された組換
え型欠損レトロウィルスを生成することになるようなも
のであるように、組換え型欠損レトロウィルスのＤＮＡ
の中に挿入される。
このときかかる組換え型欠損レトロウィルスのＤＮＡか
ら出発して、以下のような段階を含む方法により前記組
換え型欠損レトロウィルスを生成することができるニ ー　感染させる可能性のある細胞内でのその増殖を許容
するウィルス性たん白質に対する暗号づけ配列の組換え
型欠損ベクター内での欠如に対し補足することのできる
核配列（以下「相補性配ダ自と呼ぶ）をその独自のゲノ
ムＤＮＡに組込まれた形で含んでいる補助細胞系列のト
ランスフェクション； −前記「相補性配列」により暗号づけされたウィルス性
たん白質の「トランスでの」相補による持ち込みのおか
げで、この組換え型レトロウィルスを原位置で複製でき
るようにする条件の下で、このようにトランスフェクシ
ョンされた補助細胞系列を培養する段階ニ ー　前記補助細胞系列の培養の浮遊物内の生成された組
換え型欠損レトロウィルスの回収段階。
特に相補性配列には、ウィルス性たん白質に対して特に
暗号づけする相応する野生型レトロウィルスのゲノムＤ
ＮＡの一部分、すなわち組換え型欠損レトロウィルス自
身には備わっていない相応する野生型レトロウィルスの
遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖが含まれている。
前述の条件下での能力細胞宿主のトランスフェクション
の後のように、欠損レトロウィルスＤＮＡ内に含まれて
いる外部プロモータの作用の下で上述の組換え型遺伝子
を転写すると、このとき一定のポリペプチドに対する暗
号づけ配列が上記内部プロモータの直接的制御の下に置
かれているような相応する組換え型欠損レトロウィルス
を製造することができる。
上に定義されているような組換え型遺伝子内に含まれて
いる「遮断配列」は有利なことにポリアデニル化部位で
構成されている。当然のことながら、その他のあらゆる
遮断配列を用いることが可能である。これは内部プロモ
ータにより課せられた転写方向に複数の開始コドン及び
停止コドンを含む配列で構成されていてもよい。又当然
のことながら、上述の説明の中で、前記組換え型遺伝子
を形成するヌクレオチドの連鎖は場合によっては、組換
え型遺伝子の全てが上述の逆方向゛にて外部プロモータ
から転写されうるように選択される。
有利なことに、上に定義づけされているような組換え型
遺伝子は、野生型レトロウィルスのＬＴＲ”領域に相応
するプロモータ領域の制御の下で、欠損レトロウィルス
ＤＮＡの内部で前記条件下に置かれる。本発明に基づく
好ましい組換え型欠損レトロウィルスＤＮＡは従って連
続的に以下のものを含んでいるニ ー　詰込み領域が後に続く、相応する野生型レトロウィ
ルスのＬＴＲ”領域； −ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子により通常暗号づけ
されるウィルス性たん白質に相応するＲＮＡの開始部位
ニ ー　これらのｇａｇ、ｐｏｌ及び６ｎｖ遺伝子を含むレ
トロウィルス領域の全て又は一部分に代る、上に規定さ
れている方向性の上に規定されている組換え型遺伝子、
なおかかる組換え型遺伝子は適当な外部ブロモーク場合
によってはＬＴＲ’°領域自体の制御下に置かれている
；そして −相応する野生型レトロウィルスＲＮＡのポリアデニル
化部位と一致するＬＴＲ”°領域。
本発明の好ましい応用の１つにおいては、上記組換え型
遺伝子内で内部プロモータの制御下に置かれている暗号
づけ配列は、レトロウィルスに感染しつる細胞に対して
有毒なたん白質に対し暗号づけする。又前記補助細胞系
列内の組換え型欠損レトロウィルスの生成にあたって、
かかる細胞系列は実際、遮断配列の介在のため、この組
換え型遺伝子の内部のプロモータの作用下でこの暗号づ
け配列の転写が遮断されるために、有毒たん白質に対し
て保護されることになるということがわかる。これに対
して、自生型レトロウィルスそして当然同様に本発明に
基づく組換え型欠損レトロウィルスに感染しつる細胞は
、それらが組換え型レトロウィルスに感染したためにそ
の結果得られるプロウィルスをこの細胞のゲノム内に組
込ませ内部プロモータの制御の下での暗号づけ配列の表
現を得た場合、きわめて感受性が高くなりひいては破壊
される。
その他の暗号づけ配列も当然のことながら、上述の組換
え型欠損レトロウィルス内に組込まれつる。例えばマー
カーがそれである。本発明はこの場合、一定の野生型レ
トロウィルスに相当するレトロウィルスに感染しつる細
胞のマーキング技術を提供しており、このとき暗号づけ
配列は、これらの細胞が感染する可能性の「指標」とし
て挙動する。
本発明のもう１つの応用分野は、特にガン細胞がそれに
特異的な抗原を有する場合の健康な組織内でのガン細胞
の選択的破壊である。この選択的破壊は、一方ではこれ
らのガン細胞の特異的抗原を又他方では組換え型レトロ
ウィルスのウィルス性たん白質を認識する抗体が利用で
きるようになった場合、ならびにこれらの抗体が問題の
抗原及びウィルス性たん白質に固定された後、２つの最
初のタイプの抗体を含む第２のカテゴリーの抗体を介し
て、ガン細胞内に欠損ウィルスが介在する可能性のある
状態でこれらを密に接触させた場合に直ちに可能となる
。
本発明のその他の特徴は、本発明に従った組換え型欠損
レトロウィルスの操作上の性質を実証することを目的と
した試験についての、図面を参考にした以下の記述の中
でさらによく理解できることだろう。
〈実施例〉 以下に説明されている実験は、高等哨乳動物の細胞を感
染させることのできるレトロウィルスの大部分を代表す
る構造を持つマウスのモロ；−白血病ウィルスから誘導
された欠損プロウィルスを使用して行なわれた。当業者
ならば、以下に説明する試験が同様にして他のタイプの
レトロウィルスにも拡大できるものであることがわかる
であろう。
図面のより詳しい説明により、以下の試験についての次
に続く記述をより容易に理解できることと思われる。
第１図ニレトロ転位の検出のための基本的要素。
（Ａ）レトロ転位の指示遺伝子である （ｎ　；＝　ｏ　）ＲＴの構造がここに表わされている
。この指示遺伝子は、自生型レトロウィルスのゲノム内
でその構造的たん白質特にＥＮＶ　（ウィルス粒子膜構
造たん白質）遺伝子に対して暗号づけする領域の１つの
代りに組込まれるための組込み「組換え型遺伝子」に相
当する。各々の遺伝的要素は、帯域内で矢印により示さ
れている：ｔｋは、Ｈ３Ｖ（ヘルペスウィルス）のチミ
ジンキナーゼの遺伝子のプロモータを表わす；ｐｏ　１
　ｙＡは、前述の遺伝子のポリアデニル化配列を表わす
； ｎ８０は、ネオマイシンに対する抵抗性に対して暗号づ
けする遺伝子の配列を表わす。
Ｓ、Ｄ、及びＳ、Ａはそれぞれ、継ぎ合せ供与部位と継
ぎ合せ受容部位を表わす。
（Ｂ）には、上述の組換え型遺伝子が中に組込まれてい
る組換え型レトロウィルスのｐＭｏ−ＭＬＶ　−（ｎ　
ｅ　ｏ）”構造が示されている。この構造のレトロウィ
ルス性部分はクローニングされたプロウィルスｐＭｏｖ
３から来る。この図は又、ｎｅｏフラグメント（上述の
組換え型遺伝子が中に組込まれている組換え型レトロウ
ィルスの「指示」フラグメント）及びｐｏ　ｌｙＡフラ
グメント（遮断配列）をも示している。
（Ａ）及び（Ｂ）において、プラスミドの構成のために
用いられた制限部位は、それらが削除されている場合、
星印がついている。
第２図は、組換え型欠損レトロウィルスに感染した細胞
のゲノム内に組込まれるプロウィルスに到達するようＲ
ＮＡ　（継合せＲＮＡｇ）へと組換え型レトロウィルス
ＤＮＡを転写によって移行させる作業が関与している、
本発明に従った欠損レトロウィルスの製造の連続的段階
を表わしている。
１旦３：　ｐＭｏ−ＭＬＶ　（ｎｅｏ）”でトランスフ
ェクションされた細胞から得られたウィルスに感染した
抵抗性Ｇ４１８細胞のゲノムのＤＮＡの「サザンプロッ
ト」法による分析。
クローン３Ｔ３ｇｐｔＭｏ　（ｎｅｏ）”　−Ａ（ｐＳ
Ｖ２ｇｐｔとｐＭｏ−ＭＬＶ　（ｎｅｏｌＲ７のトラン
スフェクションによって得られたクローン３Ｔ３）から
の細胞をＭ　ｏ　−Ｍ　Ｌ　Ｖウィルスに感染させた；
７８後浮遊物を回収しその１００ψ１を用いてテスト用
細胞３Ｔ３を１０４個感染させた；２日後、これらの細
胞を６４１８の存在する中で選択に付した。抵抗性６４
１８細胞を混合クローン（母集団３Ｔ３Ｍｏ　ｆｎｅｏ
）”　）の形又は個々のクローン（３Ｔ３Ｍｏ　　（ｎ
ｅｏ）”ｃ　／　１−　ｃ　／　７　）の形で分析した
。
使用された制限酵素は、ＸｂａＩ　　（Ｘ）又はＸｂａ
Ｉ＋５ａｃｌ　（Ｘ＋Ｓ）である、これらにより、継ぎ
合せが正しく行なわれたことを確認することができた。
１０μｇ又は２５μｇのＤＮＡが用いられた（２つの最
初の帯）。フィルターはｎｅｏゾンデ（フラグメントＢ
　ｇ　Ｉ　ＩＩ−ＳｍａＩ、Ａ）又はｐｏｌｙＡゾンデ
（フラグメントＳｍａ　１−Ｎｃｏ　１．Ｂ）と交雑さ
せた。
１土遍：　３Ｔ３ｇｐｔＭｏ　（ｎｅｏ）”でトランス
フェクションされたクローンから単離された６４１８に
対する抵抗性細胞のゲノムのＤＮＡのサザンプロット法
による分析；継ぎ合せ接合物の配列 （Ａ及びＢ）クローン３　Ｔ　３　ｇ　ｐ　ｔ　Ｍ　ｏ
　−（ｎｅｏ）”Ａ及びＢからの細胞をＧ（４１８）の
存在する中で選択に付した（プレート１０ｃｍあたり１
０６個の細胞）、プレート１枚あたり６４１８に対する
抵抗性クローンが０−２個得られた（例えば３Ｔ３ｇｐ
ｔＭｏ　（ｎｅｏ）＊ＴクローンＡ−１〜Ａ−５、及び
クローンｃ／ＩＢ−１を参照のこと）；継ぎ合せが適切
に行なわれることをテストするためＸｂａＩ及びＸｂａ
　Ｉ　＋Ｓａｃ　Ｉを用いて制限した後、第２図につい
て説明されているようにＤＮＡを分析した。クローンＢ
−１内及びクローンＡ−５内の新しいコピーは、それぞ
れ第３図のクローンＭｏ（ｎｅｏｌ”ｃ／３（”）及び
ｃ／２　（”）の２．６ｋｂ及び２．７ｋｂのフラグメ
ントＸｂａＩと共遊走する。フィルターは、ゾンデｎ、
ｅｏ（Ａ）又はゾンデｐｏ　ｌ　ｙＡ　（Ｂ）と交雑さ
せた。
（Ｃ−）ｐＭｏ−ＭＬＶ　（ｎｅｏｌ”の転位されたプ
ロウィルスコピー内の継ぎ合せ接合部３Ｔ３ｇｐｔＭｏ
　　［ｎｅｏ）”　−Ａ−５のＤＮＡからの２．７ｋｂ
のフラグメントＸｂａ　Ｉをλｇｔｌｏ内でクローニン
グし、暗号づけ領域ｎｅｏ内にあるＰ　ｖ　ｕ　ＩＩ部
位及びプロモータｔｋ内にあるＥｃｏＲＩ部位により限
定されている６６２の塩基対のフラグメントはＭ１３内
にてサブクローニングし配列決定した。継ぎ合せ接合部
に現われた新しい部位５ａＣＩが示されている。
１）社主レー包珠 ａ）ズ乏ノ一二し２１或 レトロ転位指標　（ｎｅｏｎ”を構築するために、単純
性庖疹ウィルスのチミジンキナーゼの遺伝子のポリアデ
ニル化のための暗号づけ配列を、長さが３１０塩基対の
フラグメントＳｍａ　Ｉ　−ＮｃｏＩの形でプラスミド
ｐＡＧｏから単離させ（ＣＯＬＢＥＲＥ−ＧＡＲＡＰＩ
Ｎ、　Ｆ他著、Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、。
１５０、１−１４　　（１９８１年））、２つのフラグ
メントのＫｌｅｎｏｗ酵素による処理の後モロ；−の供
与及び受容継ぎ合せ部位の間に、プラスミドｐＺｉｐの
単独部位ＢａｍＨＩのレベルに挿入した（ＣＥＰＫＯ，
Ｃ，Ｌ、、他著、Ｃｅ１１．３７．１０５３−１０６２
（１９８４年））。次に、ポリアデニル化配列及び継ぎ
合せ部位を含むフラグメントをフラグメントＫｐｎ　Ｉ
−Ｋｐｎ　Ｉから単離させ、２つのフラグメントのＫｌ
ｅｎｏｗ酵素による処理の後ｐＳＶｔｋ−ｎｅｏｂｅｔ
ａの部位Ｂ　ｇ　Ｉ　ＩＩのレベルで遺伝子（ｎｅｏ）
に対する暗号づけ領域とプロモータ５Ｖｔｋの間に挿入
した［ＮＩＣ０ＬＡＳ、　Ｊ。
Ｓ、及びＢＥＲＧ、　Ｐ、、細胞増殖に関するＣｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ会議報告書、編集：　５ｉ
ｌｖｅｒ、　Ｌ。
Ｍ、　ＭＡＲＴＩＮ、　Ｇ、　Ｒ，＆　５ｔｒｉｃｋｌ
ａｎｄ、　Ｓ、　Ｓ、、　１０゜４６９−４８５　（１
９８３年）］：指示遺伝子ｎｅｏ”（第１Ａ図）は、フ
ラグメントＨｉ　ｎｄｌｌ［−Ｓｍａ　Ｉから単離させ
た。
プラスミドｐＭｏｖ３内のｅｎｖ遺伝子を削除するよう
な形で［ＨＡＲＢＥＲ，Ｋ、、他、米国国立科学アカデ
ミ−会報、７８．７６０９−７６１３　ｆ１９８１年）
］、プラスミドｐＭＶＯ３のフラグメントＥｃｏＲＩを
まず最初にｐＳＶｔｋ−ｎｅｏｂｅｔａの３．４ｋｂの
フラグメントＥｃｏＲＩ内で再クローニングした；この
とき、たん白質ｇｐ７０の一部分及びたん白質ｐ１５Ｅ
全体に対して暗号づけするフラグメントＢａｍＨＩ−Ｃ
１ａ工　（それぞれｒＲＮＡ腫瘍ウィルス、編集：■Ｅ
ＩＳＳ、　Ｒ。
ＴＥＩＣＨ，Ｎ、、　ＶＡＲＭＵＳ、　Ｈ＆　Ｃ０ＦＦ
ＩＮ、　Ｊ、、　２．７６６−７６７　　（１９８５年
）」内に記されている塩基対６５３７及び７６７４に相
当する）は、Ｃ１ａＩを用いた完全消化及びＢａｍＨＩ
を用いた部分消化によって除去された。
最終的な構成（ｐＭｏ−ＭＬＶ　（ｎｅｏｌ”　）は、
Ｋｌｅｎｏｗ酵素による処理の後の指示遺伝子（ｎｅｏ
）”で上述の方法でｅｎｖ遺伝子が除去されたベクター
ｐ　Ｍ　ｏ　ｖ　３の大葉によって得られた（第１Ｂ図
）。
ｂ）ＷＬｌａＵ立　、トランスフェクション　び爪歯 これらの方法はＪＡＣＯＢ、　Ｈ及びＮＩＣ０ＬＡＳ、
　Ｊ、　Ｓ、著の「酵素科学における諸方法Ｊ　１５１
．６６−８１　（１９８７年）の中に記述されている。
使用する細胞はＮＩＨ３Ｔ３及びＦ　Ｇ　Ｉ　Ｏ（ＦＩ
ＮＳ）ＩＩＮＧＥＲ他、「ウィルス学Ｊ　５９．２１７
−２２９　（１９７４年））であり、用いるウィルス系
列は、モロニについては３Ｔ３Ｍ。
−ＭＬＶ、Ｍｏ−ＭＬＶｎｅｏについてはＥ４０ｐｓｉ
Ｂである（ＲＵＢＩＮＳＴＥＩＮ、　Ｊ、　Ｌ、　Ｒ，
他、米国国立科学アカデミ−会報、８１．７１３７−７
１４０　　（１９８４年）。抵抗性細胞Ｇ４１８の選択
は、ゲネチシン（Ｇ４１８）６００μｇ／ｍｆ７が存在
する中で行ない、ｐＳＶ２ｇｐｔを含む細胞（ＭＵＬＬ
ＩＧＡＮ、　Ｒ，Ｃ他、米国国立科学アカデミ−会報、
７８．２０７２−２０７６　　（１９８１年）を、２５
μｇ／−のマイコフェノール酸と２５０μｇ／ｍｌのキ
サンチンが存在する中で選択した。
感染は、５μｇ／−のポリプレンが存在する中で、前述
のＪＡＣＯＢ、、　Ｈ及びＮＩＣ０ＬＡＳ、　Ｊ、　Ｆ
。
（１９８７）中に記されているとおりに行なった。
Ｃ）綴虱旦旦五Ａ豆逝 サザン分析のためには、適切な制限酵素で処理されたゲ
ノムＤＮＡを電気泳動に付し、ナイロン膜Ｈｙｂｏｎｄ
−Ｎ　（ＡＭＥＲＳＨＡＭ）上に転移させ、放射能で９
３２を用いて（ＡＭＥＲＳＨＡＭ社が市販しているＭＵ
ＬＴＩＰＭＩＭＥキット）マーキングされたゾンデに交
雑させた。
クローン３Ｔ３ｇｐｔＭｏ　（ｎｅｏ）”　−Ａ−５か
らのＤ　Ｎ　Ａ　５０　μｇをＸｂａＩで消化させ、０
．７％のアガロースゲル内で電気泳動に付した。２．５
〜２．９ｋｂのフラグメントを含むアガロース帯を切断
し、電気溶離により抽出されたＤＮＡを用いて、アダプ
タ（リンカ−）ＥｃｏＲＩの助けを借りて標準的手順に
徒ってベクターλｇｔ１０内に部分的ゲノムバンクを構
築した（　ＨＵＹＮＨ他著、ＤＮＡクローニング、編集
：Ｇｌｏｖｅｒ、　Ｄ、　Ｍ、　Ｎ、　Ｙ、、　ＩＲＬ
　Ｐｒｅｓｓ、　１．４９−７８（１９８５年））。ク
ローンは、支持フィルター上のＰ　３２でマーキングさ
れたｎｅｏゾンデとの交雑により選択した。正のクロー
ンからのフラグメントＰ　ｖ　ｕ　ＩＩ　−Ｅ　ｃ　ｏ
　ＲＩをベクターＭ１３ｍｐ１０内でサブクローニング
し、５ＡＮＧＥＲ，Ｆ、他著の（米国国立科学アカデミ
−会報、７４．５４６３−５４６７（１９７７年））内
に記載の方法によって配列決定した。
２）■ ａ）ニム土二皿ｌ テストの原則は、ＲＮＡを媒体とした転位により活化さ
れうる選択遺伝子の使用にある（第１図）。遺伝子（ｔ
ｋｎｅｏ）は、遺伝子の構造的部分とプロモータ（ｔｋ
）の間にポリアデニル化のための部位（ｐｏｌｙＡ）及
び信号を挿入することにより不活性化される；ポリアデ
ニル化のための配列は、供与及び受容継ぎ合せ部位（ｎ
ｅｏ”、第１Ａ図）により、暗号づけしないＤＮＡの錆
止において、とり囲まれている。ｐｏｌｙＡ配列が、レ
トロトランスポゾン（ｐＭｏ−ＭＬＶ　（ｎｅｏ）”　
、第１Ｂ図）内で反対方向に挿入されると、暗号づけし
ない継ぎ合わされたＲＮＡｎｅｏ”の逆転写の結果、ｎ
ｅ。
遺伝子がプロモータｔｋの制御下に置かれる構造的ＤＮ
Ａが形成されることになる。従って、レトロ転位された
コピーを含む細胞は６４１８に対し抵抗性のものとなる
（第１Ｃ図）。
ｎ　ｅ　ｏ　”遺伝子内では、（１）選択された遺伝子
の表現はｐｏｌｙＡ領域が介在配列内に存在するかぎり
存在しな（ではならず、（２）ｐｏｌｙＡ領域の削除は
、宿主細胞に０４１８に対する抵抗性を与える構造を作
り上げるはずである。
これら２つの点そしてレトロウィルスの非ウィルス性レ
トロ転位を、ウィルス外膜の主な構成要素に対して暗号
づけするその遺伝子が削除されているクローニングされ
たプロウィルスＭｏ−ＭＬＶ内にｎ　ｅ　ｏ　”遺伝子
を挿入することによってテストした。
ｂ）　　Ｍｏ−ＭＬＶ　　ｎｅｏ　”は６４１８に・　
る　　　　　えない。
（ｎｅｏ）”が前述の２つの点を満たすことを立証する
ため、ｐＭｏ−ＭＬＶ　（ｎｅｏ）”のトランスフェク
ションにより細胞ＮＩＦ（３Ｔ３内にこれを導入した。
ｐＭｏ−ＭＬＶ　（ｎｅｏｌ”が選択的に導入されなか
ったクローン（クローン３Ｔ３ｇｐｔＭｏ　（ｎｅｏ）
”　）を分離させ、トランスフェクション効率を測定す
るような形でｐＳＶ２ｇｓｔを同時トランスフェクショ
ンした。
ｎｅｏ”内でのｎｅｏ遺伝子の第１の不活性化テストに
おいては、トランスフェクションされた細胞の母集団を
直接抗生物質Ｇ４１８を含む媒質の中での選択に付し、
抵抗性クローンの数を、ｎｅｏ遺伝子がその中で活性で
あるようなプラスミド（ｐＭｏ−ＭＬＶｎｅｏ、前述の
ＲＵＢＥＮＳＴＥＩＮ、　Ｊ、　Ｌ、　Ｒ他（１９８４
年））のトランスフェクションにより得られたものと比
較した。ｐＭｏ−ＭＬＶ　（ｎｅｏ）”によるとトラン
スフェクションにより６４１８に対する抵抗性のあるク
ローンが０〜３個しか得られず（３回の実験）、一方、
プラスミドｐＭｏ−ＭＬＶｎｅｏでは６４１８に対する
抵抗性のあるクローンが７５個以上得られる（マイコフ
ェノール酸を含む媒質内での並行選択は、トランスフェ
クション効率が同様であることを示している（表１））
。
０４１８に対する抵抗性のある個々のクローン５個の構
造なサザン法で分析したところ、（おそらくトランスフ
ェクションを原因とする）指示遺伝子（第１ａ図に示さ
れている）を含む３．５ｋｂのフラグメントＸｂａＩの
再配列が存在していた。
第２のテストでは、ｇｂｔの表現によりクローンを選択
し、そのうち再配列されていない（ｎｅｏ）”遺伝子を
含む７つく例として第３図のクローン３Ｔ３ｇｐｔＭｏ
　（ｎｅｏｌ”　−Ａ及び−Ｂを参照）を６４１８に付
した。そのうちのいずれも６４１８に対する抵抗性をも
たなかった（以下の節も参照のこと）。
これらの実験は、（ｎｅｏ）”遺伝子が、再配列されな
いかぎり６４１８に対する抵抗性を与えるものでないと
いうことを示している。
える。
トランスフェクションを受けた細胞内にｐＭ。
−ＭＬＶ　（ｎｅｏｌ”によって生成されたＲＮＡの分
画は継ぎ合せされなくてはならず、従ってポリアデニル
化配列を含まない、このＲＮＡは、ウィルス性ゲノムの
ＲＮＡの特性を保っており、これはウィルス性生成物の
トランス−相補性メカニズムによりウィルス粒子の内部
に詰込まれなくてはならない、逆転写により得られたコ
ピー（第１Ｃ図）が６４１８に対する抵抗性を与えつる
か否かをテストするために、Ｍｏ−ＭＬＶウィルスに感
染した細胞３Ｔ３ｇｐｔＭｏ−（ｎｅｏ）”の浮遊物を
テスト細胞ＮＩＨ３Ｔ３に転移させた。。
上述のトランスフェクションされた７つのクローン３Ｔ
３ｇｐｔ　　（ｎｅｏ）”の浮遊物から、６４１８に対
する抵抗性のコロ；−が得られた。浮遊物の滴定量は０
．５〜２Ｘ１０”ｎｅｏ’ｆｕ／−である、新しいプロ
ウィルスの構造をサザン法（サザンプロット法）により
分析した。
第２ａ図に記されているように、ｎｅｏゾンデと共にク
ローン３Ｔ３ｐｇｔＭｏ　（ｎｅｏ）”内に観察された
　［ｎｅｏｌ”を含むフラグメントＸｂａ工は、感染し
た細胞の母集団（母集団Ｍｏ　　（ｎ　ｅ　ｏｌ”　）
内又はサブクローン（Ｍ。
（ｎｅｏ）訂ｃ／１〜ｃ／７）内で縮小したサイズをも
つ。母集団の中には、濃度の異なる帯が最高４つまで見
られ、そのうち２つ（２，７ｋｂと２．６ｋｂのもの）
は、サブクローン内に大部分が表わされている。感染を
受は分析された２５のクローンのうち８つは２．７ｋｂ
の帯を含み、１２が２．６ｋｂの帯を含んでいる。観察
されたその他２つの帯はさらに小さく　（２，５ｋｂ及
び２．０ｋｂ）、もとの帯３．５ｋｂは、全くみられな
かった。これらの４つの帯のうちいずれも、イントロン
（介在配列）領域のゾンデｐｏ　１　ｙＡと交雑しない
（第２ｂ図）。
２．７ｋｂの帯は、それが継ぎ合せ接合部位に現われる
はずのＳａｃ　Ｉ部位を含んでいるかどうかを見極める
目的でさらに限定的に研究された（ＭＡＮＮ、　Ｒ他著
、　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、、　５４．４０１−４０７　ｆ
１９８５年）：第１ｃ図）、実際２．７ｋｂのフラグメ
ントは、ゲノムＤＮＡが制限酵素ＸｂａＩ及び５ａｃＩ
により先導されｎｅｏゾンデを用いて交雑テストに付さ
れる場合、１．９ｋｂのフラグメントに縮小される。反
対に、２．６ｋｂの帯はＳａｃ　Ｉ部位を含んでおらず
、潜在部位Ｄ−Ａが関与する継ぎ合せ事象又は、逆転写
中の再配列に相当しな（ではならない。
結論として、ｐＭｏ−ＭＬＶ　（ｎｅｏ）”は、中間Ｒ
ＮＡを介した、ｎｅｏ遺伝子が活性である構造への移行
を可能にする。
ｄ）モロ；−プロウィルスｅｎｖ−のレトロ−位 独立した４つのクローン３Ｔ３ｇｐｔ （ｎｅｏ）”からの１０８の細胞を６４１８選択に付し
た。各ケースにおいて、１０’の細胞について１〜１０
個の抵抗性クローンが得られ、そのＤＮＡを分析した（
第３図）。これらは２つのカテゴリに再分類することが
できる。
第１のカテゴリー（Ｇ４１８に対する抵抗性クローン３
７個のうち１３個）では、３．５ｋｂのＸｂａＩフラグ
メント（第１Ａ図のトランスフェクションされたプラス
ミドに相当する）は、イントロンゾンデｐｏｌｙＡ（第
３Ｂ図）と交雑しない新しいフラグメント（第３図、ｃ
　／　１及びｃ／２）で置換されている；従ってこれら
のクローンは、少なくともｐｏｌｙＡ配列が削除されて
いる最初のコピーの再配列としてみなすことができる。
第２のカテゴリー（分析された３７のクローンのうちの
２４個）では、トランスフェクションされたクローン（
第３Ａ図、クローンＡ−３〜Ａ−５、及びＢ−１）の３
．５ｋｂの最初の帯の他に、ｎｅｏゾンデと交雑する１
つ又は場合によっては２つの帯がみられる。これらの付
加的な帯はゾンデｐｏｌｙＡ（第３Ｂ図）と交雑しない
。複数の場合において（それぞれ５つと２つのクローン
）、これらの帯は、感染したクローン（第３Ａ図、クロ
ーンＡ−５及びＢ−１）の２．６ｋｂの継ぎ合せコピー
或は２．６ｋｂの継ぎ合せコピーと共遊走する。２．７
ｋｂの帯がトランスフェクションされたプロウィルスの
正しく継ぎ合された転写配列の逆転写からきているとい
う事実は、１．９ｋｂの帯を生成するＳａｃ　Ｉ及びＸ
ｂａ　ＩのＤＮＡ　（第３Ａ図、クローンＡ−５）の消
化により実証された。この結論は、６４．８での６４１
８抵抗性クローンの１つ（クローン八−５）からの２．
７ｋｂのフラグメントＸｂａ　Ｉのクローニングによっ
て、ならびに継ぎ合せ接合部位の配列決定（第３Ｃ図）
によって確認されている。
従って前述の試験の結果、ｎｅｏ”の内部プロモータの
制御の下で、ｎｅｏマーカーの転写の通常の方向とは反
対の方向でレトロウィルスの外部プロモータから転写さ
れた核配列内に継ぎ合せ部位が含まれるような方向性で
（レトロトランスボゾンとして働く）欠損レトロウィル
ス内のｎｅｏ”遺伝子から、そのときそれに結びつけら
れている内部プロモータの制御の下でそれ自体翻訳され
うるｎｅｏ配列に相応するＲＮＡ配列を含む伝令ＲＮＡ
を提供することのできる組換え型ＤＮＡを逆転写の後に
生成するような組換え型ＲＮＡを得ることができるとい
うことになる。
本発明に基づく組換え型欠損レトロウィルスが生成され
うるトランス相補性系列は、ψ２という呼称でＡｍｅｒ
ｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔ
ｉｏｎ（ＡＴＣＣ）で入手可能であるということにも留
意されたい。
【図面の簡単な説明】
第１Ａ図及び１８図は、本発明に基づく組換え型遺伝子
の組織化及び欠損レトロウィルスベクター内へのその挿
入を概略的に示している。 第２図は、第１図の組換え型ＤＮＡから得られた組換え
型欠損レトロウィルスをプロウィルスの形で感染した細
胞内に組込む連続的段階、ならびに伝令ＲＮＡへのその
転写及びその逆転写そしてゲノム内への感染した細胞の
組込みの段階を概略的に示している。 第３図及び第４図は、感染した細胞から抽出したＤＮＡ
の、さまざまな制限酵素による消化後の、テストされた
ＤＮＡの異なるフラグメントのゲル上での分画な、概略
的に示している。 Ｇ、ｌ。

Claims (11)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）特に哺乳動物の有能な真正核類細胞宿主内で内部
    プロモータにより課せられた転写方向でかかる内部プロ
    モータの下流に置かれ一定のポリペプチドに対して暗号
    付けする配列を含む組換え型遺伝子において、前記プロ
    モータと前記暗号付け配列の間にかかる転写を遮断でき
    る１つの配列を含む雑種フラグメントが介在すること、
    かかる遮断配列自体には、この雑種フラグメントの中で
    その相対する２つの端部にて一方では暗号づけ配列の側
    面の継ぎ合せ供与部位が又他方では前記プロモータの継
    ぎ合せ受容部位が、能力細胞宿主内のこの雑種フラグメ
    ントの切除を可能にする条件の下で添えられていること
    、しかもこのとき、前記組換え型遺伝子は前記能力細胞
    宿主のポリメラーゼにより同様に認識可能な先行するも
    のとは異なる外部プロモータの制御の下に置かれており
    、又、前記内部プロモータにより刻みつけられたものと
    は反対の方向（逆方向）に上述の要素全体を転写できる
    ようにする条件が存在することを特徴とする、組換え型
    遺伝子。
  2. （２）上述の第１の転写を遮断することのできる配列は
    ポリアデニル化部位により構成されていることを特徴と
    する、請求項（１）に記載の組換え型遺伝子。
  3. （３）特に哺乳動物の、真正核類能力細胞宿主を感染さ
    せることのできる野生又は自生のレトロウイルスから誘
    導された組換え型欠損レトロウイルスのＤＮＡにおいて
    、このＤＮＡには、このレトロウイルス内で野生型ウィ
    ルスの「シスにて」作用し通常レトロウイルスの詰込み
    、そのＤＮＡ分子への逆転写ならびにその宿主細胞ゲノ
    ム内への組込みを行なう部分に相応する部分ならびにこ
    のＲＮＡのポリアデニル化部位が含まれていること、（
    なおこの組換え型レトロウイルスＤＮＡは、特に、野生
    型又は自生型ウィルスのウィルスたん白質に対する暗号
    づけ配列の全てとは言わないまでも少なくともその一部
    分に相当する領域が欠失していること、そして欠失部分
    は、この組換え型欠損レトロウイルスのＤＮＡで形質転
    換された相応する能力宿主細胞内に生成されうる欠損レ
    トロウイルスの複製が禁じられるように充分な大きさを
    もっていることを特徴としている）、さらに組換え型レ
    トロウイルスのＤＮＡの中に含まれている別の外部プロ
    モータの制御の下での請求項（１）又は（２）の組換え
    型遺伝子による欠質部分における置換、この別の外部プ
    ロモータと組換え型遺伝子の相対的位置ならびに、こう
    して構成されている組換え型欠損レトロウイルスによる
    感染可能な宿主細胞において前記逆方向でこの外部プロ
    モータの制御下での前記組換え型遺伝子の転写が行なわ
    れうるようなこの組換え型遺伝子の方向性、を特徴とす
    る、組換え型欠損レトロウイルスのＤＮＡ。
  4. （４）別の外部プロモータがレトロウイルスのＬＴＲ＾
    ５＾′領域のものであることを特徴とする、請求項（３
    ）に記載の組換え型レトロウイルスのＤＮＡ。
  5. （５）そのゲノムには以下のものが連続的に含まれてい
    ることを特徴とする組換え型欠損レトロウイルスのＤＮ
    Ａ； −詰込み領域が後に続いている、相応する野生型レトロ
    ウイルスのＬＴＲ＾５＾′領域：−通常ｇａｇ（ウィル
    ス内部構造たん白質遺伝子）、ｐｏｌ（同義遺伝子）及
    びｅｎｖ（ウィルス粒子膜構造たん白質遺伝子）遺伝子
    により暗号づけされるウィルス性たん白質に相応するＤ
    ＮＡの開始部位； −これらのｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子を含むレト
    ロウイルス領域の全て又は一部分の代わりに上に規定さ
    れている方向性をもつ請求項（３）又は（４）の組換え
    型遺伝子、なお、この組換え型遺伝子は適切な外部プロ
    モータ、場合によってＬＴＲ＾５＾′領域自体の制御下
    におかれている、そして −相応する野生型レトロウイルスのＲＮＡのボロアデニ
    ル化部位に一致するＬＴＲ＾３＾′部位。
  6. （６）特に哺乳動物の真正核類能力細胞宿主を感染させ
    ることのできる野生型又は自生型のレトロウイルスから
    誘導された組換え型欠損レトロウイルスにおいて、かか
    るレトロウイルスは、その中で野生型ウィルスの「シス
    にて」作用し通常レトロウイルスの詰込み、そのＤＮＡ
    分子への逆転写およびその宿主細胞ゲノム内への組込み
    を行なう部分ならびにこのＲＮＡのポリアデニル化部位
    を含んでおり、さらに、上述の自生型レトロウイルスに
    よる感染が可能な細胞宿主のポリメラーゼにより認識で
    きるこのレトロ転位雑種配列の内部のプロモータの直接
    的制御の下で一定のポリペプチドに対して暗号づけする
    ＤＮＡ配列を含むレトロ転位雑種配列での、欠失部分に
    おける置換（なおこのレトロ転位雑種配列はそれ自体そ
    の外部にあり欠損レトロウイルスのゲノム内に含まれて
    いるプロモータの制御下におかれている）、ならびにレ
    トロ転位雑種配列の外部の暗号づけ配列及び外部プロモ
    ータの相対的位置は、前記組換え型レトロウイルスに感
    染した細胞宿主内の内部プロモータの制御の下で前記暗
    号づけ配列の転写及び表現が前記外部プロモータの制御
    下でのレトロ転位雑種配列の転写方向とは逆の方向に行
    なわれうるようなものであること、を特徴とする、組換
    え型、欠損レトロウイルス。
  7. （７）別の外部プロモータは相応するレトロウイルスの
    ＬＴＲ＾５＾′領域のものであることを特徴とする、請
    求項（６）に記載の組換え型欠損レトロウイルス。
  8. （８）そのゲノムが連続的に以下のものを含んでいるこ
    とを特徴とする、請求項（６）又は（７）に記載の組換
    え型欠損レトロウイルス： −詰込み領域が後に続いている、相応する野生型レトロ
    ウイルスのＬＴＲ＾５＾′領域。−通常ｇａｇ、ｐｏ１
    及びｅｎｖ遺伝子により暗号づけされているウィルス性
    たん白質に相応するＲＮＡの開始部位。 −これらのｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ、遺伝子を含むレ
    トロウイルス領域の全て又は一部分の代わりの上に規定
    されている方向性でのレトロ転位雑種配列。なおこのレ
    トロ転位雑種配列は、レトロウイルスのゲノム内に含ま
    れている適当な外部プロモータ、場合によってはＬＴＲ
    ＾５＾′領域自体の制御下に置かれている。 −相応する野生型レトロウイルスのポリアデニル化部位
    と一致するＬＴＲ＾３領域。
  9. （９）請求項（６）乃至（８）のいずれかに記載の組換
    え型欠損レトロウイルスに相応する自生型レトロウイル
    スによる感染が可能な細胞培養の細胞ゲノム内への一定
    のポリペプチドに対し暗号づけするヌクレオチド配列の
    組込み方法において、前記細胞培養と、前記暗号づけ配
    列が一定のポリペプチドに対する前記暗号づけ配列に相
    当しているようなこの組換え型欠損レトロウイルスとの
    接触が、組換え型欠損レトロウイルスによるこれらの細
    胞の感染を許容する条件の下で行なわれること、そして
    場合によっては暗号づけ配列が表現されている細胞の分
    離を特徴とする、組込み方法。
  10. （１０）以下の段階を含む、請求項（４）乃至（６）の
    いずれかに記載の組換え型欠損レトロウイルスの製造方
    法： −感染させる可能性のある細胞内でのその増殖を許容す
    るウィルス性たん白質に対する暗号づけ配列の組換え型
    欠損ベクター内での欠如に対し補足することのできる核
    配列（以下「相補性配列」と呼ぶ）をその独自のゲノム
    ＤＮＡに組込まれた形で含んでいる補助細胞系列のトラ
    ンスフェクション； −前記「相補性配列」により暗号づけされたウィルス性
    たん白質の「トランスでの」相補による持ち込みのおか
    げで、この組換え型レトロウイルスを原位置で複製でき
    るようにする条件の下で、このようにトランスフェクシ
    ョンされた補助細胞系列を培養する段階； −前記補助細胞系列の培養の浮遊物内の生成された組換
    え型欠損レトロウイルスの回収段階。
  11. （１１）相補性配列にはさらに限定的に言うと、特にウ
    ィルス性たん白質に対して暗号づけする相応する野生型
    レトロウイルスのゲノムＤＮＡの一部分すなわち、組換
    え型欠損レトロウイルス自体には備わっていない相応す
    る野生型レトロウイルスの遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅ
    ｎｖが含まれていることを特徴とする、請求項（１０）
    に記載の方法。
JP1076892A 1988-03-31 1989-03-30 組換え型欠損レトロウイルス、相応する野生型レトロウイルスによる感染可能な細胞培養ゲノム内への一定のたん白質に対する暗号付け配列の組込みに対するその応用、ならびにかかる組換え型レトロウイルスの製造用の組換え型ｄｎａ Pending JPH0213384A (ja)

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