JPH02138196A - カルシトニン遺伝子関連ペプチド誘導体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はカルシウム代謝異常疾患の治療薬として有用な
新規カルシトニン遺伝子関連ペプチド（Ｃａｌｃｉｔｏ
ｎｉｎ　　Ｇｅｎｅ　　Ｒｅ１ａｔｅｄ　　Ｐｅｐｔｉ
ｄｅ；以下ＣＧＲＰという）誘導体に関する。

〔従来の技術〕

Ｃ０ＲＰは、ヒト、ラット、ニワトリ、ブタなどの脳、
心臓などに存在するペプチド（Ｎａｔｕｒｅ、２９８，
２４０’　２４４　（１９８２）　、Ｎａｔｕｒｅ、３
０４．１２９　１３６　　（１９８３）、５ｃｉｅｎｃ
ｅ、２２５．１３１５−１３２０　　（１９８４）、Ｆ
ＥＢＳ　　Ｌｅｆｔ、、１８３、　　４０３−４０７　
　（１９８５）　　、　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、６，７２１
−７４５　　（１９８５）、Ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ
ｓ、９．７５　８２　　（１９８７）〕であり、循環器
系（Ｅｕｒ、Ｊ、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、、１２３，２０
７−２１６　　（１９８６）〕、骨代謝（Ｎｅｕｒｏｐ
ｅｐｔ　１ｄｅｓ。

↓、４２５−４３４　（１９８４）　、Ｅｎｄｏｃｒｉ
ｎｏｌｏｇｙ、１１Ｂ　　（５）、４６−５１　　（１
９８６））、消化器系（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ。

ｇｙ、　　１１８　　（５）、　　２１４４−２１４５
　　（１９８６）〕およびその他（Ｅｕｒ、Ｊ、Ｐｈａ
ｒｍａｃｏｌ、、　　１４２．　３５５　　３５８　　
（１９８７）　　、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ
、　Ｒｅｓ。

Ｃｏｍｍｕｎ、、　　１５２　　（１）、　　３８３　
　３９１（１９８８）等〕に対する多くの作用を有する
ものであり、その＝ｉ体も多数合成されている〔Ｃｈｅ
ｍ、Ｐｈａｒｍ、Ｂｕｌｌ、、３↓（９）３９１５　３
９１８　（１９８６）、Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ、４３
，８９０−８９２　（１９８７）、特開昭６２−１２９
２９７等）〕。また、ヒトＣ０ＲＰのＣ端断片（８−３
７）の合成などについての報告もある（Ｂｉｏｃｈｅｍ
、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、、１５２　
（１）、３８３−３９１　　（１９８８））が、そのフ
ラグメントによっては生物活性が失活する報告もある〔
Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕ
ｎ、、１３４　（３）、１３０６　１３１１（１９８６
））。

〔発明が解決しようとする課題〕

しかしながら、今までに知られているＣＯＲＰおよびそ
の誘導体は、これらの生物活性を示すか、または失活す
るかのいずれかであり、１つの生物活性を残し、他の活
性は消失するという、いわゆる作用の分離が見られた報
告はない。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者らは、上記の点に着目してＣＧＲＰ誘導体につ
いて種々合成した結果、血圧低下作用を有しないが、血
清カルシウム低下作用を有する、いわゆる作用が分離さ
れたＣ０ＲＰ誘導体を見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、弐 −Ａｌａ Ｖａ　　Ｉ−Ｔｈｒ Ｂ−Ｃ ｃ　ｌ　ｙ−ｃｔｙ Ａｓｎ−Ｐｈｅ Ｖａｌ−Ｇｌｙ ｉｓ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ａｒｇ−Ｌｅｕ Ｓｅｒ−Ａｒｇ −Ｌｙｓ Ｐｒｏ−Ｔｈｒ Ｌｉ２−Ａｌａ Ａｌａ Ｓｅｒ 　　Ｓ　ｎ Ａｓｎ Ｈ （式中、ＡがＡｓｐのときは、Ｂはｃｒｙ、ｃはＬ　ｅ
　ｕ　％　ＤはＶａｌを示し、ＡがＡｓｎのときは、Ｂ
はＡｓｐ、ＣはＰ　ｈ　ｅ　ＳＤはｃｒｙを示す）で表
されるペプチドまたはその塩を提供するものである。

本発明のペプチド〔１〕は、公知のペプチド合成の常法
手段に従って合成できる。液相法によって実施する場合
には、例えばＣ末端のアラニル基のカルボキシル基をエ
ステル化して保護し、式〔１〕で示されるアミノ酸順序
に個々の保護されたアミノ酸および（または）保護され
た低級ペプチドを縮合し、縮合反応の最終段階で、Ｌ−
システイニル基のメルカプトａの保護基およびその他の
側鎖の官能基の保護基を酸分解により脱離し、次いで、
Ｌ−システイニル基のメルカプト基を酸化してジスルフ
ィド橋を形成することにより得られる。

縮合反応自体は、ペプチド合成のための常法手段に従っ
て、保護基の脱着、縮合反応を繰り返すことにより行わ
れる。即ち、本ペプチド〔１〕の原料ならびにすべての
中間体の製造において使用される各種の保護基は、ペプ
チド合成において既知なもの、例えば、加水分解、酸分
解、還元、アミツリシス、ヒドラジツリシスなどのよう
な既知手段によって容易に脱離することのできる保護基
が用いられる。このような保護基はペプチド合成化学の
分野の文献ならびに参考書に記載されている。

本発明においては、α−アミノ基の保護にｔブチルオキ
シカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、ｐ−メ
トキシベンジルオキシカルボニル基を用い、側鎖のアミ
ノ基、即ちリジンのεアミノ基の保護にベンジルオキシ
カルボニル基、ｐ−クロロベンジルオキシカルボニル基
を用い、α−カルボキシル基の保護にメチルエステル基
、ベンジルエステル基を用い、側鎖のカルボキシル基、
即ちアスパラギン酸またはグルタミン酸の側鎖カルボキ
シル基の保護にベンジルエステル基を用い、セリンおよ
びスレオニンの水酸基の保護にベンジル基を用い、アル
ギニンのグアニジノ基中のアミノ酸の保護にメシチレン
−２−スルホニル基またはトシル基を用い、システィン
およびβ−メルカプトプロピオン酸のメルカプト基の保
護基にｐ−メトキシベンジル基またはアセトアミドメチ
ル基を用いるのが好ましい。

本ペプチド〔１〕の合成においては、個々のアミノ酸お
よび（または）低級ペプチドの縮合は、例えば、保護さ
れたα−アミノ酸および活性化末端カルボキシル基をも
つアミノ酸または低級ペプチドと遊離のα−アミノ基お
よび保護された末端カルボキシル基をもつアミノ酸また
は低級ペプチドとを反応させるか、あるいは活性化α−
アミノ基および保護された末端カルボキシル基をもつア
ミノ酸または低級ペプチドと遊離の末端カルボキシル基
をもつアミノ酸または低級ペプチドとを反応させること
により実施することができる。

この場合、カルボキシル基は、例えば、酸アジド、酸無
水物、酸イミダゾリドまたは活性エステル、例えば、シ
アノメチルエステル、ｐ−ニトロフェニルエステル、Ｎ
−ヒドロキシコハク酸イミドエステルなどに変換するこ
とによって活性化することができる。また、カルボジイ
ミド、例えばＮ、Ｎ’　　−ジシクロへキシル−カルボ
ジイミド（ＤＣＣ）　、Ｎ−エチル−Ｎｏ　−３−ジメ
チルアミノプロピル−カルボジイミド、Ｎ、Ｎ’　　−
力ルボニル−ジイミダゾールなどの縮合剤を使用して反
応させることによって、活性化することができる。

本発明において好ましい縮合方法は、アジド法、活性エ
ステル法、混合酸無水物法およびカルボジイミド法であ
る。縮合の各段階ではラセミ化が起こらない方法または
ラセミ化が最少になる方法を用いるのが望ましく、好ま
しくはアジド法、活性エステル法、Ｗｕｎｓｃｈ法（Ｚ
、Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ、、２１ｂ、４２６　（１９
６６）］またはＧｅｉｇｅｒ法（Ｃｈｅｍ、Ｂｅｒ、、
１０３．７８８　　（１９７０））などを用いる。

縮合順序は式〔１〕で示されるアミノ酸順序であれば、
いかなる順序からも合成してもよいが、Ｃ末端側から順
次アミノ酸および（または）低級ペプチドを連結させる
のが好ましい。

かくして得られる鎖状保護ペプチドから目的のペプチド
〔１〕を得るには、先ず上記鎖状保護ペプチド、即ち保
護されたω−アミノ基、側鎖カルボキシル基、水酸基、
グアニジノ基およびメルカプト基を有するヘキサトリア
コンタペプチドの保護基が脱離される。これらの保護基
は上記と同じ方法によって、遊離メルカプト基を有する
ヘキサトリアコンタペプチドが得られる。

次いで、このペプチドは酸化により分子内ジスルフィド
橋が形成され、目的のペプチド〔１〕が得られるのであ
るが、このジスルフィド橋の形成は通常、水中の大気酸
素、有機溶媒中のショートエタン、氷酢酸中の沃素、水
溶液中のフェリシアン化カリウム等で酸化することによ
って行われる。

本発明においては、上記の液相法によるペプチド合成法
の他に、固相法によるペプチド合成法を一部または全部
利用してペプチド（１）を合成することができる。

例えば、１番目から３６番目までのベプチドフラググメ
ントを固相法により合成し、保護されたヘキサトリアコ
ンタペプチド結合樹脂が得られる。

これらの保護基および樹脂は、公知の方法、例えば、ト
リフルオロメタンスルホン酸、無水弗化水素などによる
方法によって一段階で脱離され、遊離メルカプト基を有
するヘキサトリアコンペタペプチドが得られる。このペ
プチドは前記の液相法で述べたと同じ方法で分子内ジス
ルフィド橋を形成することにより目的のペプチド〔１〕
が得られる。

上記の固相法で用いられる樹脂としては、固相法で通常
用いられる樹脂、例えば４−（オキシメチル）−フェニ
ルアセトアミドメチル樹脂等が挙げられる。この樹脂は
官能基当量や架橋度の違いによって所望の性状を有する
樹脂が入手可能であり、市販品を購入することもできる
。

上記の固相法においては、樹脂に式〔１〕で示されるア
ミノ酸順序にＣ−末端のアミノ酸から１番目のアミノ酸
までを順次−つずつ縮合させて行う。該アミノ酸の官能
基は公知の方法により保護基で保護される。上記の保護
基の例としては、前記で述べた通りである。

上記の固相反応に際しては、樹脂を反応器に入れ、ジク
ロロメタン、クロロホルム、ジメチルホルムアミド、ベ
ンゼンまたは樹脂を膨潤させる溶媒を樹脂１ｇに対し、
溶媒２〜２０ｍ１の割合で添加する。これに、予め別の
反応器で、樹脂中のアミノ基１当量に対し１〜６当量の
Ｂｏｃ−アミノ酸とＤＣＣを反応させ、得られた対称酸
無水物を副生じたジシクロヘキシル尿素（Ｄ　ＣＵ）よ
り分離して、上記樹脂の入った反応基に加える。縮合剤
（ＤＣＣ）の使用量はＢｏｃ−アミノ酸１当量に対し、
０．５から３当量を用いる。反応は通常５〜６０分行わ
れる。

各工程で得られたＢｏｃ−アミノ酸−樹脂またはＢｏｃ
−ペプチド−樹脂の一部を採取し、常法（Ｔ、Ｆａｉｒ
ｗｅｌｌ、ｅｔ、ａｌ、、Ｂｉ。

ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２２．２６９１　　（１９８３）
〕に従い反応したＢｏｃ−アミノ酸量を測定してカンプ
リング量を求めればよい。

次ぎに、α−アミノ基の保護基であるＢｏｃをトリフル
オロ酢酸の如き酸で脱離して、順次縮合反応を遂行すれ
ばよい。上記の固相法によるペプチド合成は自動固相合
成機を用いるが、手動法で遂行してもよい。これらの操
作は全て窒素ガス気流下で行うのが望ましい。

このようにして１番目から３６番目までのペフ。

チドフラグメントが結合した樹脂が得られる。このよう
にして得られた保護されたヘキサトリアコンペタペプチ
ド結合樹脂は、上記で述べた通り、無水弗化水素などに
より一段階で保護基と樹脂が脱離され、ｉｔ＋［メルカ
プ）Ｍを有するヘキサトリアコンタペプチドが得られる
。

前記ペプチドは前記の通り分子内ジスルフィド橋を形成
することにより目的のペプチド〔１〕が得られる。

このようにして得られたペプチド〔１〕は、ペプチドま
たは蛋白質を精製する公知の手段によって分離精製する
ことができる。例えば、セファデックスＧ−２５、セフ
ァデックスＧ−５０、セファデックスＬＨ−２０などの
ゲル濾過剤を用いるゲル濾過法、カルボキシメチルセル
ロース、その他のイオン交換樹脂などを用いるカラムク
ロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィーなどに
より行うことができる。

本発明により得られるペプチド〔１〕の例としては、次
のペプチドが挙げられる。

ヒトＣ０ＲＰ　　（１−３６）　　（ｈ−ＣＧＲＰ　　
（１３６））； Ａ＝Ａ　ｓ　ｐ、　Ｂ＝Ｇ　１　ｙ、、Ｃ＝Ｌ　ｅ　ｕ
、　Ｄ−Ｖｔ ニワトリＣ０ＲＰ　　（１−３６）　　（ｃ−ＣＧＲＰ
（１−３６））； Ａ＝Ａｓｎ、、Ｂ＝Ａｓｐ、Ｃ＝Ｐｈｅ、Ｄ＝Ｇｙ 本発明の新規ペプチド〔１〕は、その方法の条件により
塩基またはその塩の形で得られる。例えば、酢酸、クエ
ン酸、リンゴ酸、酒石酸などの公知の有機酸との塩を形
成することができる。

尚、本明細書中において記載の略号は、次の意味を有す
る。

Ａｌａ　；Ｌ−アラニン Ａｓｐ；Ｌ−アスパラギン酸 Ａｓｎ；Ｌ−アスパラギン Ｔｈｒ−Ｌ−スレオニン Ｃｙｓ；Ｌ−システィン Ｖａｌ；Ｌ−バリン Ｈｉｓ；Ｌ−ヒスチジン ＡｒｇＨＬ−アルギニン Ｌｅｕ；Ｌ−ロイシン ｃｔｙ；グリシン Ｐｈｅ；Ｌ−フェニルアラニン ３ｅｒ；ｌ−−セリン Ｌｙｓ；Ｌ−リジン ＰｒｏＨＬ−プロリン Ｂｏｃ　；　ｔ−ブチルオキシカルボニルＣＩ−Ｚｉｐ
−クロロベンジルオキシカルボニル ｌ３ｚｌ；ベンジル ＭＢｚｌ；ｐ−メトキシベンジル ＴＯ８；トシル ０　Ｂ　ｚ　ｌ　；ベンジルエステル ＴＦＡ；ｌ−リフルオロ酢酸 ＤＭＦ；Ｎ、Ｎ’　　−ジメチルホルムアミドＤＣＭ、
ジクロロメタン ＤＣＣ；Ｎ、Ｎ’　　−ジシクロへキシル−カルボジイ
ミド ＤＩＥＡｉジイソプロピルエチルアミンＨＯＢ　ｔ　；
　１−ヒドロキシベンゾトリアゾールＰＡｌｆ脂；４−
（オキシメチル）−フェニルアセトアミドメチル樹脂 〔発明の効果〕 血清カルシウム低下作用 ［活性測定法〕 本発明のペプチド〔１〕および公知のｈ−ＣＧＲＰ各々
８０μｇを０．１％生血清アルブミン含有クエン酸緩衝
液（ｐＴ４６．５）（以下単に溶解液と称する）１ｍ７
！に溶し、ウィスター系ラット（８０−９０ｇ）１群５
−６匹に８０ｇｇ／ｋｇになるよう尾静脈より投与し、
３０分後に腹部下行大動脈より採血し、血清カルシウム
濃度を原子吸光により測定した。

〔測定結果〕

測定した結果は、第１表の通りである。

第１表　血清カルシウム低下作用活性 血圧低下作用 〔活性測定法］ 体重３２０〜４１０ｇの雄性Ｗ　ｉ　ｓ　ｔ　ａ　ｒ系
ラット（静動協）をウレタン（１、０ｇ　／　ｋ　ｇ　
、　　ｉ。

ｐ、）麻酔し、大腿動脈内にカニュレーションして圧ト
ランスデユーサ−を介し血圧を測定した。

被検薬は生理食塩水に溶解、希釈後、凍結し、用時室温
に戻して大腿静脈内に挿入したカニユーレを介して０．
０５ｍ６／１００ｇの液量を投与した。

〔測定結果〕

測定した結果は第２表の通りである。

第２表　血圧低下作用 以上の結果から、公知のＣ０ＲＰは強い血圧低下作用を
示したが、本発明のペプチド（１）は、第２表に示す通
り、血圧低下作用を有しないので、カルシウム代謝異常
が関与する疾患の治療薬として有用である。

〔実施例〕

次に実施例を挙げて本発明の製造例を具体的に説明する
。

実施例　１ ｈ−ＣＯＲＰ　　（１−３６） 保護−ｈ−ＣＯＲＰ　（１−３６）−ＰＡＭ樹脂、即ち
Ｈ−Ａｌａ−Ｃｙｓ　　（ＭＢ２１）　−Ａｓｐ（ＯＢ
ｚ　　１）−Ｔｈｒ　　（Ｂｚ　　Ｉ）−Ａｌａ−Ｔｈ
ｒ　　（Ｂｚ　　Ｉ）−Ｃｙｓ　　（ＭＢｚ　　１）−
Ｖａ　　１−Ｔｈｒ　　（Ｂｚ　　Ｉ）−Ｈｉｓ　　（
Ｔｏｓ）−Ａｒｇ　　（Ｔｏｓ）　　−Ｌｅｕ−Ａｌａ
−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−３ｅｒ　　（Ｂｚ　　ｌ）
−Ａｒｇ　　（Ｔｏｓ）　　−３ｅｒ　　（Ｂｚ　　Ｉ
）−Ｃ；１ｙ−Ｇｌｙ−Ｖａ　　１−Ｖａ　　ＩＬｙｓ
　　（ＣＩ−Ｚ）−Ａｓｎ−Ａｓｎ−ＰｈｅＶａ　　１
−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ　　（Ｂｚ　　１）　　−ＡｓｎＶａ
　　１−Ｇｌｙ−５ｅｒ　　（Ｂｚ　　１）−Ｌｙｓ　
　（ＣＩ−Ｚ）−Ａｌａ−ＰＡＭ樹脂１．０ｇにアニソ
ール１ｍｌ、ジメチルスルフィドｌ　ｍ　ｌ　、エタン
ジチオールＱ、３ｍｌを加え、これに無水弗化水素１０
ｍｇを加え、０℃で１時間攪拌した。反応後、無水弗化
水素を減圧下留失投、残渣をエーテルで洗浄し、これに
２０％酢酸３　Ｑ　ｍ　７！を加え、ペプチドを抽出し
た。抽出液をｌ）ｏｗｅｘ　　ＷＧＲのカラム（２，５
Ｘ１５ｃｍ）に通し、１Ｍ酢酸１５０ｍｇで溶出した。

得られた溶出液を凍結乾燥し、４００ｍｇの白色粉末を
得た。この粉末４００ｍｇを８Ｍ尿素、５ｍＭジチオス
ライトールを含む５０ｍＭ　　Ｎａｚ　ＨＰＯ４緩衝液
（ｐＩ（７，５）３０ｍ；に溶解し、室温で１時間攪拌
した後、５０ｍＭ　　Ｎａｇ　ＨＰＯ４１１衝液（ｐＨ
７゜５）２５００ｍｇで希釈し、２０ｍＭ　　Ｋ３Ｆ（
３（ＣＮ）１．水溶液１５ｍｆｆを加えた。この溶液を
ＣＨＰ−２０Ｐ　（三菱化成工業社製）のカラム（３，
Ｏｘ　３４　ｃｍ）にチャージし、５％アセトニトリル
含有ＩＮ酢酸水溶液１２００ｍβ〜４５％アセトニトリ
ル含有ＩＮ酢酸水溶液１２００ｍ１の直線型濃度勾配に
よるグラジェントｉ８出を行った。溶出液を１０ｍｇづ
つ分画し、その１００μｌを使用してフォリン・ローリ
−法により発色させ、７５０ｎｍで測定し、フラグ９３
フ８０〜１００番目を集め、凍結乾燥して白色粉末７０
ｍｇを得た。この粉末をＣＭ−）ヨバール６５０Ｍのカ
ラム（２，６ｘ３５ｃｍ）にチャージし、０゜ＩＮ酢酸
アンモニム水溶液（ｐＨ７，５）７００ｍ１〜０．４５
Ｍ酢酸アンモニム水溶液（ｐＨ７゜５）７００ｍｇの直
線型濃度勾配によるグラジェント？容出を行った。を容
出液をｌＱｍ７！づつ分画し、フラジ９３フ４〜６０番
目を集め、凍結乾燥して白色粉末を得た。

得られた白色粉末を０．１Ｍ酢酸に溶解し、５ｅｐｈａ
ｄｅｘ　　Ｇ−２５Ｆｉｎｅのカラム（２゜６Ｘ９５ｃ
ｍ）にチャージし、０．１Ｍ酢酸で溶出した。溶出液を
ｌＱｍｌづつ分画し、フラクション２３〜３６番目を集
め、凍結乾燥して白色粉末２０．５ｍｇを得た。

これを下記の条件による逆相系高速液体クロマトグラグ
イ−（ＨＰ　Ｌ　Ｃ”）により精製し、ｈ−ｃＧＲＰ　
（１−３６）の精製品７．５ｍｇを得た。

カラム；５ｅｎｓｙｕ　　Ｐａｋ　　０ＤＳ−Ｈ−５２
５１（２０ｍｍ　Ｅ、　Ｄ、　　Ｘ　２５０ｍｍ）溶出
液：０．１％ＴＦＡ−アセトニトリル（アセトニトリル
を３０分間に２５〜３５％に変化させるグラジェント溶
出） 流速　；９，０ｍ４７分 分取　；約２８分に溶出されるピークを分取した。

本品の物性； アミノ酸分析値（６Ｎ塩酸加水分解）；Ａｓｐ２．８６
　（３）　、Ｔｈｒ３．８２　（４）、５ｅｔ２．９０
　（３）　、Ｐｒｏｌ、２８　（１）、Ｇｌｙ３．９７
　（４）　、Ａｌａ４．００　（４）、Ｖａ　１５．０
０　（５）　、Ｌｅｕ３．０６　　（３）、Ｐｈｅｌ、
８５　（２）　、Ｌｙｓ２．０７　　（２）、Ｈｉｓｓ
、９８　（１）　、Ａｒｇｌ、９２　（２）、シスチン
０．５０　（１） アミノ酸分析値（トリプシン・アミノペプチダーゼＭに
よる酵素分解） Ａｓｎ２．８８　（３）　、Ｔｈｒ３．８６　（４）、
５ｅｔ３．１３　（３）　、Ｐｒｏｏ、９７　（１）、
Ｇｌｙ４．Ｏｆ　　（４）　、Ａｌａ４．００　（４）
、Ｖａ　１５．０２　（５）　、Ｌｅｕ３．１１　　（
３）、Ｐｈｅｌ、９９　（２）　、Ｌｙｓ２．１９　（
２）、Ｈｉｓｓ、９２　（１）　、Ａｒｇｌ、９２　（
２）、シスチン０．８７　　（１）（Ａｒｇはシトルリ
ンにて定量〕 上記の保護−ｈ−ＣＯＲＰ　（１−３６）−ＲＡＭ樹脂
は次の方法により得た。

固相合成装置としてＡｐｐｌｉｅｄ　　Ｂｉａｓｙｓｔ
ｅｍｓ社製４３０Ａ−ペプチドシンセサイザーを用いて
固相合成を行った。

Ｂｏｃ−Ａｌａ−ＲＡＭ樹脂（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓ
ｙｓｔｅｍｓ社製、Ｂｏｃ−Ａｌａｏ。

７０ｍモル／ｇ）０．７１ｇをペプチド固相合成用反応
容器に入れ、ＤＣＭ８ｍｌ（４回、各１回分）、６０％
ＴＦＡ含有ＤＣＭ溶液８ｍｆｆ（２０分）　、ＤＣＭ４
ｍｊ！　（３回、各１５秒）、ＤＩＥＡ　１　ｍ　ｌを
含有したＤＭＦ溶液３ｍｌ　（２回、各１分）　、ＤＭ
Ｆ８ｍｌ（６回、各４０秒）の順に窒素ガス気流中攪拌
下処理し、各々の処理後濾過した。

一方、アミノ酸順序３５番目のＢｏｃ−１，ｙｓＣＣＩ
−Ｚ）２ｍモルをＤ　ＣＭ　５　ｍ　ｌに溶解し、アミ
ノ酸活性化容器中でＤＣＣ（０，５Ｍ−ＤＣＭ溶液）２
ｍを加え、５分間反応させた。反応液を濾過して濃縮容
器に移し、これにＤ　Ｍ　Ｆ　ａ　ｍ　１を加え、窒素
がス気流下ＤＣＭを留去した。これにＤ　Ｍ　Ｆ　３　
ｍ　ｌを加え、前記の反応容器に移して２５分間反応さ
せた。次いで、ＤＣＭ８ｍＪ（６回、各２０秒）で洗浄
、濾過してＢｏｃ−Ｌｙｓ（ＣＩｌ−Ｚ）−Ａｌａ−Ｒ
ＡＭ樹脂を得た。

次に、前記のＢｏｃ−Ｌｙｓ　（Ｃ１−Ｚ）−Ａｌａ−
ＲＡＭ樹脂を反応容器中ＤＣＭ８ｍ！！（４回、各１分
）で洗浄し、濾過した。これに６０％ＴＦＡ含有４０％
ＤＣＭ溶液８ｍｊ２を加え、２０分間攪拌し、Ｂｏｃ基
を脱離した。得られた樹脂ＤＣＭ４ｍｆｆｉ　（３回、
各１５秒）、ＤＩＥＡ１ｍｌ含有ＤＭＦ溶液３ｍｌ　（
２回、各１分）、ＤＭＦ８ｍｌ　（６回、各４０秒）で
順次洗浄し、濾過した。

一方、アミノ酸順序３４番目のＢｏｃ−３ｅｔ（Ｂｚｌ
）２ｍモルをＤＣＭ５ｍｌに溶解し、アミノ酸活性化容
器中でＤＣＣ（０，５Ｍ−ＤＣＭ溶液）２ｍＪを加え、
５分間反応させた。次いで、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ　＜Ｃ１−
Ｚ）の場合と同様に処理し、ＤＭＦを加えて窒素ガス気
流下で濃縮した後、反応容器に移して２０分間反応させ
た。次いでＤＣＭ８ｍｌ（６回、各２０秒）で洗浄、濾
過してＢｏｃ−３ｅｔ　（Ｂｚ　１）−Ｌｙｓ　　（Ｃ
１−Ｚ）Ａｌａ−ＲＡＭ樹脂を得た。

以下、順次３３番目から１番目までのアミノ酸をカップ
リングし、最後に６０％ＴＦＡ含有ＤＣＩｖｆ？Ｗ液に
てＢｏｃ基を脱離しＤＣＭ、ＤＩＥＡおよびＤＭＦで順
次洗浄して、保護−ｈ−ＣＯＲＰ（１−３６）−ＲＡＭ
樹脂を得た。

用いた保護アミノ酸は次の通りである。

アミノ酸　　　保護アミノ酸　　　　　　使用量順序　
　　　　　　　　　　　　　　　ｍモル３５　　　Ｂｏ
ｃ−Ｌｙｓ　　（ＣＩｌ−Ｚ）　　　　２３４　　　Ｂ
ｏｃ−３ｅｒ−（Ｂｚ　１）　　　　２３３　　　Ｂｏ
ｃ−Ｇｌｙ　　　　　　　　　２３２　　　Ｂｏｃ−Ｖ
ａｔ　　　　　　　　　　２３１　　　Ｂｏｃ−Ａｓｎ
　　　　　　　　２Ｘ２３０　　　Ｂｏｃ−Ｔｈｒ　　
　　　　　　　２２９　　　Ｂｏｃ−Ｐｒｏ　　　　　
　　　　２２８　　　Ｂｏｃ−Ｖａｌ　　　　　　　　
　　２Ｂｏ　　ｃ−Ｐｈｅ Ｂｏｃ−Ａｓｎ Ｂｏｃ−Ａｓｎ Ｂｏｃ−Ｌｙｓ Ｂｏｃ−Ｖａｌ Ｂｏｃ−Ｖａｌ Ｂｏｃ−Ｇｌｙ Ｂｏｃ−Ｇｌｙ Ｂｏｃ−３ｅｒ　　（Ｂｚｌ） Ｂｏｃ−Ａｒｇ　　（Ｔｏｓ） Ｂｏｃ−３ｅｒ　　（Ｂｚ　　１） Ｂｏｃ−１，６１１ Ｂｏｃ−Ｌｅｕ Ｂｏｃ−Ｇｌｙ Ｂｏｃ−Ａｌａ １３ｏｃ−Ｌｅｕ Ｂｏｃ−Ａｒｇ　　（Ｔｏｓ） Ｂｏ　ｃ−Ｈｉ　　ｓ　　（Ｔｏ　５）Ｂｏｃ−Ｔｈｒ
　　（Ｂｚｌ） Ｂｏｃ−Ｖａｌ Ｚ） （ＣＩ ７　　　　Ｂｏｃ−Ｃｙｓ　　（ＭＢｚ　　Ｉ）　　　
　　２６　　　　Ｂｏｃ−Ｔｈｒ　　（Ｂｚ　　１）　
　　　　　２５　　　　　Ｂｏｃ−Ａｌａ　　　　　　
　　　　　　　　２４　　　　Ｂｏｃ−Ｔｈｒ　　（Ｂ
ｚ　　ｌ）　　　　　　２３　　　　Ｂｏｃ−Ａｓｐ　
　（ＯＢｚ　　ｌ）　　　　　２２　　　　Ｂｏｃ−Ｃ
ｙｓ　　（ＭＢｚ　　１）　　　　　２１Ｂｏｃ−Ａｌ
ａ２ 上記固相合成において、Ａｓｎ、Ａｒｇを用いた場合は
、２ｍモルのアミノ酸をＤＭＦ−ＤＣＭ（３：１）混合
溶媒４ｍｌ中、ＤＣＣ溶液２ｍｌ、ＨＯＢ　　ｔ：容を
夜　（０，５Ｍ−ＤＭＦ溶？ｆｆｌ）２ｍｆｆ　を加え
、１分間反応させた後、他のアミノ酸と同様に処理し、
反応容器に移してカンブリング反応をし、ＤＣＭ洗浄、
濾過後、もう−度２ｍモルアミノ酸をＤＭＦ−ＤＣＭ　
（３：　ｌ）混合溶媒４ｍｌ中、ＤＣＣ溶液２ｍｌ、Ｈ
ＯＢ　を溶？ｆｆ１（０，５ＭＤＭＦ熔液）２ｍｌを加
え、２５分間反応させたものを反応容器に移してカップ
リング反応させる、いわゆるダブル・カップリング法で
行った。

実施例　２ ｃｍＣｏＲＰ　　（１−３６） 保護−ｃ−ＣＯＲＰ　（１−３６）−ＲＡＭ樹脂、即ち
Ｈ−Ａｌａ−Ｃｙｓ　　（ＭＢｚ　ｌ）　−Ａｓｎ−Ｔ
ｈｒ　　（Ｂｚ　　１）−Ａｌａ−Ｔｈｒ　　（Ｂｚ　
　ｌ）　　−Ｃｙｓ　　（ＭＢｚ　　１）−Ｖａ　　１
−Ｔｈｒ　　（Ｂｚ　　１）−Ｈｉｓ　　（Ｔｏｓ）−
Ａｒｇ　　（Ｔｏｓ）−ＬｅｕＡｌａ−Ａｓｐ　　（Ｏ
Ｂｚ　　１）−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−３ｅｒ　　（Ｂｚ　　
］）−Ａｒｇ　　（Ｔｏｓ）−５ｅｔ（Ｂｚｌ）　　　
Ｇｌｙ　　　Ｇｌｙ−Ｖａｔ−Ｇｌｙ　−Ｌｙｓ　　（
ＣＩ−Ｚ）−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ　−Ｖａ　　１−
Ｐｒｏ−Ｔｈｒ　　（Ｂｚ　　１）−Ａｓｎ−Ｖａｌ−
Ｇｌｙ−３ｅｒ　　（Ｂｚｌ）−Ｌｙｓ　　（ＣＩＺ）
−Ａ　ｌ　ａ−ＲＡＭ樹脂０．８０ｇにアニソールｌ　
ｍ　ｌ　、ジメチルスルフィド１ｍｌ、エタンジチオー
ル０．３ｍｌを加え、これに無水弗化水素１０ｍｊｌ！
を加え、０℃で１時間攪拌した。反応後、無水弗化水素
を減圧留去後、残渣をエーテルで洗浄し、これに２０％
酢酸３　Ｏｍｌを加え、ペプチドを抽出した。抽出液を
Ｄｏｗｅｘ　　ＷＧＲのカラム（２，５Ｘ１５ｃｍ）に
通し、０．１Ｍ酢酸１５　Ｏｍｌで溶出した。得られた
溶出液を凍結乾燥し、４５０ｍｇの白色粉末を得た。こ
の粉末４４０ｍｇを８Ｍ尿素、５ｍＭジチオスライトー
ルを含む５０　ｍＭ　　Ｎ　ａ　ｚ　ＨＰ　０４　ｍ衝
液（ｐＨ７，５）３０ｍＪに溶解し、室温で１時間攪拌
した。その後５０ｍＭ　　Ｎａｚ　ＨＰＯ４１ｆｚ衝液
（ｐＨ７，５）３０００ｍｆで希釈し、２０ｍＭＫ３　
Ｆ　ｅ　（ＣＮ）　ｂ水溶液１６ｍｌを加えた。

この溶液をＣＨＰ−２０Ｐ　（三菱化成工業社製）のカ
ラム（３，ＯＸ３４ｃｍ）にチャージし、１０％アセト
ニトリル含有０．ＩＮ酢酸水溶液１２００ｍｊ！〜５０
％アセトニトリル含有ＩＮ酢酸水溶液１２０　Ｏｍｌの
直線型濃度勾配によるグラジェント溶出を行った。溶出
液をｌ　Ｏｍｌづつ分画し、その１００μｌを使用して
フォリン・ローリ−法により発色させ、７５０ｎｍで測
定し、フラグ９３フ８９〜１０４番目を集め、凍結乾燥
して白色粉末６９ｍｇを得た。この粉末をＣＭ−）ヨバ
ール６５０Ｍのカラム（２，６Ｘ３５ｃｍ）にチャージ
し、Ｏ，１Ｍ酢酸アンモニウム水溶液（ｐＨ７，５）７
００ｍｌ　〜０．４５Ｍ酢酸アンモニウム水？８液（ｐ
Ｈ７，５＞７００ｍ１の直線型濃度勾配によるグラジェ
ント溶出を行った。溶出液を１０ｍｊｉ！づつ分画し、
フラジ９３フ４３〜５２番目を集め、凍結乾燥した。

得られた白色粉末をＯ，１Ｍ酢酸に溶解し、５ｅｐｈａ
ｄｅｘ　　Ｇ−２５Ｆｉｎｅのカラム（２゜６Ｘ９５ｃ
ｍ）にチャージし、０．１Ｍ酢酸で溶出した。溶出液を
ｌ　Ｑｍｊ！づつ分画し、フラグ９３フ２２〜２９番目
を集め、凍結乾燥して白色粉末１４．２ｍｇを得た。

これを下記の条件による逆相系高速液体クロマトグラフ
ィー（ＨＰ　Ｌ　Ｃ）により精製し、ｃ−ＣＯＲＰ　（
１−３６）の精製品４．２ｍｇを得た。

カラム；５ｅｎｓｈｕ　　Ｐａｋ　　０ＤＳ−Ｈ−５２
５１（２０ｍｍ１．Ｄ、ｘ２５０ｍｍ）溶出液；０．１
％ＴＦＡ−アセトニトリル（アセトニトリルを３０分間
に２５〜３５％に変化させるグラジェント溶出） 流速　；９，０ｍ１１分 分取　；約２７分に溶出されるピークを分取した。

本島の物性； アミノ酸分析値（６Ｎ塩酸加水分解）；Ａｓｐ４．７９
　（５）　、Ｔｈｒ３．６９　（４）、５ｅｔ２．７５
　（３）　、Ｐｒｏｌ、０８　（１）、Ｇｌｙ３．９５
　（４）　、Ａｈａ４．００　（４）、Ｖａｌ３．９８
　（４）　、Ｌｅｕｌ、９９　＜２）、Ｐｈｅ２．０２
　（２）　、Ｌｙｓ２．０２　（２）、Ｈ４５１，０３
（１）　、Ａｒｇｌ、９４　（２）、シスチン０．７１
　　（１） アミノ酸分析値（トリプシン・アミノペプチダーゼＭに
よる酵素分解）； Ａｓｐｌ、１１　　（１）　、Ａｓｎ３．４６　（４）
、Ｔｈｒ３．８６　（４）　、５ｅｔ３．１９　（３）
、Ｐｒｏｌ、３８　（１）　、０１ｙ４．０１　　（４
）、Ａｈａ４．００　（４）　、Ｖａ　１４．２６　（
４）、Ｌｅｕ２．０９　（２）　、Ｐｈｅ２．００　（
２）、Ｌｙｓ２．３３　（２）　、Ｈｔ　ｓＱ、９５　
（１）、Ａｒｇｌ、８９　　（２）　、シスチン０．８
８　　（１）（Ａｒｇはシトルリンにて定量〕 上記の保護−ｃ−ＣＯＲＰ　（１３６）−ＰＡＭ樹脂は
、実施例１と同様に固相合成を行た。

用いた保護アミノ酸は次の通りである。

アミノ酸　　保護アミノ酸　　　　　　使用量順序　　
　　　　　　　　　　　　　ｍモル３５　　　Ｂｏｃ−
Ｌｙｓ　　（ＣＩ−Ｚ）　　　２３４　　　Ｂｏｃ−３
ｅｔ　（Ｂｚｌ）　　　　２３３　　　Ｂｏｃ−Ｇｌｙ
　　　　　　　　２３２　　　Ｂｏｃ−Ｖａｌ　　　　
　　　　２３１　　　Ｂｏｃ−Ａｓｎ　　　　　　　２
Ｘ２３０　　　Ｂｏｃ−Ｔｈｒ　　　　　　　　２２９
　　　Ｂｏｃ−Ｐｒｏ　　　　　　　　２２８　　　Ｂ
ｏｃ−Ｖａｔ　　　　　　　　２２７　　　Ｂｏｃ−Ｐ
ｈｅ　　　　　　　　２２６　　　Ｂｏｃ−Ａｓｎ　　
　　　　　２Ｘ２２５　　　Ｂｏｃ−Ａｓｎ　　　　　
　　２Ｘ２２４　　　Ｂｏｃ−Ｌｙｓ　　（ＣＩ−Ｚ）
　　　２２３　　　Ｂｏｃ−Ｇｌｙ　　　　　　　　２
２２　　　Ｂｏｃ−Ｖａｔ　　　　　　　　２２１　　
　Ｂｏｃ−Ｇｌｙ　　　　　　　　２１３ｏｃ−ｃｌｙ Ｂｏｃ−３ｅｒ　　（Ｂｚｌ） Ｂｏｃ−Ａｒｇ　　（Ｔｏｓ） Ｂｏｃ−３ｅｒ　　（Ｂｚｌ） Ｂｏｃ−Ｌｅｕ Ｂｏｃ−Ｐｈｅ Ｂｏｃ　−ＡＳｐ Ｂｏｃ−Ａｈａ Ｂｏｃ　　−Ｌ　ｅｕ Ｂｏ　Ｃ−Ａｒｇ　　（Ｔｏｓ） Ｂｏｃ−Ｈ４ｓ　　（Ｔｏｓ） Ｂｏｃ−Ｔｈｒ　　（Ｂｚｌ） ＢＯＣ−Ｖａｌ Ｂｏｃ−Ｃｙｓ　　（ＭＢｚ　　１） Ｂｏｃ−Ｔｈｒ　　（Ｂ２　１） Ｂｏｃ−Ａｌａ Ｂ　ｏｃ−Ｔｈｒ Ｂｏｃ−Ａｓｎ １３ｏｃ−ｃｙｓ Ｂｏｃ−Ａｌａ ２×２ （ＯＢｚｌ）　　　２ ２×２ （Ｂｚｌ）　　　　　２ ２×２ （ＭＢｚｌ）　　　２ 上記固相合成において、Ａｓｎ、Ａｒｇを用いた場合は
、２ｍモルのアミノ酸をＤＭＦ−ＤＣＭ（３：　１）混
合溶媒４　ｍ　ｌ中、ＤＣＣ溶液２　ｍ　ｌ、ＨＯＢ　
を溶液（０，５Ｍ−ＤＭＦ溶液）　２ｍｌを加え、１分
間反応させた後、他のアミノ酸と同様に処理し、反応容
器に移してカップリング反応をし、ＤＣＭ洗浄、濾過後
、もう−度２ｍモルアミノ酸をＤＭＦ−ＤＣＭ　（３：
　１）混合溶媒４　ｍ　Ｅ中、ＤＣＣ溶液２ｍ１ＸＨＯ
Ｂ　を溶液（０，５Ｍ−ＤＭＦ溶液）２ｍｊ！を加え、
２５分間反応させたものを反応容器に移してカップリン
グ反応させる、いわゆるダブル・カップリング法で行っ
た。

手続補正書 １．事件の表示 昭和６３年特許願第２９１９８８号 ２、発明の名称 カルシトニン遺伝子関連ペプチド誘導体３、補正をする
者 事件との関係　特許出願人 住所　静岡県田方郡大仁町三福６３２番地の１名称　東
洋醸造株式会社 ４、代理人　〒１７０ 東京都豊島区北大塚２−２５−１ ５、補正の対象 明細書の発明の詳細な説明の欄 ６、補正の内容 （１１明細書第９頁上から６行目ないし７行目「上記と
同じ方法によって」とあるを「公知の方法、例えばトリ
フルオロメタンスルホン酸、無水弗化水素酸などで処理
する方法によって一段階で脱離され」と訂正する。

（２）明細書第１１頁上から１０行目「反応基」とある
を「反応器」と訂正する。

（３）明細書第２０頁上から３行目ないし４行目「ジチ
オスライトール」とあるを「ジチオスレイトール」と訂
正する。

（４）明細書第２４真上から７行目ないし８行目「を反
応容器中ＤＣＭ８ｍｊ！　（４回、各１分）で洗浄し、
濾過した。これ」とあるを削除する。

（５）明細書中第２７真上から９行目ないし１０行目［
をＤＭＦ−ＤＣＭ　（３：　１）混合溶媒４　ｍ　ｊｌ
！中、」とあるを「に」と訂正する。

（６）同真上から１１行目ｒ２ｍｌＪとあるを「４ｍ１
Ｊと訂正する。

（７）同頁上から１２行目「１分間」とあるを「４０分
間」と訂正する。

（８）同真上から１５行目ないし１６行目「をＤＭＦ−
ＤＣＭ　（３：　１）混合溶媒４ｍｌ中、」とあるを「
に」と訂正する。

（９）同真下から４行目ｒ２ｍｊ？を加え、２５分間」
とあるをｒ４ｍｌを加え、４０分間」と訂正する。

００明細書第２９真上から３行目ないし４行目「ジチオ
スライトール」とあるを「ジチオスレイトール」と訂正
する。

以上

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、ＡがＡｓｐの時は、ＢはＧｌｙ、ＣはＬｅｕ、
   ＤはＶａｌを示し、ＡがＡｓｎのときは、ＢはＡｓｐ、
   ＣはＰｈｅ、ＤはＧｌｙを示す）で表されるペプチドま
   たはその塩。