JPH07504661A - 放射免疫イメージング及び放射免疫療法に関するビオチン及びデフェロキサミンのコンジュゲート - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 放射免疫イメージング及び放射免疫療法に関するビオチン及びデフエロキサミン のコンジュゲート 技術分野 本発明は、放射ラベリングに適しさらに２段階放射免疫イメージング及び放射免 疫療法に有用なビオチン誘導体を提供する。特に、本発明は、生体内で安定なし かも放射ラベリングに適したビオチン及びデフエロキサミン（ｄｅｆｅｒｏｘａ ｍｉｎｅ）の共有コンジュゲートに関する。

背景技術 ２段階アプローチにおいて、放射ラベルしたビオチン誘導体は、目標物結合スト レブタビジン又はアビジン共役抗体又は他の細胞ターゲテイング剤にイメージン グ及び療法に適した放射性核種を伝達するのに使用される。放射イメージング及 び放射療法は、放射活性、常磁性又は細胞毒性剤に関する伝達系として細胞又は 組織特異性ターゲテインク剤を利用する。関心のある損傷又は部位に特異的な全 ての削は、潜在的にターゲティング剤として動り１例えば、成る細胞又は組織の タイプにかなりな特異性を示すポリクローナル及びモノクローナル抗体が生成で きる。トキシン例えばジフテリアトキシンを含む多（の他の剤は、細胞特異性を 示し、そして診断又は治療の剤を伝達するのに使用される。モノクローナル抗体 （ＭＡｂｓ）の伝達の手法は、癌の療法、並びに癌、血栓塞栓症及び心筋疾患の 診断について検討された。成功した放射免疫イメージングでは、十分なラベルし たＭＡｂは、検出のための十分な信号を提供するために目標部位で局在化しなけ ればならない、目標対パックグラウンドの比は、目ｔｌ物に結合した放射活性と 他の器官２組織及び血液のパックグラウンドレベルとの間の適切な対照を達成す るために、高くなければならない、成功する放射免疫イメージングに対する主な 障害は、Ａｂｓに対する通常な代謝部位である肝臓及び牌臓における長期の循環 及び蓄積により、自由に循環する放射ラベルしたＭＡｂｓの高いパックグラウン ド活性である。その上、高い放射量の毒性の効果は、放射免疫療法及び放射免疫 イメージングの両方に考えるべきである。この障害は、又モノクローナル抗体以 外のターゲティング剤を利用する方法に関する考慮である。　。

この障害を克服するために、　１予備ターゲテイングＪ又は「２段階」アプロー チが、検討された。従来の１段階方法では、放射性核種は、直接又は二官能性キ レート剤を経てＭＡｂに結合される。２段階アプローチでは、抗体はラベルされ でいない、未ラベル抗体は投与され、そして目標部位に局在化していない抗体は 、放射活性の投与前に循環から取り去られる。放射活性は１次に抗体に間する高 い親和性を有する化学的な形で投与される。

抗体に対する高い親和性を有する形の診断又はイメージング剤を提供するために 、２段階方法が、ビオチンに関するアビジン（ａｖｉｄｉｎｅ）及びストレプト アビジンの高い親和性を利用するために、デザインされた。卵白に見出される６ ７キロダルトン（ｋＤ）の糖蛋白であるアビジンは、ビオチンに対して例外的に 高い結合親和性（Ｋ　＝１０　”）を有する。アビジンは、４個のサブユニット よりなり、それぞれ一つのビオチン分子を結合できる。Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ ｓ　ａｖｉｄｉｎｉで生成される同様な蛋白であるストレプトアビジンは。

ビオチンに間する高い親和性及び安定性、並びにアビジンと顕著に構造及びアミ ノ酸組成が等しい、しかし、ストレプトアビジンはグリコシレートされず１組織 に対する非特異的結合をより示さないとされる。ストレプトアビジンは、その低 い非特異的結合のためにアビジンの代りに広く使用される。Ｂ複合ビタミンの一 員であるビオチンは、アミノ酸及び奇数の鎖の脂肪酸の分解、糖新生及び脂肪酸 合成に必須であり、そして通常ビオシチンとして酵素結合の形で見出される。

放射免疫イメージング及び放射免疫療法に関する２段階アビジンービオチン又は ストレプトアビジン−ビオチンアプローチの使用は、　ＦＪＩｔ＆的に興味があ る。それは、１）ビオチン及びアビジンがこれらの応用に要求されるレベルで無 毒のようであり、２）アビジン及びビオチンの高い親和性は、アビジン−ビオチ ン結合の生体内安定性を生じ、３）腎臓によるビオチンの早いクリアランスは、 放射しベルしたＭＡｂｓの使用に伴う問題を避け、そして４）ビオチンに対する アビジン及びストレプトアビジンの四原子価は、目標部位における信号の拡大を するからである。

２段階アビジン−ビオチン又はストレプトアビジン−ビオチンのアプローチでは 、抗体は、ビオチン又はアビジンの何れかとカップリングし、対象物に投与され １次にそれぞれ放射ラベルされたアビジン又はビオチンを投与する。動物の非腫 瘍モデルを使用して、Ｈｎａｔｏｗｉｃｈら［（１９８７）Ｊ、Ｎｔｔｃｌ、Ｍ ｅｄ、２８．１２９４］は、マウスへのアビジン共役抗体の投与１次に１１１１ ｎ−ラベルビオチンの投与を示した。イメージングは、他の器官に対する目標器 官の放射活性の比を決定するために行われた。！！瘍をシュミレートするために プロティンＡ共役ビーズを使用して、Ｈｎａｔｏｗｉｃｈらは、それ故、従来の １段階アプローチに対する改良した目ｅＩｌｆｌｌ対非目ｔ！１ｉｔｂ比を有し て、目標物へのラベルの局在化を示した。同様な研究で、Ｐａｇａｎｅｌ　ｌ　 ｉら［（１９８８）Ｉｎｔ、Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ２．１２１１は、　■−及び１ｌ ｌＩｎ−ラベルアビジンによるビオチン化抗体の生体内ラベリングを示した。

Ｋａｌｏｆｏｎｏｓら（（１９９０）Ｊ、Ｎｕｃｌ、Ｍｅｄ、３１．１７９１１ は、肺の扁平上皮癌の患者がストレプトアビジン共役モノクローナル抗体次に１ １Ｉ、ｎ−ラベルビオチンを受けた制限された臨床実験の予備的結果を報告して いる。１０人の患者の内８人において、腫瘍は、恐らく腫瘍中のラベルしたビオ チンの局在化により、ストレプトアビジン共役抗体の以前の投与なしに、ラベル されたビオチン単独により検出された。これらの患者の３人では、イメージは。

抗体の先の投与により改良された。ターゲテインクが全ての患者では改良されな かったという事実は、抗体の急速な内在化によるのではなく、腫瘍細胞によるビ オチンの取り込みの結果であると予想された。

２段階アプローチ（ビオチン化ＭＡｂ次にｌｌｌＩｎ−ラベルストレプトアビジ ン）及び３段階アプローチ（ビオチン化ＭＡｂ次に冷アビジン次にＩＩＩＩ！］ −ラベルビオチン、）もＰａｇａｎｅｌ　ｌ　ｉら［（１９９０）Ｊ、Ｎｕｃｌ 、Ｍｅｄ、３１．７３５］により報告された。

上記の研究では、ビオチン、アビジン及びストレプトアビジンは、それぞれＨｎ 　ａ　ｔ　ｏ　ｗ　ｉ　ｃ　ｂら［（１９８２）Ｉｎｔ、Ｊ、Ａｐｐｌ、Ｒａｄ ｉａｔ、Ｉｓｇｔｏｐ、３３．３２７１の二環無水物法により、二官能性キレー ト剤ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）を経て１１１！ｎによりラベ ルされた。

二官能性キレート剤は、蛋白又は抗体へ結合するばかりでなく、金属イオンへ結 合する能力を有する試薬である５放射ラベルビオチンへのキレート剤の使用は。

直接ラベリングより有利である。それは、得られたコンプレックスがより安定な ようであり、生物学的活性を維持するようだからである。しかし５ビオチンをラ ベルするためのキレート剤としてのＤＴＰＡの使用は、２段階放射免疫イメージ ング及び放射免疫療法の開発に顕著な制限をもたらす、ＤＴＰＡ−ビオチンは。

２個のビオチン分子（ビオチン−ＤＴＰＡ−ビオチン）を含む二量体である。ア ビジンのそれぞれの分子が４個のビオチン分子を結合するので、最大２モルのＤ ＴＰＡ−ビオチンがアビジン又はアビジン共役抗体１モル当り結合し、従って目 標部位に伝達できる放射活性の量を制限する。

ラベリング試薬としてのＤＴＰＡ−ビオチンの他の不利は、ＤＴＰＡ及びビオチ ンの兵役化の結果である。ＤＴＰＡ−ビオチンは、ＤＴＰＡ及びビオシチンの環 状無水物、兵役化のための利用できる第一級アミンとビオチンとのリジンコンジ ュゲート（Ｈｎａｔｏｗｉｃｈ、１９８７）の使用によるビオチンへのＤＴＰＡ の共有結合化により製造される。ＤＴＰＡは、キレート剤のアミノカルボン酸群 の一員であり、金属イオンに結合するための３個の第三級アミノ基及び５個の脱 プロトン化カルボキシレート基を有する。５個のＣ０〇−基の二つは、ビオシチ ンへの兵役化に使用されるので、ＤＴＰＡは、オクタデンテートよりむしろヘキ サデンテートを提供し、熱力学的安定性を減少させ、そしてその結果ラベル不安 定性を減少させる。Ｍａｅｃｋｅら［（１９８９）Ｊ−Ｎｕｃｌ、Ｍｅｄ、３Ｏ １１２３５］は、　Ｉｎ−ＤＴＰＡのオクタデンテートのりガントが生体内の応 用においてより小さいデンチシティーを有するリガンドより優れていることを示 した。

キレート剤としてのＤＴＰＡの他の不利は、生体内で見出される二価の陽イオン 特にＭｇ　及びＣａ＋２（それぞれ９及び１１の安定性常数）に対するその＋２ 親和性である。二価陽イオンに関するＤＴＰＡの親和性は、生体内の応用におけ る二価金属による放射金属の交換を行う０例えば、Ｉｎ及びＹは、生体内で１日 当り約ｌＯ％の率でＤＴＰＡ−ＭＡｂｓから放出され［Ｈｎａｔｏｗｉｃｈら。

（１９８５）Ｊ、Ｎｕｃ　１．Ｍｅｄ、２６．５０３］　、そして非常に高い濃 度で存在するＭｇ＋２及びＣａ＋２により置換されるだろう、目標部位に伝達さ れる放射金属の量を減少させることに加えて、他の問題は、放射金属を二価陽イ オンで置換することにより生ずる。成る放出された放射金属は、ヒト血漿金属結 合蛋白であるトランスフェリンにより結合するようになる１例えば、Ｆｅ及びＣ ａに対するトランスフェリンの親和性は、これらの金属に対するＤＴＰＡの親和 性より高く、従ってＤＴＰＡからトランスフェリンへのＦｅ及びＣ’ａの溶脱を 促進する。この溶脱の結果は、特に放射の撰１基を受けやすい組織である肝臓及 び骨髄への放射金属−トランスフェリン複合体の生じうる金属イオン封鎖である 。

二価陽イオンへのＤＴＰＡの親和性の他の結果は、放射性核種溶液中のこれらの 競合する不純物の存在によるラベリング効率の低下である。

ＤＴＰＡのなお他の不利は、金属イオンに対するＤＴＰＡの親和性がｐＨ依存性 であるために生ずる。脱プロトン化の形がキレート部分であるので、金属結合親 和性は、腫瘍及び膿瘍に存在する条件である低いｐＨで低下する。Ｂｒｅｃｈｂ ｌｅｌら、Ｈ９８６）Ｉｎｏｒｇａｎ、Ｃｈｅｍ、２５，２７７２］及びＭｅａ ｒｅｓ　［（１９８６）Ｎｕｃｌ、Ｍｅｄ、Ｂｉｏｌ、＋３．３！ｌ】は、Ｃｕ 、Ｉｎ又はＹによるＤＴＰＡの陰イオン複合体は、酸又は陽イオン触媒化解離を 受けやすく、そして遊離の金属イオンが生体内に早く放出し、肝臓、骨及び骨髄 に蓄積する傾向がある。

従って１診断及び療法に好適な放射性核種によりラベルできるより良いビオチン コンジュゲートに対する要請が存在する０本発明は、従来の技術の化合物の欠点 を克服するデフェロキサミン及びビオチンのコンジュゲートを提供する。

デフエロキサミン（ＤＦＯ）は、遷移金属に対して非常に高い親和性を有する三 価の金属キレート剤である］例えば、鉄（Ｉ　Ｉ　＋）に関してＫ　＝ｌＯ−３ ０Ｍｌｌ、それは、３個のヒドロキサム基を含み、そしてトリポジティブ金属イ オンと化学量論的に反応して八面体複合体を形成する。デフェロキサミンメシレ ートは、市販されており、鉄の毒性、鉄の貯蔵疾患及び鉄及びアルミニウムの過 負荷の短期間の治療のための安全な薬剤として立証されている。他の金属に対す るその高い親和性のために、ＤＦＯは、放射活性金属例えば９９ｍ７Ｃ，ｌ　ｌ 　１６７　９０　１８４　１８６　２１２Ｂｉ、又は常磁性イＩｎ、　Ｇａ、　 Ｙ、　Ｒｅ、　Ｒｅ。

オン例えばＦｅ及びＧｄに結合するとき、核医薬及び核磁気共鳴イメージングを 含む放射線医学の成るモダリティ−に潜在的に有用である。ＤＦＯは、安定な金 属キレートを形成し、そして蛋白とカップリングに利用できる反応性アミノ基を 有する。

ＤＦＯは、コンパクト構造の未電荷キレートを形成し、従ってそれが共役してい る蛋白の生物学的性質に対するその作用を最小にする。ＤＦＯは、６７Ｇａラベ ルヒト血清アルブミンｊＹ　ｏ　ｋ　ｏ　ｙ　ａ　ｍ　ａら、（１９８１）Ｊ、 Ｎｕｃｌ、Ｍｅｄ、２３．９０９］モして６７Ｇａラベルフイブリノーゲン［Ｏ ｈｍｏｍｏら、（１９８２）Ｅｕｒ、Ｊ、Ｎｕｃｌ、Ｍｅｄ、７．４５８１を製 造するのに使用されている。Ｔａｋａｈ　ａｓｈ　ｉら［（１９８５）Ｖｉｅｎ ａ　ＩＡＥＡ４７１］は、６７Ｃａ−フィブリノーゲン−（ＤＡＳ−ＤＦＯ）コ ンジュゲートを提供するために、官能性重合体、ジアルデヒド澱粉（ＤＡ、Ｓ） を経てＤＦＯをフィブリノーゲンにカップリングすることにより６７Ｇａラベル フイブリノーゲンの特異的活性を増大する方法を提供している。Ｙａｍａｍｏ　 ｔ　ｏら［（１９８８）Ｅｕｒ、Ｊ、Ｎｕｃｌ、Ｍｅｄ、１４．６０１は、静脈 血栓のイメージングのために６７Ｇａ−フィブリノーゲン−（ＤＡＳ−ＤＦＯ） を評価した。５ｕｎｄｏｒ。

の米国特許第４６８０３３８号は、アミンリガンドの橋かけを最小にするための 二官能性逐次リンカ−及びその使用を開示し、ＤＦＯ−抗体コンジュゲートの製 造におけるその使用を考慮している。Ｋｕｂｏｄｅｒａら（米国特許第４８８８ １６３号）及びＹａｚａｋｉら（米国特許第４９４３４２７号）は、又放射ラベ ルしたＤＦＯ−抗体コンジュゲートの製造をしようとしている。

ＤＦＯは、２段階放射免疫イメージング及び放射免疫療法のための二官能性キレ ート剤としてＤＴＰＡより顕著な利点を提供する。ＤＦＯは、蛋白とのカップリ ング反応に利用される１個の第一級アミンを有し、従ってＤＦＯ−ビオチンコン ジュゲートは、単量体即ちビオチン１分子当り１分子のＤＦＯであると予想され るだろう、従って、ＤＦＯ−ビオチンコンジュゲートは、ＤＴＰＡ−ビオチンの 二量体に対してビオチン１分子当りの金属のモル量の２倍を伝達する可能性を有 する．その上，ビオチンの共没化に利用できるアミン基は，キレート化に含まれ る最も近いヒトロキサム基から５個の炭素原子により離れている．従って，ＤＴ ＰＡ−ビオチンと対照的に．ＤＦＯに対するビオチンの共役化は、金属イオンに 対するＤＦＯの親和性にかなり影響を与えてはならない．二官能性キレート剤と してのＤＦＯの他の利点は，二価金属に対するその低い親和性である．ＤＦＯに よるＭｇ＋２及びＣａ＋２の安定性常数は，それぞれ３及び４である．従って， 体液及びパッファーにおいて高い濃度で存在するＭｇ＋２及びＣａ＋２による放 射金属の交換は最小である．Ｗｅｉｎｅｒら［（１９７９）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎ ｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｓｅｃｏｎｄ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｓｙｎｐｏ ｓｉｕｍ　ｏｎ　Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔ　ｔｅａｌｓ、３３ｌ】は、 ６７Ｃ；ａ−トランスフエリン複合体より遥かに強いことを立証した．これは、 トランスフエリンへの或る金属の溶脱が排除されている点で，ＤＦＯの他の利点 を提供する．ＤＦＯはイオン化可能な基を有しないので、金属に対するその親和 性は、低いｐＨに対して説政でなく，それは．キレート剤としてＤＴＰＡより優 れた他の利，？！である． 発明の開示 従って、本発明は，放射免疫イメージング及び放射免疫療法に使用されるＤＦＯ 及びビオチンの安定なコンジュゲートを提供する．上述のように、本発明の化合 物は．ＤＴＰＡ及びビオジチンのコンジュゲ−１・である市販のビオチン誘導体 ＤＴ　Ｐ　Ａ−ビオチンの欠．ウを克服するために開発された．ビオシチンは， 食品中のビオナンの主な形であるビオチンのリジンコンジュゲートであり．ぞし て第一級アミンの入手性によりそれは容易に共没されるので、ヒオチン誘導体の 合成に有用である．ビオシチンは．ナクシンイミジル−６−（ビオチンアミド） ヘキサノエート　（ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン）と１，てそのｐＪｖｌ：ｉｉの形 で市販されている．しかし、本発明により．ＤＦＯに共有的に結合したビオシチ ンのコンジュゲート（デフエローデサミノリジルービオチン、ＤＬＢ）は、以下 に示されるように不安定であり，そしてそれ故２段階イメージング及び療法に使 用するのに不適当である，ＤＦＯ−ビオチンコンジュゲートは、ビオチン及びデ サミノリジルデフエ口キサミンに急速に分解する．解裂の部位は．ビオチニダー ゼによる分解が生ずるビオシチンにおける部位をよく真似をする．ビオチニダー ゼは，以下のようにビオチン及び遊離のリジンへのビオシチンの加水分解を触媒 化する血漿．腸及び他の組織中で高い濃度で見出される市素である．ビオチニダ ーゼも短いビオチニル蛋白を分解する．ビオチニダーゼは，一般的な蛋白分解醪 素ではなく，むしろ加水分解のための基質の特定の構造上の要件を有するするこ とが示された［Ｃｈａｕｈａｎら．　（１９８６）Ｊ．Ｂｊｏｌ．Ｃｈ　ｅｍ． 　２’６　Ｉ．　４　２６　８］　．そのため、ビオチニダーゼによる急速な分 解を受けないＤＦＯ−ビオチンコンジュゲートを提供するのが本発明の他の目的 となった． 本発明は、アビジン及びストレブトアビジンを結合できる生体内で安定な、ビオ チン及びデフエロキサミンのコンジュゲート及びその誘導体である化合物に関す る．ここで規定するように，ＤＦＯ−ビオチンコンジュゲートは，直接的又は結 合基を経て、ビオチンに共有的に結合したＤＦＯを含む化合物に関する．ここで 規定したように．ＤＦＯ−ピオチンコンジュゲートの誘導体は，コンジュゲート が金属キレート化及びアビジン結合化能力を保持するような．全ての共有又は非 共有の＃Ｉ飾を含む．好ましい態様では，化合物は、デフエロビオチン（ＤＢ） であり、それは以下の式により表さられる．他の好ましい懸様では、化合物は、 デフゴ．ロアセチＪレーシステイニノレービＪナン（ＤＡＣＢ）であり、そして 以下の式レこより表さられる．本発明の他のり挿では，化合物は，金属イオン又 （よ放射ｉ舌性金属各こよりキレート化される． 本発明は，さらに、ビオチン及びデフエロキサミンのコンジュゲートの合成、特 にデフエロビオチン及びデフエロアセチルーシステニＪレービオチンの合成の方 法を提供する．該方法は、ビオチン及びデフエロキ→ｔミンの直接又（よ間１妾 の！吉合を行うのに十分な時間及び条件下デフエロキサミン又１よその誘導イ本 とビオチン又はその誘導体とを反応させ，そして該化合物を採取することを含む ．本発明の他の態挿は、ここで提供されたビオチンーデフエロキサミンコンジュ ゲートによる放射免疫イメージング及び放射免疫療？去の方ｉ去を１是１共する ．放射免疫イメージングの方法は，目標部位に結合するの番二十分な量で宿主（ こアビジン又はストレブトアビジン共役モノクローナル抗体を投与し，久ｔこ該 モノクローナフレ抗体と複合体を形成する条件及び検出するのも二十分な投与量 で常磁性又（よ放射一性金属によりラベルした本発明のデフエロキサミンービオ チンイヒ台１勿を１又与することを含む．得られる複合体は．次に検出される． 放射免疫療法の方法は、目標部位に結合するのに十分な量で宿主にアビジン又は ストレブトアビジン共役モノクローナル抗体を投与し、次に治療投与量でそして 該モノクローナル抗体と複合体を形成する条件下で放射活性金属ｔこよりラベＪ レした本発明のデフエロキザミンービオチン化合物を投与することを含む．本発 明の他のｔ！！様は、本発明のビオチンーデブエロキサミンコンジュゲート及び 製薬上許容できる担体を含む製薬組成物を促供する．放射イメージング又は放射 療法のためのコンパートメント化キットも本発明により提供される． 図面の簡単な説明 図１は，塩水及び血漿中のインキュベーシロン後のＤＡＣＢ．ＤＢ及びＤＬＢに より生体外で保持されたアビジン結合能力の％のグラフである．図２は、血漿中 のインキュベーシジン後の放射ラベルされたＤＢ及びＤＬＢのＨ　Ｐ　Ｌ　Ｃプ ロフィルを示す．カラム溶離液中の放射活性は．溶離溶媒容量の関数としてプロ ットされる． 図３は，コンジュゲートの静脈内注射後の血漿及び尿のサンプル中ののＤＡＣＢ ．ＤＢ及びＤＬＢにより保持されるアビジン結合能力の％のグラフである．図４ は．放射ラベルされたＤＡＣＢ．ＤＢ及びＤＬＢの静脈内注射後に得られた尿サ ンプルのＨＰＬＣプロフィルを示す．図５は，アビジンに結合した６７Ｇａ−Ｄ ＬＢ及び”　１１１１−ＤＴＰＡ−ビオチンの結合比を示すグラフである． 図６は、増大するモル比のビオチン及びＤＴＰＡ−ビオチンによるインキュベー シジン後のＳＡの電気泳動的移行を示す．図７Ａは．”Ｇａ−ＤＡＣＢの血漿フ ァーモコキネチツクスを示す．図７Ｂは．　６７Ｇａ−ＤＡＣＢの尿蓄積を示す ．発明を実施するための最良の形態 本発明は、生体内に安定で、高い親和性及び安定性を有する金属イオンと結合で き，そしてアビジン及びストレブトアビジンと安定に結合できるビオチン及びデ フエロキサミンのコンジュゲートである化合物に関する．ここで使用されるとき 、「生体内で安定」であるコンジュゲートは、以下に記載されるツーノン１合ア ッセイにより測定されるように、未インキュベートコンジュゲートに対して。

６時間血漿中のインキュベーション後金属結合及びアビジン結合能力の両方の５ ０％以上を維持するコンジュゲートとして規定される。

本発明の好ましい化合物は、以下の式により示されるデフエロキサミン及びビオ チンの共有コンジュゲートであるデフエロビオチン（ＤＢ）である。

本発明の他の好ましい化合物は、以下の式により示されるヨードアセチルーデフ エロキサミン及びシステニル−ビオチンの共有コンジュゲートであるデフエロー アセチル−システニル−ビオチン（ＤＡＣＢ）である。

本発明の化合物は、ＤＦＯ及びビオチン又はその誘導体を共有的に結合し１次に 安定性及び活性即ち金属イオンをキレートしそしてアビジン又はストレプトアビ ジンを結合する能力について得られる化合物を評価することにより提供される。

安定性及び活性は、アビジン結合アッセイにより生体外で評価できる。このアッ セイでは、放射活性金属がＤＦＯ−ビオチンコンジュゲートに結合し、そして放 射活性コンジュゲートがアビジン又はストレプトアビジンとインキュベートされ る。ＤＦＯ−ビオチンコンジュゲートの解離は、ビオチン−アビジン複合体に結 合した減少した放射金属として反映する。それ故、ＤＦＯ−ビオチンコンジュゲ ートの完全さ、並びにその金属及びアビジン結合容量は、アビジン−ビオチン複 合体と結合するようになる放射活性の量を測定することにより評価できる。ＤＦ ｏ−ビオチンコンジュゲートの放射活性ラベリングは、ＤＦＯ−ビオチンコンジ ュゲートへの放射活性金属溶液例えば６７Ｇａの直接添加１次に１−数時間室温 のインキュベージジンにより容易に達成できる。アビジン結合は、アビジン−ビ オチン結合に十分な時間（１−数分）過剰のアビジンにより放射ラベルされたＤ ＦＯ−ビオチンコンジュゲートをインキュベートすることにより達成できる。こ の結合は、ＤＦＯ及び小さい代謝物からのアビジン及びビオチンの次の分離を行 うためにフィルター上で最も好都合に行われる。好ましい態様では、フィルター は、ＣｅｎＬｒ１ｃｏｎ３０ミクロ漉過装置であり、それは、アビジン及びＤＦ Ｏ−ビオチンコンジュゲートを保持するが、未複合ＤＦＯ又は遊離の放射金属を 保持しない、Ｃｅｎｔｒ　１ｃｏｎ３０ミクロ漉過装置により、濃過は、約２０ −３０分間約４０００−５０００Ｘｇの遠心分離により達成される。インキュベ ージジン混合物中に存在１”る放射アイソトープの量は、当業者に周知のしかも 使用されるアイソトープに適切な方法により濾過前及び後に測定される０例えば 、６７Ｇａは、γカウンターにより測定される。未分離のインキュベージジン混 合物に存在する放射活性対保持物中に存在する放射活性即ちＤＦＯ−ビオチンコ ンジュゲートを経てアビジンに結合した放射活性の比は、ＤＦＯ−ビオチンコン ジュゲートの安定性の目安を提供する０例えば、０．５の比は、５０％の放射ラ ベルされたコンジュゲートが解離したことを示す、放射ラベルされたコンジュゲ ートの生体内の安定性は、アビジン結合アッセイ前の種々の量の時間について塩 水又は血漿中のコンジュゲートのインキュベーション後のアビジン結合アッセイ を行うことによりｌＦＰ価される。

本発明の化合物の生体内の安定性をさらに評価するために、化合物は、放射ラベ ルされそして動物に注射される。血漿及び尿のサンプルは、種々の時点で得られ １次にビオチンと結合して残存する放射活性の量即ち生体内のＤＦＯ−ビオチン コンジュゲートの安定性を決定するために、上記のアビジン結合アッセイにかけ られる。血漿及び尿のサンプルは、又例えば高速液体クロマトグラフィー（ＨＰ ＬＣ）により分析されて、不変のＤＦＯ−ビオチンコンジュゲート及びその代ｎ Ｉ物の存在をめる。血漿及び尿のサンプルのクロマトグラフィーのプロフィルは 、未インキュベート放射ラベルＤＦＯ−ビオチンコンジエゲート、未共役放射ラ ベルＤＦＯ又は他の予想される代謝物の周知のプロフィルに比較されて、ＤＦＯ −ビオチンコンジュゲートが分解したかどうかを決める。ＨＰＬＣの条件及び方 法は、当業者に周知であり、クロマトグラフィーの条件例えば流速及び勾配プロ グラムは、容易に選択されそして当業者により最適にされる。好ましい態様では 、逆相クロマトグラフィーが使用され、そして複合体化剤は、移動相に含まれて バッファーに存在するか又はカラムに結合した鉄の汚染物が分析に干渉しないこ とを確実にする。好ましくは、複合体化剤は、ニトリロトリ酢酸（ＮＴＡ）であ り、約２ｍＭの濃度で存在する。ＤＦＯ及びその誘導体の分離及び同定のための 特定の方法は、Ｋｒｕｃｋら［（１９８５）Ｊ、Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ、４３１ ．１２３１及びＳｉｎｇｈら［（１９９０）Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１８７ ．２１２１に見出される。

本発明によれば、ＤＦＯ及びビオチン、デフエロビオチン（ＤＢ）の共有コンジ ュゲートが生体内で安定であり、高い親和性及び安定性で金属イオンと結合し。

そしてアビジン及びストレプトアビジンと安定に結合できることが見出された。

ＤＢは１例えば以下のスキームＩＩによりＤＦＯ及びビオチンを共有的に共役す ることにより合成できる。

５ＣＨｒ：、ＭＥ　１！ スキーム＋１によるＤＢの合成は、以下のように達成できる。固体のデフエロキ サミンメシレートは、約［ＯｍＭの濃度でメタノールに添加され１次にＮａＯＨ を添加されてｌ０ｍＭのＮ　ａ　ＯＨのＲ終濃度に達する。溶液は、約６０°Ｃ に維持される。固体のＮＨ３−ビオチンがＤＦＯ溶液に添加されて２０ｍＭＮＨ ３−ビオチンの最終のモル度に達し、そして６０°Ｃで少なくとも１時間インキ ュベートされる。　（スキームＩＩは、ＮＨ３−ビオチン、スルホ−ＮＭＳ−ビ オチンの水溶性アナログを示している。当業者は、ＤＦＯの第一級アミンと反応 する適切なビオチンアナログを決定できる。）ＮＨ３−ビオチン：デフエロキサ ミンメシレートの好ましいモル比は、２−５：Ｉである。スキームＩＩにより合 成されたＤＢは、当業者に周知の標準の方法例えばＨＰ　Ｌ　Ｃにより精製でき る。

ＤＢの生体外の安定性は、上記のアビジン結合アッセイにより決定できる。ＤＢ は、先ず放射金属によりラベルされる０例えば、ＤＢは、ＤＢへの６７Ｇａ溶液 の直接添加後、上記のように塩水又はヒト血漿中のインキュページ田ンにより６ ７Ｇａによりラベルできる。　６７Ｇａ−ＤＢが１水中で３７°Ｃでインキュベ ートされその後上記のようにアビジン結合活性を測定するとき、約９０％の放射 ラベルが、２０時間接アビジンと結合するその能力を維持し、ＤＢが塩水に極め て安定であることを示す、６時間と）・血漿中の６７Ｇａ−ＤＢのインキュベー ション１１約７５％の放射ラベルが、アビジン結合アッセイでアビジンと結合で き。

ＤＢが又血漿中で安定であり、ＤＢがＤＬＢが行うような急速な分解を行わない ことを示す。

ＤＢの生体内の安定性は、実験動物例えばイヌに放射ラベルされたＤＢ例えば６ ７Ｇａ−ＤＢを静脈内に注射し、次に血漿及び尿のサンプルを上記のアビジン結 合アッセイにかけることにより評価できる。このアッセイは、６０分で取り去ら れるそれぞれ尿及び血漿のサンプルに存在する放射活性の約８５％及び６５％が 、アビジンを結合する能力を保持することを示す、これは、生体外の研究の結果 と一致し、そしてＤＢが生体内で安定であり、従って生体内のイメージング及び 療法における応用に適していることを示す。

ＤＢの安定性は、生体外の研究で得られた血５バのサンプル、並びにＤＢ、ＤＦ Ｏ及び池の可能な代！１物の存在について放射ラベルされたＤＢの静脈注射１麦 得られた尿サンプルを、例えばＨＰＬＣにより調べることによりさらに評価でき る。

特に、放射ラベルされたＤＢは、２４時間血漿中にインキュベートされ、次にＨ ＰＬＣによるクロマトグラフィー分析にかけられる。カラム溶離液における放射 活性は、溶離する溶媒容量の関数としてプロットされ、そして未インキュベート された放射ラベルＤＢ及びＤＦＯのＨＰＬＣ溶離プロフィルは、血漿中にインキ ュベートされた放射ラベルされたＤＬＢに比較される。放射活性の主なピークは 。

未インキュベートＤＢ及びＤＦＯとともに溶離され、２４時間後ですら、がなり の量のＤＢが不変のままであることを示す。

ＨＰＬＣ分析のための尿サンプルは、実験動物例えばイヌに放射ラベルしたＤＢ を注射し、そして種々の時間の間隔で膀胱をフラッシングすることにより尿サン プルを得ることにより得ることができる１例えば尿サンプルは、３０分、２時間 、及び４時間で得られ、ＨＰＬＣにより分析される。３０分で得られたサンプル では、存在する放射活性の殆ど全ては、未注射ＤＢの放射活性とともに溶離し。

一方２及び４時間では、増大する量の放射活性が放射ラベルされたＤＦＯととも 池の好ましい態様では、生体内で安定であり、高い親和性及び安定性で金属イオ ンと結合し、そしてアビジン及びストレプトアビジンと安定に結合できるＤＦＯ −ビオチンコンジュゲートが提供される。この好ましい化合物即ちデフエローア セチル−システニル−ビオチン（ＤＡＣ：Ｂ）は、アセチル及びシステニル基を 含み、ＤＦＯ及びビオチンの間に結合を提供する。上述のように、ＤＦＯ及びビ オチンの間の結合の性質は、ビオチン溶液による蛋白分解を最低にし、それによ り生体内で安定な化合物を提供する極めて重要なものである。

ＤＡＣＢは１例えば以下のスキームＩＩＩにより、共有的にヨードアセチルーデ フエロキサミン及びＮ−システニル−ビオチンを共役することにより合成できる 。

、＜ＣＨｒ、Ｈｔ　１口 スキームＩ１１によるＤＡＣＢの合成は、以下のようにして達成できる。固体の デフエロキサミンメシレートを２０ｍＭの濃度にメタノールに加え９次にＮａＯ Ｈを加えて２０ｍＭＮａＯＨの最終濃度にする。溶液を加熱し６０°Ｃに維持す る。

固体のヨード酢酸Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエステル（ＮＨ５−ＩＡ）をデ フエロキサミン溶液に加えて５０ｍＭＮＨ５−ＩＡの最終モル度にし、６５°Ｃ で少なくとも１時間インキュベートした。Ｎ）（Ｓ−ＩＡ　：　ＤＦＯの好まし いモル比は、２−１０：Ｉである。得られたヨードアセチルーデフエロキサミン （ｒＡ−ＤＦＯ＋は、例えばＯ−１０ｍ０−１Ｏ％バッフＴ−Ａ　（０，０２５ Ｍホスフェート、ｐＨ６，２ｍＭＮＴＡ）及び１０−６１０−６Ｏ１００％バッ ファーＢ（０゜０２５Ｍホスフェート、ｐＨ６，２ｍＭＮＴＡ、７５％メタノー ル）の線状勾配を使用するＥＭ　ＬｊＣｈｒｏＣＡＲＴ逆相カラムによる１−Ｉ ＰＬＣにより精製される。未コンジュゲー１−ＤＦＯではないＩＡ−ＤＦＯは、 ２６０ｎｍで吸収を有し、従って溶離液の吸収を測定し、２６０ｎｍの吸収を有 するフラッシング集めることにより精製できる。

システィン−ビオチンを製造するために、システィンは、システィンに対して少 なくとも等モルの濃度のジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む帆　０５Ｍホスフ ェートバッファー、ｐＨＩ２に添加される。Ｐｓえば、６０−１２０ｍＭのＤＴ Ｔは、６０ｍＭシスティンの最終濃度で０．０５Ｍホスフェートバッファー中の システィンに添加される。ＮＭＳ−ビオチンは、２０ｍＭの濃度でメタノール中 で可溶化され、６０°Ｃに加熱される０等容量のシスティン及びＮＭＳ−ビオチ ン溶液を混合し、６５°Ｃでインキュベートされる。システィン：　ＮＨ３−ビ オチンの好ましいモル比は、２−１０：Ｉである。得られたｃｙｓ−ビオチンは ９例えばＨＰＬＣにより精製される。Ｃｙｓ−ビオチンを含むフラッシング、５ ．５゜−ジチオビスー（２−ニトロ安息香酸）　（ＤＴＮＢ、ＥＩ　Ｉｍａｎの 試薬）とのその反応性により同定できる。ＥＩ　Ｉｍａｎの試薬は、チオールを 検出するのに使用され、そしてａｙｓ−ビオチンと反応するが遊離のＳＨ基を含 まない遊離のビオチンと反応しない。

精製したｃｙｓ−ビオチン及びＩＡ−ＤＦＯのｐＨは、ＮａＯＨにより７．５に 調節される。ｃｙｓ−ビオチン及びＩ　Ａ−ＤＦＯを混合し、−晩インキュペー トする。　ｃｙｓ−ビオチン：ＩＡ−ＤＦＯの好ましいモル比は、２目である。

得られたＤＡＣＢは、当業者に周知の１準の方法により精製され、例えばＩＡ− ＤＦＯのＨＰＬｃｌｉ製について上述されたカラム及び勾配のパラメーターを使 用するＨＰＬＣによる。

ＤＡＣＢの生体外安定性を測定するために、アビジン結合アッセイが使用される 。ＤＡＣＢは、先ず放射金属によりラベルされる。Ｗ４えは、ＤＡＣＢは、ＤＡ ＣＢへの　Ｇａ溶液の直接添加後、ｌ−数時間室温でのインキュベーションによ り６７Ｇａによってラベルできる。放射ラベルされたＤＡＣＢのサンプルは。

ｉｍＬの塩水又はヒト血漿に添加され、次に２４時間まで３７℃でインキュベー トされる。放射ラベルされたＤＡＣＨの一部を１種々の時点で取り出し、アビジ ンと結合する能力についてテストした。

６７Ｇａ−ＤＡＣＢが、上記のように塩水で３７°Ｃでインキュベートされ１次 にアビジン結合活性を測定するとき、約９５％の６７Ｇａが、インキュベージジ ンの２４時間後にそのアビジン結合能力を維持し、コンジュゲートが塩水で極め て安定であることを示す、６時間のヒト血漿中のインキュベーション１１６７Ｇ ａ−ＤＡＣＢが約９５％でアビジンに結合する。２４時間後、約８０％の放射ラ ベルが、アビジン結合アッセイにおいてアビジンと結合できるままであり、血漿 中のＤＡＣＢの優れた安定性を示す。

ＤＡＣＢの生体内の安定性は１．実験動物例えばイヌに放射ラベルされたＤＡＣ Ｂ例えば６７Ｇａ−ＤＡＣＢを静脈内に注射し１次に血漿及び尿のサンプルを上 記のアビジン結合アッセイにかけることにより評価できる。このアッセイは、６ ０分で取り去られるそれぞれ尿及び血漿のサンプルに存在する放射活性の約９５ ％及び８５％が、アビジンを結合する能力を保持することを示す、これは、生体 外の研究の結果と一致し、モしてＤＡＣＢが生体内で掻めで安定であり、従って 生体内のイメージング及び療法における応用に適していることを示す。

ＤＡＣＢの安定性は、生体外の研究で得られた血漿のサンプル、並びにＤＢ。

ＤＦＯ及び他の可能な代謝物の存在について放射ラベルされたＤＢの静脈注射後 得られた尿サンプルを、例えばＨＰＬＣにより調べることによりさらに評価でき る。ＨＰＬＣ分析のための尿ザンブルは、実験動物例えばイヌに放射ラベルした ＤＡＣＢを注射し、そして種々の時間間隔で膀胱をフラッシングすることにより 尿サンプルを得ることにより得ることができる１例えば尿サンプルは、３０分。

２時間、及び４時間で得られ、ＨＰＬＣにより分析される。カラム溶離液におけ る放射活性は、溶離する溶媒容量の関数としてプロットされ、そして未インキュ ベートされた放射ラベルＤＢ及びＤＦＯのＨＰＬＣ溶離プロフィルは、血漿中に インキュベートされた放射ラベルされたＤＬＢに比較される。３０分で得られた サンプルでは、存在する放射活性の全ては、未注射ＤＡＣＢの放射活性とともに 溶離し、ＤＡＣＢが生体内で優れた安定性を有することを保証する。

本発明の他のｎｔｌは、金属イオンによりラベルした本発明のＤＦＯ−ビオチン コンシュケートを提供する。好ましいｔ！！様では、金属は、常磁性又は放射活 性を有する。上記のように、ビオチン又はビオチン誘導体との共役化に含まれる ＤＦＯのアミン基は、金属キレート部分を含むヒドロキサム基がら空間的に離れ ており、そのためＤＦＯの共役化はキレート能力と妥協しない、従って、ＤＦＯ と安定な金属キレートを形成できる全ての金属は１本発明の化合物をラベリング するのに有用であると考えられる。好ましい態様では１本発明のＤＦＯ−ビオチ ンコンジュゲートは、Ｆｅ、Ｇｄ、　９９”Ｔｃ、”　’　Ｉｎ、６７Ｇ、９０ Ｙ、１８４Ｒｅ、１８６Ｒｅ、又は２１２Ｂ、どのキレート化によりラベルされ る。金属イオンとのキレート化は、当業者に周知の方法により達成できる０例え ば、本発明の化合物は、ＤＦＯ−ビオチンコンジュゲートへの６７Ｇａ溶液の直 接添加＋１１−数時間室温でのインキュベーションにより６７Ｇａによってラベ ルできる。

本発明の他の態様は、治療的用途を有する放射活性、常磁性又は他の金属のため の伝達系として本発明のラベルしたＤＦＯ−ビオチン化合物を使用する免疫イメ ージング又は免疫療法の方法に関する。

２段階アプローチは、患者に関心のある組織又は損傷に特異的なアビジン又はス トレプトアビジン共役モノクローナル抗体＜ＭＡｂ）を投与し、次に１−数日後 常磁性又は放射活性金属によりラベルした本発明のＤＦＯ−ビオチンコンジュゲ ートを投与することを含む、関心のある組織又は損傷の放射免疫イメージングで は、ＤＦＯ−ビオチンコンジュゲートが、Ｆｅ、Ｇｄ、５２Ｆ、６８Ｇ。

９９ｍ７ｃ、ｌ　Ｉ　Ｉ　Ｉｎ、又は６７Ｇａによりラベルされるのが好ましい 、放射免疫療法では、９０Ｙ、１８４Ｒｅ、ｌ８６Ｒｅ、２１２Ｂｉによりラベ ルされるのが好ましい、放射免疫イメージングの応用では、ラベルされたＤＦＯ −ビオチンコンジュゲートの投与は、複合体の検出後である０診断イメージング に使用される方法は、コンジュゲートの特別な金属で適切である０例えば、常磁 性金属イオン例えばＦｅ及びＧｄは、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分析又は磁気共鳴イ メージング（ＭＲＩ）に好適である　”２Ｆｅ及び６８Ｇａは、陽電子放射断層 撮影（ＰＵＴ）による分析に適切であるが　９９ｍＴ、Ｉ　ｌ　Ｉ　Ｈｎ、又は ６７Ｇａは。

ガンマカメライメージングにより検出できる。イメージ分析の上記の手段は、当 業者に周知であり、そして十分に確立された手法に従って行われる。

上記の２段階放射免疫イメージング及び放射免疫療法の方法は、アビジン又はス トレプトアビジン共役モノクロール抗体を利用する０本発明により考えられてる 抗体は、抗腫瘍抗体、抗フィビリン抗体、抗ミオシン抗体及び任意の損傷特異性 抗体を含む、抗フィブリン及び抗ミオシン抗体は、特に心臓イメージングに有用 である。非特異性１ｇＧは、又本発明に有用である。それは、それがＦｃ受容体 結合を経て膿傷のターゲティングに使用できるからである。ＭＡｂｓの製造及び 精製の標準的方法は、当業者に周知であり、そして例えばＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｈａｒｌｏｗら編、（１９８８） Ｇｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙに見出される。

モノクローナル抗体ヘアビジン又はストレプトアビジンを共役する方法は、当業 者に周知である。Ｗ４えば、Ｋａｌｏｆｏｎｏｓら（＋９９０）及びＨｎ　ａ　 ｔ　ｏｗｉｃｈら（１９８７１は、抗体とストレプトアビジン又はアビジンとの 間の結合基としてビオチンを使用するそれぞれストレプトアビジン及びアビジン と抗体を共役する方法を開示している。

本発明の他の態様では、目標物特異的抗体及びＤＦＯ−ビオチンコンジュゲート は、所望の治療的又は診断的効果に十分な量で製薬組成物として宿主に投与され る。製薬組成物は、製薬上許容できる担体とともに有効投与量の本発明によるコ ンジュゲートを含む、化合物は、経口、静脈内、筋肉内、経鼻、経皮５皮下。

非経口などを含む周知の経路により投与できる。投与の経路に応じて、製薬組成 物は、保護的コーティングを要する。

注射可能な用途に好適な製薬上の形は、滅菌注射可能な溶液又は分散物のその場 の調製のための滅菌水溶液又は分散物及び滅菌粉末を含む、全ての場合において 、究極の溶液の形は、滅菌しなければならず流体でなければならない０代表的な 担体は１例えば水、バッファーした水溶液（即ちバイオコンパチブルバッファー ）、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチ レングリコールなど）、好適なそれらの混合物、界面活性剤又は植物油を含む溶 媒又は分散媒体を含む、滅菌は、１壬意の当業者に認識された技術により達成で き、それは、抗菌剤又は抗かび削例えばパラベン、クロロブタノール、フェノー ル、ソルビン酸、チメロサールなどの添加を含むが、これらに限定されない、さ らに、等張化剤例えば砂糖又は塩化ナトリウムが本発明の組成物に配合できる。

本発明のコントラスト剤を含む滅菌注射可能な溶液の製造は、必要に応じ、上記 の種々の成分とともに適切な溶媒に要求された量でこれらの剤を配合し１次に滅 菌好ましくはフィルター滅菌を行うことにより達成される。滅菌粉末を得るため に、上記の溶液を必要に応じ真空乾燥又は凍結乾燥する。

コンジュゲートが経口投与されるとき、有効量のコントラスト剤を含むその製薬 組成物は、又不活性希釈剤、同化可能な食用担体などを含み、ハード又はソフト ゼラチンカプセルに入れ、錠剤に打錠され、又はエリキシル、懸濁物、シロップ などにできる。共役抗体の好ましい組成物は、約０．１−５ｍｇの範囲の有効な 投与量を提供する。好ましい態様では、有効な投与量は、約１ｍｇである。ラベ ルされたＤＦＯ−ビオチンコンジュゲートの好ましい組成物は、約１−１０００ μｇの範囲で有効投与量を提供する。ラベルされたＤＦＯ−ビオチンの好ましい 投与量の範囲は、約１０−１００μｇである。

ここで使用されるとき、製薬上許容できる担体は、１壬意のそして全ての溶媒。

分散媒体、コーティング、抗菌剤及び抗かび剤、等張化剤などを含む、この媒体 及び剤の使用は、当業者に周知である。

本発明は、又放射イメージング又は放射療法に関するキットに関する。一つの態 様では、キットは、コンパートメント化されて１本発明のＤＦＯ−ビオチンコン ジュゲートを含むように適合されたコンテナーを受容する０本発明のキットの例 示的な使用では、ＤＦＯ−ビオチンコンジュゲートは、放射活性又は常磁性金属 によりラベルされ、そしてストレプトアビジン又はアビジン共役ターゲ手イング 剤の投与１−４日後患者に投与される。

他の態様では、キットは、コンパートメント化されて、本発明のＤＦＯ−ビオチ ンコンジュゲートを含むように適合された第一のコンテナー、並びにアビジン又 はストレプトアビジン共役抗原−１細胞−又は組線−特異性ターゲティング剤を 含むように適合された第二のコンテナーを受容する１本発明のキットの例示的使 用では、第二のコンテナーの内容は、ＤＦＯ−ビオチンコンジュゲートは、族１ １１活性又は冨磁性金属によりラベルされ、そしてターゲティング剤の投与ｌ− 数日後宿主に投与される。好ましいｔＩｔ樟では、ＤＦＯ−ビオチンコンジュゲ ートは。

ＤＢ又はＤＡＣＢである。

実施例 以下の実施例は、さらに本発明を説明する。

実施例　■ デフエローデスアミノリジル−ビオチンの合成及び分析ビオシチンを、以下のス キーム■によりＤＦＯに共有的に結合し、ＤＦＯは。

その市販されている形、デフエロキサミンメシレートとして提供された。スキー ム■は、ＤＦＯ及びビオチンの共有コンジュゲートであるＤＬＢの合成を生ずる 。

Ｄｅｆｅｒｏ−ｄａｓａｍｉｎｏｌｙｓｙｌ−ｂｉｏヒｌｎ　＋０１．ＩｌｌＳ ＣＨＥＭＣＩ スキームＩによるＤＬＢの合成は、以下のように達成された。固体のデフエロキ サミンメシレートを、約１０ｍＭの濃度にメタノールに加え、次にＮａＯＨを加 えてＩ　０ｍＭＮａＯＨの最終濃度にした。溶液を約６０″Ｃに維持した。固体 のＮＨ５−ＬＣ−ビオチンをデフエロキサミン溶液に加えて２０ｍＭＮＨ５−Ｌ Ｃ−ビオチンの最終モル度にし、６０°Ｃで少なくとも１時間インキュベートし た。ＮＨ５−ＬＣ−ビオチン：デフエロキサミンメシレートの好ましいモル比は 、２−５：１である。スキームｌにより合成されたＤＬＢは、当業者に周知の標 準の方法例えば高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により精製された。

ＤＬＢの生体外の安定性を測定するために、アビジン結合アッセイを使用した。

ＤＬＢは、ＤＬＢへの６７Ｇａ溶液の直接添加後、１−数時間室温でのインキュ ベーションにより６７Ｇａによってラベルされた。放射ラベルされたＤＬＢのサ ンプルは、ＩｍＬの塩水又はヒト血漿に添加され１次に２４時間まで３７℃でイ ンキュベートされた。放射ラベルされたＤＬＢの一部を、種々の時点で取り出し 、アビジンと結合する能力についてテストした。

図１に示されるように、　６７Ｇａ−ＤＬＢは、塩水で３７°Ｃでインキュベー トされ１次に上記のようにアビジン結合活性を測定するとき、約８５％の６７Ｇ ａが、インキュベーションの２４時間後にそのアビジン結合能力を維持し、コン ジュゲートが塩水で安定であることを示す、ヒト血漿中のインキュベージジン後 。

６７Ｇａ−ＤＬＢがそのアビジン結合能力を急速に失い、血漿中のインキュベー ジタンの１０分ＩＬアビジンと結合可能な放射ラベルは５０％より少なくなり。

そして２時間で１５％より少なくなり、コンジュゲートが生理学的条件下では急 速に解離しつつあることを立証する。

ＤＬＢの生体内の安定性は、イヌに６７Ｇａ−ＤＬＢを静脈内に注射し、次に血 漿及び尿のサンプルをアビジン結合アッセイにかけることにより評価された。

血液を６７Ｇａ−ＤＬＢの注射後間隔をおいて取り出し、血漿分析のためにヘパ リン処理管に入れた。尿サンプルは、大体３０分置きに塩水により膀胱をフラッ シングすることにより得られた。血漿及び尿のサンプルのアビジン結合アッセイ は、それぞれ１０分及び３０分で取り出される血漿及び尿のサンプルに存在する 放射活性の約２０％のみが、アビジンに結合するその能力を保持していたに過ぎ なかったことを示す、これらの結果は１図３に示される。これば　生体外の研究 の結果と一致し、そしてＤＬＢが生体内で不安定であることを示す、ＤＬＢの安 定性をさらに評価するために、”Ｇａ−ＤＬＢを２時間３７°Ｃで血漿中でイン キュベートし、次にＨＰＬＣによるクロマトグラフィー分析にかけた。カラム溶 離液における放射活性は、溶離する溶媒容量の関数としてプロットされ、そして 未インキュベートされた放射ラベルＤＬＢ及びＤＦＯのＨＰＬＣ溶離プロフィル は、血漿中にインキュベートされた放射ラベルされたＤＬＢと比較された。クロ マトグラフィーのプロフィルは、図２に示される。血漿インキュベートサンプル の放射活性の主なピークは、未インキュベートサンプルの主なピークより早く溶 離され、ＤＬＢが不安定であることを示す、しかし、血漿インキュベートサンプ ルは、放射ラベルＤＦＯとともに溶離せず、ＤＬＢが単にＤＦＯ及びビオシチン に解離しなかったことを示し、むしろＤＬＢが生体内でビオチン及びデスアミノ リジルーデフエロキサミンに急速に分解したことを立証する。上述されしがも図 ４に示された。生体内の実験からの尿サンプルのクロマトグラフィー分析は、た とえ３０分後でも、放射ラベルされたＤＬＢがデスアミノリジルデフエロキサミ ンに分解したことを確認する。

実施例　Ｉ＋ ＤＬＢ、ＤＢ及びＤＡＣＢの生体外安定性ＤＬＢ、ＤＢ及びＤＡＣＢは、６７Ｇ ａシトレート溶液（６７Ｇａの５０−５００μＣｉ／μｇの比活性）の直接添加 後、室温で一晩のインキュベージジンにより６７Ｇａによってそれぞれラベルさ れた。それぞれ放射ラベルされたコンジュゲートのサンプルは、ＩｍＬの塩水及 びＩｍＬのイヌ血漿に添加され２次に２６時間３７°Ｃでインキュベートされた 。放射ラベルされたコンジュゲートの部分Ｉ００μＬを１種々の時点で取り出し 、アビジン結合アッセイにより評価した。

それぞれの放射ラベルされたコンジュゲートを、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ３０フィル ターで室温で１−１０分間１００μｇのアビジンとともにインキュベートした。

フィルターをガンマカウンターでカウントし、ＰＢＳ、ｐＨ７，５で洗い、塩水 サンプルでは２０分間、血漿サンプルでは３０分間４０００−５０００　ｇで遠 心分離した。洗浄／還心分Ｎ後、フィルターを再びカウントした。遠心分離後の 毎分のカウント（ｃ　ｐ　ｍ）対遠心分離前のものの比を計算した。ｌの比は、 インキュベーション１發維持される１００％のアビジン結合能力を表す、結果は 、単位時間当りのアビジン結合能力％としてプロットされ０図１に示される。

ＤＬＢ及びＤＢの血漿濾液をＨＰＬＣにより分析し、　Ｇａ−及び５２Ｆｅ一う ベルＤＦＯのＨＰＬＣプロフィルに比較した。結果は図２に示される。同じであ る６７Ｇａ−ＤＦＯ及び５２Ｆｅ−ＤＦＯのプロフィルは、へネルＡに示され、 そしてへネルＢ及びＣで矢印により示される。

実施Ｗ４　ＩＩ！ ＤＬＢ、ＤＢ及びＤＡＣＢの生体内安定性ＤＬＢ、ＤＢ及びＤＡＣＢを実施例Ｉ に記載したように６７Ｇａによりラベルし、ガンマカウンターでカウントした。

それぞれの放射ラベルされた化合物（１゜２μｇＤＬＢ、５μｇＤＢ又は５μｇ ＤＡＣＢ）をイヌに静脈内に注射した。全血を注射１０．６０及び１２０分後採 り、ヘパリン処理管に入れた。尿のサンプルは、３０．６０及び１２０分にｌｏ ｏｍＬの塩水により膀胱をフラッシングすることにより得られた。アビジン結合 が評価され、そして実施例Ｉに記載したようにグラフにした。結果は１図３に示 される。放射ラベルＤＢ注射３０分５２時間及び４時間後そして放射ラベルＤＡ ＣＢ注射３０分後に得られた尿サンプルを、実施例１に記載されたようにＨＰＬ Ｃにより分析され、そして注射前のラベルされた化合物のＨＰＬＣプロフィルと 比較した。結果を図４に示す。

実施例　ＩＶ ６７Ｇ３−ＤＬＢのアビジン結合比 アビジン１モル当りの結合した放射ラベルＤＦＯ−ビオチンのモルの比（［結合 比Ｊ）を測定し、市販のＤＴＰＡ−ビオチンの結合比ど比較した。

図５に示されるように、　６７Ｇａ−ＤＬＢの結合比は４に近付き、ＩＩＩＩｎ −ＤＴＰＡ−ビオチンの２と比較される。これらの結果は、放射ラベルＤＦＯ− ビオチンが、Ｄ　Ｔ　Ｔ）　Ａ−ビオチンと比較して、ＳＡ−又はアビジン−共 役ＭＡｂに２倍ラベルを伝達できることを示す。

これらの結果は、さらに、１モルのＤＴＰＡ−ビオチンが恐らくアビジンに２個 の結合部位を満たすことを示す（アビジンはビオチンについて４＠の結合部位を 有する）。

電気泳動分析は、図５に示されるように、２以上のモル比では、ＤＴＰＡ−ビオ チンが結合部位を結合し嬌かけすることによりＳＡを安定化することを立証する 。ＳＡがビオチンとインキュベートされ、そして電気泳動にかけられるとき、Ｓ Ａはそのサブユニット分子量で移行する。２以上のモル比でＤＴＰＡ−ビオチン とインキュベートされるとき、ＳＡは、約６０ＫＤで移行し、２モルのＤＴＰＡ −ビオチンに存在する４モルのビオチンがその４個のビオチン結合部位を経てＳ Ａを橋かけすることを示す。

実施例　■ ６７Ｇａ−ＤＡＣＢのファーマコキネテ旬りス６７Ｇａ−ＤＡＣＢの基本的な生 体内ファーマコキネティックスパラメーターを以下のように調べた。

６７Ｇａ−ＤＡＣＢを５μｇの投与量でイヌに静脈内注射し、血液クリアランス 及び尿排出をモニターした。全血を、静脈内注射後間隔を置いて採り、予め秤量 した管に入れた。ファーマコキネティックスは、Ｒ−ストリップ曲線フィッティ ングプログラム（Ｍｉｃｒｏｍａｔｈ、５ａｌｔ　Ｌａｋｅ　Ｃ！ｔｙ、ＵＴ） を使用してめた。血液を血漿分析のためにヘパリン処理管に入れた。イヌにおけ る６７Ｇａ−ＤＡＣＢの尿排出をめるために、膀胱を３０分毎に約３０ｍＬの塩 水によりフラッシングした０時間インクレメント（３０分）毎の全合計放射活性 を、サンプルのカウントに採取した尿の全容積を乗ずことによりめた。

図７八ネルＡに示されるように、Ｄ　Ａ　ＣＢの血漿ファーマコキネティックス は、小さい放射活性丸レートの代表である３個の外挿フィツトにより最も適合す る。

図７八ネルＢで示されるように、注射１００分後に、５０％のＤＡＣＢが尿に蓄 積し、一方６時間で８０％のＤＡＣＢが尿に蓄積した。

生体外安定性 生体内安定性 ＯＯ。

く口 堪２ 八 分 ＦＩＧ、３ インクレメント比−モルキレート／アビジンＦｊＧ、５ Ｒ竺ｔｌｏ　０　１　２　４　１０　１　２　４　１０ＦＩＧ、６ Ｇａ−６７ＤＡＣＢの血漿ファーマコキネテイツクス分 Ｏｔｏｏ　２００　３００　４００ 分 国際調査報告 フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，８識別記号　庁内整理番号Ｃ０７Ｋ　５１０２　８ ３１８−４Ｈ ＧＯＩＮ　３３１５３４　７０５５−２Ｊ／／Ｃ０７Ｄ４９５１０４　１０３　 ９１６５−４ＣＧＯＩＮ　３３１５３　Ｕ　７０５５−２Ｊ８４１５−４Ｃ Ｉ Ａ６１Ｋ　４３１００

Claims (41)

【特許請求の範囲】
1. １．デフェロキサミン及びビオチン又はその誘導体の共有コンジュゲートを含む 化合物において、該化合物が生体内で安定でありそしてアビジン又はストレプト アビジンを結合できる化合物。
2. ２．該化合物が式 ▲数式、化学式、表等があります▼ を有する請求項１の化合物。
3. ３．該化合物が式 ▲数式、化学式、表等があります▼ を有する請求項１の化合物。
4. ４．該化合物が金属イオンによりラベルされている請求項１−３の何れか一つの 項の化合物。
5. ５．該金属が常磁性である請求項４の化合物。
6. ６．該金属がＦｅ又はＧｄである請求項５の化合物。
7. ７．該金属が放射活性である請求項４の化合物。
8. ８．該金属が９９ｍＴｃ．１１１ｎ、６７Ｇａ、９０Ｙ、１８４Ｒｅ、１８６Ｒ ｅ．２１２Ｂｉ、５２Ｆｅ、又は６８Ｇａである請求項７の化合物。
9. ９．該化合物が式 ▲数式、化学式、表等があります▼ を有するデフェロキサミン及びビオチンの共有コンジュゲートを含む化合物。
10. １０．該化合物が式 ▲数式、化学式、表等があります▼ を有するデフェロキサミン及びビオチンの共有コンジュケートを含む化合物。
11. １１．ビオチン及びデフェロキサミンの直接又は間接の結合を行うのに十分な時 間及び条件下デフェロキサミン又はその誘導体とビオチン又はその誘導体とを反 応させ、そして該化合物を採取することを含む請求項１−３の何れか一つの項の 化合物を合成する方法。
12. １２．デフェロキサミン又はその誘導体とビオチンのＮ−保護誘導体とを反応さ せることを含む請求項２の化合物を合成する方法。
13. １３．前記のビオチンのＮ−保護誘導体がＮ−ヒドロキシサクシンイミド−ビオ チンである請求項１２の方法。
14. １４．該Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド−ビオチン及び該デフェロキサミン又は その誘導体が約２−５：１のモル比で反応する請求項１３の方法。
15. １５．デフェロキサミン又はその誘導体とビオチンのＮ−保護誘導体とを反応さ せることを含む請求項３の化合物を合成する方法。
16. １６．前記のデフェロキサミンの誘導体がヨードアセチルーデフェロキサミンで ある請求項１５の方法。
17. １７．前記のビオチンのＮ−保護誘導体がＮ−システニルビオチンである請求項 １５又は１６の方法。
18. １８．該Ｎ−システニルビオチン及び該ヨードアセチルーデフェロキサミンが、 約２：１のモル比で反応する請求項１７の方法。
19. １９．ａ）目標部位に結合するのに十分な量で宿主にアビジン又はストレプトア ビジン共役モノクローナル抗体を投与し、ｂ）デフェロキサミン及びビオチン又 はその誘導体の共有コンジュゲートを含む化合物を投与し、該化合物は生体内で 安定でありさらにアビジン及び／又はストレプトアビジンと結合可能であり、そ の上該モノクローナル抗体と複合体を形成する条件及び検出するのに十分な投与 量で常磁性又は放射活性金属によりラベルされており、 ｃ）該複合体を検出する ことを含む放射免疫イメージングの方法。
20. ２０．ａ）目標部位に結合するのに十分な量で宿主にアビジン又はストレプトア ビジン共役モノクローナル抗体を投与し、ｂ）デフエロキサミン及びビオチン又 はその誘導体の共有コンジュゲ−トを含む化合物を投与し、該化合物は生体内で 安定でありさらにアビジン及び／又はストレプトアビジンと結合可能であり、そ の上該モノクローナル抗体と複合体を形成する条件及び治療上有効な投与量で常 磁性又は放射活性金属によりラベルされており ことを含む放射免疫療法の方法。
21. ２１．該化合物が式 ▲数式、化学式、表等があります▼ を有する請求項１９又は２０の方法。
22. ２２．該化合物が式 ▲数式、化学式、表等があります▼ を有する請求項１９又は２０の方法。
23. ２３．該常磁性金属がＦｅ又はＧｄである請求項１９の方法。
24. ２４．該放射活性金属が５２Ｆｅ、又は６８Ｇａである請求項１９の方法。
25. ２５．該放射活性金属が９９ｍＴｃ、１１１ｎ．又は６７Ｇａである請求項１９ の方法。
26. ２６．該複合体が核磁気共鳴分折により検出される請求項２３の方法。
27. ２７．該複合体が陽電子放射断層撮影により検出される請求項２４の方法。
28. ２８．該複合体がガンマカメライメージングにより検出される請求項２５の方法 。
29. ２９．該放射活性金属が１８４Ｒｅ、１８６Ｒ８、又は９０Ｙである請求項２０ の方法。
30. ３０．該モノクローナル抗体が、０．１−５ｍｇの投与量で投与される請求項１ ９又は２０の方法。
31. ３１．該化合物が、１−１０００μｇの投与量で投与される請求項１９又は２０ の方法。
32. ３２．デフェロキサミン及びビオチン又はその誘導体の共有コンジュゲートであ る化合物、並びに製薬上許容できる担体を含み、該化合物は生体内で安定であり さらにアビジン及び／又はストレプトアビジンと結合可能であり、その上該化合 物は、任意に常磁性又は放射活性金属によりラベルされている製薬組成物。
33. ３３． 該化合物が式 ▲数式、化学式、表等があります▼を有する請求項３２の製薬組成物。
34. ３４．該化合物が式 ▲数式、化学式、表等があります▼ を有する請求項３２の製薬組成物。
35. ３５．該化合物が、約１−１０００μｇの単位投与量で存在する請求項３２の製 薬組成物。
36. ３６．該化合物が、約１０−１００μｇの単位投与量で存在する請求項３５の製 薬組成物。
37. ３７．デフェロキサミン−ビオチンコンジュゲートを含むように適合された第一 のコンテナーを受容するように適合された放射イメージング又は放射療法用のコ ンパートメント化キット。
38. ３８．デフェロキサミン−ビオチンコンジュケートを含むように適合された第一 のコンテナー．並びにアビジン−文はストレプトアビジン−共役ターケチィング 剤を含むように適合された第二のコンテナーを受容ずるように適合された放射イ メージング又は放射療法用のコンパートメント化キット。
39. ３９．該テフェロキサミン−ビオチンコンジュゲートが式▲数式、化学式、表等 があります▼ を有する請求項３７又は３８のキット。
40. ４０．該デフェロキサミン−ビオチンコンジュケートが式▲数式、化学式、表等 があります▼ を有する請求項３７又は３８のキット。
41. ４１．該ターケチィング剤がモノクローナル抗体である請求項３８のキット。