JPH02142782A - 新規キサンテン染料 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、新規なキサンチン染料、より詳細には細胞分
析に使用できる蛍光スルホンキサンチン（ｓｕｌｌｏｎ
ｅｘａｎｌｈｅｎｅ）染料に関する。

（従来の技術） キサンチン染料は最も一般的に使用されている種類の蛍
光染料の一つである。フルオレセイン、即ちジヒドロキ
ンキサンチン染料は幾つかの理由により特に有益な生物
学的染料であり、その理由としては　そのジアニオン型
の染料は水に非常によく溶けること、ｐＫ、が６３〜６
７であるので、生理学的ｐｌ（（７，０〜７．６）で殆
ど脱プロトン化されそして蛍光性であること；染料の最
大励起（４９０ｎｍ）はアルゴンイオンレーザ−の４８
８ｎｍ線によく一致していること；高い消衰係数（８Ｘ
’ｌＯ’Ｍ　’ｃｍ　　’）を有していること；および
高い量子収量を有していることである。最後の二つの特
性は微量の染料の検出を可能にする。

これらの特性に加えて、フルオレセインの誘導体は、簡
単に合成でき、そして生物学的目的のために染料の利用
を可能にしている（例えば、フルオレセインジアセテー
トは膜透過性エステラーゼ基質としての用途を有してい
る）。一つの誘導体であるフルオレセインイソチオンア
ネート（ＦＩＴＣ）はフローサイトメトリーの分野にお
いて広く使用されている。

フローサイトメーターは、１以上の励起源を有している
こと（典型的には特定の波長に調整されたレーザー）、
細胞を一度に実質的に１個づつ測定区域を通過させるこ
とを可能にする手段、およびそれらの細胞が測定区域を
通過するときの細胞からの散乱光及び蛍光を検出するた
めの手段を般的な特徴としている。各々の細胞について
のデータを記録するための手段を装置に接続することも
可能である。

フルオレセインイソチオシアネートは、どのような型の
抗体とも結合させることができるけれとも、一般的には
、サンプル中の特定の細胞と反応するモノクロナール抗
体（ＭＡｂ）と結合させて用いるようなシステムにおい
て使用されている。

ＦＩＴＣに結合したＭＡｂを保持している細胞が測定区
域を通過する際、レーザーが染料を励起し、そして蛍光
が放出され、検出手段の一つにより集められる。ヘーゼ
ンバーグ（ＩＩｅｒｚｅｎｂｅｒ４）らによるＳｃｉ、
　Ａｍｅｒ、、（１９７９）の報告および米国特許第４
゜５９９．３０７号明細書は一般的なフローサイトメー
ターを開示しており、また、ＦＩＴＣ結合ＭＡｂを使用
して特定の細胞の存在を検出できることを開示している
。更に、米国特許第４，７２７゜０２０号明細書は、核
酸染料のような他の標識付は用試薬（Ｌａｇｇｉｎｇ　
ａｇｅｎｔ）と組み合わせてＦＩＴＣ結合ＭＡｂを用い
て血液細胞の亜集団（サブポピュレーンヨン）分析につ
いての方法を開示している。

しかしながら、フルオレセインイソチオシアネトの有益
性には、４８８ｎｍで励起され５２０ｎｍで放出される
という幾分の制限がある。ＦＩＴＣの特徴を有すると共
にフルオレセインの赤領域に最大励起を持っていること
は有益であろう。

より長い波長の励起および放出を有する染料の利点は幾
つかあり；即ち、生物学的試料（例えば、ＤＮＡ）から
のバックグラウンド蛍光が少なく：染料を励起するため
に必要なレーザーの大きさおよび価格が減少し；ならび
に低波長のレーザーとしてアルゴンイオンレーザ−を使
用する２レーザー励起を実現できる可能性がある。この
ような理由により、そのような性質を有している染料は
サンプル中の細胞分析に有益である。

（発明の構成） 本発明はフルオレセインの赤領域に最大放出（エミッシ
ョン）および励起を有している新規キサンチン染料を提
供する。本発明のキサンチン染料はスルホンフルオレセ
イン（ｓｕｌｌｏｎｅｌｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）および
ナフトスルホンフルオレセイン（ｎａｐｈｔｈｏｓｕｌ
ｌｏｎｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）の誘導体、並びにフ
ルオレセインおよびナフトフルオレセインの誘導体を含
んでいる。スルホンフルオレセインおよびナフトスルホ
ンフルオレセインの誘導体が好ましく、そしてビタブル
ー（Ｖｉｌａ　Ｂｌｕｅ）と命名されたナフトスルホン
フルオレセインが特に好ましい。

本発明のキサンチン染料は細胞分析において有益である
。種々の固体組織（例えば、肺臓および胸腺）および体
液（例えは、血液、尿および骨髄）から採取された細胞
サンプルを、特定の細胞と反応性のある標識付は用試薬
（ｌａｇｇｉｎｇ　ａｇｅｎｔ）　（例えば、モノクロ
ナール抗体）と組み合わせて分析することができる。こ
れらの標識付は用試薬は、ビオチン−アビジン複合体の
ように当分野でよく知られている手段によって本発明の
新規染料と間接的にもしくは直接的に結合される。更に
本発明の染料の別の態様のものは細胞内ｐＨ指示薬とし
て、および゛生″細胞と゛′死″細胞を識別する手段と
して使用することができる。

サンプル中の細胞の分析は、標識細胞からの蛍光を検出
できるいかなる手段によっても行うことができる。蛍光
顕微鏡はその方法の一つであり、そしてフローサイトメ
ーター（例えば、ベクトン・ディキンソン・イムノサイ
トメトリー・システムズ（ＢＤＩＳ）のＦＡＣ５ｃａｏ
（商標）またはＦＡＣ５ｆａｒ（商標）である）は自動
化手段として使用することができる。

ここで、図面について簡単に説明する。

第１図は、ＶＢＤＢ（化合物１４）とブタ肝臓エステラ
ーゼのラインウニバー−パーク（ＬｉｎｅｌＭｅａｖｅ
ｒＢｕｒｋ）プロットである。

第２図は、ＢＣＥＣＦ、ＦＤＡまたはＶＢＤＢで染色さ
れたヒト白血球細胞についての蛍光の対数のヒストグラ
ムを表す一連の図面であって、（ａ）および（ｄ）はそ
れぞれ５３０／３０バンドパスフイルターおよび６６０
／２０バンドパスフイルターを使用した非染色細胞を表
している。

第３図は、化合物１〜９について吸光度（０、Ｄ　、）
と波長のプロットである。

第４図は、化合物１〜９について相対蛍光エミッション
と波長のプロットである。

第５図は、種々のｐＨにおけるビタブル−１，７ｘ１ｏ
”Ｍ（ａ）および３．４　Ｘ　１０−’Ｍ　（ｂ）の濃
度での吸光度（０，Ｄ、）と波長のプロットである。

第６図は、種々のｐＨにおけるヒタブルーについて蛍光
と波長のプロットである。

第７図は、ヒタブルーについて蛍光とｐＨのプロットで
ある。

第８図は、第１表のデータについてｐＨとｌｏｇ［（１
−ｎ　ｆ）　／　（ｎ　ｆ）　］のププロトであって、
ここで’ｎｆ″′は正規化された蛍光である。

本発明の基礎をなすキサンチン化合物は以下の方法によ
って調製された。特に明記しない限り、全ての化合物は
アルドリッチ・ケミカル・コーポレーション（Ａｌｄｒ
ｉｃｂ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）から入手した。

キサンチン染料の基本構造は次の構造式（Ａ）、（Ｂ）
および（Ｃ）に示される。

構造式（Ｂ）において、化合物４はＲがＣ０２ＨＸがＨ
であり：化合物５はＲがＣＯ□Ｈ，ＸがＢｒであり：化
合物６はＲが３０３）（、ＸがＨである。

構造式（Ａ）において、化合物ｌはＲがＣ０２ＨＹかＯ
であり：化合物２はＲが５Ｏ３Ｈ，ＹがＯであり；化合
物３はＲかＣ０２Ｈ、Ｙが十Ｎ（ＣＨ３）２である。

構造式（Ｃ）において、化合物７はＲかＣＯ２Ｈ。

ＸがＨであり、化合物８はＲかＣＯ２Ｈ、ＸかＢｒであ
り：化合物９はＲか５Ｏ３Ｈ，ＸかＨである。

フルオレセインの構造は化合物ｌとして示される。化合
物２のスルホンフルオレセイン（Ｓｌｌ　ｌ　１ｏｎｅ
ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｏ）は次のようにして調製された
ニレゾルシノール（２ｇ、１８ｍｍｏｌ）　、２−スル
ホ安息香酸無水物（１，７ｇ、９ｍｍｏｌ）　、ポリリ
ン酸（８ｇ）を丸底フラスコ中で混合し、油浴中で３．
５時間加熱した。生成した赤色の溶液を水中に注ぎ、そ
して濾過して固体を得た。その固体を１０％ＮａＨＣＯ
３溶液に溶かし、そして濾過した。濾液を沸騰するまで
加熱し、そして濃塩酸で酸性化した。

固体を濾過して得、乾燥した。収量は１．８５ｇ（５５
％）であった。’ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ、）は：δ８
．０（ｄ、　Ｋ□８Ｈｘ、　ｌ■）、　７．６９（ｍ、
　Ｉｎ）、　７．６０（ｍＩＨ）、７．４（ｄ、　Ｊｌ
Ｏ［１ｚ、　２Ｈ）、　７．２８（ｍ、　３Ｈ）、　７
．１６（ｍ、　２１＋）である。

スルホンフルオレセインジアセテート、化合物１３は次
のようにして調製された。スルホンフルオレセイン（０
，２８ｇ、　０．７６ｍｍｏｌ）を無水酢酸（１５ｍＱ
）と共に７時間還流した。そして、溶液を一夜冷却した
。次の日、暗い緑の光る結晶を濾過して得、重さが変化
しなくなるまで乾燥した。収量は０．２ｇ（６４％）て
あった。その固体の’ＨＮＭＲの結果はそれがモノアセ
テートおよびジアセテートの混合物であることを示した
。

ジアセテートはシリカゲル上での中圧クロマトグラフィ
ーによって精製することができた。モノアセテートおよ
びジアセテート（２０ｍｇ）のＣＨ２Ｃ１□溶液（０，
５ｍｆｉ　）をシリカゲルに負荷し、そして追加のＣＨ
２Ｃｌ２で迅速に溶出した。モノアセテートはこの条件
下では加水分解されたようであり、そして赤色の固体の
層（おそらく化合物２）がカラムの頂上に残った。濾液
を濃縮して、黄色の固体（５ｍｇ）を得た。’ＨＮＭＲ
（ＣＤＣ１３）は：δ８．１２（ｄ、　ＪＪＨｚ、　ｌ
１ｌ）、　７．７１（ｍ、　ＩＨ）７．６２（ｍ、　Ｉ
Ｈ）、　７．４９（ｄ、　Ｊ・９＋１ｚ、　２Ｈ）、　
７．４６（ｄ、　Ｊ＝２１１２　２Ｂ）、　７．１０（
ｄｄ、　Ｊ＝９Ｈｚ、２［１ｚ、　２Ｈ）、　７．０５
（ｄ、　Ｊ＝ｔｌＨｚ、　ＩＢ）、　２．３５（ｓ、　
６Ｈ）である。

ロートル（Ｒｈｏｄｏｌ）、化合物３は次のようにして
調製された。フルオレセイン（３，２ｇ、９．６ｍｍｏ
１）　、水酸化すトリウム（６，４ｇ、　０．１７ｍｍ
ｏｌ）および水（３，２ｍＱ）をオイルバス中で３時間
撹拌しながら加熱した。溶液は紫色に変化し、そして次
に黄色になった。溶液を冷却し、水（２０ｍｆｆ）を添
加し、そしてその溶液を濃塩酸でｐＨｌまで酸性化した
。生成した混合物（黄色の油状物と白色の固体である）
はエテールで抽出し、そのエテール画分を濃縮した。油
状物をエタノール水混合物から再結晶させ、黄色の光る
針状物を得た（１．５ｇ、６０％）。融点は２１０°Ｃ
であつｌこ。

２−カルボキシ−２′、４−ジヒドロキシベンゾフェノ
ン（０，８７ｇ、　　２．８ｍｍｏｌ）　、３−ジメチ
ルアミノフェノール（０，３９ｇ、　２．８ｍｍｏｌ）
及び塩化亜鉛（０，３８ｇ、　２．８ｍ　ｍａｔ）を丸
底フラスコ中で混合して油浴中で一夜の間加熱した。

エタノールに溶かした反応混合物の一部分の薄層クロマ
トクラフィー（シリカゲル、酢酸エチル）はフルオレセ
イン、ローダミンおよびロードルの混合物であることを
示した。その混合物を、酢酸エチルに続いて酢酸エチル
とエタノール１：１の混合物を使用するシリカゲル上の
中圧クロマトグラフィーによって精製した。ロードルお
よびローダミンを含んでいる画分を濃縮し、メタノール
とエチルアセテ−）１　：　１０の混合物で破砕して、
濾過し、そして乾燥した。収量は０．２ｇ（２１％）で
あり、赤色の固体であった。’ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ
ｓ）は：δ８．０３（ｄ、　Ｊ＝７１１ｚ、　　ＩＩＩ
）、７．６６（ｍ、　２Ｈ）、　７．２（ｄ、　Ｊ□７
Ｈｚ、　ｌ１ｌ）、　６．６２−６．４０（ｍ、　６［
１）。

２．９８（ｓ、　６■）である。

次に、構造式（Ａ）に示される化合物の基本構造を、構
造式（Ｂ）に示された化合物を形成するために修飾した
。具体的には、１．２．７．８−ジベンゾフルオレセイ
ン、化合物４は次のようにして調製された。丸底フラス
コ中で、１．３−ジヒドロキシナフタリン（１ｇ、　　
６．３ｍｍｏｌ）およびフタロイルジクロリド（０，６
３ｇ、　３．１　ｍｍｏｌ）を油浴中で短時間加熱した
。水（３０ｍｌ＋）および水酸化ナトリウム（Ｉｇ）を
加えた。その溶液を濃塩酸で酸性化して、濾過した。そ
の固体を無水酢酸（３０ｍＱ）と共に均質になるまで還
流した。その溶液を一夜冷却した。ジアセテートを濾過
して、淡いオレンジ色の固体として集めた。

’ＨＮＭＲ（ＣＤＣＩ　、）は：δ８．１９（ｄ、　Ｊ
□８Ｈｚ。

ＩＨ）、　７．９２（ｍ、　２Ｈ）、　７．５５（ｍ、
　４１１）、　７．３（ｍ、　６［１）７．２１（ｄ、
　Ｊ□７［１ｚ、　Ｉｎ）、　２．５０（ｓ、　６Ｂ）
であった。水酸化ナトリウム（１ｇ）およびエタノール
（１０ｍｌｉ）を丸底フラスコ中のジアセテートに添加
し、そして混合物を減圧下で乾燥するまで濃縮した。水
（２０ｍＱ）および濃塩酸を添加し；濾過して固体を得
、乾燥した。収量は０．３４ｇ（２４％）であった。

１．２．７．８−ジベンゾ−４，５−ジブロモフルオレ
セイン、化合物５は次のようにして調製された。１．２
．７．８−ジベンゾフルオレセイン（０゜２５　ｇ、　
０．５８ｍｍｏｌ）　、臭素（０，４ｇ、２．３ｍｍｏ
ｌ）および酢酸（３ｍａ）をマグネット撹拌子および還
流コンデンサーか装備された丸底フラスコ中で混合した
。混合物を１時間還流した。水（２０ｍα）を添加し、
混合物を濾過して、得られた赤色の固体を乾燥した。収
量は０．２１ｇ（６２％）であった。この化合物は、化
合物４について述べたようにジアセテートへの変換およ
び塩基性エタノール中で加水分解によって精製された。

ジアセテートの’ＨＮＭＲ（ＣＤＣＩ、）は：　δ８．
１５（ｄ、　　Ｊ・７１１ｚ、　　ｌ［Ｉ）、　　７．
８３（ｍ、　　２１１）、　　７．６５（ｄ。

Ｊ＝８＋１ｚ、　　２［１）、　　７．５５（ｍ、　　
２１１）、　　７．３６（ｍ、　　４［１）、　　７．
２６（ｄ、　３□７Ｈｚ、　ＩＩＩ）、　２．５４（ｓ
、　６１１）であった。

１．２．７．８−ジベンゾスルホンフルオレセイン、化
合物６は次のようにして調製された。丸底フラスコ中で
、１，３−ジヒドロキシナフタリン（２ｇ、　１２．５
ｍｍｏｌ）および２−クロロスルホニルベンゾイルクロ
リド、化合物１ｏ（１，５ｇ５６　、３　ｍｍｏｌ）を
混合して、油浴中で短時間加熱した。黒い固体を熱いＮ
　ａ　ＨＣＯ３溶液に溶かして、濾過した。黒い残渣（
０，２ｇ）を捨てた。濾液を沸騰するまで加熱し、濃塩
酸で酸性化した。濾過して固体を得、熱いエタノール（
１５０ｍｌ）で還流した。固体を濾別して、乾燥した。

収量は０．９ｇ（３０％）で、赤色の固体であった。１
ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ、、６０℃）は：δ８．３１（
ｄ、　Ｊ□８Ｈｘ、　２１１）、　８．１３（ｄ、　、
１８）Ｉｚ、　ＩＩ）、　７．８１（ｍ。

ＩＨ）、　７．６３（ｍ、　ＩＨ）、　７．４８（ｍ、
　２Ｈ）、　７．２４（ｄ、　Ｊ４ＨｚＩＨ）、　７．
１６（ｍ、　２Ｈ）、　７．０２（ｓ、　２［１）、　
６．９６（ｄ、　Ｊ＝９ＨＥ、　０１）であった。

構造式（Ａ）に示されたキサンチン染料は構造式（Ｃ）
に示された化合物を形成するために更に修飾された。具
体的には、ナフトフルオレセイン、化合物７は次のよう
にして調製された。丸底フラスコ中で、１．６−シヒド
ロキシナフタリン（１０ｇ、　　６３ｍｍｏｌ）　、無
水フタル酸（４，６ｇ、３１ｍｍｏｌ）および塩化亜鉛
（４，２ｇ）を混合し、油浴中で２時間加熱した。水酸
化ナトリウム（１５ｇ）および水（１００ｍｆｆ）を反
応混合物に添加した。青色の溶液をセライト（商標）で
濾過して、濃塩酸で酸性化し濾過した。得られた固体を
乾燥した。収量は１２．５ｇ（９３％）であった。粗染
料は、ジアセテートに変換後（４１％収量）、化合物４
について述へたと同様に塩基性エタノール中で加水分解
すること（８５％収量）によって精製した。ジアセテー
トの’ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ　３）は：δ８．７６（ｄ、
　Ｊ□９［１ｚ、　２１＋）、　８８−１１（、Ｉｎ）
、　７．６４（ｍ、　２Ｈ）、　７．５９（ｄ、　Ｊ＝
２Ｈｚ、　２Ｈ）、　７．４８（ｍ、　４）１）。

７．０８（ｍ、　Ｉｎ）、　６．８７（ｄ、　Ｊ＝９Ｈ
ｚ、　２［１）、　２．３４（ｓ、　６Ｈ）であった。

化合物７の’ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯｄＳ）は＝δ８．６７
（ｄ、　Ｊ＝９Ｈ２，２■）、　８．０８（ｍ、　ＩＨ
）７．７５（ｍ、２Ｈ）、７．４４（＋Ｉ、Ｊ□９Ｈｚ
、２Ｈ）、７．３６（ｄｄ、Ｊ＝９Ｈｚ、　　２Ｈ）、
　　７．２９（ｍ、　　ＩＩ）、　　７．２０（ｄ、　
　Ｊ＝２Ｈ２，２１１）６．６８（ｄ、　Ｊ・９１１２
．２［１）であった。

４．１０−ジブロモナフトフルオレセイン、化合物８は
次のようにして調製された。マグ不ント撹拌子および還
流コンデンサーを装備した丸底フラスコ中で、ナフトフ
ルオレセイン（０，２５ｇ。

０．５８　ｍｍｏｌ）　、臭素（０，５６ｇ、　３．５
ｍｍｏｌ）および酢酸（２ｍＱ）を混合し、１時間還流
した。

臭素および酢酸を蒸留によって除去した。無水酢酸（５
ｍｆｆｉ）を添加して、混合物をその色か消えるまで還
流した。混合物を冷却して、濾過した。

収量は０．３２ｇ（７８％）で、白色の固体であった。

ジアセテートの’ＨＮＭＲ（ＣＤＣＩ３）は：δ８．７
４（ｄ、　Ｊ＝９Ｈｚ、　２Ｈ）、　８．１３（ｍ、　
ＩＢ）、　７．９５（ｄ。

Ｊ＝９Ｈ２，２１’ｌ）、　７．６６（ｍ、　２１１）
、　７．５０（ｄ、　Ｊ＝９［１２，２Ｈ）７．０４（
ｍ、　ＩＨ）、　６．９９（ｄｌＪ＝９Ｈ２，２Ｈ）、
　２．１６（Ｓ、　６１１）であった。このジアセテー
トを、化合物４について述べたように塩基性エタノール
中で加水分解した（収量９８％）。

２−クロロスルホニルベンゾイルクロリド、化合物１０
はヒタブル−（化合物９）の合成の途中で次のようにし
て調製された。無水２−スルホ安息香酸（２５ｇ、　０
．１３ｍｏｌ）および５塩化リン（５６ｇ、　０．２７
ｍｏｌ）をマグネット撹拌子と還流コンデンサーを装備
した丸底フラスコ中で混合した。その混合物を撹拌しな
から油浴中で２時間加熱して、氷上に注ぎ、エーテルで
抽出した。そのエーテル性溶液を希水酸化アンモニウム
溶液で、抽出液か塩基性（ｐＨＩＯ）になるまで抽出し
た。

この工程は“非対称′″ジクロリド化合物１１をシアン
誘導体、化合物１２に変換する。このエテル性溶液を乾
燥して、白色の固体になるまで濃縮した（融点ニア５−
７８°Ｃ１文献値＝７９°Ｃ）。

収量は８．１ｇ（２６％）であった。

ビタブルー、化合物９は下記に示す工程に従って次のよ
うにして調製された。丸底フラスコ中で、２−クロロス
ルホニルベンゾイル−クロリド（３゜５　ｇ、　　１５
ｍｍｏｌ）　、１．６−シヒドロキシナフタリン（４，
７ｇ、　２９ｍｍｏｌ）および塩化亜鉛（２ｇ１１５ｍ
ｍｏｌ）を混合し、油浴中で加熱した。触媒なしに行っ
た反応でも、塩化亜鉛と共に行った反応と比較し得る収
量が得られた。

（化合物１０） （化合物１１） （化合物９） （化合物１３） （化合物１４） １時間後、混合物は黒色の固体に変化した。水酸化ナト
リウム（６ｇ、　０．１５ｍｏｌ）および水（１００ｍ
０．）を添加した。黒い溶液を濾過した。

濾液を濃塩酸で酸性化して、濾過した。黒い固体をマグ
ネット撹拌子を装備したエルレンメイヤーフラスコに移
した。エタノール（１５０ｍｔ）を添加し、混合物を撹
拌しながら沸騰させ、そして１夜の間冷却した。次の口
、混合物を濾過した。

粗染料からなる紫色の固体、化合物９を得た。収量は０
．１５ｇ（２％）であった。染料をジアセテート、化合
物１３に変換し次に加水分解することにより精製した。

ビタブルーへの変換は次のようにして行われた。

ビタブルージアセテート、化合物１３は次のようにして
調製された。丸底フラスコ中で、粗ビタブル−（１５ｇ
、０．３２ｍｍｏｌ）を無水酢酸（１００ｍＭ）と共に
その溶液が均質に見えるようになるまで還流した。熱い
間に溶液を減圧下でブフナー漏斗で濾過した。濾液を、
大気圧下で無水酢酸を蒸留することによって最初の体積
の半分まで濃縮した。赤−オレンジ色の固体が出現し、
その溶液を１夜の間冷却した。次の日、混合物を濾過し
、赤−オレンジ色の固体（２３ｍｇ）を得た。濾液を濃
縮し、そして現れた濃い茶色の固体を濾過して得た。そ
の濃い茶色の固体を無水酢酸４ｍｆｌから再結晶させ、
追加の赤−オレンジ色の固体（１７ｍｇ）を得た。全収
量は４ｏｍｇ（２２％）であった。固体は融解しなかっ
たが、２５０°Ｃ以上では分解した。’ＨＮ　Ｍ　Ｒ（
ＣＤ　ＣＩ　３）は：８８．９（ｄ、　Ｊ＝９Ｈｚ、　
２Ｂ）、　８．６２（ｄ、　Ｊ＝８Ｈｚ、　ＩＨ）、　
７．８４（ｍ、　ｌ１ｌ）、　７．５０（ｄ、　Ｊ□９
Ｈｚ、　２１１）、　７．６１（ｍ、　３Ｂ）。

？、４［１（ｍ、　４Ｈ）、　７．０３（ｄ、　Ｊ□ｇ
Ｆｉｚ、　Ｉ［ｌ）、　２．３９（ｓ、　６＋１）であ
った。

ビタブルージブチレート（ＶＢＤＢ、化合物１４）は次
のようにして調製された。丸底フラスコ中で、ビタブル
ージアセテート（１３ｍｇ、　　０．０２３ｍｍｏｌ）
を無水酪酸（５ｍｇ）と共に溶液が均質になるまで還流
した。溶媒は水アスピレターで提供される減圧下で蒸留
により除去された。追加の無水酪酸（５ｍＡ）を添加し
て、溶液を短時間還流した。溶媒を、約０．５ｍ１１の
みが残るように減圧下で除去した。生成した明るいオレ
ンジ色の固体を濾過し、エーテルで洗浄し、そして乾燥
した（１ｍｍＨｇ）、収量は１３ｍｇ（９３％）であっ
た。固体は融解しなかったが、２５０°Ｃ以上では分解
した。’ＨＮ　Ｍ　Ｒ（ＣＤ　ＣＩ　３）は：δ８．８
３（ｄ。

Ｊ＝９ｔ［ｚ、　　２［１）、　　８．６３（ｄ、　　
Ｊ＝８Ｈｘ、　　ＩＨ）、　　７．８３（ｍ、　　ｌ１
ｌ）。

７．６６（ｄ、　　Ｊ＝９１１２．　２１１１）、　　
７．６（ｍ、　　３■）、　　７．４５（ｍ、　　４Ｈ
）７．０３（＋ｌ、　　Ｊ４Ｈｚ、　　ＩＨ）、　　２
．６２（）、　　Ｊ＝７Ｈ２，４８）、１．８４（ｍ、
　４■）、　１．１０（Ｌ、　Ｊ□７■Ｚ、　６Ｈ）で
あった。

ビタブルーは、次の方法によってもビタブルージアセテ
ートから調製することができる。エタノール（５ｍｇ）
を、丸底フラスコ中で固体水酸化ナトリウム（０，２ｇ
、　５　ｍｍｏｌ）でその固体が殆ど溶けるまで暖めた
。ビタブルージアセテート（１８ｍｇ、　０．０３３ｍ
ｍｏｌ）を添加した。溶液は直ぐに青−緑色に変化した
。溶液をロータリーエバポレーターで乾固するまで濃縮
した。水（２０ｍＡ）および濃塩酸（１ｍυ）を添加し
た。混合物を濾過して、得られた紫色の固体をオーブン
中で乾燥した。収量は１５ｍｇ（９７％）であった。

’ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ、）は：δ１１．５２（ｂｒ
　ｓｌ　１１）、　９．２６（ｄ、　Ｊ＝９１１２．２
［１）、　８．０７（ｄ、　Ｊ４Ｆｈ、　Ｉ［Ｉ）７．
９２（ｄ、　Ｊ・９Ｈ３２Ｈ）、　７．７６（ｍ、　Ｉ
Ｈ）、７．６７（ｍ、　ＩＨ）。

７．６７（ｍ、　１Ｂ）、　７．５２（ｄｄ、　Ｊ・９
１１ｚ、　２［ＩＺ、　２Ｈ）、　７．４５（ｄ、　　
、ｈ２１’ｌｚ、　　２Ｈ）、　　７．３１（ｄ、　　
Ｊ＝８Ｈ２，ＩＨ）、　　７．２５（ｄ。

Ｊ・９［１２，２Ｈ）であった。

化合物３．６．９および９の誘導体は本発明のナフトス
ルホンフルオレセインおよびスルホンフルオレセインの
誘導体を含んでいる。残りの化合物は本発明のフルオレ
セインおよびナフトフルオレセインの誘導体を含んでい
る。それらの調製に続いて、各化合物をその蛍光特性に
ついて分析し、第１表の結果を得た。

第　　１　　表 ８．０ｘｌＯ’　　　　５１６ ７．８ＸｌＯ嘔　　　５１７ ５．７ＸｌＯ’　　　　５１５ １１．１ＸＩＯ’　　　　５６５ ２．４　Ｘ　１０”　　　　５８１ ８、Ｉ　Ｘ　１０’　　　　５６７ （、（Ｘ　１０’　　　　６６０ ３．２　Ｘ　１０’　　　　６８２ ３．６ＸｌＯ’　　　　６６５ （ｐＨ９，５） （ｐＨ５，２） ４８０　　　　　５．９ｘ１０３ １３ＸＩＯ’　　　　８７０ ６．３３÷／−０，０１ ６，２３＋／−０，０４ ５，５０＋／−０，０４ ６，０２＋／−０，０４ ３，９２＋／−０，０３ ５，９５＋／−０，０５ ７，９９＋／Ｊ、０２ ７．１５＋／−０，０１ ７，５６＋／−０，０３ ０，０４ Ｄ ０．０３ Ｄ 最初に、化合物１〜９および１４の消衰係数を測定した
。各染料のストック溶液（５Ｘ　１０−３Ｍ）を、染料
を２当量の０．ｌＮＮａＯＨ中に溶かし、そしてその体
積を炭酸塩／炭酸水素塩緩衝液（０゜１６．０．３４Ｍ
、ｐＨ９，５）で調整することによって調製した。その
溶液を追加の緩衝液（最終ｐＨ９，５〜１０）で希釈し
く２　Ｘ　１０−５Ｍ）、吸光スペクトルを測定した。

ビタブルーのストック溶液（１，２Ｘ　１０−３Ｍ）を
ＤＭＳＯ中で調製し、クエン酸塩緩衝液（０，１Ｍ、ｐ
Ｈ５，２）で希釈して最終濃度を１．６Ｘ１０−５Ｍに
して、その吸光スペクトルを測定した。ＶＢＤＢのスト
ック溶液（８，２Ｘ　１０−３Ｍ）をＤＭＳＯ中で調製
し、ピロリン酸塩緩衝液（０，１Ｍ、ｐＨ７，２）で希
釈して最終濃度を８．Ｉ　Ｘ　１０−’Ｍにして、その
吸光スペクトルをベツクマンＤＵ−６ＵＶ型可視光スペ
クトロフォトメーターで測定した。

次に、化合物１〜９および１４の量子収量を測定した。

化合物１〜９の溶液（Ｉ　Ｘ　１０−６Ｍ）を炭酸塩／
炭酸水素塩緩衝液（＋）Ｈ９，５）中で調製した。蛍光
放出スペクトルをパーキン−エルマーＭＰＦ−２Ａ蛍光
スペクトロフォトメーターで３ｍＭ使い捨てプラスチッ
クキュベツトを用いて測定した。励起波長を最大励起波
長の赤色側３０ｎ　ｎ〕に設定し、放出スペクトルを測
定した。放出スペクトルの下の面積（Ｆ）を測定した。

量子収量（Φ）は次式　Ｆ＝ｋ１．Φεｃｂ（式中、Ｆ
は蛍光、ｋは蛍光光度計定数、■。は励起波長での光強
度、εは励起波長での消衰係数、Ｃは染料の濃度、ｂは
キュベツトの光路長である）を用いて得られる。ｋの値
は、Φの文献値を用いることおよびフルオレセイン（４
７０〜６７０ｎｍ、Φ＝０．９２）、エオシン（５００
〜７００ｎｍ。

Φ−０，１９）およびアロフィコシアニン（アプライド
・バイオシステンズ（Ａｐｐｌｉｅｄ　ＢｉｏＳｙｓｊ
ｅｍｓ）社）、６００−８００ｎｍ、Φ−０６８）の蛍
光を測定することによって３種類の放出波長領域につい
て測定した。■。の値は、エミッンヨンモノクロメータ
ー開口を有する蛍光スペクトロフォトメーターで励起波
長の範囲を走査することによって得られる表から求めた
（白い紙を試料ホルダに置いて励起光を反射させた）。

染料の濃度は０．６〜１．０μＭであった：いずれの場
合でもこの値は式が有効となるために要求される濃度（
０００５／ε）以下であった。

化合物１〜９の蛍光滴定も行った。化合物１〜９は３ｍ
１１キユベツト中で滴定された。次に示す方法はビタブ
ルーについての滴定法である。キュベントに次に挙げる
溶液を添加した：ヒタブル（７５ｐｌ、３．３Ｘ１０−
５Ｍ）、ＥＰＰＳ緩衝液（０，２ｍＡ　、０．１Ｍ、ｐ
Ｈ８，６）　、ピロリン酸塩緩衝液（０，２ｍＭ　、０
．１Ｍ、ｐＨ１０）および水（２，５２ｍｆｆ１　）で
ある。染料の最終濃度は８．２　Ｘ　Ｉ　Ｏ−’Ｍであ
った。溶液のｐＨおよび蛍光（励起波長は６２０ｎｍ、
放出波長は６６０ｎｍである）を測定した。濃塩酸（１
μＣ１１、ＯＮ）を添加して、再度、ｐＨおよび蛍光を
測定した。この操作を、最後の蛍光が最初の蛍光の１０
％になるまで繰り返した。

次に、ビタブルーの吸光滴定を行った。プラスチックキ
ュベツト（３ｍＭりに次の溶液を添加した：り、ｘ７酸
塩緩衝液（０，１ｍＭ、０．１Ｍ。

ｐＨ４，２）、ビロリン酸塩緩衝液（０，１ｍＭ、０．
１Ｍ、ｐＨ６，２）、ＥＰＰＳ緩衝液（０，１ｍＭ　、
　０．１Ｍ、　ｐＨ８，４）　、水（２，６ｍ１１）、
塩酸溶液（５μｍ１．６Ｎ）およびビタブルー溶液（８
もしくは４０μｌ、１．２５Ｘ１０−３Ｍ）である。ヒ
タブルーの最終濃度は３．４ＸＩＯ−’もしくは１．７
Ｘ１０−’Ｍであった。初発のｐＨは約３であった。Ｎ
ａＯＨ溶液を少しく１〜３μａ１４Ｎ）添加して、７０
０ｎｍから４００ｎｍまでの吸光スペクトルおよびｐＨ
を測定した。

ビタブルーの蛍光放出スペクトルも測定した。

５つの各プラスチックキュベツト（３ｍＭ）に次に挙げ
る緩衝液（０，１Ｍ）の一つを添加した：クエン酸塩緩
衝液（ｐＨ４，２１）　、３種のｐｉ（（６，２２，７
，２１，９，０５）のピロリン酸塩緩衝液、およびＥＰ
ＰＳ緩衝液（ｐＨ８，３７）である。ビタブルー溶液（
５μＱ、１．２５Ｘ１０Ｍ）を添加し、そして４５０ｎ
ｍから６５０ｎｍまでの蛍光放出スペクトルを測定した
。励起波長は５４０ｎｍであった。

最後に、ＶＢＤＢのに□測定を行った。ＶＢＤＢ（５ｍ
ｇ、　８．２　Ｘ　１０−３ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１
ｍＭ）中に溶かし、黄色の溶液（８，２Ｘ　１０−３Ｍ
）を得た。その溶液（３０μａ）をＥＰＰＳ緩衝液（１
２ｍＭ、０．１Ｍ、ｐＨ８，０）で希釈した：最終濃度
は２．０Ｘ１０−’Ｍであった。この溶液をＥＰＰＳ緩
衝液（ｐＨ８，０）で４．ＯＸ１０Ｍ〜２Ｘ１０−５Ｍ
の濃度範囲まで希釈し、６０８ｎｍでのＯ，Ｄ、変化を
エステラーゼ（シグマ・ケミカル、Ｅ、Ｃ，３，１，１
，１，８μｇ）添加後に測定した。ラインウニバー−パ
ークプロットを第１図に示した。Ｋｍ値は４Ｘ１０−’
Ｍであり；比活性は２．５（μｇ基質）（ｍ　ｉ　ｎ）
−’　（ｍｇ酵素）−１であった。

本発明に従って調製される種々のキサンチン染料の分析
の後、染料の一つ（ＶＢＤＢ）を細胞の染色に使用した
。細胞を染色するＶＢＤＢの能力をＢＣＥＣＦ−ＡＭ、
膜透過性エステラーゼ基質（モルキュラー・プローベ）
およびフルオレセインジアセテ−１−（ＦＤＡ）と比較
した。遠心管にヒト全血（１，５ｍＭ）および塩化アン
モニウム溶解溶液（３０ｍＭ　、０．１５Ｍ　ＮＨ４Ｃ
１，１０ｍＭＫＨＣＯ３，０，１１ｍＭ　ＥＤＴＡ、ｐ
Ｈ７，３）を添加した。インキュベーション後、遠心分
離を行った。この方法は赤血球を特異的に溶解するが、
白血球は生きたままでインタクトな状態に影響を与えな
い。上澄液を除去し、残っている白血球細胞を２回洗浄
し、血液細胞希釈液（１ｍＭ、ダイアゴノスティク・テ
クノロジー社（ＤｉａｇｎｏｓｔｉｃＴｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｙ、　Ｉｎｃ））中に再懸濁した。細胞濃度および死
細胞の比率を蛍光顕微鏡およびヘマサイトメーターを使
用して手動で細胞を計数することによって確認した；ア
クリジンオレンジおよびエチジウムプロミドを使用して
生細胞および死細胞をそれぞれ染色した。細胞濃度は２
．８Ｘ１０’細胞／　ｍ　ｉｌで、死細胞の比率は２〜
４％であった。

次に、約１．７Ｘ１０’細胞の４つのサンプルをポリス
チレンの試験管に入れた。各試験管に次の溶液の一つを
添加した：　ＦＤＡ　（１μＭ）、ＢＣＥＣＦ−ＡＭ　
（１μＭ）　、ＶＢＤＢ　（０，８，１７Ｍ）、又はＶ
ＢＤＢ　（８，０μＭ）。染料溶液は各染料のストック
溶液（１−８ｍＭ１ＤＭＳＯ溶液）を血液細胞希釈液で
希釈することによって調製した。試験管を室温で３０分
間保持した。サンプルを３回洗浄して、血液細胞希釈液
（１ｍｌ＋）中に再懸濁した。

分析はアルゴンイオンレーザ−（２００ｍＷ）からの４
８８ｎｍの励起波長およびヘリウム−ネオンレーザ−（
４５ｍＷ）からの６３３ｎｍの励起波長を用いてＦＡＣ
８（登録商標）４４０デユアルレーザーフローサイトメ
ーターで行った。ＦＤＡおよびＢＣＥＣＦ−ＡＭの両方
については５３０／３０バンドパスエミツシヨンフイル
ターを使用し、一方、ＶＢＤＢについては６６０／２０
バンドパスエミツシヨンフイルターを使用した。

染色直後、染色後１時間後、および染色後２時間後の各
サンプルについて１０，０００個のデータを採取した。

第２図においては、ＶＢＤＢ、ＢＣＥＣＦ−ＡＭおよび
ＦＤＡを、溶解全血を染色しそしてフロザイトメトリー
により蛍光を検査することによって活性染料として比較
した。全ての染料は細胞内エステラーゼによって開裂さ
れて蛍光染料を提供する膜透過性エステラーゼ基質であ
る。４つの細胞サンプルをＢＣＥＣＦ−ＡＭ　（１μＭ
）、ＦＤＡ（１μＭ）およびＶＢＤＢ　（０，８μＭ、
８．０μＭ）とインキュベーションした。細胞を染色直
後（ｔ＝０）、１時間後（１＝　１）および２時間後（
ｔ＝２）に分析した。

ＦＤＡで染色された細胞は時間経過とともに最初の蛍光
を保持しなかった。低濃度のＶＢＤＢ（０，８μＭ）で
染色された細胞は最初の蛍光を維持した。ＢＣＥＣＦ−
ＡＭおよび高濃度ＶＢＤＢ（８μＭ）の両方では、染色
された細胞は１時間後に僅かに蛍光か実際に増加した。

膜透過性もしくは蛍光染料の′″漏れ″におけるこの差
異はおそらく遊離の染料の電荷に原因している　より負
に荷電されたもしくはイオン性染料は細胞膜に対する透
過性が減少する。ヒタブルーおよびフルオレセインの両
方は２つのイオン化可能なプロトンを持っている：しか
しながら、ヒタブルーのスルホン酸基はフルオレセイン
のカルボン酸基よりも数単位低いと予測されるｐＫ、を
有している。それゆえ、スルホン酸基のせいで、フルオ
レセインよりも高い比率のヒタブルーが生理学的ｐＨ６
〜７で陰イオン型またはジアニオン型（ｄｉａｎｉｏｎ
ｉｃｆｏｒｍ）であると予想される。ＢＣＥＣＦ酸は５
つのイオン化可能なプロトン（４つはカルボン酸である
）を有している。それによって他の染料と比べて細胞に
よる優れた保持性が示され、そしてそれは比較のために
有益である。

第２図に示されたデータは生細胞と死細胞の定量にも使
用することかできる。蛍光ヒストグラムには２つのピー
クが現れている。生細胞は染料を保持している細胞であ
り（右側のピーク）、そして死細胞は膜か漏れ易くなっ
ている細胞（左側のピーク）であると考えられる。主ピ
ークの直く左にゲートを設定することによって、ゲート
の左の死細胞を計数した。時間とともに、ＢＣＥＣＦＡ
Ｍの場合、死細胞もしくは乾燥細胞の数はほぼ定となっ
た（ｔ−０，１９％；ｔ＝１，２１％：ｔ−２，２１％
）。高濃度のＶＢＤＢ　（８μＭ）については、死細胞
の数は増加した（ｔ−０，１２％：ｔ−１，１７％：ｔ
−２，２２％）。低濃度のＶＢＤＢ　（０，８μＭ）に
ついても、死細胞の数は増加した（Ｌ−０，１４％；ｔ
＝１，１８％：ｔ−２，２０％）。ＶＢＤＢおよびＢＣ
ＥＣＦの両方について、′漏れる″″細胞数はエチジウ
ムプロミドおよびアクリジンオレンジを用いて最初に計
数した死細胞の比率（３〜４％）よりも多かった。この
差は細胞膜に対する染料の透過性の違いによるものと考
えられる。

蛍光ヒストグラム中で同しような変動係数（ＣＶ）を得
るにはＢＣＥＣＦに比べて高濃度のＶＢＤＢか必要であ
った。ＢＣＥＣＦの場合、ＣＶは時間経過に伴って僅か
に減少した：ｔ−０、ＣＶ−３１％；　ｔ＝１．ＣＶ＝
２８％；ｔ−２、ＣＶ−２８％であった。ＶＢＤＢの場
合、ＣＶは時間経過に伴って僅かに増加した。低濃度の
ＶＢＤＢ（０，８μＭ）の場合・１＝０、ＣＶ＝　３９
％；ｔ＝１、ＣＶ＝４３％：ｔ−２、ＣＶ＝４６％であ
った。高濃度のＶＢＤＢ　（８μＭ）の場合１＝０、Ｃ
Ｖ＝　３０％；ｔ−１、ＣＶ＝　３５％。

ｔ＝２、ＣＶ＝　３４％であった。高濃度の染料は細胞
に対して有害ではないようであった。ＢＣＥＣＦおよび
ＶＢＤＢの両方について２時間後間し数の漏れる″′細
胞が見い出された。

最後に、化合物１〜９のスペクトル特性を測定した。化
合物１〜９の消衰係数および量子収量をｐＨ９，５で測
定した。プロトンを１個付与されたヒタブルーの消衰係
数および量子収量もｐ　Ｈ５。

２で測定した。ＶＢＤＢの消衰係数および量子収量はｐ
Ｈ７，２で測定された。第３図は化合物１〜９の吸光ス
ペクトルを示しており；第４図は化合物１〜９の正規化
エミッションスペクトルを示している。

化合物９は第１表に示された染料の中で２つの蛍光（即
ち、１個および２個のプロトンを付加された両方の型と
もに蛍光を有し、しかも異なった最大励起および最大エ
ミッションを有している）を示す唯一のものであった。

第５図は異なった２種の濃度における、種々のｐＨでの
ビタブルーの吸光スペクトルを示している。明らかに、
２量体が高濃度で形成されている；化合物９のスペクト
ル中には６００ｎｍに最大値を有するピーク（ｌ。

７Ｘ　１０−５Ｍ、Ｉ）Ｈ３，１０，４，０６および６
゜４５）は低濃度（３，４Ｘ　Ｉ　Ｏ−６Ｍ）での吸光
スペクトル中には見られない。約５４０ｎｍ付近にはイ
ソベスティク（ｉｓｏｂｅｓｆｉｃ）ポイントが低濃度
での吸光滴定中にはっきりと見られる。第６図は種々の
ｐＨでの化合物９のエミッションスペクトルを示してお
り：励起波長には５４０ｎｍを使用した。エミッション
スペクトルは６３０ｎｍにイソベスティクポイントを示
している。

染料のｐ　Ｋヮ、値を蛍光滴定で測定した。示されたｐ
Ｋ、値は吸光滴定で測定された。吸光滴定またはｐ　Ｈ
滴定を用いてフルオレセインおよびその関連化合物のｐ
Ｋ−３値を測定する際の主な困難性は、ｐＫ１□とｐＫ
、３の値が僅か２．３単位しか異なっていないためにモ
ノアニオン（ｍｏｎｏａｎｉｏｎｉｃ）型のみの溶液を
作製することが不可能であることである。全ての異なっ
たプロトンを付加された型の吸光スペクトルは重なって
いるので、異なった型の消衰係数を得ることは困難であ
る。蛍光滴定によるｐＫ−１測定については、ジアニオ
ン（ｄｉａｎｉｏｎｉｃ）型のみが蛍光であると仮定し
て、そしてそれゆえ蛍光の測定値はジアニオンであるも
のと正比例している。実際には、ビタブルーについては
ジアニオンおよび七ノアニオン型の両方が蛍光である。

しかしながら、七ノアニオン型の量子収量（０，０４）
はジアニオン型のそれ（０，１５）よりもかなり低く、
２つの型の最大エミッションは１１００ｎ離れており、
分析に対する七ノアニオン型の蛍光の寄与は非常に少な
い。

水性の塩基性溶液中の染料を収納しているキュベツトを
濃い酸で滴定した。ｐＨおよび蛍光を一つの励起および
一つのエミッション波長で測定した。式ｌは酸について
のＩ）ＨおよびＩ）Ｋ−３の関係を表しており、式中Ｅ
ＨＡ’−１゜は酸（例えば、フルオレセイン）の全濃度
であり、［Ａ２−］はジアニオン型の酸の濃度である。

染料の蛍光は脱プロトンされた型の濃度に比例している
と仮定すると、式１は式２のように変形でき、式中［Ａ
２−］／［ＨＡ”〕。−正規化蛍光（ｎｆ）である。

［Ａ２−］　＝　［ＨＡ’−］。のとき、正規化蛍光因
子、又は最大蛍光についての値はその蛍光として定義さ
れる。

例えば、第７図はｐＨとビタブルーの蛍光滴定から得ら
れるデータの蛍光のプロットを示している。変曲点はｐ
　Ｈ７，６であると判断された。ｐＨ８，６およびそれ
以上のデータは採用しなかった。第８図は正規化蛍光因
子を用いて第１表の全ての染料のデータのプロット（ｌ
ｏｇ　［（１−ｎ　ｆ　）／　ｎ　ｆ　］　とｐＨ）を
示しており、その線の傾きは１に非常に近いことが分か
った。それらの点を結んで直線を引くことができ、ｐＫ
−ｓはｌｏｇ　ＥＣＩｎｆ）／ｎｆｌの値がゼロである
ときのｐＨの値として求めることができる。ビタブルー
の場合、滴定を繰り返した。２回のｐＫ−３の値は７．
５４十／−０，０３および７．５７＋／−０，０３であ
り；その平均値は７．５６＋／−０，０３であった。

第１表を検討すると、化合物５および８に２つの臭素基
を付加することは予想されるように元の化合物４および
７に比べてｐＫ、３を低下させることが分かる。化合物
５および９の消衰係数および量子収量も元の染料よりも
低下し、そして、フルオレセイおよびエオシンとの類似
性によって予期されるように最大励起はより長波長であ
った。

般に、化合物２．６および９のスルポン酸基は最大吸光
（６〜１４ｎｍ）および最大エミッション（１〜５ｎｍ
）をカルボキシ類似体１，４および７と比較して赤色に
遷移させていた。化合物２および６のスルホン酸基はｐ
Ｋ、３をカルボキシ類似体１および４に比較してほんの
僅が又は全く低下させなかった；しかしながら、ビタブ
ルーのスルホン酸基はｐＫ−３をカルボキシ類似体７に
比較して０．４単位低下させた。化合物２および９のス
ルホン酸基はカルボキン類似体１および７に比較して消
衰係数および量子収量に殆ど影響を与えなかった。しか
しながら、スルホン酸類似体、化合物６はカルボキシ類
似体４の２倍の量子収量を有している。

化合物２．６および９のスルホン酸基の別の効果はジア
セテート合成中のスルホラクトン形成を阻害することで
あった。化合物２は無水酢酸中で緑色のモノアセテート
および黄色のジアセテートの混合物を生成した：そのジ
アセテートはシリカゲル上での迅速クロマトグラフィー
により精製できた。化合物６は還流無水酢酸中でジアセ
テートを生成する前に分解した。ビタブルーも有色のジ
アセテートを生成した；ビタブルーを無水酢酸中で数時
間還流した後、そのジアセテートを赤色の固体として得
た。化合物２および９の両方のジアセテートの’ＨＮＭ
Ｒスペクトルは染料あたり２つの酢酸を示している；ジ
アセテートは色が付いているという事実はそれらの構造
が閉したスルホラクトン型および開いた双性イオン型の
間の平衡状態であることを示している。化合物９のジブ
チレート誘導体および２のジアセテート誘導体はｐＨ７
の水中で比較的安定であった。化合物９のジブチレート
誘導体は、双性イオン構造を示すとき４８０ｎｍで５．
９ＸＩＯ３の消衰係数および００３の量子収量を有する
蛍光であった（最大励起は４８０ｎｍ、最大エミッンヨ
ンは５５０ｎｍである）。

ＶＢＤＢはブタ肝臓エステラーゼ（Ｅ、Ｃ，３゜１．１
．１）の良い基質となることが分かった。

ＶＢＤＢのｐＨ８でのミカエリス（Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ
）定数（Ｋ、）は４Ｘ］０−５Ｍであることか分かった
（第１図）。このに、、、はエチルブチレートのそれ（
４，４Ｘ　１０−’Ｍ）に匹敵する。ＶＢＤＢのに□が
エチルブチレートのものよりも実際に低いという事実は
発色団の大きな立体的部分が酵素による加水分解を阻害
しないことを示している。化合物２および９のジアセテ
ートエステルもニステラゼの基質であった；しかじ、と
ちらのジアセテトも膜透過性ではなかった。

本明細書に記載された全ての出版物および特許出願は本
発明の属する分野の当業者のレベルの指標である。全て
の出版物および特許出願は個々の出版物もしくは特許出
願が参照により取り込まれるために特定的におよび個別
的に示されたように同じ範囲に参照によりここに取り込
まれる。

多くの変更および修飾が特許請求の範囲にしめさた思想
および範囲から逸脱することなく本発明の範囲内で可能
であることは当業者には明白である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ＶＢＤＢ（化合物１４）とブタ肝臓エステラ
ーゼのラインウニバルーバーク（Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ
Ｂｕｒｋ）プロットを表す図面である。 第２図ａ−ｆは、ＢＣＥＣＦ、ＦＤＡまたはＶＢＤＢで
染色されたヒト白血球細胞についての蛍光の対数のヒス
トグラムを表す一連の図面である。 第３図は、化合物１〜９について吸光度（０、Ｄ　、）
と波長のプロットを表す図面である。 第４図は、化合物１〜９について相対蛍光放出と波長の
プロットを表す図面である。 第５図ａおよびｂは、種々のｐＨにおけるビタブル−１
，７ｘ　１０−’Ｍ（ａ　）および３．４Ｘ１０Ｍ　（
ｂ）の濃度での吸光度（０，Ｄ、）と波長のプロットを
表す一連の図面である。 第６図は、種々のｐＨにおけるビタブルーについて蛍光
と波長のプロットを表す図面である。 第７図は、ビタブルーについて蛍光とｐＨのプロットを
表す図面である。 第８図は、化合物１〜９についてｐＨとｌｏｇ［（１−
ｎｆ）／　（ｎｆ）］のププロトを表す図面である。 Ｆ／Ｇ−５ σノ ／、７　Ｘ　１０’Ｍ ｂノ Ｊ、４　ｘ　ｔｃｆ’％ｔ ミ反長 （ｎｍ） 液長 （ｎｍ）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、構造式： ▲数式、化学式、表等があります▼ で表される化合物４、構造式： ▲数式、化学式、表等があります▼ で表される化合物５、構造式： ▲数式、化学式、表等があります▼ で表される化合物６、構造式： ▲数式、化学式、表等があります▼ で表される化合物９、構造式： ▲数式、化学式、表等があります▼ で表される化合物１３または構造式： ▲数式、化学式、表等があります▼ で表される化合物１４のいずれかの構造を有する化合物
   。 ２、請求項１記載の化合物９の構造を有する化合物。 ３、請求項１記載の化合物１４の構造を有する化合物。 ４、細胞を請求項１記載の化合物４、５、６、９、１３
   または１４のいずれかと結合している標識付け用試薬（
   ｔａｇｇｉｎｇａｇｅｎｔ）と接触させることからなる
   サンプル中の細胞を染色する方法。 ５、標識付け用試薬がモノクロナール抗体である、請求
   項４記載の方法。 ６、細胞が体組織または体液由来である、請求項４記載
   の方法。 ７、化合物が請求項１記載の化合物９である、請求項４
   記載の方法。 ８、化合物が請求項１記載の化合物１４である、請求項
   ４記載の方法。 ９、細胞を請求項１記載の化合物４、５、６、９、１３
   または１４のいずれかと結合している標識付け用試薬と
   接触させることおよびそれによって放出される蛍光を検
   出することからなるサンプル中の細胞を同定する方法。 １０、標識付け用試薬がモノクロナール抗体である、請
   求項９記載の方法。 １１、細胞が体組織または体液由来である、請求項９記
   載の方法。 １２、蛍光がフローサイトメーターを用いて検出される
   、請求項９記載の方法。 １３、化合物が請求項１記載の化合物９である、請求項
   ９記載の方法。 １４、化合物が請求項１記載の化合物１４である、請求
   項９記載の方法。 １５、細胞を請求項１記載の化合物４、５、６、９、１
   ３または１４のいずれかと結合している標識付け用試薬
   と接触させることおよびそれによって放出される蛍光を
   検出することからなるサンプル中の生細胞および死細胞
   を識別する方法。 １６、細胞を請求項１記載の化合物４、５、６、９、１
   ３または１４のいずれかと接触させることからなる細胞
   サンプル中の酵素活性を検出する方法。