JPH02140286A - キレート化グループ置換ポリ（アミノ）酸化合物、キレート化合物グループの生体分子への光化学的付加用組成物および付加方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の背景］ キレート化剤と生体分子との結合体は公知である。■、
ｅｅ、　ＩＰ　Ａｐｐｌｎ、　１７３，６２９　（Ｃｙ
Ｌｏｇｅｎ）；　Ｒｏｄｗｅｌｌ、　Ｕ、Ｓ、　４，６
７１．９５８；　５ｔａｖｒｉａｎｏｐｏｕｌｏｓ、　
Ｕ、Ｓ、　４，７０７３５２Ｉ）Ａ１．Ｋ　　ｕ、ｓ、
　４．６５２，４４０；　Ｇａｓｎｏｗ、ＷＯ３８１０
二官能性のキレート他剤（以下ｒｒ３ＦｃＡｊという）
はギＩノート化可能なイオンを生体分子に関連させるた
ぬに使用されている。ＲＰ　ＣΔの二官能性はイオンを
キレート化するが、他の官能性は生体分子を結合する。

そうしてできた結合体は診断治療剤としての価値を認め
られている。例えば人の血清アルブミンや（ＩｌｎａＬ
ｏｗｉｃｈ、　ｅＬ　ａｌ、、　ｌｎＬ、　ＪＡｐｐｌ
、　Ｒａｄｉａｌ、　ＩＳＯ，、３３：３２７　’、１
９８２１）、フィブリノーゲン（１，ａｙｎｅ、　ｅｔ
　ａｌ、、　Ｊ、　Ｎｕｃｌ、　Ｍｅｄ、、　２３：６
２７　ｆｊ９８２］）のような放射標識付けされた蛋白
質が患者の血液型の決定や凝血の局在化のための放射線
医薬品として使用されている。Ｍ、Ｙ、Ｂｒｅｃｈｂｅ
ｌ等は（Ｉｎｏｒｇ、　Ｃｈｅｍ、　２５：　２７７２
　［１９８６］）、人の色彩表面癌の診断のための臨床
実験において、ＭｏＡＢ　Ｂ７２３−キレータ−（ｃ　
Ｉ＋　ｅＩ　ａ　１．ｏ　ｒ　）結合体の使用にツｌ＋
’で報告しており、その他にも勿論多くのものか存在す
る（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ、
７８０：１５１１１９８５コ）。

アミノ−ベンジル−Ｅ　Ｔ）　ｉ’　Ａのアミノ機能基
（Ｎ　Ｈｔ　）は変換して、蛋白質と反応する、ジアゾ
グループ（−Ｎ　２　）（Ｓｕｎｄｂｃｒｇ、　ｅＬ　
ａｌ、、　Ｊ、　ＭＯ＋ＩＣｈｃｍ、　　１７：ｌ３０
４　［１９７４］）、またはイソチオシアナート（−Ｎ
Ｃ８）またはブロモアセタミド（−ＮＨＣＯＣＨｔＢｒ
　）機能基に転換させられる（Ｍｅａｒｅｓ、　ａｔ　
ａｌ、、　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｌ＋ａｍ、、　１４２
：　６８　［１９８４］）。

Ｄ　Ｔ　Ｉ）　Ａ　テは、−Ｃ１２Ｎ　　（ＣＩ、Ｃ０
０Ｉ（）２は同様の目的のために、二無水物（Ｉｌｎａ
ｔＯｗｉｃｂ、ｅｔ　ａｌ、。

Ｊ、　　　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　　Ｍｅｔｈｏｄｓ、　　
６５：　　１４７　１１９８３１）、　プＪ　ルボキシ
炭酸（Ｋｒｅｃｊａｒｅｋ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏ
ｃｈｃｍ、　Ｉ（ｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍ
ｕｎ、、　７７：５８１　［１９７７］）の無水物、コ
ハク酸イミド（Ｎａｊａｆｉ、　ｅｔ　ａｌ、、Ｎｕｃ
ｌ、　Ｍｒ＋ｄ、　Ｉ（ｉｏｌ、。

１３・３４５　［１９８６１）またはペンジルイソチオ
ソアネートとなるように変換される。

米国特許第４６８０３３８号の５ｕｎｄｏｒｏは、リガ
ンド（例キレータ−）をアミン含有の蛋白質に結合する
のに適した二官能性リンカ−に関する特許である。

ＢＦＣ八使へにとって全体的プロトコルは通常２つの形
態をとる。蛋白質は［−予めキレート化され」るこ七が
でき、この場合にはＩＴ（Ｔ”　ＣＡは蛋白質にょう付
加され、そして精製された（未結合■３Ｆ　ＣＡを除去
するため）蛋白質に付加された金属イオンに例月する。

またはＢＦＣΔは最初金属イオンに結合し、次に蛋白質
に結合する。この場合には最終的な精製は非結合ＢＦＣ
Ａと非結合金属イオンとを除去する。実際」二は、これ
ら両方のアプローチとも条件次第で有効である。予めキ
レート化された蛋白質は、大量の同じバッチが用意され
なければならない場合とか、放射性金属イオンが使用さ
れる場合、あるいは最終的な金属イオンの結合が非常に
有効である場合には好ましい。金属イオンの予かじめの
キレート化は、両反応体が高い濃度に維持されるであろ
うし、プロセスを行うための追加の反応体が使用される
であろうから（例えばＢｐ　ｃ　Ａの存在における過テ
クネチウ１１酸塩［−ｐ　ｅ　ｒ　ｔ　ｅｃ　１１ｎ　
ｅ　ｔ　ａ　ｔ　ａ　］の第１錫イオン還元）、金属キ
レートの定量的形成を通常可能にする。しかしＢＴ？Ｃ
Δの蛋白質への付着が高い収量反応でない場合には、潜
在的に高価な金属イオン（例　ラジオインジウム）の大
半が浪費されることになる。。

今日有効なり　Ｆ’　ＣＡに対する蛋白質反応性グルー
プ（例：ノアゾ、イソヂオンアナート、ブロモアセタミ
ド、無水物、コハク酸イミド、ペンヅイミデート）は、
主としてアミノ酸システィン、リジン、ヂロソンおよび
トリプトファンに対する求電子アタックを介してポリア
ミン酸と反応する。

ごの事実は、その固定されたアミノ酸組成を与えられた
蛋白質−ヒにキレートの論理」−の達成可能の最大数を
制限する。これは高い金属イオン含ＦＴが検出感度を向
」二させるためとか（例：高い特定の放射能プローブが
必要とされている場合）、あるいけ金属イオン結合の動
力学および効率を向−１−するため（例、短命放射性金
属イオンのためとか、あるいは標識収量が乏しいとき）
とかに要求される場合に問題となり得る。−船釣な意味
で、これらＢＦＣＡは特定の化学的官能性を有する標識
生体分子に対してのみ使用され、同じＩ３　Ｆ　ＣＡの
数種の変態は種々の異なる生体分子に適合することを要
求され得る。

逆に、本発明に係る光活性化されたｒ３ＦｃＡはかなり
高度なレベルの蛋白質その他の生体分子へのキレート付
加ができる。キレート化剤を生体分子に付加させるため
光活性化された反応グループを使用することは従前に報
告されていない。

アリールアジ）・を含む光活性化剤が、抗原または抗体
を担体」―に固定するために使用されている。

Ｋｒａｍｅｒ、　Ｕ、Ｓ、　４，６８９，３］０；　５
ｃｈｅｅｂｅｒｓ、　Ｕ、Ｓ、　４，７１６．１２２；
　ＡＵ−Ａ−４７６９０／８５　（Ｏｒｇａｎｏｇｅｎ
）を参照。米国特許第４７１３３２６号のＤａｔｔａｇ
ｕｐｔａは、核酸を光化学的に基体にカップリングした
。この技術で他の分ｊ′−も固定化された。Ｐａｎｄｅ
ｙ等はハプテンの第１級芳香族アミン（３−アジド−Ｎ
−エチルカルバゾール）を種々の蛋白質に結合して合成
抗原を創製した（Ｊ、　１ｍｍｕｎｏ１．　Ｍｅｔｈ、
、　９４：　２３７−４７　（１９８６））。

さらに橋渡し基を光化学的に分裂させることにより、「
プロドラッグ［ｐｒｏｄｒｕｇ］　Ｊまたは「プロトキ
シン［ｐｒｏｔｏｘｉｎｃｌＪを活性ある薬剤ｉ’ｄｒ
ｕｇｌまたは毒素［ｔｏｘｉｎ’、］に変換することが
できる。ＺｗａｉｇＵ、Ｓ、４，２０２，３２３：５ｃ
ｎｔｃｒ、Ｕ、Ｓ、４，６２５，０１４；ＩシｄｅＩｓ
ｏｎ、　Ｕ、Ｓ、　４，６］２．００７およびＲｃｉｎ
ｈｅｒｚ　　Ｕ、Ｓ、　４４４３．４２７　（第４欄）
参照。

酵素の光親和力標識もまた公知である。Ｃ１１（ｌ　Ｗ
　（Ｉ　ｒ　ｙＡｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、
、　４８：　２９３−３０５　（１９７５）参照。

この技術においては、供試化合物は特定のレセプタまた
は結合ザイトを期している生物マトリックスと交互反応
させる。相互の親和力により特異コンプレックスが生成
したときに、ベアは供試化合物Ｊ−の反応性グループを
介して化学的に結合する。

これは、レセプタ自体の固定および特徴付（）を非常に
容易にする。光活性基を組み込んだ供試物の大きな利点
は、結合方法が、供試物のすべての非特異性交互反応が
除去されてしまっており、かくして加水分解を介する供
試物の殆どまたは乱雑な結合または損失は起こらなくな
った後、活性化されるであろうことである。これらの光
親和力試薬は、簡単な分子には合成経路を通じ、より複
雑な旨分子には光活性リガンドの結合を通ずる何れかに
、にり調整することができろ。

しかしながら、キレート化グループと、光活性化すると
非常に反応性となる（炭素−水素結合基に組入れられる
能力のある）グループとを有する二宮能性剤の構成を示
唆した者は皆無であった。

［発明の概要］ 本発明は光活性化された官能性によって生体分子にキレ
ート化作用あるグループを付加することに関する。光活
性化可能な二官能性キレート化剤（ｒ）　ｈ　−Ｂ　Ｆ
　ＣＡ　）は、次の通りに、キレート化可能なイオンで
生体分子を標識化する手段として顕苔な利点を有ずろ新
しい級の化合物を表わす。

１　それらは総てのタイプの生体分子の標識化を容易に
受は入れる。光活性化スピーシーズに特有の付加態様は
、単純な炭素−水素、酸素−水素または窒素−水素結合
を単に必要とするだけであり、概略総ての生体分子中に
遍在するこれら構造の存在は酋遍的基質を確保するもの
である。

２　結合体収量は定量的とな得る。このことは、未結合
のキレートを除去するための二次的工程なしにキレート
化産物を直接的に使用することを可能にする。このこと
は時間がかかり問題の多いステップを省略して、高価な
試薬でありからなものを有効利用することができる。

３、結合の程度は、一般に生体分子とは無関係に、また
潜在的に無制限に、容易に制御できる。収率が定量的で
あるならば、付加されたキレート化グループの数は最初
の反応体比の単純な関数となる。このように、もし１０
キレートの（＝１加が所望なら、生体分子に対する最初
の試薬比は１０となる。非特異的標識化工程であるとす
れば、」；記特質はいかなる生体分子にも適用できる。

付加されたキレートの数は、化学的グループの特異反応
で得ることができるものよりずっと多数であってよい。

例えば１０のフリーなアミングループを含有する生体分
子は、試薬を必要とするアミンを使用することによって
はそれ以」−に結合さイすることばてきないが、新種の
試薬を用いれば無制限の可能ｒ１かある。アジ１、とか
ノアゾの置換基のような嵩ばりの少ない光活性化グルー
プを導入することは立体的関係て得策である（Ｈａｙｌ
ｃｙ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｌｒ＋ｚｙ
ｍｏ１４６：　６９）　ｔ、＋９７７］）。

４　カップリングは多くの化学的結合方法に比べて相対
的に穏やか、かつ、迅速である。僅かに塩枯性ｐＨの適
当な安定緩衝液に溶解すること、適当な波長で短時間の
照射（〈１０分間）をすること、そして強い光源が必要
とされる全てである。こうした条（’ｌか酵素や抗体の
ような構造機能に依存する生体分子にと−・て重要な最
小限の損傷を生ぜ１７めると期待される。

本発明のＰ　Ｉ”−ＢＩ”　ＣΔ化合物は次の構造を有
する。即ち、 Ｃｈ−任意のスペーサー−Ｐ　Ｆ ここにＣｈはイオンキレート化グループ、ＰＦはアンド
グループのような光活性化可能な官能性である。

［発明の詳細な説明］ 生体分子をイＪ゛するｌ’　Ｆ−１３Ｆ　ＣΔという光
活性化可能は、とんな牛体分子にもキレート官能性をも
ちこむための穏やがて非常に有効な方法である。。

こうした試薬の比較的非選択的な標識パターンは、特定
の金属イオンで標識付けすることが従来困難ないし不可
能であった生体分子を、この方法で研究することを可能
にするものである。オリゴザツカライド、１１チン、リ
ピドおにび化学的に特定な付加のためいくつかの適当な
サイトを含む個々の蛋白質のような物質こそ適当な基体
である。薬剤、デキストラン、ポリエチレン　グリコー
ルのようなその他の生物的活性な材料は、金属イオンプ
ローベのキャリアとして今やより０効に利用することが
できる。金属イオンを含有する生体分子はＮＭＲコント
ラスト剤（例：　Ｇ　（］またはＭ　ｎを取り入れ）と
して、また蛍光マーカ（例：　Ｅ　ｕまたは１゛ｂを取
り入れ）として極ぬで有益である。各々異なる金属イオ
ンで２以上の生体分子を標識付する能力は、アッセイ工
程（例：　ＲＩΔまたはＩ　ＲＭ△）にそれらを利用す
ることを可能とし、単一のザンブル中の複数のスピーシ
ーズを検出することかできる。放射性金属イオンについ
ては広範な供給かあるので、キレート化さ！１に生体分
子は、あらゆるタイプの生体外および生体内の適用のた
め放射性標識付けできる。核医薬映像のため”Ｇａ、＋
１＋１ｎまたは００″ｒｃのような所望の＃放射性同位
体がより効果的に使用でき、またそれらは１’　Ｅ　’
Ｉ’　（例　１１　ｎ　Ｇａ）および放射線調剤治療（
例１１１１ｙ）のような特定の手順のためにも同様に使
用できる１゜ ［キレート化可能なイオン およびキレート化グループ］ 本発明はいずれか特定のキレート他剤に限定されるもの
でない。ＥＩ）ＴΔおにびＤ　’Ｉ’　Ｆ　Ａの誘導体
が好ましいが、多くのキレート化剤が知られている。Ｍ
ｅａｒｅｓ、Ｕ、Ｓ、　４，６７８．６６７；　１ｌｉ
ｅｄｅｒ、　ｕ、ｓ、　４３５２．７５１：　Ｉｌｎａ
ｔｏｗｉｃｈ、　Ｕ、Ｓ、　４，４７９，９３０；　Ｍ
ｅａｒｅｓ。

Ｕ、Ｓ、　４０４３．９９８；　Ｕｅｄａ、　Ｕ、Ｓ、
　４，５６４，７４２；　Ｄａｖｉｄｓｏｎ、　Ｕ、Ｓ
、　４，６７３，５６２；　ｌｌｎａｔｏｗｉｃｈ、　
Ｕ、Ｓ、　４，６６８．５０３、　　Ａｒａｎｏ、　　
Ｕ、Ｓ、　　４，５５９，２２１　　ａｎｄ　　Ｃｏ５
ｔａ、　　Ｕ、Ｓ、　　３，８０９，６３２゜下記の表
は種々の試薬でキレート化されるイオンを示す。

キレー律〕ヒＬｔＩｙ　＋−７’　　　先−レート　イ
オンＥＤ　’Ｉ’Δ　　　目＋　Ｉｎ、［１７Ｇａ、１
１０″］′ｃ、１１（ＩＹＤ　１’　Ｉ）八　　　〇９
″Ｔｃ、”’Ｉｎ、”Ｇａ、！。Ｙ％ＧｄＭＡ　　Ｉ）
　Ｔ’　Ｐ　Ａ　　”’Ｉｎｓ”ＧａＳ”′ＴｃＳ”Ｙ
、ＧｄＣＡ−ＤＴＰ　　Ａ　　Ｉ　　Ｉ　　＋　　１１
．Ｏ’＋にａ、ロロ″Ｔｃ、”Ｙ　　Ｇｄ’Ｉ’　Ｅ　
ＴΔ；　Ｉ）　ＯＴ八　Ｉ　ｌ　ｌ　ｌ、、　１１７Ｇ
、、　ｌｌ０Ｙ１）　Ａ　Ｄ　Ｓ　　　　　””’Ｔｃ
、　１８ｎＲｃ、　１ｆｌＲＲａ［光活性化可能な官能
性］ 光活性化可能な官能性（Ｉ）　Ｉ；’　）は、光の照射
を受けるとより反応性の高い化学的スピーシーズ（ＰＦ
＊）に転換させられる化学構造であ。て、自然界に生起
するアミノ酸その他の化学的部分の全部ないしは大半の
側鎖に反応することができる１、好ましくはＰ　Ｉ”は
（暗所では）低い化学反応性であって、ＰＦ＊は高い化
学反応性であるのがよい。

第一の具体化ではＰＦ＊はカルベンである。カルベンは
炭素−窒素の二重結合の開裂によって典型的に生成し、
極めて反応性である。カルヘンは、求核センターとに配
位することにより（カルパンイオンを与える）、また多
重結合（芳香系のものを含む）に付加することにより、
単結合中（炭化水素結合を含む）への挿入によって、ま
た水素抜出（次に力・ソプルする２つのフリーラジカル
を生成）にＪニー、て、種々の化学機能体に迅速に反応
する。１．かじ、カルヘンセンターに近接する炭素に水
素原子があるときには、水素の移行が簡単に起こり非反
応性のオレフィンを生成する。このため近接する原子は
水素を持っていてはいけない。

また、α−ケトカルベンは、ケテンを結果する分子内の
つ」ルフ転位を受けることができる。文献［カルベンＪ
　（Ｍ、　Ｊｏｎｃｓ、　Ｊｒａｎｄ　Ｒ，Ａ、　Ｍｏ
５ｓ。

ａｄｓ、）。ｌｌｉ　ｌｅｙ　（Ｉｎｔｃｒｓｃｉｅｎ
ｃｅ）、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　Ｖｏｌｌ、　１９７３；
　ＶＯｌ、　Ｉｆ　、　１９７５参照１゜好ましくはカ
ルベンはアリールノアノリン（例Δｒ　ｙ　ｌ　−Ｃｌ
ｌＮ２）　、またはフッ素化ノアゾ化合物（例　■えＣ
（０）（ＣＦｆｆｉ）−Ｎ　　＝Ｎ　　）から製造され
る。これらの前駆体は暗所で安定であり転位に対し感知
しにくいから好ましい。

第二二の具体化では、Ｉ）　Ｉ”　＊はニトロンである
。

ニトロンは、アジド中に見られる。Ｊ：うに窒素−窒素
結合の光分解によって作られる。好ましくはアリールニ
トレンはアリールアジドの光活性化によって発生する。

アリールアジドはアシル−スルボニル−９またはホスホ
リルアジドより化学反応性は小であって、容易に調製で
きる３、アリールニトレンは反応性の高い、電荷されて
いない電子欠損スピーシーズである。ニトロンに起こる
反応はカルベンによって経験するものと広範囲に亙って
同様であるが、ニトロンの反応性はかなり低く従ってよ
り選択性が高い。例えば、ニトロンはいくらか求電子性
であって、Ｃ−１１結合より０−１１結合を選択する。

ニトロンの可能性ある最終結果は、二重結合への付加を
含み、ヘテ［１環式リング、求核アタック、水素の抜出
、Ｃ−Ｈ結合中への挿入をもたらす。

ニトロンが結合場所その場で発生するならば、直接的挿
入、抜出・カップリングあるいは付加反応は標識のその
位置への共有付加をもたらす。

１ＮｉＬｒＯｎｃｓｌ　（Ｗ、　１．ｗｏｗｓｋｉ、　
ｃｄ、、　Ｗｉｌｅｙ　Ｉｎｔｅｒｓｃｉｃｎｃ（！、
　Ｎ（！Ｗ　Ｙｏｒｋ、　１９７０；　Ｔ、１．、　Ｇ
１１ｃｂｒｉｓＬ　ａｎｄ　ＣＬ　　ＲＯ（！Ｓ、ｆｃ
ａｒｂｅｎＯｓ、Ｎ１Ｌｒａｒ＋ｅｓ　　ａｎｄ　　Ａ
ｒｙｎｃｓｊ　　Ｎｃｌｓｏｎ、　１．ｏｎｄｏｎ、　
１９６９参照。

第三の具体化では、Ｐ　Ｆ　＊はフリーラジカルである
。前駆体は好ましくはα、β−不飽和ケトンがよい。フ
リーラジカルは炭素−水素結合への指向性ある有効な水
素抜出体である。フリーラジカルは媒体中にあってより
少なく水分子に反応し易Ｌ）。

■〕Ｆ＊は好ましくはプＪルベン、ニトロンまたはフリ
ーラジカルであるが、生体分子、特にアミノ酸もしくは
糖単位を含有するもの、と反応する別の光発生した反応
性の高いスピーシーズであってもよい。ｌ）　ｌ”　＊
がソステイン、リシン、ヂ［７ンンおよびトリプトファ
ン アミノ酸または化学的部分とも反応するものであること
が好ましい。

ＰＦ＊の反応性は、場合によっては改良さ１１得る。か
くして二１・口基のような電子求引性置換基はアリール
ニトレンの反応性を向上する。置換基の電子求引力は、
その誘起置換基定数によって示される。ニトロ基の値は
０．７８である。参照：例えばＦｕｓｏｎ、　Ｒｅａｃ
ｔｉｏｎｓ　ｏｆ　（ｌｒｇａｎｉｃ　Ｃｏｍｐｏｕｎ
ｄｓｌｌ−１２（１９６２） ＢＦＣＡのその他の性質もまた修正され得る。

ニトロ置換基はアリールアンドの紫外線吸引スペクトル
を長い波長に移動させるのに用いらイ１てもよい。トリ
フルオロステル機能基はジアゾアセデル基を安定させる
のに用いられてもよい。親水置換基が、水媒体中のＢ　
Ｆ　Ｃへの溶解度を改良するために用いられてもよい。

［実施例１．１ｐ−アジジベンジル　エヂレン　ジアミ
ン　テトラ　酢酸（Ａ　ｙ、　ＢＥ　Ｉ）　’Ｉ″Ａ）
の合成この化合物は、ＩＣＩ）　’１１’Δ誘導体の合
成中に経験した我々の体験、即ぢ光活性化官能性として
のアリールアジドの利点と共に金属イオンＥ　Ｄ　’Ｉ
’Δ錯体の生体外および生体内での使用における例外的
安定性という我々の体験、に基づき光活性ＢＦＣＡ（Ｐ
Ｉ”−ＢＦｃΔ）のこのクラスの最適例として選択され
た。全ての合成は試薬級の薬品と二重に蒸留された脱イ
オン水を用いて達成された。

ＩＱ　料前駆体ｐ−アミノベンジルーエチレンジアミン
アトラ酢酸１がＹｃｂ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ａｎａｌ、
　Ｂｉｏｃｈｅｍ。

、１００・１５２　（１９７９）に記述されているよう
に合成された。この材料が酸性並硝酸ナトリウ１４を用
いてジアゾニラ１１中間体２へ転換された。０℃で１２
゜２　　Ｍ　　ｌｌＣｌの２５０ｕｌ中に１をかきまぜ
た懸濁液（］　９．３６ｍｇ、　０．０４８ｍｍｏｌ）
に０．５Ｍ　　ＮａＮ０２（０，０６２５ｍｍｏｌ）の
＋２５ｕｌを加え、その混合物が１時間かきまぜられた
。このとき余分な１ｌｌｉ硝酸は５ｍｇの尿素を添加し
継続的に２０分間余分にかきまぜることによって破壊さ
れた。生成物は、一部をレゾルシノールと反応させ着色
複合体を生成させ、これを分光光度的に３８５ｎｍでモ
ニターてきるごとによって分析された。

２１５００　　Ｍ−’ｃｍ−’という吸光係数を用いて
、総括ジアゾニウム収率は〜７５％と評価された。

この中間体は、ナトリウノ、アジドと処理するごとによ
ってアジゾ類縁体３に転換された。２の相溶液に水中２
．８６　　Ｍ　　ＮａＮ：＋（６，５ｍｇ、０．１ｉｍ
ｏｌ）の３５ｕ１が０℃において１時間激しくかきまぜ
ながら添加された。ごの酸性溶液はＮ　ａ　Ｏ１１で注
意深く中和され、凍結乾燥によりナトリウム塩として濃
縮された。生成粉末が水に溶解され０．８ＸＩ５ｃｍＦ
−２バイオゲル（Ｈｉ　ｏ　−Ｒａ　（＋　）カラムに
充填された。フラクションは水を使って溶出され、ＴＣ
Ｌ（Ｒｆ　　Ｏ，７５，アセトニトリル７：３の水中に
展開されたセルロース台板）を用いて最終的化合物のた
め分析が行われた。適当なフラクションがプールされ、
凍結乾燥され〜７０％の総括収率を得た。精製された化
合物は、第４図および第５図に各々示されるようにＩ　
ｎおよびＮＭＲによって分析された。その結果のスペク
トルはｐ−アジドベンジルエヂレンノアミンテトう酢酸
の次に示す特徴付けをもたらした。即ち、ＩＲ（ＫＢｒ
）：３３８６　ｃｍ−’（−０１１）；　２＋２２　ｃ
ｍ−’（−Ｎ！ｌ）’ＩｂＮＭＲ（：（００ＭＨｚ、Ｄ
、０．ｐｔｌ−１２）：　　７０４０　　（ｄ、２Ｈ１
Ｊ９１１ｚ）；　６．８８０　（ｄ、　２１１．　Ｊ−
９１１ｚ）：　３．２４０　（ｄ、　Ｉｔｌ、　Ｊ１６
１１ｚ）；　　３．０９０　　（ｍ、　　ＩＨ）；　　
２．９０５　　（ｄ、　　ｉｌｌ、　　Ｊ＝１６Ｈｚ）
；　　２．７６：（（ｄ、　　ｉｌｌ、Ｊ−１６１１ｚ
）；　　２．６９２　　（ｄ、　　Ｉｌｌ、　　Ｊ＝１
６１１Ｚ）；　　２．ｆｉ８：（（ｄ、　　１１Ｉ、Ｊ
＝１６１１２）：　　２．６２５　（ｄ、　　１１Ｉ、
　　Ｊ＝１６１１ｚ）；　　２．４４３　　（ｄ、　　
１１Ｉ、　　Ｊ１６１１ｚ）＋　　２．３１２　　（ｔ
、　　２ｔｌ、　　Ｊ１４１１ｚ）；　　２．２７］　
　（ｄ、　　１１ｌ、　　Ｊ＝１６１１ｚ）；　　２．
１９４　　（（１，１■。

Ｊ＝１２１１ｚ）：　２．１５６　（ｄ、　ＩＨ，Ｊ＝
１２１１ｚ）表題の化合物は少なくとも４週間、４℃の
暗所で安定であった。

［実施例２　：　Ａ　ｚ　ｒ３ＥＩ）ＴＡによる放射性
同位体のキレーンヨン］ 放射免疫映像研究に現在用いられている最も有益な放射
性金属イオンの一つけインジウム−１１１（Ｉ　ｎ−１
１１）であるため、それらを現在の方法に関係づけるよ
う結合研究のためにこのトレーサーが選択された。結合
体の程度を査定するため、簡単なアッセイ方法を標県的
放射性同位体トレーサ一方法論と組合せた１゜ ΔＺ　ＢＥ　Ｉ）　’Ｉ’　ＡによるＩｎ−１１Ｉのギ
１ノーノヨンは、０．０５　　Ｎ　　１１ＣＩ　　（Ａ
ｔｏｍｉｃ　ｌｉ旧！ｒｇｙ　ｏｆＣａｎａｄａ　１．
Ｌ（１，）中のＩｎ−１１Ｉの放射化学級（ギヤリアの
添加なしに）の溶液（１０１００ｕｌ）を０．１　　Ｍ
　　＜えん酸塩中のハｙ、　Ｉ−（Ｅ　Ｄ　ｉ”Δ（０
゜０５　ｍｍｏｌ　）の溶液（２０−２００ｕｌ）に加
え、さらに室温で３０分間反応させるごとに３１；り達
成された。ΔＺ　Ｂ　Ｅ　Ｄ　ＴＡ−Ｉｎ−１１Ｉの定
量的＝１ンバージョンが、フリーなＩｎ−１１Ｉか原点
に残留しキＩノートがＲｆＯ，７を伴って移動するＴ　
ＣＬ分析（アセトニトリル、水　７：３、セル［７−ス
）に示されるように起こる。

「実施例３　］　１　ｎ−１１Ｉ−Ａ　ｚ　１３　Ｅ　
Ｄ　’Ｉ’Δの光分解および蛋白質への結合 光分解の装置と手順 放射標識材されたΔｙ、　Ｂ’ｈ：　Ｄ　’Ｉ’Δ（Δ
ｙ、　１１　Ｅ　ＤＴＡ−Ｉｎ−１１１）が、光ｌ古性
化グループを介し様々な状態下において牛の血清アルラ
ミン（ＢＳＡ）に結合する度合を決定するため使用され
た。

１（ＳΔは蛋白質性材料を要求する多数の手順によく（
重用されるラボ゛ラドリスタンダートである。いくつか
の緩衝液中の様々な濃度の両反応体の保存溶液がｆω１
１されＪ１ｑ射の直前に所与の量が混合され〕ご、。

光分解装置は、氷水が急速に循環しているＩｃｍの経路
長さの石英のシャケ、Ｉト付きセル中のハノリア［Ｈａ
ｎｏｒｉａＪ紫外線ランプ（２５４ｎｍ）である。

多数のサンプルは、所１ノの緩衝液中の放射標識材（Ｊ
されたキレートと蛋白質との適当量を石英チューブ（１
，２ｃｍＸ　７ｃｍ）中で混合し、かつ、反応体の混合
物の照射がランプ中心から］０ｃｍ離れて行われるよう
にして、それらをクランピングするごとにより、同時に
照射できる。設備全体は光分解実験が実際に仕事台」−
で安全に行えるように空洞容器中に収められる。このよ
うにして、Ａ　：ｔ　１３ＥＤ’ｌ’Ａ　−１ｎ−１１
Ｉの各段階の比がＴ３　ＳΔ（適当な緩衝液中の５％溶
液と１７で）に添加され、様々なインターバル時間（１
〜ＩＯ分間）サンプルは光分解された。

２：（ 結合程度は筒中な’Ｉ’　Ｃｒ、アッセイにより決定さ
れた。フォトライズされた反応混合物の一部はセルロー
ス台板（０，８Ｘ　Ｏ，８ｃｍ）　、Ｊ−にスポットさ
れ、０．１　　Ｎ　　ｌ−ｌＣｌ・メタノール（３・７
）中て顕色［ｄｃｖｃｌｏｐｌされた。ごのノスア１１
ては蛋白質の付いたΔｚ　ＢＥＩ）　ｉ’Δ−Ｉｎ−１
１Ｉはハ；」点に残り、ＡｚＢＥＩ）ＴＡ−Ｉ　ｎ−１
１Ｉは約（１、７（１）ｎｆで移動する。両スピーソー
ズと６放射性同位体を有しているので、各フラクション
中のパーセンテージはｉ’　ＣＬ台板の各部からの放射
能を測定することから計算された。それから蛋白質分子
内たりの結合キレート数が反応物の当初のモル比で決定
される３゜ 新規のＩ）　Ｆ　−１１　ＦＣΔのパフォーマンスに影
響する要因が、一連の簡単な実験で求められた。表１に
示されろように反応に対する蛋白質濃度には殆ど影響が
ないようであった。反応容ｔｉ１如何は、表２に示され
るように重要と思われ、光の移動方式における何らかの
局面につき示唆しているように考えられる。蛋白質に対
する（ｙド−Ｂ　Ｆ　ＣＡの濃度が増加するとき、−層
効果的なプロセスであるように考えられる（表３）。キ
レート結合の実際数は反応収率と当初比との関数であり
、したがってｌ　１０反応の１８％は、蛋白質分子内た
り８０ギレートをノｊえるＩ：１００の８０％に対比し
、蛋白質分子内たり約２のキレート結合をもたらず、と
記憶されなければならない。表４に示されたように、照
射時間は結合と明確に積極的な相関関係かある３、予期
されたＪ、うに、光活性化の程度は、システムにインプ
ットされた全紫外線および可視光線エネルギーに関係す
る。結合は、反応が行われろ水媒体のｐ　１１にも影響
され得る。塩基性溶液１１では反応は定Ｉｉｔ的である
（表５）、、これはアルカリ状態によって促進される水
素原子の抜出というアリールニトレンの性向によって説
明できるであろう。

ごれらの研究は、容易に決められる条件下で１１Ｉ　ｎ
−Δｚ　ｆ（Ｅ　Ｉ）　’Ｉ’ΔとＢ　ＳΔ間の反応は
蛋白質に対するキレートの定量的結合を生ずることがで
きろごとを明らかにするものである。このことを証明す
るため、Ｂ　ＳＡが同一の条件下に非放射性Ａ　ｚ　１
３　Ｅ　Ｉ）　’Ｉ’　Ａと結合され、そして光分解後
’Ｉｎのくえん酸塩が加えられた。この溶液の分析は、
ＢＦＣＡを用いた金属イオンの付加のため第２番目のプ
ロトコル（即ぢ、蛋白質の存在下で光活性化ＲＩ；’　
ＣＡ　（Ｐ　Ｆ　−１３Ｆ　ＣΔ）の光分解を用いた蛋
白質のブリ・キレーンヨンを行い、次にその精製された
蛋白質に金属イオンを添加すること）を経由して蛋白質
へのＩ　Ｉ　１１　ｎの結合を明らかにし、そしてＡ　
ｙ、　ＢＥ　Ｉ）　’Ｉ’　Ａで処理されたＲ　ＳＡ　
ｌｔにキレート化グループの存在を証明した。

イまた。表６に示されるように、ＭＡｂ−１５５単独ま
たはキレートが存在する場合に比較し、光分解５分後の
ＭＡｂ−１５５の相対的な抗原結合率には明瞭な変化が
見られない。したがって免疫機能を決定することによっ
て、ＭＡｂ−１５５はプロセスに影響されずに抗原材料
に対する自らの反応性を保持する。

（以下　余白） ［実施例４］モノクロ一ナル抗体の光分解キレートの光
活性化の反応条件は生体分子の生物的パフォーマンスに
影響しないことを明らかにするため、我々は光分解装置
中にモノク［１−ナル抗体（ＭＡｂ−１５５）を使用し
、操作手順の後その相対的な免疫反応性を測定した。固
定化した抗原に対するＭＡｂ−１５５の種々の濃度での
結合効率を測定するため、Ｅ　Ｌ　Ｉ　Ｓ　Ａ技術が使
用さパラメーター 蛋白質：　Ｐｈ−ＢＦＣＡ 蛋白質濃度 緩衝液（ｐＨ） 全反応容量 光分解時間 パラメーター 蛋白質：　Ｐｈ−ＢＦＣＡ 蛋白質濃度 緩衝液（ｐＨ） 全反応容量 光分解時間 パラメーター 蛋白質：　Ｐｈ−ＢＦＣＡ 蛋白質濃度 緩衝液（ｐｌｙ） 全反応容量 光分解時間 蛋白質ごΣの一結合％ １　：　Ｉ　０ ２ｍｇ／ｍ１ ５ｍｇ／ｍｌ ］Ｏｍｇ／ｍｌ Ｏ，１Ｍクエン酸塩（６，１） ０．２ｍ１ ５．０分間 表２ 値　　　進頂−■）り庫論多− １：　　１００ ５ｍｇ／ｍｌ （］　、　Ｉ　Ｍクエン酸塩（６，１）０．２ｍｌ　　
　　　　　　　　　８００．５ｍｌ　　　　　　　　　
　　２４５．０分間 表３ ｆ（ １：１ １：１０ １　：　１００ ５ｍｇ／ｍｌ Ｏ，１Ｍクエン酸塩（６，１） ０．２ｍ１ ５．０分間 パラメーター 蛋白質：　Ｐｈ−ＢＦＣＡ 蛋白質濃度 緩衝液（ｐｉｆ） 全反応容量 光分解時間 パラメーター 蛋白質：　Ｐｈ−ＢＦＣＡ 蛋白質濃度 緩衝液（ｐＨ） 全反応容量 光分解時間 表４ 値　　　　　欺α■さの綾部 １：１０ １０ｍｇ／ｍｌ Ｏ，１Ｍクエン酸塩（６，１） ０．２ｍ１ １０分間　　　　　　　　４ ３０分間　　　　　　　　７ ５．０分間　　　　　　　１５ １００分間　　　　　　　１００ 表５ 飲　　　　捩ａ罠さｑ級代災 ｌ：１０ １０ｍｇ／ｍ１ ２．０Ｍ燐酸塩（１，５）　　７ ０．１Ｍクエン酸塩（６，１）　　　１５０２Ｍ燐酸塩
（６，２）　　１７ ０５Ｍ燐酸塩（７，８）　　９９ ０５Ｍ燐酸塩（９，０）　　９９ ０．２ｍ１ ５．０分間 表６ ＭＡｂ−１５５μｇ／ウェル　　　　　光学的濃度イｌ
１１１（標準化ＥＬＩＳＡにおいて） ＭＡｂ−１５５ＭＡｂ−１５５ＭＡｂ−１５５＋Ｉ００
：Ｉ　ＡｚＨＥｌ）ＴＡ　　４１００：Ｉ　Ａｚｌｌｌ
ｉＤＴＡ−）５分間の光分解 １０　　　　０．８１±０．０１　０．７８士０．０４
　　　０．８２±００８３　　　　０．８２±０．０５
　０．７９±０．０７　　　０．８５±０１０１　　　
　０、７８±０．０４　０．７４±０．０３　　　０．
８３±００７０．０１　　　０．５３±０．０６　０．
４７土０．０２　　　０．６８＋−０，８９０，０＋　
　　　０．１２±０．０１　　０．１２±０．０２　　
　０．２２±００５Ｘ±ｓ、ｄ、；　ｎ−３

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. （１）キレート化グループ、および炭素−水素、窒素−
   水素、または酸素−水素結合との反応を光活性化によっ
   て可能とする光活性化可能なグループを持つ化合物を含
   む組成物。
2. （２）光活性化可能なグループがカルベンになるように
   光活性化し得る請求項１に記載の組成物。
3. （３）光活性化可能なグループがニトレンになるように
   光活性化し得る請求項１に記載の組成物。
4. （４）光活性化可能なグループがフリーラジカルになる
   ように光活性化し得る請求項１に記載の組成物。
5. （５）光活性化可能なグループがアリールアジドである
   請求項３に記載の組成物。
6. （６）光活性化可能なグループがアリールジアザリンで
   ある請求項２に記載の組成物。
7. （７）光活性化可能なグループがフルオルアルキルジア
   ゾアセチル　グループである請求項２に記載の組成物。
8. （８）生体分子の存在下に請求項１の化合物を光活性化
   することにより、光活性化されたグループが前記生体分
   子をカップルする工程（ａ）、およびキレート化条件下
   に前記化合物とキレート化可能なイオンとをインキュベ
   ートする工程（ｂ）とをその順序を問わず含むキレート
   化可能なイオンを生体分子と結合する方法。
9. （９）工程（ａ）が工程（ｂ）に先行、または同時に行
   われる請求項８に記載の方法。
10. （１０）工程（ｂ）が工程（ａ）に後続する請求項８に
    記載の方法。
11. （１１）光活性化可能なグループが、光活性化されてカ
    ルベンになる請求項８に記載の方法。
12. （１２）光活性化可能なグループが光活性化されてニト
    レンになる請求項８に記載の方法。
13. （１３）光活性化可能なグループが光活性化されてフリ
    ーラジカルになる請求項８に記載の方法。
14. （１４）光活性化可能なグループがアリールアジドであ
    る請求項１２に記載の方法。
15. （１５）光活性化可能なグループがアリールジアザリン
    である請求項１１に記載の方法。
16. （１６）光活性化可能なグループがフルオルアルキルジ
    アゾアセチル　グループである請求項１１に記載の方法
    。
17. （１７）キレート化可能なイオンがキレート化グループ
    によってキレート化された請求項１に記載の組成物。
18. （１８）少なくともシスチン、リシン、チロシンまたは
    トリプトファン以外の少なくとも１個のアミノ酸がキレ
    ート化グループで置換されているポリ（アミノ）酸化合
    物。
19. （１９）生体分子が抗体である請求項８に記載の方法。
20. （２０）化合物が抗体である請求項１８に記載の化合物
    。