JPH0965871A

JPH0965871A - 海洋性微細藻類の培養方法

Info

Publication number: JPH0965871A
Application number: JP7226246A
Authority: JP
Inventors: Kenichi Uehara; 原健一上; Daizo Takeuchi; 内大造武
Original assignee: Kawasaki Steel Corp
Current assignee: JFE Steel Corp
Priority date: 1995-09-04
Filing date: 1995-09-04
Publication date: 1997-03-11

Abstract

(57)【要約】【課題】短期間に高密度の藻体の安定した増殖が得られ
る海洋性微細藻類の培養方法の提供。【解決手段】海洋性微細藻類に属し、かつ、ドコサヘキ
サエン酸を産生する能力を有する藻類を培養する方法に
おいて、培養途中の培養液に炭素源および窒素源を含む
栄養源を連続的にまたは間欠的に添加して、該培養液中
の炭素源および窒素源の濃度を調整して培養する海洋性
微細藻類の培養方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ドコサヘキサエン
酸を産生する能力のある海洋性微細藻類を良好に増殖さ
せドコサヘキサエン酸の生産性を高めるための培養方法
に関するものである。ドコサヘキサエン酸は、近年、コ
レステロール低下作用、抗血液凝固作用、学習機能向上
作用など多彩な生理作用が報告されている高度不飽和脂
肪酸である。

【０００２】

【従来の技術】多彩な生理作用が報告されている高度不
飽和脂肪酸であるドコサヘキサエン酸について、魚油以
外に起源を求めて微生物などに選択的に産生させる検討
が行なわれてきた。中でも海洋性微細藻類に属するクリ
プテコディニウム・コーニーを増殖させることによりド
コサヘキサエン酸を産生させることが検討されている。

【０００３】クリプテコディニウム・コーニーは従属栄
養生物であるためその藻体収率やドコサヘキサエン酸収
率を高めるためには炭素源や窒素源など生体成分となり
うる栄養源の濃度を高める必要がある。このためには培
養開始時から栄養源の濃度を高めておく方法と、培養の
途中で新たに栄養源を添加する方法とが考えられる。し
かしながら前者の方法では炭素源や有機窒素の濃度が高
いために初期増殖速度の低下や増殖そのものが行われな
いなど培養自体が不安定になる例がしばしば観察され
た。一方、後者の方法として、マーテック社による検討
では、ドコサヘキサエン酸の収量の増大を目的として炭
素源や窒素源を培養の途中で添加する方法が試みられて
いる（特表平０５−５０３４２５号公報）が藻体増殖が
十分であるとは言えない。

【０００４】また、クリプテコディニウム・コーニーの
培養を扱ったものについて幾つか挙げて示すと、Ｒ・Ｃ
・タットュルら（Phycologia, 14(1), 1-8(1975)参照)
が培養時の温度やｐＨ、照射光強度の世代時間への効果
を報告しているが、培養中に新たに栄養源を添加する効
果については全く触れられていない。

【０００５】一方、本発明者らは特開平０５−２７６９
６３号公報で、ドコサヘキサエン酸産生能を有する海洋
性微細藻類の振盪培養方法や深部通気攪拌培養方法につ
いて示し、また、特開平０６−２５３８１７号で、特定
の炭素源を至適な濃度で存在させることにより極めて良
好な藻体の増殖性とドコサヘキサエン酸の生産性が得ら
れることを示した。特願平０７−２９３６７号公報では
海洋性微細藻類の藻体収量の向上を目的として、５０ｇ
／ｌを超える比較的高濃度の炭素源が存在する条件でも
ｐＨ値のコントロールによって安定した増殖と高い藻体
収量が得られることを示した。しかしながら、それらの
内のいずれでも初期増殖速度が高いレベルであるとは言
えず、一定の藻体収量に達するまでに十分な培養時間を
取る必要がある場合がしばしば観察された。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、海洋
性微細藻類に属し、かつ、ドコサヘキサエン酸を産生す
る能力を有する藻類を藻体収量の向上を目的として培養
するに際し、短期間で高密度（高濃度）に藻体を安定に
増殖させるための簡便でかつ有効な培養方法の開発が望
まれていた。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明ではこれらの問題
点を解決するために鋭意検討した結果、ドコサヘキサエ
ン酸を産生する能力を有する海洋性微細藻類を藻体収量
の向上を目的として増殖させるに際し、培養中の培養液
に新たに高濃度の栄養源を連続的にまたは間欠的に添加
する条件で培養することにより、短期間で高密度に、藻
体の安定な増殖が得られることを見いだし本発明をなす
に至った。

【０００８】すなわち、本発明は、海洋性微細藻類に属
し、かつ、ドコサヘキサエン酸を産生する能力を有する
藻類を培養する方法において、培養途中の培養液に炭素
源、窒素源を含む栄養源を連続的にまたは間欠的に添加
して、該培養液中の炭素源、窒素源の濃度を調整して培
養する海洋性微細藻類の培養方法を提供する。さらに、
培養液中の海洋性微細藻類が３×１０⁶細胞／ｍｌに達
した時に栄養源を添加し始めるのが好ましい。そして、
海洋性微細藻類に属し、かつ、ドコサヘキサエン酸を産
生する能力を有する藻類が、クリプテコディニウム・コ
ーニー（Crypthecodinium cohnii )ＡＴＣＣ３００２
１であるのが好ましい。

【０００９】本発明の培養方法は、海洋性微細藻類とし
てクリプテコディニウム・コーニーなどに属する藻類を
増殖させるに際し、連続的にまたは間欠的に培養中に新
たに栄養源を添加する条件で培養させると、短期間で高
密度に再現性のある非常に安定した増殖を示すばかりで
なく、高度不飽和脂肪酸としてドコサヘキサエン酸のみ
の脂質中の割合を高度に上昇させたまま、生産性を向上
できる点で特筆すべきである。

【００１０】本発明において利用される微生物は、海洋
性微細藻類に属し、かつ、ドコサヘキサエン酸を産生す
る藻類であればいずれでもよく、例えばクリプテコディ
ニウム・コーニー（Crypthecodinium cohnii ) などが
ある。これらの微生物としてＡＴＣＣ(American Type C
ulture Collection)などの各種保存機関から入手できる
公知のものも利用することが可能である。具体例として
は、クリプテコディニウム・コーニーＡＴＣＣ３００２
１、３０５４３、３０５５６、３０５７１、３０６７
２、３０７７５、５００５１、５００５３、５００５
５、５００５６、５００５８、５００６０等が挙げられ
るが、中でも、クリプテコディニウム・コーニーＡＴＣ
Ｃ３００２１であるのが、藻体の培養初期の増殖率が高
いという点で優れている。このほかこのような微生物と
して、例えば、紫外線照射や各種変異剤による処理等の
公知の変異処理を施した変異株の使用も本発明に包含さ
れるものである。

【００１１】本発明の方法において海洋性微細藻類の短
期間で高密度の増殖に関しては、培養の途中で新たに栄
養源と添加することが肝要である。本発明の方法で、本
培養の開始時に用いる培地（初発培地）は、後述の新た
に添加させるのと同じ栄養源を含有する培地を使用する
ことができる。ただし、初発培地では、炭素源、特にグ
ルコースや、窒素源、特にコーンスティープリカー、グ
ルタミン酸ナトリウムを下記の特定の濃度以下の低濃度
にして、培養藻体の濃度が、特定の濃度に達した時点で
添加液を加えることで培養液中の炭素源、窒素源の濃度
を高濃度にして培養する。さらに、炭素源および窒素源
以外の無機塩類、重金属元素等は添加液を添加する前後
で一定に保って培養するのが好ましい。なお、本培養を
行う前に、人工海水にグルコース、酵母エキス等を加え
た培地、例えば、下記培地例１の初発培地と同様の培地
で予め液体振盪培養した（前培養）藻体を用いてもよ
い。

【００１２】初発培地中の炭素源としてのグルコースの
濃度は、１５０ｇ／ｌ以下、さらに５０ｇ／Ｌ以下、３
０ｇ／Ｌ以下、特に１５〜２５ｇ／Ｌであるのが藻体の
生産性の点で好ましい。また、初発培地中の窒素源の濃
度は、１５ｇ／Ｌ以下、特に０．１〜５ｇ／Ｌであるの
が藻体の生産性の点で好ましい。初発培地中の無機塩類
の濃度は０．１〜１００ｇ／Ｌであるのが好ましく、重
金属を含む成分の濃度は０．００１〜５０ｍｇ／Ｌであ
るのが好ましい。好ましい組成の初発培地の例を下記培
地例１の初発培地に例示する。

【００１３】次に、藻体濃度が特定の濃度以上、特に３
×１０⁶細胞／ｍｌ以上になった時点で、培養中の培養
液に新たに添加液を加える。本発明の方法は、培養液に
添加液を加えて、培養液中の栄養源、特に炭素源および
窒素源の濃度を高濃度にすることで、藻体の増殖を十分
に行うことができる。

【００１４】本発明において用いられる新たに添加され
る培地（添加液）に含まれる栄養源は、好ましくは炭素
源、窒素源、無機塩類、重金属元素を含む成分の各々を
組み合わせたものや、各々を単独に用いてもよい。これ
らの栄養源は生体構成成分として必須である。

【００１５】炭素源としては例えば、ガラクトース、グ
ルコース、ラクトースの加水分解物などの炭水化物、魚
油、大豆油などの油脂類、乳酸、酢酸などの有機酸類、
エタノールなどのアルコール類などが挙げられ、さらに
これらを組み合わせることも可能である。添加液を添加
した後の炭素源の含有量は、培養液中１５０ｇ／Ｌ以下
であるのが生産性が高いこと、ｐＨをコントロールしな
くてよい点で好ましい。

【００１６】窒素源としては例えば、酵母エキス、牛肉
エキス、ペプトン、廃糖蜜、コーンスティープリカーな
ど有機態窒素や、硝酸カリウム、塩化アンモニウム、グ
ルタミン酸ナトリウムなど無機態窒素があげられ、さら
にこれらを組み合わせることも可能である。添加液を添
加した後の窒素源の含有量は、培養液中１５ｇ／Ｌ以下
であるのが生産性が高い点で好ましい。

【００１７】無機塩類としては、市販の人工海水の濃縮
物を用いることも可能であるが、例えば、塩化ナトリウ
ム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウム、硝酸カリウ
ム、リン酸水素カリウムなどを組み合わせて用いること
も可能である。重金属元素を含む成分としては、例え
ば、鉄、マンガン、コバルト、亜鉛などの単体、イオ
ン、塩化物、硫酸塩、硝酸塩など、さらには塩化鉄、塩
化マンガン、塩化コバルト、硫酸亜鉛などの種々の塩が
挙げられる。以上のほか、重金属元素を含む成分の安定
化のために例えば、ホウ酸やエチレンジアミン四酢酸を
用いることも可能である。

【００１８】培地のｐＨは、例えば５〜８であるのが好
ましい。このｐＨ安定化のために例えば、トリスヒドロ
キシメチルアミノメタン、モルホリノエタンスルホン酸
などの緩衝剤を用いることも可能である。好ましい組成
の添加液の例は、下記培地例１の添加液等が挙げられ
る。さらに、炭素源、窒素源、無機塩類および重金属を
含む成分の少なくとも１種、特に炭素源と窒素源と無機
塩類と重金属を含む成分とを含有してなる添加液を、培
養の途中で間欠的にまたは連続的に加えて、培養液中の
炭素源、窒素源の濃度を調整し、かつ、炭素源、窒素源
以外の無機塩類、重金属を含む成分等は初発培地と同程
度の濃度に保持させることが、藻体の生産性を向上させ
る点で好ましい。調整された培養中の培養液の各成分の
濃度は、例えば、炭素源０．１〜１５０ｇ／Ｌ、窒素源
０．１〜１５ｇ／Ｌ、無機塩類０．１〜１００ｇ／Ｌ、
重金属を含む成分０．００１〜５０ｍｇ／Ｌであるのが
好ましい。

【００１９】栄養源の添加の方法としては、培養開始か
ら一定量を連続的に添加する方法、または培養開始後一
定量を間欠的に添加する方法のいずれもが用いることが
可能である。複数種の栄養源を同時に添加してもよい。
栄養源の添加を開始する時期としては海洋性微細藻類の
濃度が３×１０⁶細胞／ｍｌ以上に達した時点であるの
が好ましい。この濃度より低い時点で栄養源の添加を開
始すると高い増殖速度が得られず、新たな栄養源を添加
する効果が薄れるので好ましくない。

【００２０】本培養全体の培養時間は、培養に用いる藻
体の培養開始時の濃度、培地組成、培地の量等の条件に
よっても異なるが、２４〜２４０時間である。培養開始
から添加液を添加する前、添加時、添加後から培養終了
までの培養時間の比率は、添加前：添加中：添加後＝
１：１：８〜１：８：１の割合であるのが好ましい。

【００２１】また、培養する方法は、深部通気撹拌培
養、回転振盪培養、通気撹拌培養、振盪培養等であるの
が好ましい。

【００２２】培養温度としては通常１５〜３４℃で藻体
生産を行なうことが可能である。培養終了後、培養液か
らの藻体の回収は一般的な方法、例えば、１０℃、８０
００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離法や濾紙およびガラス
フィルターによる濾過法等により行なうことが可能であ
る。このように回収した藻体をそのままか、あるいは凍
結乾燥法、熱風乾燥法などにより乾燥藻体としたのち、
ドコサヘキサエン酸を高度に含有する粗脂質を抽出する
ことが可能である。藻体からドコサヘキサエン酸を高度
に含有する粗脂質を抽出する方法としては、Ｆｏｌｃｈ
法やＢｌｉｇｈ−Ｄｙｅｒ法に代表されるクロロホルム
／メタノール系等の有機溶媒による一般的な抽出方法を
用いることが可能である。

【００２３】粗脂質からのドコサヘキサエン酸の精製は
常法に従って行なうことが可能である。例えば、粗脂質
をＮａＯＨなどでケン化したのちそのままか、あるいは
酸またはアルカリ触媒によりアルコールエステルとする
ことで、カラムクロマトグラフィーまたは分別、蒸留、
超臨界抽出などの方法によって容易に純品として得るこ
とが可能である。これは藻体中にドコサヘキサエン酸と
物性の非常に似通った高度不飽和脂肪酸が同時に含まれ
ていないことによるもので、従来の魚油などからの精製
に比較して非常に簡便で効率良くドコサヘキサエン酸を
得ることが可能である。

【００２４】以上のように本発明によれば、ドコサヘキ
サエン酸を産生する能力を有する海洋性微細藻類を藻体
収量の向上を目的として、培養するに際し、培養中に新
たに栄養源を添加する条件で培養することにより、短期
間で高密度に藻体の安定した増殖が得られることを見い
だしたが、本発明の趣旨に従い通常行なわれる改変は本
発明に含まれる。

【００２５】

【００２６】

【実施例】以下に本発明を実施例によりさらに詳しく説
明するが、これらの実施例が本発明の範囲を限定するも
のでないことは言うまでもない。

【００２７】下記の実施例中、海洋性微細藻類の藻体生
産性は培養後の藻体の乾燥藻体重量で示し、また、ドコ
サヘキサエン酸の含有量は乾燥藻体からクロロホルム／
メタノール（２：１）で抽出される粗脂質を三フッ化ホ
ウ素メタノール錯体で脂肪酸メチルエステルとし、ヘプ
タデカン酸を内部標準として産生したドコサヘキサエン
酸をガスクロマトグラフィーにより定量することにより
測定した。

【００２８】（実施例１）下記表１に示す培地を用い、
下記表１に示す培地３Ｌを５Ｌ容ジャーファーメンタに
入れて滅菌をした。冷却後、この培地に、グルコース１
０ｇ／ｌ、酵母エキス２ｇ／ｌを人工海水アクアマリン
（八洲薬品株式会社製）に溶解しｐＨ７．４に調整した
培地で予め５日間液体振盪培養したクリプテコディニウ
ム・コーニーＡＴＣＣ３００２１の培養液３００ｍｌを
接種し、本培養として、２８℃で７日間、攪拌速度２５
０ｒｐｍ、通気量０．６７ｖｖｍ、培養中のｐＨ値はコ
ントロールせずに深部通気攪拌培養を行なった。培養開
始３０時間後（藻体濃度５．０×１０⁶細胞／Ｌ）から
表１に示す添加液５００ｍＬを３８時間の間に等量ずつ
６時間ごとに５回に分けて添加した。培養藻体から得た
乾燥藻体収量は表１に示す結果を得た。

【００２９】（実施例２）下記表１に示す培地を用い、
培養開始３０時間後から表１に示す添加液５００ｍＬを
２４時間かけて連続的に添加した以外は実施例１と同様
にして深部通気攪拌培養を行なった。培養藻体から得た
乾燥藻体収量は表１に示す結果を得た。

【００３０】（比較例１〜４）下記表２に示す培地を用
いたこと、および培養開始後は新たに培地を添加しなか
ったこと以外は、実施例１と同様に深部通気攪拌培養を
行なった。培養藻体から得た乾燥藻体収量は表２に示す
結果を得た。

【００３１】（実施例３）表３に示す培地１００ｍＬを
３００ｍＬ容三角フラスコに入れて滅菌をした。冷却
後、この培地に、グルコース１０ｇ／ｌ、酵母エキス２
ｇ／ｌを人工海水アクアマリン（八洲薬品株式会社製）
に溶解しｐＨ７．４に調整した培地で予め５日間液体振
盪培養したクリプテコディニウム・コーニーＡＴＣＣ３
００２１の培養液１０ｍｌを接種し、本培養として、２
８℃で７日間、攪拌速度２００ｒｐｍ、培養中のｐＨ値
はコントロールせずに回転振盪培養を行なった。培養開
始３０時間後から表３中に示す添加液１５ｍｌを６時間
ごとに５回に分けて添加した。培養藻体から得た乾燥藻
体収量は表３に示す結果を得た。

【００３２】（比較例５）下記表３に示す培地を用いた
こと、および培養開始後は新たに培地を添加しなかった
こと以外は、実施例３と同様に回転振盪培養を行なっ
た。培養藻体から得た乾燥藻体収量は表３に示す結果を
得た。

【００３３】

【００３４】

【００３５】

【００３６】

【発明の効果】本発明の培養方法によって、ドコサヘキ
サエン酸を産生する能力を有する海洋性微細藻類を藻体
収量の向上を目的として、培養中に新たに栄養源を添加
する条件で培養することにより、短期間に高密度の藻体
の安定した増殖が得られることを見いだしたものであ
り、従来は原料の供給が不安定で品質が一定せず、独特
の臭気をもつ魚油からの抽出と高度な分離精製技術によ
り得ていたドコサヘキサエン酸を高濃度に安定して生産
でき、かつ、非常に簡便な分離精製技術により純度の高
いものを供給できる点で工業的に有効な効果を奏するも
のである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｒ 1:89）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】海洋性微細藻類に属し、かつ、ドコサヘキ
サエン酸を産生する能力を有する藻類を培養する方法に
おいて、培養途中の培養液に炭素源、窒素源を含む栄養
源を連続的にまたは間欠的に添加して、該培養液中の炭
素源、窒素源の濃度を調整することを特徴とする海洋性
微細藻類の培養方法。
【請求項２】培養液中の海洋性微細藻類が３×１０⁶細
胞／ｍｌに達した時に、前記栄養源を添加し始める請求
項１に記載の海洋性微細藻類の培養方法。
【請求項３】前記海洋性微細藻類に属し、かつ、ドコサ
ヘキサエン酸を産生する能力を有する藻類が、クリプテ
コディニウム・コーニー（Crypthecodinium cohnii)Ａ
ＴＣＣ３００２１である請求項１または２に記載の海洋
性微細藻類の培養方法。