JPH0213388A - 不飽和脂肪酸含有脂質の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、炭素源を制御した培地で脂質産生糸状菌を培
養することにより、脂質の生産性を向上し、かつ目的の
不飽和脂肪酸が高い割合で含まれる菌体を生産すること
を特徴とする、不飽和脂肪酸含有脂質の製造方法に関す
る。

（従来の技術） 生体内では恒常性（ホメオスタシス）の維持が不可欠で
あり、種々の生理活性物質が共存して、生体内作用を調
整して恒常性が維持されている。

これらの生理活性物質としては、プロスタグランジン（
ＰＣ）の他、広義にはＰＣの仲間と考えられるトロンボ
キサン（ＴＸ）やロイコトリエン（ＬＴ）等の重要な生
理物質がある。これらＰＣ。

ＴＸＳＬＴ等は、いずれも生体内で必要に応じて微量生
産され、ごく微量でいろいろな生体反応の調節にあずか
っているが、これらの物質群の多くは、不飽和脂肪酸で
あるアラキドン酸からいくつかの酵素反応を経て生合成
されることがわかっており、このアラキドン酸代謝経路
全体は、あたかもいく筋にも分かれて階段状に流れ落ち
る滝のように見えることから、アラキドン酸カスケード
と呼ばれる。従って、アラキドン酸は、生体を維持して
いく上で、非常に重要な不飽和脂肪酸として位置づける
ことができる。この様に重要は不飽和脂肪酸を工業的に
安価に、かつ多量に入手することが期待されていた。

アラキドン酸は特殊な立体化学構造を有している為に、
化学合成により安価に供給することは非常に困難であり
、天然に存在する生物を原料として抽出、精製が行なわ
れて来た。しかし、動物組織、血液等の原料から抽出す
る場合には非常に繁雑な工程を要し、さらに原料中にア
ラキドン酸が極めて微量しか含有されておらず、工業的
応用は困難であった（エム・ケーラ著、山川ら訳、脂質
研究法６５頁、１９７５年東京化学同人）。そこで、工
業的応用として微生物を利用し、安価で入手しやすい原
料から、簡易な操作によりアラキドン酸を分離すること
が試みられて来た。

特開昭５２−６４４８２号公報、同５２−６４４８３号
公報、同５２−６４４８４号公報には、ペニシリウム属
、タラトスボリウム属、ムコール属、フザリウム属、ホ
ルモプントラム属、アスペルギルス属、又はロードトル
ラ属に属するアラキドン酸生産能を有する微生物を、炭
化水素、炭水化物等を炭素源とする培地で培養し、培養
物からアラキドン酸を採取する方法が記載されている。

しかし、この方法により得られに脂質中のアラキドン酸
含有量は７．５％以下であり、乾燥菌体当りの収率はわ
ずか１％にも満たない。特公昭５８−２２１９９号公報
には、アラキドン酸の前駆物質となるγ−リルン酸含有
量の高い、モルティエレラ属に属する脂質生産性の糸状
菌を、炭化水素を炭素源とする培地で培養する方法が開
示されている。この方法によると、その含有率は最大３
４．４％に達したが、脂質の収率は１００■／ｌに満た
ず実用性は低かった。また、特公昭６３−１９１５４号
公報には、培養物の一部を次培養へ転用して培養の誘導
期を短縮する方法が開示されている。この方法によると
、目的の不飽和脂肪酸の単位時間当りの生産量は増加す
るものの、脂質含有率は殆んど向上が見られないので十
分効率的な方法であるとはいえなかった。

（発明が解決しようとする課題） 従って、本発明の目的は、脂質産生糸状菌が生産する脂
質量を増加させ、かつ目的とする不飽和脂肪酸の含有率
を向上させた、糸状菌の培養方法により不飽和脂肪酸を
製造する方法を提供することにある。

（課題を解決するための手段） 本発明は、脂質生産性の糸状菌を炭素源の供給を抑制し
た条件下で培養すると、糸状菌体内への脂質の蓄積が増
大し、かつ蓄積された脂質を構成する脂肪酸の不飽和度
が増加し、該培養方法によると上記課題を効率よく解決
できるとの知見に基づいてなされたのである。

すなわち、本発明は、（イ）炭素源として糖類を用い、
脂質産生糸状菌の生育至適Ｉ！濃度以下の量で糖類を含
む培地で該糸状菌の培養を開始し、その後生育至適Ｉ！
濃度以下の量の糖類を添加して該糸状菌を増殖させる方
法及び／又は（ロ）脂質産生糸状菌の増殖定常期若しく
は増殖定常期付近において実質的に炭素源の存在しない
状態で培養する方法、により脂質産生糸状菌を培養する
ことを特徴とする不飽和脂肪酸含有脂質の製造方法を提
供する。

本発明において用いられる微生物は、脂質を生産する糸
状菌であればよく、好ましくは不飽和脂肪酸、特に好ま
しくはアラキドン酸産生糸状菌であり、例えば、ペニシ
リウム属、タラトスポリウム属、ムコール属、フザリウ
ム属、ホルモプントラム属、アスペルギルス属、ロドト
ルラ属、エントモフトラ属、デラクロイキシア属、コニ
デイオボルス属、フィティウム属、フィトフトラ属、及
びモルティエレラ属等の属に属する菌が挙げられる。こ
れらの属に属し、本発明に好適に使用できる菌としては
、不飽和脂肪酸生産性のモルティエレラ・アルビナ（Ｍ
ｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ　ａｌｐｆｎａ）　ＩＦＯ８５６
８、ＡＴＣＣ１６２６６、ＡＴＣＣ３２２２１、ＡＴＣ
Ｃ４２４３０，モルティエレラ・バイニエリ（Ｍｏｒｔ
ｉｅｒｅｌｌａ　ｂａｉｎｆｅｒｉ）　ＩＦＱ８５６９
、モルティエレラ・エロンガタ（Ｍｏｒｔｔｅｒｅｌｌ
ａｅｌｏｎｇａｔａ）　ＩＦＯ８５７０、モルテイエレ
ラ・エクシグア（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ　ｅｘｉｇｕ
ａ）　ＩＦＯ８５７１、モルティエレラ・ミヌティッシ
マ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ　ｍｉｎｕｔｉｓｓｉｍａ
）ＩＦＯ８５７３、モルティエレラ・ヴアーティシラタ
（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ　ｖｅｒｔｉｃｉｌｌａｔａ
）　ＩＦＯ８５７５、モルティエレラ・ハイグロフィラ
（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ　ｈｙｇｒｏｐｈｉｌａ）Ｉ
Ｐｏ　５９４１モルティエレラ・ポリセフアラ（Ｍｏｒ
ｔｉｅｒｅｌｌａ　ｐｏｌｙｃｅｐｈａｌａ）　ＩＰｏ
　６３３５等を挙げることができ、これらの石は、いず
れも財団法人醗酵研究所（Ｉ　ＦＯ）　、若しくは米国
のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａ
ｍｅｒｔｃａｎＴｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅ
ｃｔｉｏｎ、＾ＴＣＣ）の菌株目録に記載されている糸
状菌として、当業者が容易に入手しうるものである。

本発明では、これらの糸状菌を上記（イ）の培養方法、
すなわち糖類の量が制限された流加法（以下、流加法と
いう）及び／又は（ロ）の培養方法、すなわち置換法に
より、培養することを特徴とする。

ここで流加法を行う場合、炭素源として糖類、すなわち
、単１１！類、多Ｉ糖類を用いて、通常、液体培地で培
養を行う。ここでｔＩ類としては、例えばグルコース、
フルクトース、サッカロース、糖蜜、木材糖化液、デン
プン氷解物などを挙げることができる。このほか窒素源
、無機塩などは、通常微生物の培養に使用できるものを
用いることができる。

例えば、培地中の窒素源としてはアンモニア、アンモニ
ウム塩、グルタミン酸、アスパラギン酸、尿素等を挙げ
ることができ、これらを適宜組み合わせ、さらに必要に
応じてカリウム、ナトリウム、鉄、マグネシウム、亜鉛
、銅、マンガン等の無機塩、ビタミン等を添加して使用
することができる。

好ましい培地としては、ジャガイモ、麦芽、ペプトン、
酵母エキス、コーン・ステイープ・リカー、カザミノ酸
、ふすま等を単独に、又はそれらを組み合わせ、必要に
応じてさらにｔｉｎを添加して調製した培地を挙げるこ
とができ、特に好ましい培地としては、ジャガイモ、若
しくはその浸出液と炭水化物の混合物、又は麦芽エキス
を挙げることができる。一般に窒素源は０．０１〜５重
量％、好ましくは０．１〜２重量％の濃度とするのが良
く、培地の初発ｐＨは４．０〜７．０が適当である。ま
た、これらの培地を用いる場合には、通常１０〜３３℃
で、好ましくは２０〜３０℃において、２〜３０日培養
を行なうが、培養方法としては、通気攪拌培養、振盪培
養、又は静置培養等の通常の培養方法を挙げることがで
きる。

糸状菌を用いて脂質を生産する場合に好収率をもたらす
糖濃度は、使用する菌により種々に変化するので一概に
特定し得ないが、一般には５０〜１００　ｇ／ｌ程度の
ｔＩ！濃度がよいとされている。

従って、流加培養法では、培養当初のＩ！濃度及び培養
中の糖濃度を至適濃度の〃〜Ｚに制限する。

例えば至適デキストロース濃度が５０〜１００ｇ／ｌで
あるモルティエレラ属の菌を用いて培養を行う場合には
、培養液中の初発デキストロース濃度をｌＯ〜４０ｇ／
ｊ２とするのがよい。又、培養中に糖類を制限しながら
添加する方法としては、培養開始時より連続的に、若し
くは複数回に分割して糖類、若しくはその水溶液を培養
液中に加える方法があげられる。−船釣には、通常の培
養条件では、１日あたり１〜１０ｇの糖が消費されるの
で、その消費量を越えない範囲で培地中に糖類を追加す
る。例えば、対数増殖期において１日に約５ｇ／Ｉｔの
デキストロースを消費するモルティエレラ属の菌を培養
する場合には、その消費量を越えない範囲で、例えば、
２５ｇのデキストロースを５日目と１００日目力■えれ
ばよい。糖濃度は上述した様に菌の消費量から算出して
もよいが、培養期間中経時的に測定することが好ましい
。その方法としてはグルコースＢテスト（和光純薬工業
社製）を挙げることができる。

上記（ロ）に記載の置換法では、菌の培養を開始後、増
殖定常期若しくは増殖定常期付近において炭素源が実質
的に存在しない状態で糸状菌を培養する。すなわち、糸
状菌が炭素源を菌体内に取り込んで増殖後、実質的に炭
素源のない状態で該菌の培養をｋａ続すると菌体内の脂
質を構成する脂肪酸の不飽和度が増加する。ここで実質
的に炭素源がないとは、培地から炭素源を取り除く方法
、炭素源の供給を停止する方法などによって培地中に菌
が利用できる炭素源がなくなる状態をいう。

このうち、増殖した菌体を集め、蒸留水などで徹底して
洗浄し、その後蒸留水中で菌を培養するのがよい。尚、
置換培養を行う場合には、上記（イ）の流加法に引きつ
づいて行うこともできるが、通常の培養条件で糸状菌を
培養後に置換培養を行うこともできる。ここで、通常の
条件としては、炭素源として糖類以外のものを使用する
こともできるが、好ましくはｖＨ類を用い上記（イ）の
流加法のところで説明した培地を用いるのがよい。

置換培養を行うには、通常、培養の対数期の約１／２を
過ぎていればよく、好ましくは培養の定常期において、
培養開始後３〜１８日目に日日のがよい。菌体の集菌に
はガーゼ濾過等の通常の方法を用いればよく、その後菌
体３０ｇあたり２００ｍ１の炭素源を含まない培地、好
ましくは水で１〜１０回、好ましくは水洗した場合に洗
液が無色透明になるまで洗浄した菌体を、任意の量の、
好ましくは菌体３０ｇあたり１００〜６００ｍｌの炭素
源を含まない培地、好ましくは水とともに振盪若しくは
攪拌を継続するのがよい。振盪若しくは攪拌は通常１〜
８日間、好ましくは２〜４日間、１５℃〜３０℃で継続
すればよい。このように洗浄した菌体を炭素源を含まな
い培地に移すことにより、炭素源が存在しない状態で培
養することができるが、この様な処理過程によっても菌
体の表面には炭素源を含む培地が多少は付着しているが
、このような状態も本発明の上記（ロ）の置換法に含ま
れる。

上記方法により培養された糸状菌中に産生される脂質は
、大部分菌体内に含まれるので、培養終了後遠心分離、
若しくは濾過等の一般的分離手段により菌体を得た後、
以下の方法により分離される０分離方法としては特開昭
６３−４４８９１号公報、及び同６１−１７７９９０号
公報に記載されている様に、菌体を水洗し、好ましは凍
結乾燥法等により乾燥した後、機械的に、若しくは物理
的に菌体を摩砕し、その後脂質を例えばエーテル、ヘキ
サン、メタノール、クロロホルム、石油エーテル等の有
機溶媒やそれらの混合物、又は超臨界二酸化炭素等を用
いて抽出する方法を挙げることができる。又、上記方法
に代えて湿菌体を用いて抽出を行うこともでき、メタノ
ール、エタノール等の水相溶性の有機溶媒を用いて抽出
すればよい。これら抽出物から減圧下で有機溶媒を留去
することにより、高濃度の不飽和脂肪酸を含有した脂質
を得ることができる。

さらに、常法により該脂質を分解して不飽和脂肪酸、例
えばアラキドン酸、エイコサペンタエン酸などを単離す
ることができる。

（発明の効果） 本発明により、脂質産生糸状菌を炭素源の供給が制限さ
れた状態での流加培養及び／又は炭素源のない状態での
置換培養により培養することにより、菌体内に蓄積され
る脂質の量と該脂質中の不飽和脂肪酸の含有率を向上す
ることが可能となった。また、含有率が向上することに
よって脂質中に含有される不飽和脂肪酸の精製コストを
低減することができ、あわせて精製物の高純度化を可能
にすることができた。

（実施例） 以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本
発明はこれらの実施例により限定されることはない。

実施例１．　流加法 ２００ｇのジャガイモを浸出した浸出液に、５ｇのデキ
ストロース（２５ｇ／１１培地）、１ｇのポリペプトン
（大玉栄養化学■製）、１５０■のＣａＣｌ　、・２Ｈ
２０を加えて全体を蒸留水で２００ＩＩ＋１とした培養
液（ｐＨ５，６）を５００ｎ＋１の坂ロフフラスコに入
れて、オートクレーブで１５分間１２０℃で滅菌し、放
冷後、モルティエレラ・アルビナ（ＡＴＣＣ３２２２１
）を白金耳量接種した。本国は、あらかじめ行った培養
実験において約６０ｇ／！デキストロース濃度を至適と
していた。２０℃で振盪培養を開始し、５日後と１０日
後に、さらに５ｇのデキストロースを１０ｍ１の滅菌水
に溶かした溶液を加え、計算上でのデキストロース累積
濃度を順次５０ｇ／ｌ、７５ｇ／ｊ！とじて培養をｍｕ
した。本糸状菌は培養中に平均して約５ｇ／日のデキス
トロースを消費していたため、デキストロース濃度は培
養期間を通して常に４０ｇ／ｌ以下であった。２０日後
にガーゼを濾布として集菌し、蒸留水で洗浄し、その後
遠心濾過機で脱水し、さらに減圧デシケータ−中でシリ
カゲルを用いて乾燥した菌体を秤量後、乳鉢ですりつぶ
し、クロロホルム／メタノール（２：１　ν／Ｖ）で総
脂質を抽出した。得られた抽出液を脱溶媒した後金属ナ
トリウムを用いたアルコリシスにより脂質をメチルエス
テル化し、その後その脂質中の脂肪酸組成をガスクロマ
トグラフィーで分析して全脂質中のアラキドン酸含有率
を求めた。また、培養開始時にデキストロース濃度を７
５ｇ／ｊ！とじて、途中でデキストロースを流加しない
ものを比較例１として行った。得られた結果を第１表に
示す。

第１表 １）分析条件：ＤＥＧ３　１５％カラム（１９０℃）実
施例２．　流加法 ８０ｇのジャガイモを浸出した浸出液に、５ｇのデキス
トロース（２５ｇ／β培地あたり）、４ｇの酵母エキス
（オリエンタル酵母社製）、１５０■のＣａＣ１，・２
Ｈ２０を加えて全体を蒸留水で２００ｍ１とした培養液
を５００ｍｊ！の坂ロフラスコに入れ、実施例１と同様
に滅菌後、モルティエレラ・アルビナ（ＡＴＣＣ１６２
６６）を白金耳量接種した。本国の至適デキストロース
濃度は約７　Ｑ　ｇ　／　１であった。２０℃で振盪培
養を開始し、実施例１と同様に培養開始後５日日と１０
日日日、５ｇのデキストロースをｌ　Ｏｍ！！の滅菌水
に溶解した溶液を加えて培養を′ｍ続した。２０日後に
集菌洗浄し、実施例１と同様の操作により脂質分析を行
った。

尚、培養期間中にデキストロース濃度は４０ｇ／ｌを超
えなかった。また、培養開始時にデキストロース濃度を
１５ｇ／２００ｎ＋ｊ！　　（７５ｇ／ｊりとし、デキ
ストロースを流加せずに培養を行ったものを比較例２と
した。得られた結果を第２表に示す。

第２表 実施例３　　置換法 ２００ｇのジャガイモを浸出した浸出液に２０ｇのデキ
ストロース（１００ｇ／ｊｉ）　、２ｇのポリペプトン
（大五栄養化学■製）、１５０■のＣａＣｌ　ｚ　・２
Ｈ２Ｏを加えて全体を蒸留水で２００ｍｌとした培養液
を５００ｍｊ２の坂ロフラスコに入れ実施例１と同様に
滅菌した後、モルティエレラ・アルビナ（ＩＦｏ　８５
６８）を白金耳量接種した。本国の至適デキストロース
濃度は約６０　ｇ／　１であった。２０℃で１２日間振
盪培養後、増殖した菌体をガーゼを濾布として洗液が無
色透明になるまで滅菌水でよく洗浄し、再び菌体を坂ロ
フラスコに戻し、３００Ｉ１１１の滅菌水と共に２５℃
で振盪して、飢餓状態に保った。４日後に実施例１と同
様の操作で集菌、乾燥し、その後脂質分析を行った。

また、１６日間通常の培養を継続したものを、比較例３
とした。得られた結果を第３表に示す。

第３表 実施例４　　流加法＋置換法 １０ｇのジャガイモを２０分間蒸煮後、嵐３２のメツシ
ュを通過させて粥状物を作成した。これに５ｇのデキス
トロース（２５ｇ／ｌ）　、２ｇのポリペプトン（大玉
栄養化学■製）、１５０■のＣａＣｌ　ｚ　・２ＨｚＯ
を加えて全体を蒸留水で２００ｍ１ｌとした培養液を５
００ｍ１の坂ロフラスコに入れ、実施例１と同様に滅菌
、放冷後モルティエレラ・アルビナ（ＡＴＣＣ３２２２
１）を白金算量接種した。

２０℃で振盪培養を開始し、実施例１．２と同様に５日
後と９日後に、さらに５ｇのデキストロースを１０ｍＡ
の滅菌水に溶解した溶液を加え培養を継続した。この結
果計算上のデキストロース累積濃度は７５　ｇ＃！とな
った。１２日後、増殖した菌体をガーゼを濾布として洗
液が無色透明になるまで滅菌水でよ（洗浄し、再び菌体
を坂ロフ与スコにもどし、３００１の滅菌水と共に２０
’Ｃで４日間振盪して飢餓状態を保った。計１６日間の
上記培養の後、実施例１と同様の方法で集菌、乾燥後、
脂質分析を行った。また、培養開始時よりデキストロー
ス濃度を１５　ｇ／２００ｍｊ！（７５ｇ／ｌとして、
デキストロースの流加及び置換培養を行なわずに１６日
間培養したものを比較例４とした。得られた結果を第４
表に示す。

第４表 実施例５　　流加法＋置換法 モルティエレラ・エロンガタ（ＩＦＯ８５７０’）を実
施例４と全く同一の条件下で培養し続いて後処理を行っ
たところ、表５の結果を得た。

第５表 実施例６　　流加抜工置換法 １％のグルコース、１％のポリペプトン（大王栄養化学
側製）、１％の酵母エキス（オリエンタル酵母社製）か
らなる２００−の培養液を５００ｍ１の坂ロフラスコに
入れ、実施例１と同様に滅菌、放冷後、コニディオボラ
ス・ヘテロスポラス（ＡＴＣＣ１２９４１）を白金算量
接種し、２８℃で培養開始して２日後と４日後に、実施
例４と同様にさらに２ｇのデキストロースを５ｍｌの滅
菌水に溶解した溶液を加え、計算上のデキストロース累
積濃度を順次２０ｇ／β、３０ｇ／βとして培養を継続
した。６日後、増殖した菌体をガーゼを濾布として洗液
が無色透明になるまで滅菌水でよく洗浄し、再び菌体を
坂ロフラスコにもどし、３００ｍ７！の滅菌水と共に２
５℃で３日間振盪して１１ｔｉａ状態を保った。計９日
間の上記培養の後、実施例１と同様の方法で集菌、乾燥
後、脂質分析を行ったところ、実施例４と同様の結果を
得た。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （イ）炭素源として糖類を用い、脂質産生糸状菌の生育
   至適糖濃度以下の量で糖類を含む培地で該糸状菌の培養
   を開始し、その後生育至適糖濃度以下の量の糖類を添加
   して該糸状菌を増殖させる方法及び／又は（ロ）脂質産
   生糸状菌の増殖定常期若しくは増殖定常期付近において
   実質的に炭素源の存在しない状態で培養する方法、によ
   り脂質産生糸状菌を培養することを特徴とする不飽和脂
   肪酸含有脂質の製造方法。