JPH02145200A - 変異誘発性および催奇形性を迅速にスクリーニングする検定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、遺伝子工学に関し、特に変異誘発物質の検定
における。リポータ−遺伝子に連結した標的遺伝子（両
遺伝子ともに動物細胞内で発現が可能である）を含有す
る処理動物細胞の使用法を包含する。

（従来の技術） 多数の新しい医薬品および環境や作業場に放出される薬
剤には、毒性試験が必要である。化合物は、一般に胚に
与える損傷（催奇形（奇形発生）活性）と９分化した動
物に与える損傷（発癌活性もしくは変異誘発活性）とに
ついて検定されなければならない。

従来、化合物は、細菌細胞系を用い゛る短期間の試験（
ＳＴＴ）、または動物実験を使用して変異誘発活性が検
定されていた。大部分の動物実験は、１９７０年代の初
期に米国国立癌研究所（ｔｈｅ　ＮａｔｉｏｎａｌＣａ
ｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ）によって開発された誓
書類についてのプロトコルを用いて行われている。この
プロトコルは、ジンターフ　（３ｏｎｔａｇ）　　らが
、Ｕ、Ｓ。

である。しかし上記の２種の系で得た結果の相関関係は
、貧弱な−ものであり９客観的に評価することは難しい
。例えば、テナント（Ｔｅｎｎａｎｔ　）らが５ｃｉｅ
ｎｃｅ、　２３６．９３３〜９４１（１９８７）に報告
しているように、４種の広く用いられているＳＴＴ法と
誓書動物の発癌性の試験結果とは約６０％しか一致して
いない。比較された４種の試験法は９次のとおりである
。サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　）変異誘発法。

ＳＡＬ法（ハウオース（Ｈａｗｏｒｔｈ）　ら、　Ｅｎ
ｖｉｒｏｎ、　Ｍｕｔａｇｅｎ。

５５ｕｐｐｌ、１）３　（１９８３）およびモーテルマ
ンズ（Ｍｏｒｔｅ１ｍａｎｓ’）ら、　　Ｔｏｘｉｃｏ
ｌ、　　Ａｐｐｌ、　　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、　　７５
．　１３７．（１９８４＞などに記載されている）；チ
ャイニーズハムスター卵巣細胞内の染色体異常による方
法（ＡＢＳ法）：チャイニーズハムスター卵巣細胞にお
ける姉妹染色分体交換による方法（ＳＣＢ法）（上記２
方法は。

（１９８７）に記載されている）；およびマウスリンパ
腫細胞による方法（ＭＯＬＹ法）　（マイヤー（Ｍ　ｙ
　ｈ　ｒ　）５５〜５６８頁、ジエイ　アシュビイ　（
Ｊ、Ａｓｈｂｙ）ら編集（Ｂｌｓｅｖｉｅｒ、　アムス
テルダム；　１９８５））。

ＳＡＬ　法ｔたは、エームス（Ａｍｅｓ）のインビトロ
での検定法の最近の改変法が、オダ（Ｏｄａ）らによっ
て、　Ｍｕｔａｔｉｏｎ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　　１４
７．　２１９〜２２９（１９８５）に報告された。オダ
らは、融合させたｕｍｕＣ’−“ｌａｃＺ遺伝子を、サ
ルモネラ　チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙ
ｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）に導入した。大腸菌のｕｍｕオペ
ロンは、化学的および放射能による変異誘発の原因であ
って、　ＤＮＡを損傷させる試薬によって変異を。

誘発させ得る。被検化合物によるｕｍｕの誘発、　ｌａ
ｃＺの発現から生じるβ−ガラクトシダーゼ活性の発生
によって決定される。ＤＮＡを損傷する試薬を検出する
ＳＯＳクロモテスト法に類似の改変法が、キラーデット
　（Ｑｕｉｌｌａｒｄｅｔ）　　ら、　Ｐｒｏｃ、Ｎａ
ｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　　（ＩＩｓＡ）　７９．５９７１−５９７５
（１９８２）に記載されている。この方法は、　ＳＯ３
遺伝子の一つである５ｆｉＡを大腸菌の染色体上のｌａ
ｃＺに融合させて用いる。

インビトロで検定法で固定する検定法とは全く異なり、
誓書動物検定法には不利な問題点がある。

最も重要な問題は、化合物が発癌性であることを証明す
るのに長時間を要することである。なぜなら、この決定
が、被検化合物にさらした後の腫瘍の増殖に基づいて行
われるからである。一般に。

動物実験では、化合物が発癌性でないと決定可能になる
までに少なくとも１２〜１８ケ月にわたる期間が必要で
ある。他の問題は、遺伝子毒性化合物（ＤＮＡ内に変異
を誘発して腫瘍を増殖させる化合物）と、ある種の他の
ＤＮＡではない因子を変化させて腫瘍を増殖させる化合
物とを区別することがで−きないということである。署
歯動物による検定法のさらに他の問題は、この検定法は
定性法であって定量法ではなく、検定条件下で、試験す
る種における腫瘍の増殖を誘発する最少投与量が決定可
能であるにすぎない。

現在までのところ、非遺伝子毒性の発癌活性について、
化合物をインビトロで検定する検定法は。

はとんどない。インビトロでの検定法のひとつが。

ベンマンとフェイ　（Ｐｅｎｍａｎ　ａｎｄ　Ｆｅｙ）
の米国特許第４．５６９．９１６号に開示されている。

この方法は。

被検化合物にさらした時、細胞系で誘発される形態変化
に基づいた方法である。

化合物は、従来、胚を被検化合物にさらし９次いで異常
または増殖の阻害が発生している種々の領域からの試料
を試験することによって、催奇形活性または細胞分化の
阻害について検定されてきた。使用されている系の詳細
は、フリント（Ｆｌｉｎｔ）。

Ｔｅｒａｔｏｌｏｇｙ　ｏｆ　　ｔｈｅ　Ｌｉｍｂｓ　
（７−カー（Ｍｅｒｋｅｒ）ら編集）　、　３２５頁（
Ｗａｉｔｅｒ　ｄｅ　Ｇｒｕｙｔｅｒ　＆　Ｃｏ、、ベ
ルリン、　（１９８０））　　とフリントら、　　Ｊ、
　　Ｃｅ１ｌ　Ｓｃｉ、。

Ｔｅ５ｔｓ　（ハンバーガー（Ｈａｍｂｕｒｇｅｒ）ら
編集）　、　（Ｋａｒｇｅｒ。

およびＪ、　Ａｐｐｌ、　Ｔｏｘｉｃｏｌ、４．１０９
　（１９８４）に記載されている。報告されているよう
に、細胞毒性と細胞分化とについての検定は、インビボ
での確認試験とともにインビトロで行われている。イン
ビトロでの研究を行う場合は、最小限、中脳と前肢の部
分から得た細胞を、化合物にさらして有害効果を試験し
なければならない。他のインビトロでの催奇形性の検定
法については、霊長類の細胞培養物でのワタシニアウイ
ルスの増殖を利用する方法（ケラ−（ｋｅｌｌｅｒ）、
　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ、　１゜
２６１−２７６　（１９８７）　）が報告されているが
、インビボでの誓書動物による検定法と同等にヒトの催
奇形性を予測すると述べられている。

インビトロで発癌活性または催奇形活性をスクリーニン
グするのに現在用いられている方法で。

インビボでの試験結果と極めて良好な相関関係を示すも
のは全くないか、または試験結果を関係付けることがで
きても、試験するのに時間がかかり。

定量するのが困難で、感度に制限がある。

（発明の目的） 従って９本発明の目的は、変異誘発物質９発癌物質およ
び催奇逸物質に対して、簡単であり、定量化が可能で、
より高感度の検定法を提供することにある。

本発明の他の目的は、インビトロでの観察結果と正確に
相関しつる。変異誘発活性もしくは催奇形活性の正確な
尺度を提供することにある。

（発明の要旨） 本発明は、各細胞に標的遺伝子と、連結したリポータ−
遺伝子とを有する。操作された動物細胞。

動物の胚または分化した動物を用いる方法および検定法
を提供する。真核細胞の核酸配列の発現に変異もしくは
変化を起こさせる化合物をスクリーニングする本発明の
検定法は、標的遺伝子とリポータ−遺伝子とを与えるこ
とを包含し、該標的遺伝子の発現による産物が該リポー
タ−遺伝子の発現を調節する。各コード配列に動物プロ
モーター／エンハンサ−と転写終結シグナルとをスプラ
イスすることによって、標的遺伝子とリポータ−遺伝子
の両者を操作し、その結果９両遺伝子は動物細胞内で発
現し得る。標的遺伝子とリポータ−遺伝子とを、培養動
物細胞もしくは胚細胞に、それぞれＤＮＡ　）ランスフ
ェクション法もしくはＤＮＡマイクロインジェクション
法によって導入する。変異がない場合、標的遺伝子の産
物が、リポータ−遺伝子中の調節配列との相互作用によ
ってリポータ−遺伝子の発現を阻害する。標的遺伝子に
変異がおこり、不活性のリプレッサーまたはその他の調
節タンパクを産生するに至った時、リポータ−遺伝子は
もはや抑制されず、リポータ−タンパクが発現される。

このリポータ−遺伝子は、生物学的に活性なタンパクま
たは抗原をコードする。それらのタンパクまたは抗原の
機能と存在とは容易にモニターすることが可能で、標準
的な生化学的方法を用いて定量することができる。この
標的遺伝子は、連結してリポータ−遺伝子の発現を制御
し得る調節タンパクをコードする遺伝子からなる。これ
らの遺伝子は、リプレッサーであっても他の調節分子で
あってもよい。リプレッサー遺伝子が変異によって不活
性化すると、リポータ−遺伝子の発現を抑制できない欠
陥リプレッサータンパクの転写と翻訳が起こる。リポー
タ−遺伝子のオペレーター領域を変えると、リプレッサ
ータンパクの結合を防止するような様式で同じ効果が生
じる。次いでリポータ−遺伝子の発現は、遺伝子産物の
既知の機能を検定することによってモニターすることが
できる。

上記の場合に好ましいリポータ−遺伝子は、β−ガラク
トシダーゼをコードし、オペレーターを含有する大腸菌
ｌａｃＺ遺伝子である。標的遺伝子は。

Ｉａｃ　リプレッサーをコードする大腸菌１ａｃＩ遺伝
子である。この検定法では、処理された動物細胞を変異
誘発物質にさらす。変異が誘発される以前は。

Ｉａｃ　リプレッサータンパクがｌａｃオペレータと結
合することによって、β−ガラクトシダーゼ遺伝子の発
現は、抑制されている。変異によってＩａｃｌ遺伝子が
変化し、欠陥１ａｃ　！Ｊブレッサーが産生されるか、
またはオペレーターが変化し、リプレッサーがもはやオ
ペレーターと結合できなくなる。

次いでβ−ガラクトシダーゼ遺伝子が発現される。

β−ガラクトシダーゼについて陽性の細胞は、β−ガラ
クトシダーゼの基質である５−ブロモ−４−クロロ−３
−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａ
ｌ）を添加すると青色に染色される。

リポータ−遺伝子の発現の検出は、脱感で定量的なので
、被検化合物の効果の解析を促進する。

真核細胞の核酸配列の発現に変異もしくは変化を起こさ
せる化合物を迅速にスクリーニングする本発明の検定シ
ステムは、標的遺伝子とリポータ−遺伝子とを包含し、
該標的遺伝子の発現による産物が該リポータ−遺伝子の
発現を調節する。リポータ−遺伝子、標的遺伝子、プロ
モーター／エンハンサ−およびオペレーター配列、なら
びに検定条件を選択することにより、検定システムには
多数の実施態様が可能である。３種の実施例、つまり、
変異誘発物質のインビ）口での分析用の遺伝子導入動物
細胞系；変異誘発物質のインビボでの分析用の遺伝子導
入動物系；および催奇形性物質のインビボでの分析用の
遺伝子導入動物系を挙げろ。

（以下余白） （発明の構成） 本発明の方法は、動物もしくは動物細胞に組み込まれた
１組の２個の遺伝子（すなわち、標的遺伝子およびリポ
ータ−遺伝子）を用いて、変異誘発活性１発癌活性、ま
たは奇形発生活性を有する化合物をスクリーニングする
方法である。上記の動物もしくは動物細胞を、上記の活
性のいずれかを有する化合物に曝露すると、変異が起こ
ってリポータ−遺伝子の発現が変化する。標的遺伝子お
よびリポータ−遺伝子の両方の構成には、動物のプロモ
ーター／エンハンサ−、タンハクヲコードする配列、お
よびＳＶ４０ポリアデニル化配列が含まれている。

この方法には、変異誘発活性または奇形発生活性を有す
る化合物をスクリーニングする従来の方法に優るいくつ
もの利点がある。最も重要な利点は、検出が容易なこと
と、偽陽性の数が減少することである。リポータ−タン
パクをコードする遺伝子の変異は、以前から変異活性の
検定法に用いられているが、この変異現象により、該タ
ンパクは発現しなくなる。あるタンパクを発現しない単
一の細胞または少数の細胞を、該タンパクを発現する細
胞に取り囲まれながら検出することは、困難で単調な作
業であり、高い誤差率を生じやすい。

これとは対照的に９本発明の方法では、変異現象が起こ
った場合に、さもなければ発現しないリポータ−分子が
最終的に発現する。

本願で用いる場合、特に記載がなければ、「動物細胞」
という用語は、細胞培養物中の細胞、胚。

および分化動物の細胞を含めて用いられる。本願で用い
る「変異誘発物質」という用語は、特に記載がなければ
、毒素１発癌物質、奇形発生物質。

およびＤＮＡもしくはＲＮＡの配列もしくは発現を変化
させる他の試薬を含めて用いられる。

リポータ−遺伝子は１次の基準に基づいて選択される＋
　　（ｉ）Ｕポーター遺伝子の産物は、形質転換細胞に
対して有害もしくは致死的であってはならない、（ｉｉ
）該遺伝子産物は、その定蛍を行う簡単かつ鋭敏な検出
システムを提供するものでなければならない、　　（ｉ
ｉｉ）形質転換されていない細胞は、検定される遺伝子
の産物もしくは活性の構成的なバックグラウンドレベル
が低いものでなければならない。酵素、抗原、または生
物学的方法で容易にモニターできる生物学的に活性な他
のタンパクをコードするリポータ−遺伝子が好ましい。

これらには、β−ガラクトシダーゼ〔ツートン・ピー・
エイおよびコフィン・ジェオ・エム（Ｎｏｒｔｏｎ、　
Ｐ、Ａ、　ａｎｄ　Ｃｏｆｆ１ｎ　Ｊ、Ｍ、）　、　Ｍ
ｏ１．Ｃｅ１ｌ、　Ｂｉｏｌ、。

５、２８１−２９０（１９８５）コ、ペルオキシダーゼ
およびルシフェラーゼ〔ド・ウェット・ジェオ・アール
ら　（ｄｅ　　ｌすｅｔ、　　、Ｊ、　　　Ｒ，ｅｔ　
　ａｌ）、　　Ｍｏｌ、　　Ｃｅ１ｌ、　　Ｂｉｏｌ、
。

７、７２５−７３７（１９８７）　］が含まれる。好ま
しい実施態様では、各動物細胞におけるリポータ−遺伝
子のコピー数は、ただ１つである。しかしながら。

リポータ−遺伝子産物の量を増加させるために。

１つより多くのコピーを利用してもよい。通常は必要と
されず、また望ましくもないが、同じ動物細胞に１種よ
り多くのリポータ−遺伝子を含有させることもできる。

標的遺伝子は、リポータ−遺伝子の発現を制御する配列
に結合する調節分子をコードする配列の群から選択され
る。これらの配列は、アンチセンスＲＮＡを包含する。

リプレッサーまたは他の調節分子であり得る。最も好ま
しい実施態様では、　　１ａｃＩリプレツサー遺伝子が
変異誘発の標的として用いられる。リプレッサー遺伝子
が変異現象により不活性化されると、リポータ−遺伝子
、β−ガラクトシダーゼをコードするｌａｃＺ遺伝子の
発現をもはや抑制し得ない欠陥リプレッサータンパクの
転写および翻訳が起こる。また、リポータ−遺伝子のオ
ペレーター領域が、リプレッサータンパクの結合を防止
するように変化すると、上記と同様の効果が生じる。次
いで、リポータ−遺伝子の抑制解除は１機能が分かって
いる遺伝子産物を検定することによりモニターすること
ができる。

細菌のｌａｃオペレーター−リプレッサーシステムは好
ましいものである。その理由は、このシステムが、遺伝
子の転写を調節するタンパク−核酸量相互作用について
、最も基本的であり、かつ徹底して研究された例の１つ
だからである。これについては、クーロンドルおよびミ
ラー（Ｃｏｕｌｏｎｄｒｅａｎｄ　Ｍｉｌｌｅｒ）　、
　Ｍｏｌ、　Ｂｉｏｌ、、　１１７．５７７（１９７７
）、およびミラー、　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｇｅｎｅｔ
、、　　１７．２１５（１９８３）に記載されている。

この細菌調節システムは、哺乳類の細胞にトランスフェ
クトされ、誘発物質であるイソプロピルβ−ローチオガ
ラクトシド（ＩＰＴＧ）を添加することにより発現が検
出されている。このことは、ヒユーおよびダビッドソン
（Ｈｕ　ａｎｄＤａｖｉｄｓｏｎ）、　　Ｃｅ１ｌ、　
４８．５５５　（１９ｇ？）、およびブラウンら（日ｒ
ｏｗｎ　ｅｔ　ａｌ　）　、　Ｃｅ１１．４９．６０３
　（１９８７）に報告されている。Ｉａｃオペレーター
　ＩＪプレッサーシステムを用いていた従来の方法と１
本発明の方法との重要な差異は、リポータ−遺伝子を抑
制解除し、指標として単独で働く機能を有するタンパク
を発現させるのに、誘発ではなくて変異を用いているこ
とである。他の差異は、好ましい態様では、１細胞当り
単一コピーの機能標的遺伝子が、そのゲノムに導入され
ることである。

リポータ−遺伝子の発現を制御するリプレッサータンパ
クについては、オペレーター配列は、リポータ−遺伝子
における転写開始部位と開始コドンＡＴＧとの間の位置
に構築されねばならない。当初のＩａｃオペレーター配
列（５′−ＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡ
ＡＴＣＣ−３’）　、または変異体１ａｃオペレーター
〔例えば、リプレッサーを８倍堅固に結合する配列（５
’−ＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＣＴＣＡＣＡＡＴ−３’）　
］を、ベクターの構築に用いることができる。

１ａｃｌ遺伝子は、動物細胞に見られるＡＴＧの代わり
にＧＴＧ開始コドンを有する。このＧＴＧコドンは。

ヒユーおよびダビッドソン、　Ｃｅ１ｌ、　４８．５５
５（１９８７）の方法を用いて、インビトロでの部位特
異的変異誘発法により、　ＡＴＧに変換することができ
る。次いで、この修飾１ａｃｆ遺伝子は、真核プロモー
ターとＳＶ４０ポリアデニル化部位とを有する適当な発
現ベクターに挿入される。

発現ベクターの構築用に、いくつものプロモーターが優
れた候補として挙げられる。本発明の方法では、２種の
プロモーターが一般に用いられる。

第１の種類のプロモーターは１Ｍ在プロモーター（例え
ば、ヒストン遺伝子、リポソームタンパク遺伝子、およ
びβ−アクチン遺伝子）からなる。

第２の種類のプロモーターは１組織特異的プロモーター
（ＳＶ４０初期プロモーター、ラウス肉腫ウィルス（Ｒ
３Ｖ）の長末端重複部分（ＬＴＲ）　、およびサイトメ
ガロウィルス（ＣＭＶ　）の初期遺伝子プロモーターな
どを包含する）からなる。これらのプロモーターはすべ
て、動物細胞内で遺伝子を発現させることが知られてい
る。

インビトロでの変異誘発モデルとして用いる細胞を構築
するには９強力なウィルスプロモーター（例えば、　Ｒ
３Ｖ−ＬＴＲ）　　を用いて、　　Ｉａｃｌ遺伝子およ
びＩａｃＺ遺伝子の両方を動物細胞内で作動させる。

多くの用途を有するインビボでの変異誘発モデルとして
、トランスジェニックマウスの主要器官の大部分は、変
異誘発性の標的遺伝子とリポータ−遺伝子とを発現しな
ければならない。トランスジェニック動物システムを構
築するには９遍在するプロモーターとエンハンサ−とを
用いるのが好ましい。その結果、試験物質の特異性にか
かわらず。

標的遣１云子を含む様々な器官の組織および代謝特性に
対する試験化合物の効果を検出することができる。１ａ
ｃｌ遺伝子を作動させる遍在プロモーターとして用いる
のが好ましいプロモーターは、ヒストン３．２遺伝子プ
ロモーターである。これは、マウスの単一コピー遺伝子
であり、転写活性が非常に高い。そして、高レベルで発
現され、様々なマウス組織から単離されるヒストンＨ３
ｍＲＮＡの３０〜４０％を占める。

ヒストン３．２遺伝子プロモーターが最適の発現をもた
らさない哺乳類の細胞および動物組織については、他の
ウィルスまたは細胞のプロモーターを選択して、　１ａ
ｃｌ遺伝子を適切に発現させることができる。ＤＮＡ構
築物を形成する良い候補の例はヒトリボソームタンパク
Ｓ１４遺伝子、マウスリボソームタンパクＳ１６遺伝子
、ラット細胞質β−アクチン遺伝子、およびヒトβ−ア
クチン遺伝子である。これらの遺伝子は、すでにクロー
ン化され。

そのヌクレオチド配列が決定されており１人手して使用
できる。

好ましい実施態様では、　　ＩａｃＩ調節遺伝子と共に
用いられるリポータ−遺伝子は、細菌ｌａｃＺ遣宏子由
来の、β−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子である
。β−ガラクトシダーゼの発現は９組織化学的な手法を
用いて容易に検出される。他の実施態様では、　ＳＶ４
０大腫瘍（Ｔ）抗原をコードする遺伝子が、β−ガラク
トシダーゼ遺伝子の代わりにリポータ−遺伝子として用
いられ、免疫ペルオキシダーゼ法により、　ＳＶ４０　
Ｔ抗原を発現する細胞が検出される。ｌａｃＺリポータ
−システムを調製するのに採用した方法と同様の方法を
用いて、適当な発現ベクターに挿入するための、　ＳＶ
４０　Ｔ抗原をコードする完全な配列を有する構築物が
調製される。

次いで、　ＳＶ４０　Ｔ抗原の完全な転写ユニットは、
　　１ａｃｌ遺伝子の機能転写ユニットに物理的に連結
され。

そして適当な細胞に移入され、遺伝子発現について試験
される。

分子クローニングの原理および標準的方法は。

ティ’マニアティスら（ＴｏＭａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　
ａｌ　）　（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　　＝ニーヨーク州、コールド
スプリングハーバ−）により編集されたＭｏ１ｅｃｕｌ
ａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ３に記載されており、　当業者には
広く知られている。この方法には９次のような手法が含
まれる：　ＤＮＡおよびＲＡＮの調製、クローニングベ
クターの調製、連結、コンピテント細胞の形質転換、　
　ｉｎ　　５ｉｔｕフイルターハイブリダイゼーシヨン
法による選択およびスクリーニング〔デイピッドら（Ｄ
ｉｖｉｄ　ｅｔ　ａｌ）、　Ａｄｖａｎｃｅｃｌ　Ｂａ
ｃｔｅｒｉａｌＧｅｎｅｔｉｃｓ　（ＣｏＭ　Ｓｐｒｉ
ｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　、　−１
−ニーヨーク州、コールドスプリング）に記載されてい
る〕である。さらに、ゲル電気泳動法によるＤＮＡの分
離、制限酵素切断部位のマツピング、および酵素修飾に
よるＤＮＡ断片の修飾を行うための技術が用いられる。

大部分の制限酵素、ベクターおよび試薬は、市販されて
おり７人手可能である。

通常のベクターおよびイー・コ’Ｊ　　（Ｅ、　ｃｏｌ
ｉ）菌株が用いられる。例えば、　ｐＢＲ３２２，ｐＵ
ｃ系列、λＷＥＳ、　Ｍ１３ｍｐ、　Ｄｔ１５．　ＬＢ
３９２．　ＪＭ１０９．およびＨＢＩＯＩなどがある。

鎖終結法は、ヌクレオチド配列の決定に用いられ、　Ｄ
ＮＡ構築物のスプライシング部位が確認される。この方
法は、サンガーら（Ｓａｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ）　。

に報告されている。多くの試薬キットおよび詳細なプロ
トコルが市販されている。上記のベクタープロモーター
、および使用される遺伝子については、大部分のヌクレ
オチド配列が知られているので、配列決定実験における
プライマーとしては。

配列が分かっているオリゴヌクレオチドが用いられる。

これらのヌクレオチドは、典型的には１５〜２０個のヌ
クレオチド長であり、メシングら（Ｍｅｓｓｉｇｅｔ　
ａｔ）、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、９．
３０９　（１９８１）の方法を用い、目的とする特定領
域の配列を決定するのに非常に便利である。−本１ＪＩ
ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡのいずれも、この方法で配列
を決定することができる。

ＤＮＡの配列を決定する際にリンカ−として用いられる
オリゴヌクレオチドは、自動ＤＮＡ合成装置を用いて合
成される。このサービスは、　ＧｅｎｅｔｉＣＤｅｓｉ
ｇｎｓ、　　Ｉｎｃ、（テキサス州、ヒユーストン）の
ような商業的起源から得ることができる。次いで３０個
より多くのヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドは
、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法に供して、純度が
高いことを確認する。

ＤＮＡは、公表されている標準的な手法の１つにより、
細胞内にトランスフェクトされ、安定な形質転換体が形
成される。この標準的な手法としては、リン酸カルシウ
ム沈殿法、　　ＤＢ八へ−デキストラン法、エレクトロ
ポレーション法、およびプロトプラスト融合法などがあ
る。これらの方法は以下に詳述する。

リン酸カルシウム沈澱法：　ＤＮＡを、細胞に移入する
前に、グラハムおよびパン・デア・イブ（Ｇｒａｈａｍ
ａｎｄ　Ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ）　、　Ｖｉｒｏｌｏｇ
ｙ、　５２．４５６　（１９７３）の方法に従って、リ
ン酸カルシウムにより共沈殿させる。サケの精子ＤＮＡ
もしくは仔ウシの胸腺ＤＮＡをキャリアとし、　　１０
０ｍｍの皿にプレートされた０、５×１０６個の細胞に
対して、４０〜５０μｇのＤＮＡが用いられる。等容積
の２　ｘｃａｃ］２（２５０ｍＭ　ＣａＣｌ２および１
０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ、　ｐＨ７，０）を添加した０、５
ｄの２ＸＨｅｐｅｓ溶液（２８０ｍＭ　ＮａＣｌ、　５
０ｍＭ　１ｌｅｐｅｓ、および１．５ｍＭ　Ｎａ２ＨＰ
Ｏ４，ｐＨ７，０）と、　ＤＮＡを混合する。３０〜４
０分後に白色類粒状の沈澱が現われた溶液を、上記の細
胞に滴下して均一に分配し、４〜１６時間にわたって３
７℃で放置する。培地を除去し、グリセロールの１５％
ＰＢＳ溶液で、これらの細胞に３分間のショックを与え
る。グリセロールを除去した後。

１０％ウシ胎児血清を含有するＤ　Ｍ　Ｂ　Ｍを細胞に
供給し。

保温器内に放置する。

タンパク試料は、細胞を溶解し、タンパクを５Ｏ３−Ｐ
ＡＧＩＥ法で分離することにより、ウェスタンプロット
分析用に調製される。これらのタンパクは、アに記載さ
れているエレクトロブロッティング法にヨリ、ニトロセ
ルロースに移される。このフィルターをインスタントの
脱脂粉乳（１００ｍｊ２のＰＢＳ中にＩｇ）でブロック
した後、−次抗体を添加し。

室温で１時間インキュベートする。このフィルターをリ
ン酸援衝食塩水（ＰＢＳ　）で徹底的に洗浄し。

西洋ワサビペルオキシダーゼ−抗体結合体と共に室温で
１時間インキュベートする。このフィルターをＰＢＳで
再度徹底的に洗浄し１次いでジアミノベンジジンを添加
することにより、抗原のバンドを固定する。

酵素検定法、タンパク精製法などの伝統的な生化学的方
法が採用される。ＤＮＡおよびＲＮＡはサインブロッテ
ィング法およびノーザンブロツテイング法で分析される
。典型的には９分析試料は、ゲル電気泳動法により、サ
イズ分画される。次いで。

ゲル中の試料のＤＮＡもしくはＲＮＡは、ニトロセルロ
ースまたはナイロンのメンブレンに、プロッティング法
により移される。ゲル中の試料パターンのレプリカであ
るプロットを、サザン分析法およびノーザン分析法のプ
ローブとハイブリダイズさせる。次いで、目的とする特
定のバンドを、オートラジオグラフィーのような検出シ
ステムにより。

可視化することができる。

ＤＮＡはまた。以下の文献に記載のＤＢＡＲ−デキスト
ラン法を用いて移入させることもできる：キムテら（Ｋ
ｉｍｕｒａ　ｅｔ　ａｌ）　、　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、　
４９．３９４　（１９７２）。

およびソンパイラックら（Ｓｏｍｐａｙｒａｃ　ｅｔ　
ａｌ　）　。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ
Ａ、　７８．７５７５　（１９８１）。

ＤＮＡはさらに、ボッター（Ｐｏｔｔｅｒ）　、　Ｐｒ
ｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８１．７１６１　（
１９８４）のエレクトロポレーション法や、サンドリイ
ーゴジンら（Ｓａｎｄｒｉ−Ｇｏｄｄｉｎ　ｅｔ　ａｔ
）　、　Ｍｏ１ｅｃ、　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、、　　
１．７４３（１９８１）のプロトプラスト融合法によっ
ても移入させることができる。

検定法の好ましい実施態様では、処理された動物細胞が
試験化合物に曝露される。変異誘発の前に　ｌａｃリプ
レッサーをリポータ−遺伝子のオペレーターに結合する
ことにより、リポータ−遺伝子の発現が抑制される。変
異現象により、　　１ａｃｌ遺伝子が変化して欠陥１ａ
ｃ　ＩＪプレソサーが産生されるか、あるいはオペレー
ターが変化する場合、リプレッサーはもはやオペレータ
ーには結合しない。

次いで、レポーター遺伝子は刺激されて、リポータ−タ
ンパクの合成を行う。

動物のゲノムに導入されるＤＮＡ構築物は、実質的に同
じ方法を用いて処理される。これらのトランスジ二二ッ
ク動物は、インビボでの変異誘発試験に用いられる。好
ましい実施態様は、刺激され得るオペレーター含有リポ
ータ−遺伝子に連結された変異誘発標的としてｌａｃ　
ＩＪプレッサー遺伝子を有するトラスジェニックマウス
もしくはラットのモデルであり、該１ａｃ　ＩＪプレッ
サー遺伝子が変異誘発により不活性化された場合に、リ
ポータ−遺伝子の発現がモニターされる。標的遺伝子お
よびリポータ−遺伝子の両方は共に細菌起源であるが、
動物遺伝子発現ベクターに挿入すれば、動物細胞内で発
現され得る。このトランスジェニックモデルによれば、
インビボでの変異誘発現象を簡単かつ容易に宇土するこ
とができる。従って、このモデルは、有毒物質（例えば
、変異誘発物質。

発癌物質、および奇形発生物質）の危険性に関する評価
を、従来の誓書動物による検定法よりも正確に行うこと
ができる。このシテスムはまた。誓書動物による標準的
な検定法よりも鋭敏かつ迅速である。何故なら、標的遺
伝子内の変異もしくは変化は、腫瘍が発生する前に１組
織化学的な方法により、　ＤＮＡレベルおよび細胞レベ
ルで検出できるからである。

（以下余白） 本発明を、さらに、下記の実施例によって説明するが２
本発明は、これに限定されるものではない。

尖旌拠上：インビトロでの動物細胞の変異発生検定法 （ａ）システムの構築 有用なりＮＡ構築物の一例を第１図に示す、このＤＮＡ
構築物は、互いに物理的に結合し、各々プロモーター／
エンハンサ−、コード配列および転写終結シグナルを有
する２個の機能転写ユニットを包含する。一方のユニッ
トは、　ｌａｃリプレッサー遺伝子の発現を起こさせる
のに用いられ、他方のユニットは、β−ガラクトシダー
ゼ遺伝子の発現を起こさせるのに用いられる。図に示す
ように。

β−ガラクトシダーゼの完全コード配列には、　ｌａｃ
Ｚ構造を形成するのに用いられるＲＳＶ−ＬＩＲプロモ
ーターおよびＳＶ４０ポリアデニル化部位が隣接し、リ
ポータ−遺伝子の機能転写ユニットが形成される。

同様に、　１ａｃ１転写ニー１−７トが、　ＲＳＶ−Ｌ
ＩＲ、ｌａｃリプレッサーコード配列およびＳＶ４０ポ
リアデニル化部位で構築される。次に、このリポータ−
転写ユニットは、クローン化の手法により、　１ａｃ１
転写ユニツトに物理的に連結される。

ｌａｃ　リプレッサー転写ユニットおよびβ−ガラクト
シダーゼユニットの両者を含むＤＮＡ構築物は。

次に、第２図に示すように、胚細胞もしくは上皮細胞を
トランスフェクトするのに用いられる。好ましい細胞は
、　ＡＴＣＣＣＲＬ−１５７３（ヒト２９３）およびＡ
ＴＣＣＣＣＬ−Ｔ、１（ＬＬＣ−ＭＫｚ）であり、米国
、メリーランド州、ロックビルのｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃ
ａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ
から入手され得る。この横築物は、前記のリン酸カルシ
ウム沈澱法のような既知の方法を用い２選択マーカーと
してのネオ遺伝子とともに、ＩＩ胞に共トランスフェク
ト（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔ）される。抗生物質Ｇ４
１８に耐性の細胞コロニーは。

第２図に模式的に示すように１選択培地内での増殖によ
って検出され、クローン化され１機能性のＩａｃリプレ
ッサー遺伝子とβ−ガラクトシダーゼ遺伝子との存在に
ついて分析される。

ら）システムの分析および特性表示 非機能性１ａｃリプレツサー遺伝子と機能性β−ガラク
トシダーゼ遺伝子とを含むトランスフェクトされた細胞
は、β−ガラクトシダーゼの基質である５−ブロモ−４
−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシ
ド（Ｘ−ｇａｌ）を、誘発物質ＩＰＩＧの存在しない培
養物に添加すると青色に染まる。機能性の、　ｌａｃリ
プレッサー遺伝子とβ−ガラクトシダーゼ遺伝子との両
方を含有する望ましいコロニーは、　　Ｘ−ｇａｌだけ
を添加したときには染まらないが、　ＩＰＩＧとＸ　−
ｇａｌ　とを添加すると青色に染まるはずである。１ａ
ｃｌ遺伝子の発現に成功したということは、サムズ（Ｓ
ａｎｓ）ら、Ｊ。

Ｂｉｏｌ、　ｃｈｅｍ、＋２６０巻、　１１８５頁、　
　（１９８５年）によるｌａｃ　リプレッサータンパク
のウェスタンプロット分析法；およびリンおよびリッジ
ズ（Ｌｉｎ　ａｎｄ　Ｒｉｇｇｓ）　、　Ｊ、　Ｍｏ１
．　ｂｉｏｌ、　７２巻、６７１頁、　　（１９７２）
によるリプレッサー−オペレーターＤＮＡ複合体のフィ
ルター結合検定法によって証明することもできる。

ｌａｃリプレッサー遺伝子とβ−ガラクトシダーゼ遺伝
子とが培養細胞中で成功裏に発現した後。

各コロニーは、導入された遺伝子のコピー数を分析する
ことができる。１細胞当たりの１ａｃｌ遺伝子ノ単コピ
ー（２倍体ゲノム）は、ゲノムＤＮ＾のサザンプロット
分析法にって分析される。単コピーを存する細胞は１機
能性１ａｃｌ遺伝子を２コピ一以上有する細胞よりも非
常に好ましい。なぜなら。

後者は９機能性リプレッサー遺伝子のすべてのコピーを
不活性化して、リポータ−遺伝子の抑制状態を起こすに
は、１回を越える変異を必要とするからである。変異現
象はリポータ−遺伝子の発現で検出されるので、リポー
タ−遺伝子のコピー数は、それほど決定的なものではな
いが、ある場合には１コピーを越える方が検出が容易に
なる。単コピー配列が得られる確立は、低濃度の標的Ｄ
ＮＡと受容体細胞をトランスフェクトするのに充分なキ
ャリヤーＤＮＡとを用いることにより増大する。

（Ｃ）変異誘発活性についての化合物のスクリーニング ニトロソメチル尿素（ＮＭＵ　）が変異誘発物質のモデ
ルとして採用され得る。なぜなら、ダブリッジ（Ｄｕｂ
ｒｉｄｇｅ）ら、　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、
、　７巻、３７９頁、　　（１９８７）に、この化合物
が、インビトロで１ａｃＩ遺伝子に変異を容易に誘発す
るということが示されているからである。培養された細
胞を、所定の時間ＮＭＵで処理し、そしてその細胞を、
リポータ−遺伝子の発現についてスクリーニングする。

変異の頻度は、全細胞中のβ−ガラクトシダーゼ陽性細
胞の数を数えることによって測定される。同様に、変異
のバックグランドの頻度は、変異誘発物質に曝露されて
いない培養物中に存在するβ−ガラクトシダーゼ陽性細
胞の数をカウントすることによって得ることができる。

！ＪＩＪＬｉ＝遺伝子導入動物による変異誘発検定法イ
ンビトロでの検定に用いられる遺伝子導入動物をつくり
出す第１の工程は、マウス線維芽細胞培養物中の１ａｃ
ｌの変異によって誘発されたβ−ガラクトシダーゼリポ
ータ−遺伝子を調製し、その活性を検出することである
。上記培養物は実施例１に記載の方法を用い、連結され
た１ａｃＩ　−ｌａｃＺ遺伝子構築物を成功裡にトラン
スフェクトし１次いで試験されるべき変異誘発物質に暴
露されて得られる。対照は、トランスフェクトされてい
ない細胞と、変異誘発物質に暴露されていない連結遺伝
子とを有する細胞である。インビトロのシステムでは９
次いで、連結１ａｃｌ　−ｌａｃＺ遺伝子構築物を有す
る始祖であるＣ５７ＢＬ／６Ｊ遺伝子導入マウスの産生
と１次いで、第４図に記載したように、該遺伝子構築物
を有する遺伝子導入子孫の産生とが行われる。遺伝子の
導入が陽性である性的に成熟した遺伝子導入子孫は、対
照、および変異誘発試験の対象物として役立つ。

（ａ）　Ｄ　Ｎ　Ａの調製 第３図に示すように、　ＤＮＡ構築物を実施例１に記載
したのと同様にして調製し、遺伝子導入マウスを作製す
るのに利用した。上記の構築物は、互いに物理的に連結
され、各々プロモーター／エンハンサ−、コード配列お
よびＳＶ４０ポリアデニル化部位を有する２個の機能性
転写ユニットを有する。

一方のユニットは、　ｌａｃ　リプレッサー遺伝子の発
現を行わせるのに用いられ、他方のユニットは。

β−ガラクトシダーゼ遺伝子の発現を行わせるのに用い
られる。マウスヒストン３．２プロモーターが、　ｌａ
ｃリプレッサー遺伝子およびβ−ガラクトシダーゼ遺伝
子の両方の遍在的な発現を行わせるために、該構築物中
で利用される。最終のベクターに示されているように、
ＸｈｏＩ部位と５ａｌＩ部位とは、　ｌａｃ　リプレッ
サーおよびβ−ガラクトシダーゼのそれぞれのコード配
列をクローン化するのに用いられる。

ｌａｃ　リプレッサー転写ユニットのような標的遺伝子
とβ−ガラクトシダーゼ転写ユニットのようなリポータ
−遺伝子の両者か、またはＳＶ４０　Ｔ抗原ユニットを
有するＤＮＡ断片は、制限酵素による消化によって、ベ
クターから切り出され１次のように、マイクロインジェ
クションのために、ゲル電気泳動とアフィニティーカラ
ム精製とで単離される。断片をアガロースゲルによって
分離し、所望のバンドを電気溶出により回収する。ＤＮ
Ａをフェノール／クロロホルムで抽出し、エタノール沈
澱で濃縮し９次いでＥｌｕｔｔｐ−ｄカラムに結合させ
。

次に溶離することにより精製する。次に、　ＤＮＡをエ
タノール沈澱で回収し、滅菌した。１　ｍＭ　ＥＤＴＡ
含有１０ｍＭ　）リス緩衝液（ｐＨ８）に溶解させ、ヘ
キスト社の染料蛍光検定法または２６０ｎｍにおける分
光測定法によって定量する。

（ｂ）Ｄ　Ｎ　Ａの胚への導入 遺伝子導入マウス作成の原理と実験手順は、プリジッド
　ホーガン、フランク　コンスタンティニおよびエリザ
ベス　レイシイ　（Ｂｒｉｇｉｄ　Ｈｏｇａｎ。

Ｆｒａｎｋ　Ｃｏｎ５ｔａｎｔｉｎｉ　ａｎｄ　Ｅｌｉ
ｚａｂｅｔｈ　Ｌａｃｙ）　　（Ｃｏｌｄｓｐｒｉｎｇ
　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、米国、ニュー
ヨーク州、コールドスプリングハーバ−）による「マウ
ス胚の操作」に記載されている。マウスの接合体は　妊
娠した雌マウスの血清ゴナドトロピンの５ＩＵを投与し
、さらに４８時間後ヒト繊毛性ゴナドトロピンの５１Ｕ
を投与して過剰排卵させた６週令のＣ５７Ｂ／６Ｊの雌
のマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、米
国、メイン州、バー　ハーバ−）から採取した。

怒作された雌をＣ５７Ｂ／６Ｊの雄と一緒に置いて、翌
朝、膣栓の存在を検査した。受容体として用いられる偽
妊娠の雌は８発情期について選択され、確実に滅菌され
た精管切除ＣＤ−１雄マウスと一緒におかれたＣＤ−１
雌マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒ’￥’ｒ　Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓ、　−米国、マサチューセッツ州、ウィル
ミントン）である。接合体は、　５．１　ｇ／ｌのＮａ
Ｃ１と５　ｍｇ　／　ａｌのウシ血清アルブミンを含有
するよう改変したＢＭＯＣ−２培地に集めた。卵丘細胞
（Ｃｕｍｕｌｕｓ　ｃｅｌｌ）を、培地中６０ＩＵ／ｄ
に希釈したヒアルロニダーゼ（Ｓｉｇｍａｔｙｐｅ　Ｉ
Ｖ、　１％のＰＶＰ　４０Ｔを含有するＰＢＳ中３００
ＩＵ（Ｓｉｇｍａ社）で処理して除去する。接合体を、
２成の培地内で２回洗浄して破片を除去する。約２ｐ１
のＤＮＡ溶液を、雄の前核に、約５０％が生存するよう
に注射した。注射された接合体は、トリブロモエタノー
ルで麻酔されている受容体の雌の卵管に移動するまで、
５％のＣ（ｈを含む空気中、３７°Ｃでインキュベート
された。

パルミツター（Ｐａｌｍｉｔｅｒ）　、　Ｃｅ１ｌ、　
２９巻、７０１頁（１９８２）によって報告されている
ように、遺伝子構築物の組込みが、一般に頭−尾タンデ
ム形配列（ｈｅａｄ−ｔｏ−ｔａｉｌ　ｔａｎｄｅｍ　
ａｒｒａｙ　）の単コピーもしくは複数コピーとして起
こる。マウスの胚に遺伝子を注入する方法は、プリンス
ター（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ）ら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ
、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８２巻、　４４
３Ｂ頁（１９８５）に記載されている。組込みの頻度を
増大させる。より重要なファクターは１次のとおりであ
る：注入されたＤＮＡの濃度は組込み効率の制限因子で
あり、１〜２ｎｇ／ｌのＤＮＡ濃度または約１００〜ｉ
　、　ｏｏｏコピーのＤＮＡ断片が最適であるらしいこ
と；直線状のＤＮＡ分子が、非平滑末端となるようにエ
ンドヌクレアーゼで切断された場合には、より有効であ
ること；そして、高い効率を得るには。

原形質体への注入よりも核への注入が必要であること。

いくつかの他の因子は２組込み率に影響を与えないよう
である。雌および雄の前核注入により、注入されたＤＮ
Ａを収納することができ、同等の組込み効率を与える。

ＤＮＡを２細胞胚の核に注入すると遺伝子導入動物とな
るので、前核への注入は１組込みを引き起こすのに必須
ではない。

使用されるマウスの系統が組込みの効率に影響するであ
ろうということは示唆されている。例えば、　Ｃ５７Ｘ
Ｓ几雑種の卵子は、近交Ｃ５７系統よりも効率が高いこ
とが証明されている。上記雑種に比較し得る効率が、近
文ＣＤ−１マウス（チャールズリバー）で得られている
。近交Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系マウス（ジャクソン　ラボラ
トリーズ）は、潜在バックグラウンド修飾遺伝子の分離
をな（すために用いることができる。近交Ｃ５７ＢＬ／
６Ｊ系黒マウスの雌に卵胞刺激ホルモンと黄体形成ホル
モンとを投与して、ホルモンで過剰排卵を誘発させた。

次いでこれらのマウスを近文系の雄マウスとを交尾させ
る。

受精した単細胞胚を、卵管から洗い出し、ヒアルロニダ
ーゼで処理して、該胚から卵丘（Ｃｕｍｕｌ、ｕｓｏｏ
ｐｈｏｒｕｓ　）細胞を除去する。次に標的ＤＮＡを、
単細胞胚の前核にマイクロインジェクションで注入する
。約１００コピーのｔａｃｔ　−ｌａｃＺＤＮＡ構築物
を各胚に注入し２次に各胚を、偽妊娠の養母の卵管に移
して懐胎期間を完了させる。これらの胚は分化すること
ができ、完全な動物に発育する。

（Ｃ）インビボでの変異誘発モデル用の遺伝子導入マウ
スの選択と検定 結合した機能性１ａｃＩ　−ｌａｃＺ遺伝子構築物の単
一コピーを有する遺伝子導入マウスを９次の方法でスク
リーニングして選抜する。尾の切片および／または肝臓
の葉部を、ゲノムＤＮ＾を分離する起源として用いる。

導入された遺伝子のコピー数と構造とを、プローブとし
て用いられる。　ｌａｃ　リプレッサー遺伝子もしくは
リポータ−遺伝子由来のＤＮＡでサザンプロット法によ
り分析し、そして遺伝子導入マウスの発生中に、導入さ
れた遺伝子内に再配列もしくは修飾が起こったか否かを
ＩＩ認する。

完全１ａｃｌ　−ｌａｃＺ遺伝子構築物の単コピーを有
するマウスだけをさらに検定する。

遺伝子の発現を検定するために、適当な組織を遺伝子導
入マウスから、剖検時に収集する。ＲＮＡとタンパクと
をこれらの組織から抽出し、ノーザンプロット検定、ウ
ェスタンプロット検定およびリプレッサー機能検定に用
い、遺伝子導入マウスの組織内のｌａｃリプレッサー遺
伝子の発現を検出する。リポータ−遺伝子は、活性１ａ
ｃｌ遺伝子によって抑制されるはずであるから２機能性
１ａｃ　リプレッサーが全（存在していないか、または
誘発物質ＩＰＴＧが添加されるのでない限り１組織内で
のリポータ−遺伝子の発現は期待されない。従って。

リプレッサーおよびリポータ−の遺伝子の両者の構造中
に同じプロモーターとエンハンサ−とを用いることが、
上記２つの遺伝子の“膜結合（ｕｎ−ｃｏｕｐｌｉｎｇ
）　”を回避する重要な方法である。遺伝子導入マウス
の組織中の機能性１ａｃＩおよびＩａｃＺの遺伝子の存
在もまた１尾の組織から分離した細胞を用い、実施例１
［有］）に記載の方法で検定され得る。

機能性標的遺伝子を、１細胞当り１コピーの割合で有す
る遺伝子導入系だけを選択し、第５図に示すように、繁
殖させてホモ接合遺伝子導入系をつくりあげる。Ｆｌを
互いに繁殖させ、　Ｆ２中に期待されるＡホモ接合の遺
伝子導入系は、サザン分析法のシグナルの強度によって
同定される。ホモ接合性は、子孫の繁殖試験とサザン分
析によって確認される。２コピーの導入された遺伝子を
有するホモ接合子孫を繁殖させて、これを非遺伝子導入
の相手と交配させることによって、変異誘発検定用のホ
モ接合試験動物を生産する。

（ｄ）被検化合物に曝露された遺伝子導入動物の検定 対照のマウスおよび変異誘発物質で処理されたマウスの
両者の主要器官内の陽性細胞の局在と分布とについて、
定量的なデータが得られ得る。下記の器官から得た組織
を形態測定分析法用に供するために選択した。その器官
は、脳（小脳、中脳および前脳から収集した組ｖａ）、
肝臓、　ｌｌ１１！臓、腎臓、心臓の左心室、肺臓、生
殖腺、子宮、膵臓。

胃の底部、十三↑旨腸１回腸、結腸および胸骨骨髄であ
る。固定処理に続いて１Ｍｉ織のプロ・ンクを切り取り
、確実にランダムサンプリングを行うために、８ミクロ
ンのクリオスタットによる切片もしくは３０ミクロンの
パイプラトームの切片について。

β−ガラクトシダーゼに対する組織化学的反応が行われ
る。４０ミクロン間隔で分離された連続切片を各ブロッ
クから採集する。陽性細胞の計数は生物学的イメージア
ナライザーシステムと２パイオークアントＩＩ　（Ｂｉ
ｏ−ｑｕａｎｔ　ＩＩ　）コンビニ−タブログラム（Ｒ
ＡＭ　Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓ、米国、テネシー州。

ナツシュビル）を用いるディジタル化形態測定法によっ
て行われる。このシステムのハードウェアは、標準ツァ
イス双眼顕微鏡に取付けられた画像投影カメラ、アップ
ル■マイクロコンピュータおよびディジタル化タブレッ
トで構成されている。

このシステムを用いると、試料がコンピュータのスクリ
ーンに投影され、オペレータが１分析する領域を選択し
て略図を描く。血管と、中空器官の内腔として存在する
。からの空間との概略がスクリーンに描かれ１次に、こ
のシステムは５分析する領域から上記の領域を取り去る
よう指令される。

強く青色に染色された細胞を、ディジタイザ−を用いて
計数し９組織試料の単位面積当りの陽性細胞の数が自動
的に計算される。このようにして。

未処理のもしくは処理された動物由来の特定器官の単位
面積当りの陽性細胞の数を計数することができ、そして
、得られたデータが統計的に比較される。このシステム
による付加的な主な利点は。

所定の変異誘発物質に特に敏感な特異的な細胞系を同定
し定量することができるということである。

組織化学的分析は、同じ系統の、処理済および未処理の
雄および雌遺伝子導入マウス由来の組織について行われ
る。形態測定法は、被検化合物についての情報を与える
ためサンプリングされた器官および動物光たりのβ−ガ
ラクトシダーゼが陽性細胞の数に関する定量的データを
得、試験方法の効力および遺伝子導入動物に自然に起こ
るバックグラウンドの変異の頻度を調べるために用いら
れ得る。細胞中でのｌａｃＺ遺伝子の発現は、以下の。

β−ガラクトシダーゼ染色法で検定される。

５（］ａＭのＮａ、ＰＯ，が添加された。冷４％バラホ
ルムアルデヒド溶液に１組織を浸漬する。この混合物の
ｐｔｔを７．４に調整する。前記の浸漬された組織はこ
の混合物中、４°Ｃで一夜固定される。酵素の活性は、
この固定によって損なわれることはない。

その組織を９次に、リン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）内で
すすぎ、３０μｍの切片をバイブラトームで切断するか
、または８μｍの切片をクリオスタットで切断する。次
に、得られた切片を、１■／成のＸ−ｇａｌ、　　５ｍ
Ｍ　　へキサシアノ鉄（Ｉ）酸カリウム５１ｍＭ　　へ
キサシアノ鉄（ＩＩ）酸カリウム、２ｍＭＭｇＣ１ｚ　
、　０．０２％　ＮＰ　−４０および０．０１％　クロ
ラートを含有するＰＢＳ　　（ｐＨ７，３）中テ、３７
°（、？？５％のＣｏｔ雰囲気下にてインキュベートし
た。この溶液をアルカリ性のｐＨとすること、およびＭ
ｇ″“を添加することは、リゾソーム中に天然に存在す
るガラクトシダーゼ活性によるバックグランドの染色を
避けるのに重要である。β−ガラクトシダーゼに対して
陽性の試験組織中の細胞は青色に染まる。

この青色は１時間以内に目視可能になり、続＜１２時間
にわたって強度が増大する。この現象は５自由移動し得
るバイブラトーム切片またはゼラチンでコートしたスラ
イドガラスに固定したクリオスタットの切片のいずれに
おいても目視観察することができる。所望の色強度が得
られたならば、バイブラトーム切片を、０．１％ＫＣｒ
ＳＯｎと１％ゼラチンとをコートしたスライドガラスに
のせ、３７°Ｃで０．５時間加温して乾燥した。次に、
切片を、キシレン中で２〜３分間脱水して洗浄した。メ
チルグリーンを用いて対比染色を行い１次いで、それぞ
れの部分の上にカバーガラスを置く。組織の全封入物の
パラフィン切片も染色することができる。

なぜなら、この切片の後包埋によって青色陽性染色が損
われることがないからである。従って、パラフィン包埋
切片は、各試験法の永続的な記録品として、貯蔵し、無
期限に保存することができる。

ＳＶ４０大Ｔ抗原もしくは他の抗原をリポータ−遺伝子
として用いた場合、細胞化学的免疫ペルオキシダーゼ法
、　［例えばハナハン（Ｈａｎａｈａｎ）　、Ｎａｔｕ
ｒｅ。

３１５巻、１１５頁（１９８５）　　、オーニッッ（Ｏ
ｒｎｉｔｚ）ら、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２３８巻、１８
８頁（１９８７）　　、またはベーリンガー（Ｂｅｈｒ
ｉｎｇｅｒ）　、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８５巻、　２６４８頁（１９８８
）に記載されている方法１が、リポータ−タンパクの発
現を検出するのに用いられる。

裏庭団ユニ催奇性物質アッセイ用の遺伝子導入動物の胚 標的遺伝子と、結合リポータ−遺伝子とを有する遺伝子
導入動物の胚が、催奇性物質のスクＩＪ−ニングに利用
される。この遺伝子導入胚モデルによって、生きている
ヒト胚と類似の系で変異誘発現象を、簡単・迅速に定量
することができ、現在用いられている方法よりも、より
正確に、催奇性の化合物の危険性を評価できるはずであ
る。

実施例２に詳述した方法によって生じさせた。

ｌａｃＺ遺伝子に結合した１ａｃｌ遺伝子を有するマウ
スおよびブタのような遺伝子導入動物は、試験動物とし
て、遺伝子導入子孫を生じさせるのに使用される。遺伝
子発現が成功裏に行なわれた雌の遺伝子導入妊娠動物か
ら種々の段階で分離した胚を被検試薬に曝露し、リポー
タ−遺伝子の発現を分析した。

例えば、２０〜２１日の妊娠期間に発育し、はとんどす
べての成体構造をもった原基を有する１０ｍｍの遺伝子
導入ブタの胚を、催奇性を有する可能性のある物質に曝
露する。催奇性物質によって起こる変異によって標的遺
伝子が不活性化され、胚のある種の細胞／組織中のリポ
ータ−遺伝子を作動させる。これらの細胞／組織は、こ
のリポータ−タンパクが、β−ガラクトシダーゼもしく
はこのリポータ−タンパクに代わる他の適当な物質であ
る場合には、前記の組織化学的分析法、またはアレン　
エヌ　デイ（Ａｌｉｅｎ　Ｎ、Ｄ、）ら、　”Ｔｒａｎ
ｓｇｅｎｅｓ　ａｓｐｒｏｂｅｓ　ｆｏｒ　ａｃｔｉｖ
ｅ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ　ｄｏｍａｉｎｓ　ｉｎ　
ｍ。

ｕｓｅ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ”、　Ｎａｔｕｒｅ、
　３３３巻、　８５２−８５５頁（１９８８）に記載さ
れている組織化学的分析法を用いて検出することができ
る。

検出法および検出システム、リポータ−遺伝子に結合し
た標的遺伝子を有する。そして変異誘発物質と催奇性物
質の試験用の遺伝子導入動物および遺伝子導入動物細胞
を修飾および改変することは２本発明の前記詳細な説明
から、当業者には明らかである。このような修飾および
改変は９本国の特許請求の範囲内にある。

（発明の要約） 化合物を、変異誘発または催奇形活性について速やかに
スクリーニングするための、迅速、高感度ならびに定量
的な方法および分析方法が提供される。この方法では、
遺伝子導入動物細胞、成体または胚に遺伝子を導入した
動物を用いる。細胞培養物からの各細胞、動物からの分
化した組織。

または動物の胚は、標的遺伝子およびリポータ−遺伝子
を含む。この両者は、動物のプロモーター／エンハンサ
−、コード配列および転写終結シグナルを有する。その
ため、それらは、動物細胞中で発現が可能である。標的
遺伝子の生成物は、リポータ−遺伝子中の調節配列との
相互作用により。

Ｊポーター遺伝子の発現を調節することが可能である。

好適な実施態様においては、標的遺伝子１ａｃｌ　（ｌ
ａｃ　リプレッサー）は、リポータ−遺伝子ｌａｃＺ　
（β−ガラクトシダーゼをコードする）に結合する。

これは、細胞化学的または組織化学的方法により検出さ
れる。動物細胞が、標的遺伝子を変化させるか、または
リポータ−遺伝子のオペレーターを変化させるような変
異を引き起こす化合物にさらされると、リポータ−遺伝
子が発現する。

４、　°゛　　の　　　な舌゛日 第１図は１発現ベクターｐＲＳＶ−１−ｐＲＳＶ−Ｚの
構造を示す概略図である。この発現ベクターは、　ＲＳ
Ｖ−ＬＴＲプロモーターおよびＳＶ４０ポリアデニル化
部位が隣接するｌａｃ　リプレッサーの完全コード配列
を有しくこれは標的遺伝子の機能的転写ユニットを形成
する）；そしてＲＳＶ−ＬＴＲプロモーターおよびＳＶ
４０ポリアデニル化部位が隣接するβ−ガラクトシダー
ゼ酵素の完全コード配列（これはリポータ−遺伝子の機
能的転写ユニットを形成する）とを有する。

第２図は、　ｐＲＳＶ−１−ＲＳＶ−Ｚを含有すル、ト
ランスフェクトされたヒトの胚細胞またはサルの上皮細
胞を構築し、そして試験する方法を示す概略図である。

第３図は、マウスの線維芽細胞もしくは胚に挿入する発
現ベクターの構造を示す概略図である。

この発現ベクターは、互いに物理的に連結し各々プロモ
ーター、ヒストン３．２およびＳＶ４０ポリアデニル化
部位を有する２個の機能的転写部位を有する。１個のプ
ロモーターはＩａｃｌ遺伝子を発現させるために、最終
ベクターのＸｈｏ　１部位に挿入して用いられ、そして
もうひとつのプロモーターは。

β−ガラクトシダーゼ遺伝子を発現させるために。

最終ベクターのＳａｌ　　１部位に挿入して用いられる
。

第４図は１機能的標的遺伝子とリポータ−遺伝子とを有
する遺伝子導入マウスを生じさせ、インビボでの変異誘
発検定を実施する方法を示す概略図である。

第５図は、インビトロでの変異誘発検定法に用いる遺伝
子導入マウスを繁殖および生産する方法を示す概略図で
ある。

以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、真核細胞の核酸配列の発現に変異もしくは変化を起
   こさせる化合物をスクリーニングする方法であって、 標的遺伝子とリポーター遺伝子とを与えることを包含し
   、 該標的遺伝子の発現による産物が該リポーター遺伝子の
   発現を調節し得る、スクリーニング方法。 ２、前記リポーター遺伝子が、真核プロモーターと、調
   節配列と、リポーター遺伝子産物をコードする配列と、
   転写終結シグナルとを有し、前記標的遺伝子の発現によ
   る産物が該リポーター遺伝子の調節配列に結合して、該
   リポーター遺伝子産物をコードする配列の発現を調節す
   る、請求項１に記載の方法。 ３、前記標的遺伝子が、真核プロモーターと、調節分子
   をコードする配列と、転写終結シグナルとを有する、請
   求項２に記載の方法。 ４、前記リポーター遺伝子産物が、生化学的に検出可能
   なタンパクおよび核酸配列からなる群から選択される、
   請求項２に記載の方法。 ５、前記調節配列がオペレーターである、請求項２に記
   載の方法。 ６、前記標的遺伝子の調節産物が、リプレッサーと、前
   記リポーター遺伝子もしくは遺伝子産物に結合可能な核
   酸配列とからなる群から選択される、請求項３に記載の
   方法。 ７、前記リポーター遺伝子の産物がβ−ガラクトシダー
   ゼであり、調節分子がｌａｃリプレッサータンパクであ
   る、請求項６に記載の方法。 ８、前記標的遺伝子およびリポーター遺伝子を真核細胞
   に挿入することをさらに包含する、請求項１に記載の方
   法。 ９、前記真核細胞が、分化の初期段階にある動物胚であ
   る、請求項８に記載の方法。 １０、前記真核細胞が、充分に分化した動物組織にある
   、請求項８に記載の方法。 １１、動物細胞に挿入された前記標的遺伝子およびリポ
   ーター遺伝子のコピー数を制御することをさらに包含す
   る、請求項８に記載の方法。 １２、前記機能性標的遺伝子のコピー数が１つに限定さ
   れる、請求項１１に記載の方法。 １３、前記動物細胞を化合物に曝露すること；および曝
   露された該細胞内のリポーター遺伝子産物の発現を、該
   化合物に曝露されていない対照細胞内のリポーター遺伝
   子産物の発現と比較することをさらに包含する、請求項
   ８に記載の方法。 １４、胚を化合物に曝露すること；該胚を一定期間、細
   胞分裂させること；および該胚内のリポーター遺伝子産
   物の発現を、該化合物に曝露されていない胚内のリポー
   ター遺伝子産物の発現と比較することをさらに包含する
   、請求項９に記載の方法。 １５、分化した前記動物を化合物に曝露すること；該動
   物に該化合物を代謝させ、かつ細胞分裂させること；お
   よび曝露された該動物由来の組織内のリポーター遺伝子
   産物の発現を、該化合物に曝露されていない対照動物の
   同系統の組織内のリポーター遺伝子産物の発現と比較す
   ることをさらに包含する、請求項１０に記載の方法。 １６、前記リポーター遺伝子がβ−ガラクトシダーゼを
   コードし、 β−ガラクトシダーゼの基質を与え、フェリシアン酸塩
   −フェロシアン酸塩溶液で染色することにより、該リポ
   ーター遺伝子の発現を測定することをさらに包含する、
   請求項８に記載の方法。 １７、酵素を結合した免疫グロブリンを用いてリポータ
   ー遺伝子の発現を測定し、免疫化学的方法で抗原の発現
   を検出することをさらに包含する、請求項８に記載の方
   法。 １８、真核細胞の核酸配列の発現に変異もしくは変化を
   起こさせる化合物を迅速にスクリーニングするシステム
   であって、 標的遺伝子とリポーター遺伝子とを包含し、該標的遺伝
   子の発現による産物が該リポーター遺伝子の発現を調節
   し得る、スクリーニングシステム。 １９、前記リポーター遺伝子が、真核プロモーターと、
   調節配列と、リポーター遺伝子産物をコードする配列と
   、転写終結シグナルとを有し、前記標的遺伝子の発現に
   よる産物が、該リポーター遺伝子の調節配列に結合して
   、該リポーター遺伝子産物をコードする配列の発現を調
   節する、請求項１８に記載のシステム。 ２０、前記標的遺伝子が、真核プロモーターと、調節分
   子をコードする配列と、転写終結シグナルとを有する、
   請求項１９に記載のシステム。 ２１、前記リポーター遺伝子産物が、生化学的に検出可
   能なタンパクと、リポーター遺伝子配列に対して相補的
   な核酸配列とからなる群から選択される、請求項１９に
   記載のシステム。 ２２、前記リポーター遺伝子産物が、β−ガラクトシダ
   ーゼ、ルシフェラーゼ、ペルオキシダーゼ、および免疫
   化学的に検出可能な抗原からなる群から選択される、請
   求項２１に記載のシステム。 ２３、前記調節遺伝子産物が、リプレッサーと、前記リ
   ポーター遺伝子もしくは遺伝子産物に結合可能な核酸配
   列とからなる群から選択される、請求項２０に記載のシ
   ステム。 ２４、前記調節分子がｌａｃリプレッサータンパクであ
   り、前記調節配列がｌａｃＺオペレーターである、請求
   項２３に記載のシステム。 ２５、ヒストン３．２遺伝子、ヒトリボソームタンパク
   Ｓ１４遺伝子、マウスリボソームタンパクＳ１６遺伝子
   、ラットβ−アクチン遺伝子、サイトメガロウイルス初
   期遺伝子プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ラ
   ウス肉腫ウィルス長末端反復部分、およびモロニー白血
   病ウィルス長末端反復部分からなる群から選択される少
   なくとも１つのプロモーターをさらに包含する、請求項
   １８に記載のシステム。 ２６、真核細胞をさらに包含する、請求項１８に記載の
   システム。 ２７、前記真核細胞が、分化の初期段階にある動物の胚
   である、請求項２６に記載のシステム。 ２８、前記動物細胞が、充分に分化した動物組織にある
   、請求項２６に記載のシステム。