JPH064618B2 - 新規キサンテン染料 - Google Patents

新規キサンテン染料

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JPH064618B2
JPH064618B2 JP1218428A JP21842889A JPH064618B2 JP H064618 B2 JPH064618 B2 JP H064618B2 JP 1218428 A JP1218428 A JP 1218428A JP 21842889 A JP21842889 A JP 21842889A JP H064618 B2 JPH064618 B2 JP H064618B2
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    • C09B11/00—Diaryl- or thriarylmethane dyes
    • C09B11/28—Pyronines ; Xanthon, thioxanthon, selenoxanthan, telluroxanthon dyes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label

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Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、新規なキサンテン染料、より詳細には細胞分
析に使用できる蛍光スルホンキサンテン(sulfonexanthe
ne)染料に関する。
（従来の技術） キサンテン染料は最も一般的に使用されている種類の蛍
光染料の一つである。フルオレセイン、即ちジヒドロキ
シキサンテン染料は幾つかの理由により特に有益な生物
学的染料であり、その理由としては：そのジアニオン型
の染料は水に非常によく溶けること；ｐＫａが６．３〜
６．７であるので、生理学的ｐＨ（７．０〜７．６）で
殆ど脱プロトン化されそして蛍光性であること；染料の
最大励起（４９０ｎｍ）はアルゴンイオンレーザーの４
８８ｎｍ線によく一致していること；高い消衰係数（８
×１０4Ｍ-1cm-1）を有していること；および高い量子
収量を有していることである。最後の二つの特性は微量
の染料の検出を可能にする。
これらの特性に加えて、フルオレセインの誘導体は、簡
単に合成でき、そして生物学的目的のにために染料の利
用を可能にしている（例えば、フルオレセインジアセテ
ートは膜透過性エステラーゼ基質としての用途を有して
いる）。一つの誘導体であるフルオレセインイソチオシ
アネート（ＦＩＴＣ）はフローサイトメトリーの分野に
おいて広く使用されている。
フローサイトメーターは、１以上の励起源を有している
こと（典型的には特定の波長に調整されたレーザー）、
細胞を一度に実質的に１個づつ測定区域を通過させるこ
とを可能にする手段、およびそれらの細胞が測定区域を
通過するときの細胞からの散乱光及び蛍光を検出するた
めの手段を一般的な特徴としている。各々の細胞につい
てのデータを記録するための手段を装置に接続すること
も可能である。
フルオレセインイソチオシアネートは、どのような型の
抗体とも結合させることができるけれども、一般的に
は、サンプル中の特定の細胞と反応するモノクローナル
抗体（ＭＡｂ）と結合させて用いるようなシステムにお
いて使用されている。ＦＩＴＣに結合したＭＡｂを保持
している細胞が測定区域を通過する際、レーザーが染料
を励起し、そして蛍光が放出され、検出手段の１つによ
り集められる。ヘーゼンバーグ(Herzenberg)らによるSc
i.Amer.,(1979)の報告および米国特許第４，５９９，３
０７号明細書は一般的なフローサイトメーターを開示し
ており、また、ＦＩＴＣ結合ＭＡｂを使用して特定の細
胞の存在を検出できることを開示している。更に、米国
特許第４，７２７，０２０号明細書は、該酸染料のよう
な他の標識付け用試薬(tagging agent)と組み合わせて
ＦＩＴＣ結合ＭＡｂを用いて血液細胞の亜集団（サブポ
ピュレーション）分析についての方法を開示している。
しかしながら、フルオレセインイソチオシアネートの有
益性には、４８８ｎｍで励起され５２０ｎｍで放出され
るという幾分の制限がある。ＦＩＴＣの特徴を有すると
共にフルオレセインの赤領域に最大励起を持っているこ
とは有益であろう。より長い波長の励起および放出を有
する染料の利点は幾つかあり；即ち、生物学的試料（例
えば、ＤＮＡ）からのバックグラウンド蛍光が少なく；
染料を励起するために必要なレーザーの大きさおよび価
格が減少し；ならびに低波長のレーザーとしてアルゴン
イオンレーザーを使用する２レーザー励起を実現できる
可能性がある。このような理由により、そのような性質
を有している染料はサンプル中の細胞分析に有益であ
る。
（発明の構成） 本発明はフルオレセインの赤領域に最大放出（エミッシ
ョン）および励起を有している新規キサンテン染料を提
供する。本発明のキサンテン染料はスルホンフルオレセ
イン(sulfonefluorescein)およびナフトスルホンフルオ
レセイン(naphthosulfonefluorescein)の誘導体、並び
にフルオレセインおよびナフトフルオレセインの誘導体
を含んでいる。スルホンフルオレセインおよびナフトス
ルホンフルオレセインの誘導体が好ましく、そしてビタ
ブルー(Vita Blue)と命名されたナフトスルホンフルオ
レセインが特に好ましい。
本発明のキサンテン染料は細胞分析において有益であ
る。種々の固定組織（例えば、脾臓および胸腺）および
体液（例えば、血液、尿および骨髄）から採取された細
胞サンプルを、特定の細胞と反応性のある標識付け用試
薬(tagging agent)（例えば、モノクローナル抗体）と
組み合わせて分析することができる。これらの標識付け
用試薬は、ビチオン−アビジン複合体のように当分野で
よく知られている手段によって本発明の新規染料と間接
的にもしくは直接的に結合される。更に本発明の染料の
別の態様のものは細胞内ｐＨ指示薬として、および
“生”細胞と“死”細胞を識別する手段として使用する
ことができる。
サンプル中の細胞の分析は、標識細胞からの蛍光を検出
できるいかなる手段によっても行うことができる。蛍光
顕微鏡はその方法の一つであり、そしてフローサイトメ
ーター（例えば、ベクトン・ディキンソン・イムノサイ
トメトリー・システムズ(BDIS)のFACScan（商標）また
はFACStar（商標）である）は自動化手段として使用す
ることができる。
ここで、図面について簡単に説明する。
第１図は、ＶＢＤＢ（化合物１４）とブタ肝臓エステラ
ーゼのラインウェバー−バーグ(Lineweaver-Burk)プロ
ットである。
第２図は、ＢＣＥＣＦ，ＦＤＡまたはＶＢＤＢで染色さ
れたヒト白血球細胞についての蛍光の対数のヒストグラ
ムを表す一連の図面であって、（ａ）および（ｄ）はそ
れぞれ５３０／３０バンドパスフィルターおよび６６０
／２０バンドパスフィルターを使用した非染色細胞を表
している。
第３図は、化合物１〜９について吸光度（Ｏ．Ｄ．）と
波長のプロットである。
第４図は、化合物１〜９について相対蛍光エミッション
と波長のプロットである。
第５図は、種々のｐＨにおけるビタブルー１．７×１０
-5Ｍ（ａ）および３．４×１０-6Ｍ（ｂ）の濃度での吸
光度（Ｏ．Ｄ．）と波長のプロットである。
第６図は、種々のｐＨにおけるビタブルーについて蛍光
と波長のプロットである。
第７図は、ビタブルーについて蛍光とｐＨのプロットで
ある。
第８図は、第１表のデータについてｐＨとlog［（１−
ｎｆ）／（ｎｆ）］のプロットであって、ここで“ｎ
ｆ”は正規化された蛍光である。
本発明の基礎をなすキサンテン化合物は以下の方法によ
って調製された。特に明記しない限り、全ての化合物は
アルドリッチ・ケミカル・コーポレーション(Aldrich C
hemical Co.)から入手した。キサンテン染料の基本構造
は次の構造式（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）に示される。
構造式（Ａ）において、化合物１はＲがＣＯ２Ｈ，Ｙが
Ｏであり；化合物２はＲがＳＯ３Ｈ，ＹがＯであり；化
合物３はＲがＣＯ2Ｈ，Ｙが＋Ｎ（ＣＨ3）2である。
構造式（Ｂ）において、化合物４はＲがＣＯ2Ｈ，Ｘが
Ｈであり；化合物５はＲがＣＯ2Ｈ，ＸがＢｒであり；
化合物６はＲがＳＯ3Ｈ，ＸがＨである。
構造式（Ｃ）において、化合物７はＲがＣＯ2Ｈ，Ｘが
Ｈであり；化合物８はＲがＣＯ2Ｈ，ＸがＢｒであり；
化合物９はＲがＳＯ3Ｈ，ＸがＨである。
フルオレセインの構造は化合物１として示される。化合
物２のスルホンフルオレセイン(sulfonefluorescein)は
次のようにして調製された：レゾルシノール（２ｇ、１
８mmol）、２−スルホ安息香酸無水物（１．７ｇ、９mm
ol）、ポリリン酸（８ｇ）を丸底フラスコ中で混合し、
油浴中で３．５時間加熱した。生成した赤色の溶液を水
中に注ぎ、そして濾過して固体を得た。その固体を１０
％ＮａＨＣＯ3溶液に溶かし、そして濾過した。濾液を
沸騰するまで加熱し、そして濃塩酸で酸性化した。固体
を濾過して得、乾燥した。収量は１．８５ｇ（５５％）
であった。1Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）は：δ8.0(d,
k＝8Hz,1H),7.69(m,1H),7.60(m,1H),7.4(d,J＝10Hz,2
H),7.28(m,3H),7.16(m,2H)である。
スルホンフルオレセインジアセテート、化合物１３は次
のようにして調製された。スルホンフルオレセイン
（０．２８ｇ、０．７６mmol）を無水酢酸（１５ｍ）
と共に７時間還流した。そして、溶液を一夜冷却した。
次の日、暗い緑の光る結晶を濾過して得、重さが変化し
なくなるまで乾燥した。収量は０．２ｇ（６４％）であ
った。その固体の1Ｈ ＮＭＲの結果はそれがモノアセ
テートおよびジアセテートの混合物であることを示し
た。ジアセテートはシリカゲル上での中圧クロマトグラ
フィーによって精製することができた。モノアセテート
およびジアセテート（２０ｍｇ）のＣＨ2Ｃ１2溶液
（０．５ｍ）をシリカゲルに負荷し、そして追加のＣ
Ｈ2Ｃ１2で迅速に溶出した。モノアセテートはこの条件
下では加水分解されたようであり、そして赤色の固体の
層（おそらく化合物２）がカラムの頂上に残った。濾液
を濃縮して、黄色の固体（５ｍｇ）を得た。1H NMR(CDC
13)は：δ8.12(d,J＝8Hz,1H),7.71(m,1H),7.62(m,1H),
7.49(d,J＝9Hz,2H),7.46(d,J＝2Hz,2H),7.10(dd,J＝9H
z,2Hz,2H),7.05(d,J＝8Hz,1H),2.35(s,6H)である。
ロードル(Rhodol)、化合物３は次のようにして調製され
た。フルオレセイン（３．２ｇ、９．６mmol）、水酸化
ナトリウム（６．４ｇ、０．１７mmol）および水（３．
２ｍ）をオイルバス中で３時間攪拌しながら加熱し
た。溶液は紫色に変化し、そして次に黄色になった。溶
液を冷却し、水（２０ｍ）を添加し、そしてその溶液
を濃塩酸でｐＨ１まで酸性化した。生成した混合物（黄
色の油状物と白色の固体である）はエーテルで抽出し、
そのエーテル画分を濃縮した。油状物をエタノール−水
混合物から再結晶させ、黄色の光る針状物を得た（１．
５ｇ、６０％）。融点は２１０℃であった。
２−カルボキシ−２′，４′−ジヒドロキシベンゾフェ
ノン（０．８７ｇ、２．８mmol）、３−ジメチルアミノ
フェノール（０．３９ｇ、２．８mmol）及び塩化亜鉛
（０．３８ｇ、２．８mmol）を丸底フラスコ中で混合し
て油浴中で一夜の間加熱した。エタノールに溶かした反
応混合物の一部分の薄層クロマトグラフィー（シリカゲ
ル、酢酸エチル）はフルオレセイン、ローダミンおよび
ロードルの混合物であることを示した。その混合物を、
酢酸エチルに続いて酢酸エチルとエタノール１：１の混
合物に使用するシリカゲル上の中圧クロマトグラフィー
によって精製した。ロードルおよびローダミンを含んで
いる画分を濃縮し、メタノールとエチルアセテート１：
１０の混合物で破砕して、濾過し、そして乾燥した。収
量は０．２ｇ（２１％）であり、赤色の固体であった。
1Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）は：δ8.03(d,J＝7Hz,1
H),7.66(m,2H),7.2(d,J＝7Hz,1H),6.62-6.40(m,6H),2.9
8(s,6H)である。
次に、構造式（Ａ）に示される化合物の基本構造を、構
造式（Ｂ）に示された化合物を形成するために修飾し
た。具体的には、１，２，７，８−ジベンゾフルオレセ
イン、化合物４は次のようにして調製された。丸底フラ
スコ中で、１，３−ジヒドロキシナフタリン（１ｇ、
６．３mmol）およびフタロイルジクロリド（０．６３
ｇ、３．１mmol）を油浴中で短時間加熱した。水（３０
ｍ）および水酸化ナトリウム（１ｇ）を加えた。その
溶液を濃塩酸で酸性化して、濾過した。その固体を無水
酢酸（３０ｍ）と共に均質になるまで還流した。その
溶液を一夜冷却した。ジアセテートを濾過して、淡いオ
レンジ色の固体として集めた。1 Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣ１3）は：δ8.19(d,J＝8Hz,1H),7.
92(m,2H),7.55(m,4H),7.3(m,6H),7.21(d,J＝7Hz,1H),2.
50(s,6H)であった。水酸化ナトリウム（１ｇ）およびエ
タノール（１０ｍ）を丸底フラスコ中のジアセテート
に添加し、そして混合物を減圧下で乾燥するまで濃縮し
た。水（２０ｍ）および濃塩酸を添加し；濾過して固
体を得、乾燥した。収量は０．３４ｇ（２４％）であっ
た。
１，２，７，８−ジベンゾ−４，５−ジブロモフルオレ
セイン、化合物５は次のようにして調製された。１，
２，７，８−ジベンゾフルオレセイン（０．２５ｇ、
０．５８mmol）、臭素（０．４ｇ、２．３mmol）および
酢酸（３ｍ）をマグネット攪拌子および還流コンデン
サーが装備された丸底フラスコ中で混合した。混合物を
１時間還流した。水（２０ｍ）を添加し、混合物を濾
過して、得られた赤色の固体を乾燥した。収量は０．２
１ｇ（６２％）であった。この化合物は、化合物４につ
いて述べたようにジアセテートへの変換および塩基性エ
タノール中で加水分解によって精製された。ジアセテー
トの1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣ１3）は：δ8.15(d,J＝7Hz,1
H),7.83(m,2H),7.65(d,J＝8Hz,2H),7.55(m,2H),7.36(m,
4H),7.26(d,J＝7Hz,1H),2.54(s,6H)であった。
１，２，７，８−ジベンゾスルホンフルオレセイン、化
合物６は次のようにして調製された。丸底フラスコ中
で、１，３−ジヒドロキシナフタリン（２ｇ、１２．５
mmol）および２−クロロスルホニルベンゾイルクロリ
ド、化合物１０（１．５ｇ、６．３mmol）を混合して、
油浴中で短時間加熱した。黒い固体を熱いＮａＨＣＯ3
溶液に溶かして、濾過した。黒い残渣（０．２ｇ）を捨
てた。濾液を沸騰するまで加熱し、濃塩酸で酸性化し
た。濾過して固体を得、熱いエタノール（１５０ｍ）
で還流した。固体を濾別して、乾燥した。収量は０．９
ｇ（３０％）で、赤色の固体であった。1Ｈ ＮＭＲ
（ＤＭＳＯ−ｄ6，６０℃）は：δ8.31(d,J＝8Hz,2H),
8.13(d,J＝8Hz,1H),7.81(m,1H),7.63(m,1H),7.48(m,2
H),7.24(d,J＝8Hz,1H),7.16(m,2H),7.02(s,2H),6.96(d,
J＝9Hz,2H)であった。
構造式（Ａ）に示されたキサンテン染料は構造式（Ｃ）
に示された化合物を形成するために更に修飾された。具
体的には、ナフトフルオレセイン、化合物７は次のよう
にして調製された。丸底フラスコ中で、１，６−ジヒド
ロキシナフタリン（１０ｇ、６３mmol）、無水フタル酸
（４．６ｇ、３１mmol）および塩化亜鉛（４．２ｇ）を
混合し、油浴中で２時間加熱した。水酸化ナトリウム
（１５０ｇ）および水（１００ｍ）を反応混合物に添
加した。青色の溶液をセライト（商標）で濾過して、濃
塩酸で酸性化し濾過した。得られた固体を乾燥した。収
量は１２．５ｇ（９３％）であった。粗染料は、ジアセ
テートに変換後（４１％収量）、化合物４について述べ
たと同様に塩基性エタノール中で加水分解すること（８
５％収量）によって精製した。ジアセテートの1Ｈ Ｎ
ＭＲ（ＣＤＣ１3）は：δ8.76(d,J＝9Hz,2H),8.11(m,1
H),7.64(m,2H),7.59(d,J＝2Hz,2H),7.48(m,4H),7.08(m,
1H),6.87(d,J＝9Hz,2H),2.34(s,6H)であった。化合物７
の1Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）は：δ8.67(d,J＝9Hz,
2H),8.08(m,1H),7.75(m,2H),7.44(d,J＝9Hz,2H),7.36(d
d,J＝9Hz,2H),7.29(m,1H),7.20(d,J＝2Hz,2H),6.68(d,J
＝9Hz,2H)であった。
４，１０−ジブロモナフトフルオレセイン、化合物８は
次のようにして調製された。マグネット攪拌子および還
流コンデンサーを装備した丸底フラスコ中で、ナフトフ
ルオレセイン（０．２５ｇ、０．５８mmol）、臭素
（０．５６ｇ、３．５mmol）および酢酸（２ｍ）を混
合し、１時間還流した。臭素および酢酸を蒸留によって
除去した。無水酢酸（５ｍ）を添加して、混合物をそ
の色が消えるまで還流した。混合物を冷却して、濾過し
た。収量は０．３２ｇ（７８％）で、白色の固体であっ
た。ジアセテートの1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣ１3）は：δ8.
74(d,J＝9Hz,2H),8.13(m,1H),7.95(d,J＝9Hz,2H),7.66
(m,2H),7.50(d,J＝9Hz,2H),7.04(m,1H),6.99(d,J＝9Hz,
2H),2.46(s,6H)であった。このジアセテートを、化合物
４について述べたように塩基性エタノール中で加水分解
した（収量９８％）。
２−クロロスルホニルベンゾイルクロリド、化合物１０
はビタブルー（化合物９）の合成の途中で次のようにし
て調製された。無水２−スルホ安息香酸（２５ｇ、０．
１３mol）および５塩化リン（５６ｇ、０．２７mol）を
マグネット攪拌子と還流コンデンサーを装備した丸底フ
ラスコ中で混合した。その混合物を攪拌しながら油浴中
で２時間加熱して、氷上に注ぎ、エーテルで抽出した。
そのエーテル性溶液を希水酸化アンモニウム溶液で、抽
出液が塩基性（ｐＨ１０）になるまで抽出した。この工
程は“非対称”ジクロリド、化合物１１をシアノ誘導
体、化合物１２に変換する。このエーテル性溶液を乾燥
して、白色の固体になるまで濃縮した（融点：７５−７
８℃、文献値：７９℃）。収量は８．１ｇ（２６％）で
あった。
ビタブルー、化合物９は下記に示す工程に従って次のよ
うにして調製された。丸底フラスコ中で、２−クロロス
ルホニルベンゾイル−クロリド（３．５ｇ、１５mmo
l）、１．６−ジヒドロキシナフタリン（４．７ｇ、２
９mmol）および塩化亜鉛（２ｇ、１５mmol）を混合し、
油浴中で加熱した。触媒なしに行った反応でも、塩化亜
鉛と共に行った反応と比較し得る収量が得られた。
１時間後、混合物は黒色の固体に変化した。水酸化ナト
リウム（６ｇ、０．１５mol）および水（１００ｍ）
を添加した。黒い溶液を濾過した。濾液を濃塩酸で酸性
化して、濾過した。黒い固体をマグネット攪拌子を装備
したエルレンメイヤーフラスコに移した。エタノール
（１５０ｍ）を添加し、混合物を攪拌しながら沸騰さ
せ、そして１夜の間冷却した。次の日、混合物を濾過し
た。粗染料からなる紫色の固体、化合物９を得た。収量
は０．１５ｇ（２％）であった。染料をジアセテート、
化合物１３に変換し次に加水分解することにより精製し
た。
ビタブルーへの変換は次のようにして行われた。ビタブ
ルージアセテート、化合物１３は次のようにして調製さ
れた。丸底フラスコ中で、粗ビタブルー（１５ｇ、０．
３２mmol）を無水酢酸（１００）と共にその溶液が均
質に見えるようになるまで還流した。熱い間に溶液を減
圧下でブフナー漏斗で濾過した。濾液を、大気圧下で無
水酢酸を蒸留することによって最初の体積の半分まで濃
縮した。赤−オレンジ色の固体が出現し、その溶液を１
夜の間冷却した。次の日、混合物を濾過し、赤−オレン
ジ色の固体（２３ｍｇ）を得た。濾液を濃縮し、そして
現れた濃い茶色の固体を濾過して得た。その濃い茶色の
固体を無水酢酸４ｍから再結晶させ、追加の赤−オレ
ンジ色の固体（１７ｍｇ）を得た。全収量は４０ｍｇ
（２２％）であった。固体は融解しなかったが、２５０
℃以上では分解した。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣ１3）は：δ
8.9(d,J＝9Hz,2H),8.62(d,J＝8Hz,1H),7.84(m,1H),7.50
(d,J＝9Hz,2H),7.61(m,3H),7.48(m,4H),7.03(d,J＝8Hz,
1H),2.39(s,6H)であった。
ビタブルージブチレート（ＶＢＤＢ、化合物１４）は次
のようにして調製された。丸底フラスコ中で、ビタブル
ージアセテート（１３ｍｇ、０．０２３mmol）を無水酪
酸（５ｍ）と共に溶液が均質になるまで還流した。溶
媒は水アスピレターで提供される減圧下で蒸留により除
去された。追加の無水酪酸（５ｍ）を添加して、溶液
を短時間還流した。溶媒を、約０．５ｍのみが残るよ
うに減圧下で除去した。生成した明るいオレンジ色の固
体を濾過し、エーテルで洗浄し、そして乾燥した（１ｍ
ｍＨｇ）。収量は１３ｍｇ（９３％）であった。固体は
融解しなかったが、２５０℃以上では分解した。1Ｈ
ＮＭＲ（ＣＤＣ１3）は：δ8.83(d,J＝9Hz,2H),8.63(d,
J＝8Hz,1H),7.83(m,1H),7.66(d,J＝9Hz,2H),7.6(m,3H),
7.45(m,4H),7.03(d,J＝8Hz,1H),2.62(t,J＝7Hz,4H),1.8
4(m,4H),1.10(t,J＝7Hz,6H)であった。
ビタブルーは、次の方法によってもビタブルージアセテ
ートから調製することができる。エタノール（５ｍ）
を、丸底フラスコ中で固体水酸化ナトリウム（０．２
ｇ、５mmol）でその固体が殆ど溶けるまで暖めた。ビタ
ブルージアセテート（１８ｍｇ、０．０３３mmol）を添
加した、溶液は直ぐに青−緑色に変化した。溶液をロー
タリーエバポレーターで乾固するまで濃縮した。水（２
０ｍ）および濃塩酸（１ｍ）を添加した。混合物を
濾過して、得られた紫色の固体をオーブン中で乾燥し
た。収量は１５ｍｇ（９７％）であった。1Ｈ ＮＭＲ
（ＤＭＳＯ−ｄ6）は：δ11.52(br s,1H),9.26(d,J＝9H
z,2H),8.07(d,J＝8Hz,1H),7.92(d,J＝9Hz,2H),7.76(m,1
H),7.67(m,1H),7.67(m,1H),7.52(dd,J＝9Hz,2Hz,2H),7.
45(d,J＝2Hz,2H),7.31(d,J＝8Hz,1H),7.25(d,J＝9Hz,2
H)であった。
化合物３、６、９および９の誘導体は本発明のナフトス
ルホンフルオレセインおよびスルホンフルオレセインの
誘導体を含んでいる。残りの化合物は本発明のフルオレ
セインおよびナフトフルオレセインの誘導体を含んでい
る。それらの調製に続いて、各化合物をその蛍光特性に
ついて分析し、第１表の結果を得た。
最初に、化合物１〜９および１４の消衰係数を測定し
た。各染料のストック溶液（５×１０-3Ｍ）を、染料を
２当量の０．１Ｎ ＮａＯＨ中に溶かし、そしてその体
積を炭酸塩／炭酸水素塩緩衝液（０．１６、０．３４
Ｍ、ｐＨ９．５）で調製することによって調製した。そ
の溶液を追加の緩衝液（最終ｐＨ９．５〜１０）で希釈
し（２×１０-5Ｍ）、吸光スペクトルを測定した。ビタ
ブルーストック溶液（１．２×１０-3Ｍ）をＤＭＳＯ中
で調製し、クエン酸塩緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ５．２）
で希釈して最終濃縮を１．６×１０-5Ｍにして、その吸
光スペクトルを測定した。ＶＢＤＢのストック溶液
（８．２×１０-3Ｍ）をＤＭＳＯ中で調製し、ピロリン
酸塩緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．２）で希釈して最終濃
度を８．１×１０-5Ｍにして、その吸光スペクトルをベ
ックマンＤＵ−６ＵＶ型可視光スペクトロフォトメータ
ーで測定した。
次に、化合物１〜９および１４の量子収量を測定した。
化合物１〜９の溶液（１×１０-6Ｍ）を炭酸塩／炭酸水
素塩緩衝液（ｐＨ９．５）中で調製した。蛍光放出スペ
クトルをパーキン−エルマ−ＭＰＦ−２Ａ蛍光スペクト
ロフォトメーターで３ｍ使い捨てプラスチックキュベ
ットを用いて測定した。励起波長を最大励起波長の赤色
側３０ｎｍに設定し、放出スペクトルを測定した。放出
スペクトルの下の面積（Ｆ）を測定した。量子収量
（Φ）は次式：Ｆ＝ｋＩ0Φεｃｂ（式中、Ｆは蛍光、
ｋは蛍光光度計定数、Ｉ0は励起波長での光強度、εは
励起波長での消衰係数、ｃは染料の濃度、ｂはキュベッ
トの光路長である）を用いて得られる。ｋの値は、Φの
文献値を用いることおよびフルオレセイン（４７０〜６
７０ｎｍ、Φ＝０．９２）、エオシン（５００〜７００
ｎｍ、Φ＝０．１９）およびアロフィコシアニン（アプ
ライド・バイオシステンズ(Applied BioSystems)社）、
６００〜８００ｎｍ、Φ＝０．６８）の蛍光を測定する
ことによって３種類の放出波長領域について測定した。
Ｉ0の値は、エミッションモノクロメーター開口を有す
る蛍光スペクトロフォトメーターで励起波長の範囲を走
査することによって得られる表から求めた（白い紙を試
料ホルダーに置いて励起光を反射させた）。染料の濃度
は０．６〜１．０μＭであった；いずれの場合でもこの
値は式が有効となるために要求される濃度（０．００５
／ε）以下であった。
化合物１〜９の蛍光滴定も行った。化合物１〜９は３ｍ
キュベット中で滴定された。次に示す方法はビタブル
ーについての滴定法である。キュベットに次に挙げる溶
液を添加した：ビタブルー（７５μ、３．３×１０-5
Ｍ）、ＥＰＰＳ緩衝液（０．２ｍ、０．１Ｍ、ｐＨ
８．６）、ピロリン酸塩緩衝液（０．２ｍ、０．１
Ｍ、ｐＨ１０）および水（２．５２ｍ）である。染料
の最終濃度は８．２×１０-7Ｍであった。溶液のｐＨお
よび蛍光（励起波長は６２０ｎｍ、放出波長は６６０ｎ
ｍである）を測定した。濃塩酸（１μ、１．０Ｎ）を
添加して、再度、ｐＨおよび蛍光を測定した。この操作
を、最後の蛍光が最初の蛍光の１０％になるまで繰り返
した。
次に、ビタブルーの吸光滴定を行った。プラスチックキ
ュベット（３ｍ）に次の溶液を添加した；クエン酸塩
緩衝液（０．１ｍ、０．１Ｍ、ｐＨ４．２）、ピロリ
ン酸塩緩衝液（０．１ｍ、０．１Ｍ、ｐＨ６．２）、
ＥＰＰＳ緩衝液（０．１ｍ、０．１Ｍ、ｐＨ８．
４）、水（２．６ｍ）、塩酸溶液（５μ、６Ｎ）お
よびビタブルー溶液（８もしくは４０μ、１．２５×
１０-3Ｍ）である。ビタブルーの最終濃度は３．４×１
０-6もしくは１．７×１０-5Ｍであった。初発のｐＨは
約３であった。ＮａＯＨ溶液を少し（１〜３μ、４
Ｎ）添加して、７００ｎｍから４００ｎｍまでの吸光ス
ペクトルおよびｐＨを測定した。
ビタブルーの蛍光放出スペクトルも測定した。５つの各
プラスチックキュベット（３ｍ）に次に挙げる緩衝液
（０．１Ｍ）の一つを添加した：クエン酸塩緩衝液（ｐ
Ｈ４．２１）、３種のｐＨ（６．２２、７．２１、９．
０５）のピロリン酸塩緩衝液、およびＥＰＰＳ緩衝液
（ｐＨ８．３７）である。ビタブルー溶液（５μ、
１．２５×１０-3Ｍ）を添加し、そして４５０ｎｍから
６５０ｎｍまでの蛍光放出スペクトルを測定した。励起
波長は５４０ｎｍであった。
最後に、ＶＢＤＢのＫm測定を行った。ＶＢＤＢ（５ｍ
ｇ、８．２×１０-3mmol）をＤＭＳＯ（１ｍ）中に溶
かし、黄色の溶液（８．２×１０-3Ｍ）を得た。その溶
液（３０μ）をＥＰＰＳ緩衝液（１２ｍ、０．１
Ｍ、ｐＨ８．０）で希釈した：最終濃度は２．０×１０
-5Ｍであった。この溶液をＥＰＰＳ緩衝液（ｐＨ８．
０）で４．０×１０-6Ｍ〜２×１０-5Ｍの濃度範囲まで
希釈し、６０８ｎｍでのＯ．Ｄ．変化をエステラーゼ
（シグマ・ケミカル、Ｅ．Ｃ．３．１．１．１，８μ
ｇ）添加後に測定した。ラインウェバー−バークプロッ
トを第１図に示した。Ｋｍ値は４×１０-5Ｍであり；比
活性は２．５（μｇ基質）（ｍｉｎ）-1（ｍｇ酵素）-1
であった。
本発明に従って調製される種々のキサンテン染料の分析
の後、染料の一つ（ＶＢＤＢ）を細胞の染色に使用し
た。細胞を染色するＶＢＤＢの能力をＢＣＥＣＦ−Ａ
Ｍ、膜透過性エステラーゼ基質（モルキュラー・プロー
ベ）およびフルオレセインジアセテート（ＦＤＡ）と比
較した。遠心管にヒト全血（１．５ｍ）および塩化ア
ンモニウム溶解溶液（３０ｍ、０．１５Ｍ ＮＨ4Ｃ
１、１０ｍＭ ＫＨＣＯ3、０．１１ｍＭ ＥＤＴＡ、
ｐＨ７．３）を添加した。インキュベーション後、遠心
分離を行った。この方法は赤血球を特異的に溶解する
が、白血球は生きたままでインタクトな状態に影響を与
えない。上澄液を除去し、残っている白血球細胞を２回
洗浄し、血液細胞希釈液（１ｍ、ダイアゴノスティク
・テクノロジー社(Diagnostic Technology,Inc))中に再
懸濁した。細胞濃度および死細胞の比率を蛍光顕微鏡お
よびヘマサイトメーターを使用して手動で細胞を計数す
ることによって確認した；アクリジンオレンジおよびエ
チジウムブロミドを使用して生細胞および死細胞をそれ
ぞれ染色した。細胞濃度は２．８×１０-7細胞／ｍ
で、死細胞の比率は２〜４％であった。
次に、約１．７×１０6細胞の４つのサンプルをポリス
チレンの試験管に入れた。各試験管に次の溶液の一つを
添加した：ＦＤＡ（１μＭ）、ＢＣＥＣＦ−ＡＭ（１μ
Ｍ）、ＶＢＤＢ（０．８μＭ）、又はＶＢＤＢ（８．０
μＭ）。染料溶液は各染料のストック溶液（１−８ｍ
Ｍ、ＤＭＳＯ溶液）を血液細胞希釈液で希釈することに
よって調製した。試験管を室温で３０分間保持した。サ
ンプルを３回洗浄して、血液細胞希釈液（１ｍ）中に
再懸濁した。
分析はアルゴンイオンレーザー（２００ｍＷ）からの４
８８ｎｍの励起波長およびヘリウム−ネオンレーザー
（４５ｍＷ）からの６３３ｎｍの励起波長を用いてＦＡ
ＣＳ（登録商標）４４０デュアルレーザーフローサイト
メーターで行った。ＦＤＡおよびＢＣＥＣＦ−ＡＭの両
方については５３０／３０バンドパスエミッションフィ
ルターを使用し、一方、ＶＢＤＢについては６６０／２
０バンドパスエミッションフィルターを使用した。染色
直後、染色後１時間後、および染色後２時間後の各サン
プルについて１０，０００個のデータを採取した。
第２図においては、ＶＢＤＢ、ＢＣＥＣＦ−ＡＭおよび
ＦＤＡを、溶解全血を染色しそしてフローサイトメトリ
ーにより蛍光を検査することによって活性染料として比
較した。全ての染料は細胞内のエステラーゼによって開
裂されて蛍光染料を提供する膜透過性エステラーゼ基質
である。４つの細胞サンプルをＢＣＥＣＦ−ＡＭ（１μ
Ｍ）、ＦＤＡ（１μＭ）およびＶＢＤＢ（０．８μＭ、
８．０μＭ）とインキュベーションした。細胞を染色直
後（ｔ＝０）、１時間後（ｔ＝１）および２時間後（ｔ
＝２）に分析した。
ＦＤＡで染色された細胞は時間経過とともに最初の蛍光
を保持しなかった。低濃度のＶＢＤＢ（０．８μＭ）で
染色された細胞は最初の蛍光を維持した；ＢＣＥＣＦ−
ＡＭおよび高濃度ＶＢＤＢ（８μＭ）の両方では、染色
された細胞は１時間後に僅かに蛍光が実際に増加した。
膜透過性もしくは蛍光染料の“漏れ”におけるこの差異
はおそらく遊離の染料の電荷に原因している：より負に
荷電されたもしくはイオン性染料は細胞膜に対する透過
性が減少する。ビタブルーおよびフルオレセインの両方
は２つのイオン化可能なプロトンを持っている；しかし
ながら、ビタブルーのスルホン酸基はフルオレセインの
カルボン酸基よりも数単位低いと予測されるｐＫaを有
している。それゆえ、スルホン酸基のせいで、フルオレ
セインよりも高い比率のビタブルーが生理学的ｐＨ６〜
７で陰イオン型またはジアニオン型(dianionicform)で
あると予想される。ＢＣＥＣＦ酸は５つのイオン化可能
なプロトン（４つはカルボン酸である）を有している。
それによって他の染料と比べて細胞による優れた保持性
が示され、そしてそれは比較のために有益である。
第２図に示されたデータは生細胞と死細胞の定量にも使
用することができる。蛍光ヒストグラムには２つのピー
クが現れている。生細胞は染料を保持している細胞であ
り（右側のピーク）、そして死細胞は膜が漏れ易くなっ
ている細胞（左側のピーク）であると考えられる。主ピ
ークの直ぐ左にゲートを設定することによって、ゲート
の左の死細胞を計数した。時間とともに、ＢＣＥＣＦ−
ＡＭの場合、死細胞もしくは乾燥細胞の数はほぼ一定と
なった（ｔ＝０、１９％；ｔ＝１、２１％；ｔ＝２、２
１％）。高濃度のＶＢＤＢ（８μＭ）については、死細
胞の数は増加した（ｔ＝０、１２％；ｔ＝１、１７％；
ｔ＝２、２２％）。低濃度のＶＢＤＢ（０．８μＭ）に
ついても、死細胞の数は増加した（ｔ＝０、１４％；ｔ
＝１、１８％；ｔ＝２、２０％）。ＶＢＤＢおよびＢＣ
ＥＣＦの両方について、“漏れる”細胞の数はエチジウ
ムブロミドおよびアクリジンオレンジを用いて最初に計
数した死細胞の比率（３〜４％）よりも多かった。この
差は細胞膜に対する染料の透過性の違いによるものと考
えられる。
蛍光ヒストグラム中で同じような変動係数（ＣＶ）を得
るにはＢＣＥＣＦに比べて高濃度のＶＢＤＢが必要であ
った。ＢＣＥＣＦの場合、ＣＶは時間経過に伴って僅か
に減少した：ｔ＝０、ＣＶ＝３１％；ｔ＝１、ＣＶ＝２
８％；ｔ＝２、ＣＶ＝２８％であった。ＶＢＤＢの場
合、ＣＶは時間経過に伴って僅かに増加した。低濃度の
ＶＢＤＢ（０．８μＭ）の場合：ｔ＝０、ＣＶ＝３９
％；ｔ＝１、ＣＶ＝４３％；ｔ＝２、ＣＶ＝４６％であ
った。高濃度のＶＢＤＢ（８μＭ）の場合：ｔ＝０、Ｃ
Ｖ＝３０％；ｔ＝１、ＣＶ＝３５％；ｔ＝２、ＣＶ＝３
４％であった。高濃度の染料は細胞に対して有害ではな
いようであった；ＢＣＥＣＦおよびＶＢＤＢの両方につ
いて２時間後同じ数の“漏れる”細胞が見い出された。
最後に、化合物１〜９のスペクトル特性を測定した。化
合物１〜９の消衰係数および量子収量をｐＨ９．５で測
定した。プロトンを１個付与されたビタブルーの消衰係
数および量子収量もｐＨ５．２で測定した。ＶＢＤＢの
消衰係数および量子収量はｐＨ７．２で測定された。第
３図は化合物１〜９の吸光スペクトルを示しており；第
４図は化合物１〜９の正規化エミッションスペクトルを
示している。
化合物９は第１表に示された染料の中で２つの蛍光（即
ち、１個および２個のプロトンを付加された両方の型と
もに蛍光を有し、しかも異なった最大励起および最大エ
ミッションを有している）を示す唯一のものであった。
第５図は異なった２種の濃度における、種々のｐＨでの
ビタブルーの吸光スペクトルを示している。明らかに、
２量体が高濃度で形成されている；化合物９のスペクト
ル中には６００ｎｍに最大値を有するピーク（１．７×
１０-5Ｍ、ｐＨ３．１０、４．０６および６．４５）は
低濃度（３．４×１０-6Ｍ）での吸光スペクトル中には
見られない。約５４０ｎｍ付近にはイソベスティク(iso
bestic)ポイントが低濃度での吸光滴定中にはっきりと
見られる。第６図は種々のｐＨでの化合物９のエミッシ
ョンスペクトルを示しており；励起波長には５４０ｎｍ
を使用した。エミッションスペクトルは６３０ｎｍにイ
ソベスティクポイントを示している。
染料のｐＫa3値を蛍光滴定で測定した。示されたｐＫa
値は吸光滴定で測定された。吸光滴定またはｐＨ滴定を
用いてフルオレセインおよびその関連化合物のｐＫa3値
を測定する際の主な困難性は、ｐＫa2とｐＫa3の値が僅
か２．３単位しか異なっていないためにモノアニオン(m
onoanionic)型のみの溶液を作製することが不可能であ
ることである。全ての異なったプロトンを付加された型
の吸光スペクトルは重なっているので、異なった型の消
衰係数を得ることは困難である。蛍光滴定によるｐＫa3
測定については、ジアニオン(dianionic)型のみが蛍光
であると仮定して、そしてそれゆえ蛍光の測定値はジア
ニオンであるものと正比例している。実際には、ビタブ
ルーについてはジアニオンおよびモノアニオン型の両方
が蛍光である。しかしながら、モノアニオン型の量子収
量（０．０４）はジアニオン型のそれ（０．１５）より
もかなり低く、２つの型の最大エミッションは１００ｎ
ｍ離れており、分析に対するモノアニオン型の蛍光の寄
与は非常に少ない。
水性の塩基性溶液中の染料を収納しているキュベットを
濃い酸で滴定した。ｐＨおよび蛍光を一つの励起および
一つのエミッション波長で測定した。式１は酸について
のｐＨおよびｐＫa3の関係を表しており、式中［Ｈ
Ａ1-］0は酸（例えば、フルオレセイン）の全濃度であ
り、［Ａ2-］はジアニオン型の酸の濃度である。染料の
蛍光は脱プロトンされた型の濃度に比例していると仮定
すると、式１は式２のように変形でき、式中［Ａ2-］／
［ＨＡ1-］0＝正規化蛍光（ｎｆ）である。
［Ａ2-］＝［ＨＡ1-］0のとき、正規化蛍光因子、又は
最大蛍光についての値はその蛍光として定義される。
例えば、第７図はｐＨとビタブルーの蛍光滴定から得ら
れるデータの蛍光のプロットを示している。変曲点はｐ
Ｈ７．６であると判断された。ｐＨ８．６およびそれ以
上のデータは採用しなかった。第８図は正規化蛍光因子
を用いて第１表の全ての染料のデータのプロット（log
[(１−ｎｆ）／ｎｆ］とｐＨ）を示しており、その線の
傾きは１に非常に近いことが分かった。それらの点を結
んで直線を引くことができ、ｐＫa3はlog[(１−ｎｆ)/
ｎｆ］に値がゼロであるときのｐＨの値として求めるこ
とができる。ビタブルーの場合、滴定を繰り返した。２
回のｐＫa3の値は７．５４＋／−０．０３および７．５
７＋／−０．０３であり；その平均値は７．５６＋／−
０．０３であった。
第１表を検討すると、化合物５および８に２つの臭素基
を付加することは予想されるように元の化合物４および
７に比べてｐＫa3を低下させることが分かる。化合物５
および９の消衰係数および量子収量も元の染料よりも低
下し、そして、フルオレセイおよびエオシンとの類似性
によって予期されるように最大励起はより長波長であっ
た。一般に、化合物２、６および９のスルホン酸基は最
大吸光（６〜１４ｎｍ）および最大エミッション（１〜
５ｎｍ）をカルボキシ類似体１、４および７と比較して
赤色に遷移させていた。化合物２および６のスルホン酸
基はｐＫa3をカルボキシ類似体１および４に比較してほ
んの僅か又は全く低下させなかった；しかしながら、ビ
タブルーのスルホン酸基はｐＫa3をカルボキシ類似体７
に比較して０．４単位低下させた。化合物２および９の
スルホン酸基はカルボキシ類似体１および７に比較して
消衰係数および量子収量に殆ど影響を与えなかった。し
かしながら、スルホン酸類似体、化合物６はカルボキシ
類似体４の２倍の量子収量を有している。
化合物２、６および９のスルホン酸基の別の効果はジア
セテート合成中のスルホラクトン形成を阻害することで
あった。化合物２は無水酢酸中で緑色のモノアセテート
および黄色のジアセテートの混合物を生成した；そのジ
アセテートはシリカゲル上での迅速クロマトグラフィー
により精製できた。化合物６は還流無水酢酸中でジアセ
テートを生成する前に分解した。ビタブルーも有色のジ
アセテートを生成した；ビタブルーを無水酢酸中で数時
間還流した後、そのジアセテートを赤色の固体として得
た。化合物２および９の両方のジアセテートの1Ｈ Ｎ
ＭＲスペクトルは染料あたり２つの酢酸を示している；
ジアセテートは色が付いているという事実はそれらの構
造が閉じたスルホラクトン型および開いた双性イオン型
の間の平衡状態であることを示している。化合物９のジ
ブチレート誘導体および２のジアセテート誘導体はｐＨ
７の水中で比較的安定であった。化合物９のジブチレー
ト誘導体は、双性イオン構造を示すとき４８０ｎｍで
５．９×１０3の消衰係数および０．０３の量子収量を
有する蛍光であった（最大励起は４８０ｎｍ、最大エミ
ッションは５５０ｎｍである）。
ＶＢＤＢはブタ肝臓エステラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．
１．１）の良い基質となることが分かった。ＶＢＤＢの
ｐＨ８でのミカエリス(Michaelis)定数（Ｋm）は４×１
０-5Ｍであることが分かった（第１図）。このＫmはエ
チルブチレートのそれ（４．４×１０-4Ｍ）に匹敵す
る。ＶＢＤＢのＫmがエチルブレートのものよりも実際
に低いという事実は発色団の大きな立体的部分が酵素に
よる加水分解を阻害しないことを示している。化合物２
および９のジアセテートエステルもエステラーゼの基質
であった；しかし、どちらのジアセテートも膜透過性で
はなかった。
本明細書に記載された全ての出版物および特許出願は本
発明の属する分野の当業者のレベルの指標である。全て
の出版物および特許出願は個々の出版物もしくは特許出
願が参照により取り込まれるために特定的におよび個別
的に示されたように同じ範囲に参照によりここに取り込
まれる。
多くの変更および修飾が特許請求の範囲にしめさた思想
および範囲から逸脱することなく本発明の範囲内で可能
であることは当業者には明白である。
【図面の簡単な説明】
第１図は、ＶＢＤＢ（化合物１４）とブタ肝臓エステラ
ーゼのラインウェバー−バーグ(Lineweaver-Burk)プロ
ットを表す図面である。 第２図ａ〜ｆは、ＢＣＥＣＦ、ＦＤＡまたはＶＢＤＢで
染色されたヒト白血球細胞についての蛍光の対数のヒト
グラムを表す一連の図面である。 第３図は、化合物１〜９について吸光度（Ｏ．Ｄ．）と
波長のプロットを表す図面である。 第４図は、化合物１〜９について相対蛍光放出と波長の
プロットを表す図面である。 第５図ａおよびｂは、種々のｐＨにおけるビタブルー
１．７×１０-5Ｍ（ａ）および３．４×１０-6Ｍ（ｂ）
の濃度での吸光度（Ｏ．Ｄ．）と波長のプロットを表す
一連の図面である。 第６図は、種々のｐＨにおけるビタブルーについて蛍光
と波長のプロットを表す図面である。 第７図は、ビタブルーについて蛍光とｐＨのプロットを
表す図面である。 第８図は、化合物１〜９についてｐＨとｌｏｇ［（１−
ｎｆ）／（ｎｆ）］のプロットを表す図面である。

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】構造式： で表される化合物。
  2. 【請求項２】構造式： で表される化合物。
  3. 【請求項３】(a)特許請求の範囲第１項または第２項に
    記載の化合物を標識付け用試薬(tagging agent)と結合
    させ；そして (b)上記標識付け用試薬を結合した化合物を細胞に接触
    させる 工程からなるサンプル中の細胞を標識する方法。
  4. 【請求項４】標識付け用試薬がモノクローナル抗体であ
    る、特許請求の範囲第３項記載の方法。
  5. 【請求項５】細胞が体組織または体液由来である、特許
    請求の範囲第３項記載の方法。
  6. 【請求項６】(a)特許請求の範囲第１項または第２項に
    記載の化合物を標識付け用試薬と結合させ； (b)上記標識付け用試薬を結合した化合物を細胞に接触
    させ；そして (c)上記標識付け用試薬を結合した化合物の蛍光を検出
    することにより該化合物で標識した細胞を検出する； 工程からなるサンプル中の細胞を同定する方法。
  7. 【請求項７】標識付け用試薬がモノクローナル抗体であ
    る、特許請求の範囲第６項記載の方法。
  8. 【請求項８】細胞が体組織または体液由来である、特許
    請求の範囲第６項記載の方法。
  9. 【請求項９】工程(c)における蛍光の検出をフローサイ
    トメーターにより行う、特許請求の範囲第６項記載の方
    法。
  10. 【請求項１０】(a)特許請求の範囲第１項または第２項
    に記載の化合物を標識付け用試薬と結合させ； (b)上記標識付け化合物を細胞に接触させ； そして (c)上記標識付け用試薬を結合した化合物の蛍光を検出
    することにより該化合物で標識した細胞を検出する； 工程からなるサンプル中の生細胞および死細胞を識別す
    る方法。
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