JPH0484900A - 変異誘発性および催奇形性を迅速にスクリーニングする検定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、遺伝子工学に関し、特に変異誘発物質の検定
における１発現可能なリポータ−遺伝子に連結した発現
可能な標的遺伝子を含有する処理動物細胞の使用法を包
含する。

（従来の技術） 多数の新しい医薬品および環境や作業場に放出される薬
剤には、毒性試験が必要である。化合物は、一般に胚に
与える損傷（催奇形（奇形発生）活性）と１分化した動
物に与える損傷（発癌活性もしくは変異誘発活性）とに
ついて検定されなければならない。

従来、化合物は、細菌細胞系を用いる短期間の試験（Ｓ
ＴＴ）、または動物実験を使用して変異誘発活性が検定
されていた。大部分の動物実験は、１９７０年代の初期
に米国国立癌研究所（ｔｈｅ　ＮａｔｉｏｎａｌＣａｎ
ｃｅｒ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ）によって開発された舊歯
類についでのプロトコルを用いて行われている。このプ
ロトコルは、ジンターフ（Ｓｏｎｔａｇ）　　らが１国
Ｄｅ　　、ＨｅａｌｔｈＥｄｕｃ、Ｗｅｌｆａｒｅ　Ｐ
ｕｂｌ、（ＮＩＨ）　　Ｃａｒｃｉｎｏ　　。

ｋ■−銃Ｌ」肛ム　１　、７６（１９７６）に報告した
ものである。しかし上記の２種の系で得た結果の相関関
係は、貧弱なものであり１客観的に評価することは難し
い。例えば、テナント（Ｔｅｎｎａｎｔ　）　　らが５
ｃｉｅｎｃｅ、　２３６．９３３〜９４１（１９８７）
に報告しているように、４種の広く用いられているＳＴ
Ｔ法と蕩歯動物の発癌性の試験結果とは約６０％しか一
致していない。比較された４種の試験法は１次のとおり
である。サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　）変異誘
発法。

ＳＡＬ法（ハウオース（Ｈａｗｏｒｔｈ）　　ら、　Ｅ
ｎｖｉｒｏｎ、　Ｍｕｔａ　ｅｎ。

５５ｕｐｐ＋、１）３　（１９８３）およびモーテルマ
ンズ（Ｍｏｒｔｅｌｍａｎｓ）ら＋　　Ｔｏｘｉｃｏｌ
、　　八　　１．　　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、　　７５．
　１３７．（１９８４）などに記載されている）；チャ
イニーズハムスター卵巣細胞内の染色体異常による方法
（ＡＢＳ法）；チャイニーズハムスター卵巣細胞におけ
る姉妹染色分体交換による方法（ＳＣＥ法）（上記２方
法は。

ギヤロウエイ（Ｇａ　Ｉ　Ｉｏｗａｙ）　　ら＋　Ｅｎ
ｖｉｒｏｎ、　ｍｕｔａ　ｅｎ。

７．１　（１９８５）およびギヤロウエイらＥｎｖｉｒ
ｏｎ、　ｍｕｔａ　ｅｎ。

（１９８７）に記載されている）；およびマウスリンパ
腫細胞による方法（ＭＯＬＹ法）（マイヤー（Ｍｙｈｒ
）５５〜５６８頁、ジェイ　アシュビイ（Ｊ、Ａｓｈｂ
ｙ）ら編集（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、アムステルダム、　１
９８５））。

ＳＡＬ法または、エームス（Ａｗｅｓ）のインビトロで
の検定法の最近の改変法が、オダ（Ｏｄａ）らによって
、　Ｍｕｔａｔｉｏｎ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　１４７．
２１９〜２２９（１９８５）に報告された。オダらは、
融合させたｕｍｕｃ″−”ｌａｃＺ遺伝子を、サルモネ
ラ　チフィムリウム（Ｓａｌ■ｏｎｅｌｌａ句僅力咀吐
堕）に導入した。大腸菌の±オペロンは、化学的および
放射能による変異誘発の原因であって、　ＤＮＡを損傷
させる試薬によって変異を。

誘発させ得る。被検化合物によるｕｍｕの誘発、　ｌａ
ｃＺの発現から生じるβ−ガラクトシダーゼ活性の発生
によって決定される。ＤＮＡを損傷する試薬を検出する
ＳＯＳクロモテスト法に類似の改変法が、キラープツト
（Ｑｕｉｌｌａｒｄｅｔ）　　ら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａ
ｔｌ、＾ｃａｄ。

Ｓｃｉ、　（ＵＳＡ）　７９．５９７１−５９７５（１
９Ｂ２）に記載されている。この方法は、　ＳＯＳ遺伝
子の−っである５ｆｉＡを大腸菌の染色体上のＩａｃＺ
に融合させて用いる。

インビトロで検定法で固定する検定法とは全く異なり２
Ｍ歯歯動物足定法は不利な問題点がある。

最も重要な問題は、化合物が発癌性であることを証明す
るのに長時間を要することである。なぜなら、この決定
が、被検化合物にさらした後の腫瘍の増殖に基づいて行
われるからである。−最に。

動物実験では、化合物が発癌性でないと決定可能になる
までに少なくとも１２〜１８ケ月にわたる期間が必要で
ある。他の問題は、遺伝子毒性化合物（ＤＮＡ内に変異
を誘発して腫瘍を増殖させる化合物）と、ある種の他の
ＤＮＡではない因子を変化させて腫瘍を増殖させる化合
物とを区別することができないということである。舊歯
動物による検定法のさらに他の問題は、この検定法は定
性法であって定量法ではなく、検定条件下で、試験する
種における腫瘍の増殖を誘発する最少投与量が決定可能
であるにすぎない。

現在までのところ、非遺伝子毒性の発癌活性について、
化合物をインビトロで検定する検定法はほとんどない。

インビトロでの検定法のひとつが。

ベンマンとフェイ（Ｐｅｎｍａｎ　ａｎｄ　Ｆｅｙ）の
米国特許第４，５６９，９１６号に開示されている。こ
の方法は。

被検化合物にさらした時、細胞系で誘発される形態変化
に基づいた方法である。

化合物は、従来、胚を被検化合物にさらし１次いで異常
または増殖の阻害が発生している種々の領域からの試料
を試験することによって、催奇形活性または細胞分化の
阻害について検定されてきた。使用されている系の詳細
は、フリント（Ｆｌｉｎｔ）Ｔｅｒａｔｏｌｏ　　ｏｆ
　　ｔｈｅ　Ｌｉｍｂｓ　（マーカー（Ｍｅｒｋｅｒ）
ら編集’）　、　３２５頁（Ｗａｌｔｅｒ　ｄｅ　Ｇｒ
ｕｙｔｅｒ　＆　Ｃｏ、、ヘルリン、（１９８０））　
　とフリントら、　Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｓｃｉ。

６Ｌ　　２４７（１９８３）；　　Ｃｏｎｃｅ　　ｔｓ
　　ｉｎ　　Ｔｏｘｉｃｏｌｏ　　　、　　　第３巻Ｉ
ｎ　Ｖｉｔｒｏ　Ｅｍｂｒ　ｏｔｏｘｉｃｉｔ　　ａｎ
ｄ　Ｔｅｒａｔｏ　ｅｎｉｃｉｔＴｅＳｔＳ（ハンバー
ガー（Ｈｏｍｂｕｒｇｅｒ）　ら編集）　、　（Ｋａｒ
ｇｅｒハーゼル、１９８５）；　Ｔｏｘｉｃ、　ａ　　
１．　Ｐｈａｒｍａｃ、　７６、３８３およびＬ−人叶
↓工］旦Ｕ且りユ４．１０９　（１９８４）に記載され
ている。報告されているように、細胞毒性と細胞分化と
についての検定は、インビボでの確認試験とともにイン
ビトロで行われている。インビトロでの研究を行う場合
は、最少限、中脳と前肢の部分から得た細胞を、化合物
にさらして有害効果を試験しなければならない。他のイ
ンビトロでの催奇形性の検定法については、霊長類の細
胞培養物でのワタシニアウィルスの増殖を利用する方法
（ケラ−（ｋｅｌｌｅｒ）、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｔ
ｏｘｉｃｏｌｏ　　、　１２６１−２７６　（１９８７
）　）　　が報告されているが、インビボでの層線動物
による検定法と同等にヒトの催奇形性を予測すると述べ
られている。

インビトロで発癌活性または催奇形活性をスクリーニン
グするのに現在用いられている方法でインビボでの試験
結果と極めて良好な相関関係を示すものは全くないか、
または試験結果を関係付けることができても、試験する
のに時間がかがり。

定量するのが困難で、感度に制限がある。

（発明の目的） 従って９本発明の目的は、変異誘発物質１発癌物質およ
び催奇彫物質に対して、簡単であり、定量化が可能で、
より高感度の検定法を提供することにある。

本発明の他の目的は、インビトロでの観察結果と正確に
相関しうる。変異誘発活性もしくは催奇形活性の正確な
尺度を提供することにある。

（発明の要旨） 本発明は、各細胞に標的遺伝子と、連結したリポータ−
遺伝子とを有する。操作された動物細胞動物の胚または
分化した動物を用いる方法および検定法を提供する。真
核細胞の核酸配列の発現に変異もしくは変化を起こさせ
る化合物をスクリーニングする本発明の検定法は２標的
遺伝子とリポータ−遺伝子とを、該リポータ−遺伝子の
発現を調節する配列と組み合わせて与えることを包含し
。

該標的遺伝子の発現による産物が、該調節配列に結合す
ることによって該リポータ−遺伝子の発現を調節するこ
とができ、該リポータ−遺伝子によってコードされるタ
ンパクが容易に検出され得、そして、該標的遺伝子ある
いは該調節配列の変化が該リポータ−遺伝子の発現を抑
制する。各コード配列に動物プロモーター／エンハンサ
−と転写終結シグナルとをスプライスすることによって
、標的遺伝子とリポータ−遺伝子の両者を操作し、その
結果１両遺伝子は動物細胞内で発現し得る。標的遺伝子
とリポータ−遺伝子とを、培養動物細胞もしくは胚細胞
に、それぞれＤＮＡ　　）ランスフェクション法もしく
はＤＮＡマイクロインジェクション法によって導入する
。変異がない場合、標的遺伝子の産物が、リポータ−遺
伝子中の調節配列との相互作用によってリポータ−遺伝
子の発現を阻害する。標的遺伝子に変異がおこり、不活
性のリプレッサーまたはその他の調節タンパクを産生ず
るに至った時、リポータ−遺伝子はもはや抑制されず、
リポータ−タンパクが発現される。

このリポータ−遺伝子は、生物学的に活性なタンパクま
たは抗原をコードする。それらのタンパクまたは抗原の
機能と存在とは容易にモニターすることが可能で、標準
的な生化学的方法を用いて定量することができる。この
標的遺伝子は、連結してリポータ−遺伝子の発現を制御
し得る調節タンパクをコードする遺伝子からなる。これ
らの遺伝子は、リプレッサーであっても他の調節分子で
あってもよい。リプレッサー遺伝子が変異によって不活
性化すると、リポータ−遺伝子の発現を抑制できない欠
陥リプレッサータンパクの転写と翻訳が起こる。リポー
タ−遺伝子のオペレーター領域を変えると、リプレッサ
ータンパクの結合を防止するような様式で同じ効果が生
しる。次いでリポータ−遺伝子の発現は、遺伝子産物の
既知の機能を検定することによってモニターすることが
できる。

上記の場合に好ましいリポータ−遺伝子は、βガラクト
シダーゼをコードし、オペレーターを含有する大腸菌ｌ
ａｃＺ遺伝子である。標的遺伝子はｌａｃ　リプレッサ
ーをコードする大腸菌１ａｃｌ遺伝子である。この検定
法では、処理された動物細胞を変異誘発物質にさらす。

変異が誘発される以前はＩａｃ　リプレッサータンパク
がｌａｃオペレータと結合することによって、β−ガラ
クトシダーゼ遺伝子の発現は、抑制されている。変異に
よってＩａｃｌ遺伝子が変化し、欠陥１ａｃリプレツサ
ーが産生されるか、またはｌａｃオペレーターが変化し
、リプレッサーがもはやオペレーターと結合できなくな
る。次いでβ−ガラクトシダーゼ遺伝子が発現される。

β−ガラクトシダーゼについて陽性の細胞は、βガラク
トシダーゼの基質である５−ブロモ−４−クロロ−３−
インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ
）を添加すると青色に染色される。

リポータ−遺伝子の発現の検出は、脱感で定量的なので
、被検化合物の効果の解析を促進する。

真核細胞の核酸配列の発現に変異もしくは変化を起こさ
せる化合物を迅速にスクリーニングする本発明の検定シ
ステムは、標的遺伝子とリポータ−遺伝子とを、該リポ
ータ−遺伝子の発現を調節する配列と組み合わせて包含
し、該標的遺伝子の発現による産物が、該調節配列に結
合することによって該リポータ−遺伝子の発現を調節す
ることができ、該リポータ−遺伝子によってコートされ
るタンパクが容易に検出され得、そして、該標的遺伝子
あるいは該調節配列の変化が該リポータ−遺伝子の発現
を抑制する。リポータ−遺伝子、標的遺伝子、プロモー
ター／エンハンサ−およびオペレーター配列、ならびに
検定条件を選択することにより、検定システムには多数
の実施態様が可能である。３種の実施例、つまり、変異
誘発物質のインビトロでの分析用の遺伝子導入動物細胞
系；変異誘発物質のインビボでの分析用の遺伝子導入動
物系；および催奇形性物質のインビボでの分析用の遺伝
子導入動物系を挙げる。

（以下余白） （発明の構成） 以下に述べるように、動物もしくは動物細胞に組み込ま
れた１組の２個の遺伝子（すなわち、標的遺伝子および
リポータ−遺伝子）を用いて９変異誘発活性２発癌活性
、または奇形発生活性を有する化合物をスクリーニング
する方法が開発されている。上記の動物もしくは動物細
胞を、上記の活性のいずれかを有する化合物に曝露する
と、変異が起こってリポータ−遺伝子の発現が変化する
。

標的遺伝子およびリポータ−遺伝子の両方の構成には、
動物のプロモーター／エンハンサ−タンパクをコードす
る配列、およびＳＶ４０ポリアデニル化配列が含まれて
いる。

この方法には、変異誘発活性または奇形発生活性を有す
る化合物をスクリーニングする従来の方法に優るいくつ
もの利点がある。最も重要な利点は、検出が容易なこと
と、偽陽性の数が減少することである。リポータ−タン
パクをコードする遺伝子の変異は、以前から変異活性の
検定法に用いられているが、この変異現象により、該タ
ンパクは発現しなくなる。あるタンパクを発現しない単
一の細胞または少数の細胞を、該タンパクを発現する細
胞に取り囲まれながら検出することは、困難で単調な作
業であり、高い誤差率を生じやすい。

これとは対照的に１本発明の方法では、変異現象が起こ
った場合に、他の場合には発現しないリポータ−分子が
最終的に発現し、その発現は容易に検出される。

本願で用いる場合、特に記載がなければ、「動物細胞」
という用語は、細胞培養物中の細胞、胚および分化動物
の細胞を含めて用いられる。本願で用いる「変異誘発物
質」という用語は、特に記載がなければ、毒素１発癌物
質、奇形発生物質。

およびＤＮＡもしくはＲＮＡの配列もしくは発現を変化
させる他の試薬を含めて用いられる。

リポータ−遺伝子は２次の基準に基づいて選択される：
　（１）リポータ−遺伝子の産物は、形質転換細胞に対
して有害もしくは致死的であってはならない、（ｉｉ）
該遺伝子産物は、その定量を行う簡単かつ鋭敏な検出シ
ステムを提供するものでなければならない、そして（ｊ
ｉ）形質転換されていない細胞は、検定される遺伝子の
産物もしくは活性の構成的なハックグラウンドレベルが
低いものでなければならない。酵素、抗原、または生物
学的方法で容易にモニターできる生物学的に活性な他の
タンパクをコードするリポータ−遺伝子が好ましい。こ
れらには、β−ガラクトシダーゼ〔ツートン・ピー・エ
イおよびコフィン・ジェイ・エム（Ｎｏｒｔｏｎ、　Ｐ
、Ａ、　ａｎｄ　Ｃｏｆｆ１ｎ　Ｊ、Ｍ、）　＋　Ｍｏ
ｌ。

Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、、　　５　、２８１−２９０（
１９８５）　）　、ペルオキシダーゼおよびルシフェラ
ーゼ〔ド・ウニ’７ト・ジェイ・アールら（ｄｅ　Ｗｅ
ｔ、　Ｊ、　Ｒ，ｅｔ　ａｌ）　　Ｍｏｌ。

Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、、　　７　、７２５−７３７（
１９８７）　）が含まれる。

好ましい実施態様では、各動物細胞におけるリポータ−
遺伝子のコピー数は、ただ１つである。しかしながら、
リポータ−遺伝子産物の量を増加させるために、１つよ
り多くのコピーを利用してもよい。通常は必要とされず
、また望ましくもないが、同じ動物細胞に１種より多く
のリポータ−遺伝子を含有させることもできる。

標的遺伝子は、リポータ−遺伝子の発現を制御する配列
に結合する調節分子をコードする配列の群から選択され
る。これらの配列は、アンチセンスＲＮＡを包含する。

リプレッサーまたは他の調節分子であり得る。最も好ま
しい実施態様では、　１ａｃｌリプレツサー遺伝子が変
異誘発の標的として用いられる。リプレッサー遺伝子が
変異現象により不活性化されると、リポータ−遺伝子、
β−ガラクトシダーゼをコードするｌａｃＺ遺伝子の発
現をもはや抑制し得ない欠陥リプレッサータンパクの転
写および翻訳が起こる。また、リポータ−遺伝子のオペ
レーター領域が、リプレッサータンパクの結合を防止す
るように変化すると、上記と同様の効果が住じる。次い
で、リポータ−遺伝子の抑制解除は１機能が分かってい
る遺伝子産物を検定することによりモニターすることが
できる。

細菌のｌａｃオペレーター−リプレッサーシステムは好
ましいものである。その理由は、このシステムが、遺伝
子の転写を調節するタンパク−核酸量相互作用について
、最も基本的であり、かつ徹底して研究された例の１つ
だからである。これについては、クーロンドルおよびミ
ラー（Ｃｏｕｌｏｎｄｒｅａｎｄ　Ｍｉｌｌｅｒ）　、
　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、、　１１７．５７７（１９７７
Ｌおよびミラー、八ｎｎ、、　Ｒｅｖ、　Ｇｅｎｅｔ、
、　１７．２１５（１９８３）に記載されている。この
細菌調節システムは、＠乳類の細胞にトランスフェクト
され、誘発物質であるイソプロピルβ−Ｄ−チオガラク
トシド（ＩＰＴＧ）を添加することにより発現が検出さ
れている。このことは、ヒユーおよびダビツドソン（Ｈ
ｕ　ａｎｄＤａｖｉｄｓｏｎ）、　　Ｃｅ１ｌ、　４８
．５５５　（１９８７）、およびブラウンら（Ｂｒｏｗ
ｎ　ｅｔ　ａｌ　）　、　Ｃｅ１ｌ、　４９．６０３　
（１９８７）に報告されている。ｌａｃオペレーター−
リプレッサーシステムを用いていた従来の方法と２本発
明の方法との重要な差異は、リポータ−遺伝子を抑制解
除し、指標として単独で働く機能を有するタンパクを発
現させるのに、誘発ではなくて変異を用いていることで
ある。他の差異は、好ましい態様では、１細胞当り単一
コピーの機能標的遺伝子が、そのゲノムに導入されるこ
とである。

リポータ−遺伝子の発現を制御するリプレッサータンパ
クについては、オペレーター配列は、リポータ−遺伝子
における転写開始部位と開始コドンＡＴＧとの間の位置
に構築されねばならない。当初のｌａｃオペレーター配
列（５’　−ＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣ
ＡＡＴＣＣ−３’　）　、または変異体１ａｃオペレー
ター〔例えば、リプレッサーを８倍堅固に結合する配列
（５“−ＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＣＴＣＡＣＡＡＴ−３”
）　）を、ヘクターの構築に用いることができる。

１ａｃｌ遺伝子は、動物細胞に見られるＡＴＧの代わり
にＧＴＧ開始コドンを有する。このＧＴＧコドンはヒユ
ーおよびダビッドソン、釦旦、　４８．５５５（１９８
７）の方法を用いて、インビトロでの部位特異的変異誘
発法により、　ＡＴＧに変換することができる。次いで
、この修飾１ａｃｌ遺伝子は、真核プロモーターとＳＶ
４０ポリアデニル化部位とを有する適当な発現ベクター
に挿入される。

発現ヘクターの構築用に、いくつものプロモーターが優
れた候補として挙げられる。本発明の方法では、２種の
プロモーターが一般に用いられる。

第１の種類のプロモーターは１遍在プロモーター（例え
ば、ヒストン遺伝子、リポソームタンパク遺伝子、およ
びβ−アクチン遺伝子）からなる。

第２の種類のプロモーターは２組織特異的プロモーター
（ＳＶ４０初期プロモーター、ラウス肉腫ウィルス（Ｒ
５Ｖ）の長末端重複部分（ＬＴＲ）　、およびサイトメ
ガロウィルス（ＣＭＶ　）の初期遺伝子プロモーターな
どを包含する）からなる。これらのプロモーターはすべ
て、動物細胞内で遺伝子を発現させることが知られてい
る。

インビトロでの変異誘発モデルとして用いる細胞を構築
するには９強力なウィルスプロモーター（例えば、　Ｒ
５Ｖ−ＬＴＲ）を用いて、　１ａｃＩ遺伝子およびｌａ
ｃＺ遺伝子の両方を動物細胞内で作動させる。

多くの用途を有するインビボでの変異誘発モデルとして
、トランスジェニックマウスの主要器官の大部分は、変
異誘発性の標的遺伝子とリポータ−遺伝子とを発現しな
ければならない。トランスジェニック動物システムを構
築するには１遍在するプロモーターとエンハンサ−とを
用いるのが好ましい。その結果、試験物質の特異性にか
かわらず。

標的遺伝子を含む様々な器官の組織および代謝特性に対
する試験化合物の効果を検出することができる。１ａｃ
Ｉ遺伝子を作動させる遍在プロモーターとして用いるの
が好ましいプロモーターは、ヒストン３．２遺伝子プロ
モーターである。これは、マウスの単一コピー遺伝子で
あり、転写活性が非常に高い。そして、高レベルで発現
され、様々なマウス組織から単離されるヒストンＨ３ｍ
ＲＮＡの３０〜４０％を占める。

ヒストン３．２遺伝子プロモーターが最適の発現をもた
らさない哺乳類の細胞および動物組織については、他の
ウィルスまたは細胞のプロモーターを選択して、　１ａ
ｃＩ遺伝子を適切に発現させることができる。ＤＮＡ構
築物を形成する良い候補の例は。

ヒトリボソームタンパクＳ１４遺伝子、マウスリポソー
ムタンパク５１６遺伝子、ラット細胞質β−アクチン遺
伝子、およびヒトβ−アクチン遺伝子である。これらの
遺伝子は、すでにクローン化されそのヌクレオチド配列
が決定されており、入手して使用できる。

好ましい実施態様では、　ｌａｃ［［節遺伝子と共に用
いられるリポータ−遺伝子は、細菌＋ａｃＺ遺伝子由来
の、β−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子である。

β−ガラクトシダーゼの発現は５組織化学的な手法を用
いて容易に検出される。他の実施Ｍ様では、　ＳＶ４０
大腫瘍（Ｔ）抗原をコードする遺伝子が、β−ガラクト
シダーゼ遺伝子の代わりにリポータ−遺伝子として用い
られ５免疫ペルオキシダーゼ法により、　ＳＶ４０　Ｔ
抗原を発現する細胞が検出される。ｌａｃＺリポータ−
システムを調製するのに採用した方法と同様の方法を用
いて、適当な発現ベクターに挿入するための、ＳＶ４０
　Ｔ抗原をコードする完全な配列を有する構築物が調製
される。

次いで、　ＳＶ４０　Ｔ抗原の完全な転写ユニットは、
　ＩａｃＩ遺伝子の機能転写ユニットに物理的に連結さ
れ。

そして適当な細胞に移入され、遺伝子発現について試験
される。

分子クローニングの原理および標準的方法は。

ティ・マニアナイスら（Ｔ、　Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ
　ａｌ　）　（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ
　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　　ニューヨーク州、コール
ドスプリングハーハー）により編集されたＭｏ１ｅｃｕ
ｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　、およびアウスヘルら（Ａｕｓ
ｅｂｅｌ、ｅｔ　ａｌ）により編集されたＬａｂ　Ｐｒ
ｏｃｅｄｕｒｅｓｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌ
ｏ　　（Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｄｉｖ
ｉｓｉｏｎｏｆ　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ、米国、ニュー
ヨーク州、　１９８７）に記載されており、当業者には
広く知られている。

この方法には２次のような手法が含まれる：　ＤＮＡお
よびＲＡＮの調製、クローニングベクターの調製連結、
コンピテント細胞の形質転換、　ｉｎ　　５ｉｔｕフイ
ルターハイブリダイゼーシヨン法による選択およびスク
リーニング〔デイピッドら（Ｄｉｖｉｄ　ｅｔ　ａｌ）
ＡｄｖａｎｃｅｄＢａｃｔｅｒｉａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃ
ｓ　（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒ
ａ　ｔｏｒｙ　、　ニューヨーク州、コールドスプリン
グハーハー）に記載されている〕である。さらにゲル電
気泳動法によるＤＮＡの分離、制限酵素切断部位のマツ
ピング、および酵素修飾によるＤＮＡ断片の修飾を行う
ための技術が用いられる。大部分の制限酵素、ベクター
および試薬は、市販されており、入手可能である。通常
のベクターおよびイー・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）菌株が
用いられる。例えば。

ｐＢＲ３２２，ｐ［Ｉｃ系列、λ−ＷＥＳ、　Ｍ１３ｍ
ｐ、　Ｄ）！５．　ＬＥ３９２ＪＭＩ０９．およびＦＩ
ＢＩＯｌなどがある。

鎖終結法は、ヌクレオチド配列の決定に用いられ、　Ｄ
ＮＡ構築物のスプライシング部位が確認される。この方
法は、サンガーら（Ｓａｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ）　。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　［１
５Ａ、　７４．５４６３　（１９７７）に報告されてい
る。多くの試薬キットおよび詳細なプロトコルが市販さ
れている。上記のベクタープロモーター、および使用さ
れる遺伝子については、大部分のヌクレオチド配列が知
られているので、配列決定実験におけるプライマーとし
ては配列が分かっているオリゴヌクレオチドが用いられ
る。これらのヌクレオチドは、典型的には１５〜２０個
のヌクレオチド長であり、メシングら（Ｍｅｓｓｉｇｅ
ｔ　ａｌ）、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、
　９．３０９　（１９８１）の方法を用い、目的とする
特定領域の配列を決定するのに非常に便利である。−末
鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡのいずれも、この方法で配
列を決定することができる。

ＤＮＡの配列を決定する際にリンカ−として用いられる
オリゴヌクレオチドは、自動ＤＮＡ合成装置を用いて合
成される。このサービスは、　ＧｅｎｅｔｉｃＤｅｓｉ
ｇｎｓ、　Ｉｎｃ、（テキサス州、ヒユーストン）のよ
うな商業的起源から得ることができる。次いで３０個よ
り多くのヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドは、
ポリアクリルアミドゲル電気泳動法に供して、純度が高
いことを確認する。

ＤＮＡは、公表されている標準的な手法の１つにより、
細胞内にトランスフェクトされ、安定な形質転換体が形
成される。この標準的な手法としては、リン酸カルシウ
ム沈澱法、　ＤＥＡＥ−デキストラン法、エレクトロポ
レーション法、およびプロトプラスト融合法などがある
。これらの方法は以下に詳述する。

リン酸カルシウム沈澱法：　ＤＮＡを、細胞に移入する
前に、グラハムおよびパン・デア・イブ（Ｇｒａｈａｍ
ａｎｄ　Ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ）　、　Ｖｉｒｏｌｏｇ
ｙ、　５２．４５６　（１９７３）の方法に従って、リ
ン酸カルシウムにより共沈澱させる。サケの精子ＤＮＡ
もしくは仔ウシの胸腺ＤＮＡをキャリアとし、　１００
ｍの皿にプレートされた０、５×１０６個の細胞に対し
て、４０〜５０μｇのＤＮＡが用いられる。等容量の２
　ＸＣａＣ１ｚ（２５０ｍＭ　ＣａＣ１ｚおよび１０ｍ
Ｍ　Ｈｅｐｅｓ、　ｐＨ７，０）を添加した０、５　ｄ
の２×Ｈｅｐｅｓ溶液（２８０ｓ＋Ｍ　ＮａＣ１，５０
ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ＋　および１．５ｍＭ　ＮａｚＨＰＯ
ａ、　ｐＨ７，０）と、　ＤＮＡを混合する。３０〜４
０分後に白色顆粒状の沈澱が現われた溶液を、上記の細
胞に滴下して均一に分配し、４〜１６時間にわたって３
７°Ｃで放置する。培地を除去し、グリセロールの１５
％ＰＢＳ溶液で、これらの細胞に３分間のショックを与
える。グリセロールを除去した後。

１０％ウシ胎児血清を含有するＤｌ’ｌＥＭを細胞に供
給し。

保温器内に放置する。

タンパク試料は、細胞を溶解し、タンパクを５ＤＳＰＡ
ＧＥ法で分離することにより、ウェスタンプロット分析
用に調製される。これらのタンパクは、アウスヘルら（
＾ｕｓｕｂｅｌ　ｅｔ　ａｌ）　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒ
ｏｔｏｃｏｌｓｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏ
　　　（Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　５ｏｎｓ、　
　１９８７）に記載されているエレクトロブロンティン
グ法により、ニトロセルロースに移される。このフィル
ターをインスタントの脱脂粉乳（１００ｄのＰＢＳ中に
Ｉｇ）でブロックした後、−次抗体を添加し。

室温で１時間インキユヘートする。このフィルターをリ
ン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ　）で徹底的に洗浄し西洋ワサ
ビペルオキシダーゼ−抗体結合体と共に室温で１時間イ
ンキユヘートする。このフィルターをＰＢＳで再度徹底
的に洗浄し２次いでジアミノヘンジジンを添加すること
により、抗原のハンドを固定する。

酵素検定法、タンパク精製法などの伝統的な生化学的方
法が採用される。ＤＮＡおよびＲＮＡはサチンプロッテ
ィング法およびノーザンフロッティング法で分析される
。典型的には１分析試料は、ゲル電気泳動法により、サ
イズ分画される。次いでゲル中の試料のＤＮＡもしくは
ＲＮＡは、ニトロセルロースまたはナイロンのメンブレ
ンに、プロッティング法により移される。ゲル中の試料
パターンのレプリカであるプロットを、サザン分析法お
よびノーザン分析法のプローブとハイブリダイズさせる
。次いで、目的とする特定のハンドを、オートラジオグ
ラフィーのような検出システムにより可視化することが
できる。

ＤＮＡはまた。以下の文献に記載のＤＥＡＥ−デキスト
ラン法を用いて移入させることもできる：キムラら（Ｋ
ｉｍｕｒａ　ｅｔ　ａｌ）　、　■匹ハ■、　４９．３
９４　（１９７２）。

およびソンパイラックら（Ｓｏｍｐａｙｒａｃ　ｅｔ　
ａｌ　）Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　　Ａｃａｄ、　　Ｓ
ｃｉ、　　ＵＳＡ、　　７８．　７５７５　　（１９８
１）　　。

ＤＮＡ　はさらに、ボ・ンター（Ｐｏｔｔｅｒ）　、　
Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８１．７１６１　（１
９８４）のエレクトロポレーション法や、サンドリイー
ゴジンら（ＳａｎｄｒｉＧｏｄｄｉｎ　ｅｔ　ａｌ）　
、　Ｍｏ１ｅｃ、　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、＋　　１　
＋　７４３（１９８１）のプロトプラスト融合法によっ
ても移入させることができる。

検定法の好ましい実施態様では、処理された動物細胞が
試験化合物に曝露される。変異誘発の前に、　ｌａｃ　
リプレッサーをリポータ−遺伝子のオペレーターに結合
することにより、リポータ−遺伝子の発現が抑制される
。変異現象により、　１ａｃｌ遺伝子が変化して欠陥１
ａｃリプレンサーが産生されるか、あるいはオペレータ
ーが変化する場合、リプレッサーはもはやオペレーター
には結合しない。

次いで、レポーター遺伝子は刺激されて、リポータ−タ
ンパクの合成を行う。

動物のゲノムに導入されるＤＮＡ構築物は、実質的に同
し方法を用いて処理される。これらのトランスジェニッ
ク動物は、インビボでの変異誘発試験に用いられる。好
ましい実施態様は、刺激され得るオペレーター含有リポ
ータ−遺伝子に連結された変異誘発標的としてＩａｃ　
リプレッサー遺伝子を有するトラスジェニックマウスも
しくはラットのモデルであり、　該１ａｃリプレツサー
遺伝子が変異誘発により不活性化された場合に、リポー
タ−遺伝子の発現がモニターされる。標的遺伝子および
リポータ−遺伝子の両方は共に細菌起源であるが、動物
遺伝子発現ヘクターに挿入すれば、動物細胞内で発現さ
れ得る。このトランスジェニックモデルによれば、イン
ビボでの変異誘発現象を簡単かつ容易に定量することが
できる。従って、このモデルは、有毒物質（例えば、変
異誘発物質。

発癌物質、および奇形発生物質）の危険性に関する評価
を、従来の音間動物による検定法よりも正確に行うこと
ができる。このシテスムはまた。冨歯動物による標準的
な検定法よりも鋭敏かつ迅速である。何故なら、標的遺
伝子内の変異もしくは変化は、腫瘍が発生する前に２組
織化学的な方法により、　ＤＮＡ　レヘルおよび細胞レ
ヘルで検出できるからである。

（以下余白） 本発明を、さらに、下記の実施例によって説明するが１
本発明は、これに限定されるものではない。

実施例１：インビトロでの動物細胞の変異発生検定法 （ａ）システムの構築 ベクターＤＮＡは９文献に記載されているプラスミド成
分あるいは市販のプラスミド成分に基づいて、第１図に
示されているようにして調製された。

ρＲ５ＶＩはカルフォルニア工科大学（米国、カリフォ
ルニア州、パサディナ）のノーマン・ダビッドソ７　（
Ｎｏｒｍａｎ　Ｄａｖｉｄｓｏｎ　）博士から人手した
０ヒユー・エム・シーおよびダビッドソン・エヌ　（Ｈ
ｎ。

Ｍ、　Ｃａｎｄ　Ｄａｖｉｄｓｏｎ、　Ｎ、）によって
Ｃｅｌ　Ｉ、　４８．５５５（１９Ｂ？）に記載された
。このプラスミドは、ラウス肉腫ウィルス（Ｒ３Ｖ）プ
ロモーターとＳＶ４０ポリ（Ａ）とに連結した。　Ｅ、
ｃｏｌｉの１ａｃｌ　！Ｊプレッサーをコードする領域
を有する。ｐＣＨＩＩＯは、ハル・シー・ブイら（Ｈａ
ｌｌ、　Ｃ，Ｖ、　ｅｔａｌ）がＪ、　Ｍｏ１．Ａｐｐ
ｌ、　Ｇｅｎ、。

２　　１０１　（１９８３）　ｉ、ｍ記載したもノテあ
り、　ＤＮＡＸ　（米国、カリフォルニア州、パロアル
ト）のフランク・’Ｊ　　　（Ｆｒａｎｋ　Ｌｅｅ）博
士から提供された。β−ガラクトシダーゼ（］　ａｃＺ
）遺伝子は、このプラスミド中のＳＶ４０初期プロモー
ターおよびＳＶ４０ポリアデニル化部位に融合される。

第１図は、オペレーター配列の挿入と１組み合わせベク
ター　（ｐＸＺＩ）の構築の概要を示す。ｐｃＨｌｌｏ
は、　５ｆｉｌおよびＨｉｎｃｌｌｌｌを用いて切断さ
れ、　合成の相補性オリゴマーに連結された： ５’　　　　ＣＧＡＧ　ＣＣＴＣＴＧ　ＡＧＣＴＡＴＴ
ＣＣＡ　ＧＡ　　　　３“３’　　［１，ＧＡＧＣＴＣ
ＧＧＡＧＡＣＴＣＧＡＴＡＡＧＧＴ　ＣＴＴＣＧＡ　　
５’この方法によって、　ＳＶ４０初期プロモーターの
ＴＡＴＴＴＡ配列から１８ヌクレオチド下流にＸｈｏ１
部位を有する改変プラスミドのｐｃｉｌｌｌｏＸＨが得
られた。このｐｃ８１１０ＸＨＬｔ、　　レディ”ブイ
・ビーら　（Ｒｅｄｄｙ、　　Ｖ。

Ｂ、　ｅｔ　ａｌ）によって５ｃｉｅｎｃｅ、　２００
．４９４（１９７８）に記載されている。ｌａｃオペレ
ーターＤＮＡは、　　Ｈｉｎｄｌｌｔ邪位（上記のＴＡ
ＴＴＴＡ配列の４２ヌクレオチド下流に存在する）だけ
でなく、　Ｘｈｏ１部位に挿入される可能性もある。

第１段階としＴ、　ｐｃＨｌｌｏＸＨをＸｈｏｌテ切断
し、１８ヌクレオチドからなるパリンドロームＩａｃオ
ペレーターを有する以下に示すオリゴマーに連結した。

５’　　　ＴＣＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＣＴ［：ＡＣ
ＡＡＴ　　　３’得られたプラスミドｐｃ８１１０ＸＨ
２２は、　ＢａｍＨｌで切断され、　ｐＲ３ＶＩ由来の
ＢａｍＨ１断片として、　Ｒ５Ｖ　１ａｃｌを挿入する
ために使用された。１ａｃｌ遺伝子および］ａｃＯ−］
ａｃＺ遺伝子の両方を有する組み合わせプラスミド構築
物ｐＸＺＩは、第２図に示されているようにして、２９
３細胞をトランスフェクトするた約に用いられた。ＡＴ
ＣＣ［：ＲＬ−１５７３（ヒト胎児腎細胞２９３）は、
アメリカンタイプカルチャーコレクション　（米国、メ
リーランド州、ロックビル）から入手可能である。使用
され得る他の細胞（例えば、　ＡＴＣＣＣＣＬ−Ｔ、１
　（ＬＬＣ−ＭＫ２））もＡＴ［ｌ：Ｃから入手可能で
ある。

この構築物は、前記のリン酸カルシウム沈澱法のような
既知の方法を用い９選択マーカーとしてのネオ遺伝子と
ともに、細胞に共トランスフエフ）　（ｃｏ−ｔｒａｎ
ｓｆｅｃｔ）される。抗生物質６４１８に耐性の細胞コ
ロニーは、第２図に模式的に示すように。

選択培地内での増殖によって検出され、クローン化され
１機能性のｌａｃ　ＩＪブレッサー遺伝子とβ−ガラク
トシダーゼ遺伝子との存在について分析される。

ら）システムの分析および特性表示 非機能性ｌａｃ　！Ｊプレッサー遺伝子と機能性βガラ
クトシダーゼ遺伝子とを含むトランスフェクトされた細
胞は、β−ガラクトシダーゼの基質である５−ブロモ−
４−クロロ−３−インドリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシ
ド（Ｘ　−ｇａｌ　）を、誘発物質ＩＰＩＧの存在しな
い培養物に添加すると青色に染まる。機能性の、　　Ｉ
ａｃ　ＩＪプレッサー遺伝子とβ−ガラクトシダーゼ遺
伝子との両方を含有する望ましいコロニーは、　　Ｘ−
ｇａｌだけを添加したときには染まらないが、　ＩＰＩ
ＧとＸ−ｇａｌとを添加すると青色に染まるはずである
。１ａｃｌ遺伝子の発現に成功したということは、サム
ズ（Ｓａｍｓ）ら、Ｊ。

Ｂｉｏｌ、　ｃｈｅｍ、、２６０巻、　１１８５頁、　
　（１９８５年）によるＩａｃ　リプレッサータンパク
のウェスタンプロット分析法；およびリンおよびリッジ
ズ（Ｌｉｎ　ａｎｄ　Ｒｉｇｇｓ）　、　Ｊ、　Ｍｏｌ
、　ｂｉｏｌ、　７２巻、６７１頁、　　（１９７２）
によるリプレッサー−オペレーターＤＮＡ複合体のフィ
ルター結合検定法によって証明することもできる。

ｐＸＺＩ　ＩＩＮＡＪよヒｐＳＶ２ネ、ｔ　ＤＮＡは、
リン酸カルシウム沈澱法を用いて、ヒト胎児腎（２９３
）細胞にトランスフェクトされた。トランスフェクショ
ンから２４時間後のトリプシン化に続いて、これらの細
胞を１：１０の希釈率でプレートし、そして６４１８を
含有する　（３５０μｇ／ｍｌり培地に加えた。１０日
後。

クローニングリングを用いて９６個のコロニーを単離し
、これをＸ−ｇａ　ｌで青色の染色について試験した。

上記の２９３白来の細胞をＰＢＳ　（１５０ｍＭ　Ｎａ
［ｌ’ｌ　、　１５ｍＭリン酸ナトリウム、　ｐＨ７，
３）ですすぎ１次いでこレヲ、ＰＢＳで調製した２％ホ
ルムアルデヒドおよび０．２％ゲルトアルデヒド　（ｇ
ｌｕｔａｌｄｅｈｙｄｅ）中に４℃で５分間固定した。

固定を行い、固定媒体を除去した後、これらの細胞をＰ
ＢＳで洗浄し、　ＰＥ１Ｓ中に１■Ｘ−ｇａｌ／　ｍ、
　　５　ｍＭフェリシアン化カリウＡ、５ｍＭフェロシ
アン化カリウム、および２ｍＭＭｇＣＩ２を含有する組
織化学的な反応混合物で被覆した。Ｘ−ｇａ　Ｉをジメ
チルスルフオキシド中に１００ｍｇ／−の濃度で溶解し
、上記の反応混合物中に希釈した。上記の細胞を、青色
について調べるまで。

１８〜２４時間　３７℃でインキコベートした。

青色を示さなかった５５個のコロニーを、　１５ｍＭの
ＩＰＴＧ　（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド
）を含有する培地に加えた。ＩＰＴＧの存在下では青色
を示し、　ＩＰＴＧの非存在下では無色の状態を維持す
る７個ＯＤコｏ＝　−（ＸＺＩ　１−７．　ＸＺ［１−
１２，Ｘ２１１−１３゜Ｘ２１２−９．　ＸＺＩ　２−
１３．　ＸＺｌ　３−４．およびＸＺｌ　４−３と命名
された）が選択された。

第３図は上記のコロニー中のあるコロニーにおけるＩＰ
ＴＧの誘発を表し、　１ａｃＩ−］ａｃＯ−１ａｃ２シ
ステムが予想通りに機能し、このシステムがインビトロ
における変異誘発検定法に用いられ得ることを示してい
る。第３図（ａ）は、誘発物質ＩＰＴＧの非存在下にて
Ｘ−ｇａｌ基質で無色を維持している対照細胞の写真で
ある。第３図ら）は誘発された細胞の写真であり、これ
らの細胞は、　１５ｍＭ　ＩＰＴＧの存在下にてＸ−ｇ
ａ　］基質で青色に染色されており、このことはＩａｃ
Ｚの発現を示している。

Ｉａｃリプレッサー遺伝子とβ−ガラクトシダーゼ遺伝
子とが培養細胞中で成功裏に発現した後。

各コロニーは、導入された遺伝子のコピー数を分析する
ことができる。１細胞当たりの１ａｃｌ遺伝子の単コピ
ー（２倍体ゲノム）は、ゲノムＤＮＡのサザンプロット
分析法にって分析される。単コピーを有する細胞は１機
能性１ａｃＩ遺伝子を２コピ一以上有する細胞よりも非
常に好ましい。なぜなら。

後者は１機能性リプレッサー遺伝子のすべてのコピーを
不活性化して、リポータ−遺伝子の抑制状態を起こすに
は、１回を越える変異を必要とするからである。変異現
象はリポータ−遺伝子の発現で検出されるので、リポー
タ−遺伝子のコピー数は、それほど決定的なものではな
いが、ある場合には１コピーを越える方が検出が容易に
なる。単コピー配列が得られる確立は、低濃度の標的Ｄ
ＮＡと受容体細胞をトランスフェクトするのに充分なキ
ャリヤーＤＮＡとを用いることにより増大する。

（Ｃ）変異誘発活性についての化合物のスクリーニング ニトロソメチル尿素（ＮＭＬ）が変異誘発物質のモデル
として採用され得る。なぜなら、ダブリフジ（Ｄｕｂｒ
ｉｄｇｅ）ら、　Ｍｏｌ、　Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、、　
７巻、３７９頁、　　（１９８７）に、この化合物が、
インビトロで１ａｃｌ遺伝子に変異を容易に誘発すると
いうことが示されているからである。培養された細胞を
、所定の時間ＮＭＵで処理し、そしてその細胞を、リポ
ータ−遺伝子の発現についてスクリーニングする。変異
の頻度は、全細胞中のβ−ガラクトシダーゼ陽性細胞の
数を数えることによって測定される。

同様に、変異のバックグランドの頻度は、変異誘発物質
に曝露されていない培養物中に存在するβ−ガラクトシ
ダーゼ陽性細胞の数をカウントすることによって得るこ
とができる。

すべての７細胞系列を、　　１００ｍｍの皿に、　３０
％の融合塵（ｃｏｎｆ　］　ｕｅｎｃｅ）で一対にプレ
ートした。ＮＭＵを１０ｍｇ／−の濃度でＰＢＳに溶解
し、各細胞系列の２つの皿の一方に、最終濃度が１５０
■／ｒｎｌになるように直接添加した。３日の間隔で培
地を追加しながら、これらの皿を３７℃で６日間放置し
た。細胞が融合した場合には、半融合性および成長を維
持するように、これらを細分化した。Ｘ−ｇａ１組織化
学的反応混合物を６日後に添加し、これらの細胞を光学
顕微鏡の下で青色に着色した細胞に可視化した。

ＸＺＩ　２−９は、第４図に示すように、未処理の対照
細胞に比べて３０倍青い細胞を与えることがわかり、こ
のことはＮＭＵによってＩａｃｌが不活性化された後に
１ａｃｅが抑制解除されることを示している。

他の細胞では、未処理の対照細胞より青色の細胞が増加
することは認められず、このことはβ−ガラクトシダー
ゼ遺伝子の抑制解除をもたらすような変異が生じなかっ
たことを示している。

第５図は、化合物を変異誘発について試験するのに用い
た方法の概略図である。誘発物質の存在下でβ−ガラク
トシダーゼを発現し得る細胞を。

変異原に曝す。数日後、細胞にＸ−ｇａｌ基質を供給す
る。青色に染色している細胞の数（バックグラウンドレ
ベルに対して補正した数）は、この化合物の変異誘発活
性を示している。

実施例２：遺伝子導入動物による変異誘発検定法インビ
トロでの検定に用いられる遺伝子導入動物をつくり出す
第１の工程は、マウス線維芽細胞培養物中の１ａｃｌの
変異によって誘発されたβ−ガラクトシダーゼリポータ
−遺伝子を調製し、その活性を検出することである。上
記培養物は実施例１に記載の方法を用い、連結された１
ａｃｌ　−１ａｃ２遺伝子構築物を成功裡にトランスフ
ェクトし１次いで試験されるべき変異誘発物質に暴露さ
れて得られる。対照は、トランスフェクトされていない
細胞と、変異誘発物質に暴露されていない連結遺伝子と
を有する細胞である。インビトロのシステムでは１次い
で、連結１ａｃｌ　−ｌａｃＺ遺伝子構築物を有する始
祖であるＣ５７ＢＬ／６Ｊ遺伝子導入マウスの産生と１
次いで、該遺伝子構築物を有する遺伝子導入子孫の産生
とが行われる。遺伝子の導入が陽性である性的に成熟し
た遺伝子導入子孫は、対照、および変異誘発試験の対象
物として役立つ。

（ａ）ＤＮＡの調製 第６図に示すように、　ＤＮＡ構築物を実施例１に記載
したのと同様にして調製し、遺伝子導入マウスを作製す
るのに利用した。上記の構築物は、互いに物理的に連結
され、各々プロモーター／エンハンサ−、コード配列お
よびＳＶ４０ポリアデニル化部位を有する２個の機能性
転写ユニットを有する。

一方のユニットは、　ｌａｃ　！Ｊブレッサー遺伝子の
発現を行わせるのに用いられ、他方のユニットは。

β−ガラクトシダーゼ遺伝子の発現を行わせるのに用い
られる。マウスヒストン３．２プロモーターが、　　Ｉ
ａｃ　ＩＪプレッサー遺伝子およびβ−ガラクトシダー
ゼ遺伝子の両方の遍在的な発現を行わせるために、該構
築物中で利用され得る。

上記１ａｃリプレツサー転写ユニツトのような標的遺伝
子と上記β−ガラクトシダーゼ転写ユニットのようなリ
ポータ−遺伝子の両者か、または５ｖ４０Ｔ抗原ユニツ
トを有するＤＮＡ断片は、制限酵素による消化によって
、ベクターから切り出され。

次のように、マイクロインジェクションのために。

ゲル電気泳動とアフィニティーカラム精製とで単離され
る。断片をアガロースゲルによって分離し。

所望のバンドを電気溶出により回収する。ＤＮＡをフェ
ノール／クロロホルムで抽出し、エタノール沈澱で濃縮
し１次いでＥｌｕｔｉｐ−ｄカラムに結合させ１次に溶
離することにより精製する。次に、　ＤＮＡをエタノー
ル沈澱で回収し、滅菌した。１　ｍＭ　ＥＤＴＡ含有１
０ｍＭ）ＩＪス緩衡液（ｐＨ８）に溶解させ、ヘキスト
社の染料蛍光検定法または２６０ｎｍにおける分光測定
法によって定量する。

（ｂ）ＤＩＩＡの胚への導入 遺伝子導入マウス作成の原理と実験手順は、プリジッド
　ホーガン、フランク　コンスタンティニおよびエリザ
ベス　レイシイ　（日ｒｉｇｉｄ　Ｈｏｇａｎ。

Ｆｒａｎｋ　Ｃｏｎ５ｔａｎｔｉｎｉ　ａｎｄ　Ｅｌｉ
ｚａｂｅｔｈ　Ｌａｃｙ）　　（Ｃｏｌｄｓｐｒｉｎｇ
　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　　米国、ニ
ューヨーク州、コールドスプリングハーバ−）による「
マウス胚の操作」に記載されている。マウスの接合体は
、妊娠した雌マウスの血清ゴナドトロピンの５ＩＩＩを
投与し、さらに４８時間後ヒト繊毛性ゴナドトロピンの
５１Ｕを投与して過剰排卵させた６週令のＣ５７Ｂ／６
Ｊの雌のマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ、米国、メイン州、バー　ハーバ−）から採取した。

感作された雌をＣ５７Ｂ／６Ｊの雄と一緒に置いて、翌
朝、膣栓の存在を検査した。受容体として用いられる偽
妊娠の雛は１発情期について選択され、確実に滅菌され
た精管切除ＣＤ−１雄マウスと一緒におかれたＣＤ−１
雌マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅｒ　Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓ。

米国、マサチューセッツ州、ウィルミントン）である。

接合体は、　５．１　ｇ／ＩＩのＮａＣＲ：５　ｍｇ／
　ｍｌ、のウシ血清アルブミンを含有するよう改変した
ＢＭＯ［ニー２培地に集約だ。卵丘細胞（Ｃｕｍｕｌｕ
ｓ　ｃｅｌｌ）を、培地中６０１０／−に希釈したヒア
ルロニダーゼ（Ｓｉｇｍａｔｙｐｅ　＋ｖ、　１　％（
７）ＰＶＰ　４０Ｔ　全含有ｔ　ルＰＢＳ中３００１［
！（Ｓｉｇｍａ社）で処理して除去する。接合体を、２
ｍｌの培地内で２回洗浄して破片を除去する。約２ρ１
のＤＮＡ溶液を、雄の前核に、約５０％が生存するよう
に注射した。注射された接合体は、トリブロモエタノー
ルで麻酔されている受容体の雌の卵管に移動するまで、
５％のＣ［］２を含む空気中、３７℃でインキュベート
された。

パルミツター（Ｐａｌｍｉｔｅｒ）　、　Ｃｅ１１．２
９巻、７０１頁（１９８２）によって報告されているよ
うに、遺伝子構築物の組込みが１一般に頭−尾タンデム
形配列（ｈｅａｄ−ｔｏ−ｔａｉｌ　ｔａｎｃｌｅｍ　
ａｒｒａｙ　）の単コピーもしくは複数コピーとして起
こる。マウスの胚に遺伝子を注入する方法は、プリンス
ター（Ｂｒ　１ｎｓｔｅｒ）ら、　　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ
ｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８２巻、　　４
４３８頁（１９８５）に記載されている。組込みの頻度
を増大させる。より重要なファクターは１次のとおりで
ある：注入されたＤＮＡの濃度は組込み効率の制限因子
であり、１〜２　ｎｇ／μｌのＤＮＡ濃度または約１０
０〜１．０００コピーのＯＮ＾断片が最適であるらしい
こと；直線状のＤＮＡ分子が、非平滑末端となるように
エンドヌクレアーゼで切断された場合には。

より有効であること；そして、高い効率を得るには、原
形質体への注入よりも核への注入が必要であること。い
くつかの他の因子は１組込み率に影響を与えないようで
ある。雌および雄の前核注入により、注入されたＤＮＡ
を収納することができ。

同等の組込み効率を与える。ＤＮＡを２細胞胚の核に注
入すると遺伝子導入動物となるので、前核への注入は２
組込みを引き起こすのに必須ではない。

使用されるマウスの系統が組込みの効率に影響するであ
ろうということは示唆されている。例えば、　Ｃ５７Ｘ
５ＪＬ雉種の卵子は、近交Ｃ５７系統よりも効率が高い
ことが証明されている。上記雑種に比較し得る効率が、
近文ＣＤ−１マウス（チャールズリバー）で得られてい
る。近交Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系マウス（ジャクソン　ラボ
ラトリーズ）は、潜在バックグラウンド修飾遺伝子の分
離をなくすために用いることができる。近交Ｃ５７ＢＬ
／６Ｊ系黒マウスの雌に。

卵胞刺激ホルモンと黄体形成ホルモンとを投与して、ホ
ルモンで過剰排卵を誘発させた。次いで。

これらのマウスを近文系の雄マウスとを交尾させる。

受精した単細胞胚を、卵管から洗い出し、ヒアルロニダ
ーゼで処理して、該胚から卵丘（Ｃｕｍｕｌｕｓｏｏｐ
ｈｏｒｕｓ）細胞を除去する。次に標的ＤＮＡを、単細
胞胚の前核にマイクロインジェクションで注入する。約
１００　ＤビーのＩａｃｌ　−ｌａｃＺＩ］ＮＡ構築物
を各胚に注入し１次に各胚を、偽妊娠の養母の卵管に移
して懐胎期間を完了させる。これらの胚は分化すること
ができ、完全な動物に発育する。

（Ｃ）インビボでの変異誘発モデル用の遺伝子導入マウ
スの選択と検定 結合した機能性Ｉａｃｌ　−ｌａｃＺ遺伝子構築物の単
一コピーを有する遺伝子導入マウスを１次の方法でスク
リーニングして選抜する。尾の切片および／または肝臓
の葉部を、ゲノムＤＮＡを分離する起源として用いる。

導入された遺伝子のコピー数と構造とを、プローブとし
て用いられる。　　ｌａｃ　リプレッサー遺伝子もしく
はリポータ−遺伝子由来のＤＮＡでサインプロット法に
より分析し、そして遺伝子導入マウスの発生中に、導入
された遺伝子内に再配列もしくは修飾が起こったか否が
を確認する。

完全１ａｃｆ　−１ａｃｚ遺伝子構築物の単コピーを有
するマウスだけをさらに検定する。

遺伝子の発現を検定するために、適当な組織を。

遺伝子導入マウスから、剖検時に収集する。ＲＮＡとタ
ンパクとをこれらの組織から抽出し、ノーザンプロット
検定、ウェスタンプロット検定およびリプレッサー機能
検定に用い、遺伝子導入マウスの組織内のＩａｃ　！Ｊ
プレッサー遺伝子の発現を検出する。リポータ−遺伝子
は、活性１ａｃｌ遺伝子によって抑制されるはずである
から９機能性１ａｃリプレッサーが全く存在していない
か、または誘発物質ＩＰＴＧが添加されるのでない限り
９組織内でのリポータ−遺伝子の発現は期待されない。

従って。

リプレッサーおよびリポータ−の遺伝子の両者の構造中
に同じプロモーターとエンハンサ−とを用いることが、
上記２つの遺伝子の“脱結合（ｕｎ−ｃｏｕｐｌｉｎｇ
）”を回避する重要な方法である。遺伝子導入マウスの
組織中の機能性１ａｃＩおよび１ａｃ２の遺伝子の存在
もまた１尾の組織から分離した細胞を用い、実施例１の
）に記載の方法で検定され得る。

機能性標的遺伝子を、１細胞当り１コピーの割合で有す
る遺伝子導入系だけを選択し、第７図に示すように、繁
殖させてホモ接合遺伝子導入系をつくりあげる。Ｆｌを
互いに繁殖させ＋　Ｆ２中に期待される２ホモ接合の遺
伝子導入系は、サイン分析法のシグナルの強度によって
同定される。ホモ接合性は、子孫の繁殖試験とサイン分
析によって確認される。２コピーの導入された遺伝子を
有するホモ接合子孫を非遺伝子導入の相手に繁殖させて
。

変異誘発検定用のへテロ接合試験動物を生産する。

（ｄ）被検化合物に曝露された遺伝子′導入動物の検定 対照のマウスおよび変異誘発物質で処理されたマウスの
両者の主要器官内の陽性細胞の局在と分布とについて、
定量的なデータが得られ得る。下記の器官から得た組織
を形態測定分析法用に供するために選択した。その器官
は、脳（小脳、中脳および前脳から収集した組織）、肝
臓、ｐＡ臓、腎臓、心臓の左心室、肺臓、生殖腺、子宮
、膵臓。

胃の底部、十二指腸１回腸、結腸および胸骨骨髄である
。固定処理に続いて９組織のブロックを切り取り、確実
にランダムサンプリングを行った約に、８ミクロンのク
リオスタットによる切片もしくは３０ミクロンのバイブ
ラトームの切片について。

β−ガラクトシダーゼに対する組織化学的反応が行われ
る。４０ミクロン間隔で分離された連続切片を各ブロッ
クから採集する。陽性細胞は、生物学的イメージアナラ
イザーシステムと、パイオークアントＵ　（Ｂｉｏ−ｑ
ｕａｎｔ　ＩＩ）　コンピュータプログラム（Ｒ＆Ｍ　
Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓ、米国、テネシー州、ナツシュビ
ル）を用いるディジタル化形態測定法によって計数され
る。このシステムのハードウェアは。

標準ツァイス双眼顕微鏡に取付けられた画像投影カメラ
、アップル■マイクロコンピュータおよびディジタル化
タブレットで構成されている。このシステムを用いると
、試料がコンピュータのスクリーンに投影され、オペレ
ータが１分析する領域を選択して略図を描く。血管と、
中空器官の内腔として存在する。からの空間との概略が
スクリーンに描かれ１次に、このシステムは２分析する
領域から上記の領域を取り去るよう指令される。強く青
色に染色された細胞を、ディジタイザ−を用いて計数し
１組織試料の単位面積当りの陽性細胞の数が自動的に計
算される。このようにして、未処理のもしくは処理され
た動物由来の特定器官の単位面積当りの陽性細胞の数を
計数することができ、そして、得られたデータが統計的
に比較される。このシステムによる付加的な主な利点は
、所定の変異誘発物質に特に敏感な特異的な細胞系を同
定し定量することができるということである。

組織化学的分析は、同じ系統の、処理済および未処理の
雄および雌遺伝子導入マウス由来の組織について行われ
る。形態測定法は、被検化合物についての情報を与える
ためサンプリングされた器官および動物当たりのβ−ガ
ラクトシダーゼが陽性細胞の数に関する定量的データを
得、試験方法の効力および遺伝子導入動物に自然に起こ
るバックグラウンドの変異の頻度を調べるために用いら
れ得る。細胞中でのｌａｃＺ遺伝子の発現は、以下の。

β−ガラクトシダーゼ染色法で検定される。

５０ｍＭのＮａ５ＰＤ４が添加された。冷４％パラホル
ムアルデヒド溶液に１組織を浸漬する。この混合物のｐ
Ｈを７．４に調整する。前記の浸漬された組織はこの混
合物中、４℃で一夜固定される。酵素の活性は、この固
定によって損なわれることはない。

その組織を１次に、リン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）内で
すすぎ、３０μｍの切片をバイブラトームで切断するか
、または８μｍの切片をクリオスタットで切断する。次
に、得られた切片を、１ｍｇ／−のＸ−ｇａｌ、　　５
　ｍＭ　゛ヘキサシアノ鉄（Ｉ［［）酸カリウム。

５ｍＭ　　へキサシアノ鉄（ＩＩ）酸カリウム、２ｍＭ
ＭｇＣ１ｚ　、　０．０２％　ＮＰ−４０および０．０
１％　クロラートを含有するＰＢＳ　　（ｐ）１７．３
　）中で、３７℃で５％のＣＤ。雰囲気下にてインキュ
ベートした。この溶液をアルカリ性のｐＨとすること、
およびＭｇ”を添加することは、リゾソーム中に天然に
存在するガラクトシダーゼ活性によるバックグランドの
染色を避けるのに重要である。β−ガラクトシダーゼに
対して陽性の試験組織中の細胞は青色に染まる。

この青色は１時間以内に目視可能になり、続＜１２時間
にわたって強度が増大する。この現象は、自由移動し得
るバイブラトーム切片またはゼラチンでコートしたスラ
イドガラスに固定したクリオスタットの切片のいずれに
おいても目視観察することができる。所望の色強度が得
られたならば、バイブラトーム切片を、０，１％ＫＣｒ
Ｓ０４と１％ゼラチンとをコートしたスライドガラスに
のせ、３７℃で０．５時間加温して乾燥した。次に、切
片を、キシレン中で２〜３分間脱水して洗浄した。メチ
ルグリーンを用いて対比染色を行い９次いで、それぞれ
の部分の上にカバーガラスを置く。組織の全封入物のパ
ラフィン切片も染色することができる。

なぜなら、この切片の後包埋によって青色陽性染色が損
われることがないからである。従って、パラフィン包埋
切片は、各試験法の永続的な記録品として、貯蔵し、無
期限に保存することができる。

ＳＶ４０大工抗原もしくは他の抗原をリポータ−遺伝子
として用いた場合、細胞化学的免疫ペルオキシダーゼ法
、　［例えばハナハン（Ｈａｎａｈａｎ）　、　Ｎａｔ
ｕｒｅ。

３１５巻、１１５頁（１９８５）　　、オーニッッ（Ｏ
ｒｎｉｔｚ）ら、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２３８巻、１８
８頁（１９８７）　　；またはベーリンガー（Ｂｅｈｒ
ｉｎｇｅｒ）　、　　Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、　　Ａ
ｃａｄ。

Ｓｃｉ、　［ＪＳＡ、　８５巻、　２６４８頁（１９８
８）に記載されている方法コが、リポータ−タンパクの
発現を検８するのに用いられる。

実施例３：催奇性物質アッセイ用の遺伝子導入動物の胚 標的遺伝子と、結合リポータ−遺伝子とを有する遺伝子
導入動物の胚が、催奇性物質のスクリーニングに利用さ
れる。この遺伝子導入胚モデルによって、生きているヒ
ト胚と類似の系で変異誘発現象を、簡単・迅速に定量す
ることができ、現在用いられている方法よりも、より正
確に、催奇性の化合物の危険性を評価できるはずである
。

実施例１および２に詳述した方法によって生じさせた。

　　ＩａｃＺ遺伝子に結合したＩａｃｌ遺伝子を有する
マウスおよびブタのような遺伝子導入動物は。

試験動物として、遺伝子導入子孫を生じさせるのに使用
される。遺伝子発現が成功裏に行なわれた雌の遺伝子導
入妊娠動物から種々の段階で分離した胚を被検試薬に曝
露し、リポータ−遺伝子の発現を分析した。

例えば、２０〜２１日の妊娠期間に発育し、はとんどす
べての成体構造をもった原基を有する１０ｍｍの遺伝子
導入ブタの胚を、催奇性を有する可能性のある物質に曝
露する。催奇性物質によって起こる変異によって標的遺
伝子が不活性化され、胚のある種の細胞／組織中のリポ
ータ−遺伝子を作動させる。これらの細胞／組織は、こ
のリポータ−タンパクが、β−ガラクトシダーゼもしく
はこのリポータ−タンパクに代わる他の適当な物質であ
る場合には、前記の組織化学的分析法、またはアレン　
エヌ　デイ（Ａｌｉｅｎ　Ｎ、Ｄ、）　　ら、　　Ｔｒ
ａｎｓｇｅｎｅｓａｓ　ｐｒｏｂｅＳｆｏｒ　ａｃｔｉ
ｖｅ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ　ｄｏｍａｉｎｓ　ｉｎ
ｍｏｕｓｅ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ”、　　Ｎａｔｕ
ｒｅ、　３３３巻、　８５２−８５５頁（１９８ｇ）に
記載されている組織化学的分析法を用いて検出すること
ができる。

検出法および検出システム、リポータ−遺伝子に結合し
た標的遺伝子を有する。そして変異誘発物質と催奇性物
質の試験用の遺伝子導入動物および遺伝子導入動物細胞
を修飾および改変することは１本発明の前記詳細な説明
から、当業者には明らかである。このような修飾および
改変は９本願の特許請求の範囲内にある。

（発明の要約） 化合物を、変異誘発または催奇形活性について速やかに
スクリーニングするための、迅速、高感度ならびに定量
的な方法および分析方法が提供される。この方法では、
遺伝子導入動物細胞、成体または胚に遺伝子を導入した
動物を用いる。細胞培養物からの各細胞、動物からの分
化した組織。

または動物の胚は、標的遺伝子およびリポータ−遺伝子
を含む。この両者は、動物のプロモーター／エンハンサ
−、コード配列および転写終結シグナルを有する。その
ため、それらは、動物細胞中で発現が可能である。標的
遺伝子の生成物は、リポータ−遺伝子中の調節配列との
相互作用により。

リポータ−遺伝子の発現を調節することが可能である。

好適な実施態様においては、標的遺伝子１ａｃｌ　（ｌ
ａｃ　リプレッサー）は、リポータ−遺伝子１ａｃ２　
（β−ガラクトシダーゼをコードする）に結合する。

これは、細胞化学的または組織化学的方法により検出さ
れる。動物細胞が、標的遺伝子を変化させるか、または
リポータ−遺伝子のオペレーターを変化させるような変
異を引き起こす化合物にさらされると、リポータ−遺伝
子が発現する。

【図面の簡単な説明】

第１図は１発現ベクターｐＸＺＩの構造を示す概略図で
ある。この発現ベクターは、　Ｒ３Ｖ−ＬＴＲプロモー
ターおよびＳＶ４０ポリアデニル化部位が隣接するＩａ
ｃ　ＩＪプレッサーの完全コード配列を有しくこれは標
的遺伝子の機能的転写ユニットを形成する）；そしてＳ
Ｖ４０プロモーターおよびＳＶ４０ポリアデニル化部位
が隣接するβ−ガラクトシダーゼ酵素の完全コード配列
（これはリポータ−遺伝子の機能的転写ユニットを形成
する）とを有する。 第２図は、　ｐＸ２１とｐＳＶ２ネオを用いたヒト胎児
腎ｉｔＨ胞２９３のトランスフェクションと、　ＴＰＴ
Ｇ誘発に対して陽性の細胞系列の単離とを示す概略図で
ある。 第３図（ａ）および（ｂ）は、　　Ｉａｃｌ遺伝子およ
びＩａｃ［］１ａｃ２遺伝子を有するＸＺＩ（２９３）
細胞の写真である；第３図（ａ）は、　ＩＰＴＧの非存
在下にてＸ−ｇａ　ｌ基質で無色を維持した対照細胞の
写真であり、　　１ａｃｌ！ＪブレツサーによってＩａ
ｃ２が抑制されていることを示している；第３図ら）は
、　１５ｍＭ　ＩＰＴＧの存在下にてＸｇａ１基質で青
色に染色された細胞の写真であり。 Ｉａｃ２が発現していることを示している。 第４図（ａ）および（ｂ）はＸ２１２−９細胞の写真で
ある；第４図（ａ）は、　ＮＭｔｌに曝されていない対
照細胞の写真であり；第４図（ｂ）は、培地中の細胞１
ｍｌ当り１５０ｇｇのＮＭ［ｌに曝された細胞の写真で
ある。 第５図は、　ＸＺＩ細胞系列をＮＭｔｌ　テ処理し、　
Ｘ−ｇａｌの補充によって対照より青色に着色された細
胞を検出する方法の概略図であって、これらの細胞は変
異誘発を受けていることを示している。 第６図は１機能的標的遺伝子とリポータ−遺伝子とを有
する遺伝子導入マウスを生じさせ、インビボでの変異誘
発検定を実施する方法を示す概略図である。 第７図は、インビボでの検定法に用いる遺伝子導入マウ
スを繁殖および生産する方法を示す概略図である。 以 上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、真核細胞の核酸配列の発現に変異もしくは変化を起
   こさせる化合物をスクリーニングする方法であって、 標的遺伝子とリポーター遺伝子とを、該リポーター遺伝
   子の発現を調節する配列と組み合わせて与えることを包
   含し、 該標的遺伝子の発現による産物が、該調節配列に結合す
   ることによって該リポーター遺伝子の発現を調節するこ
   とができ、該リポーター遺伝子によってコードされるタ
   ンパクが容易に検出され得、そして、該標的遺伝子ある
   いは該調節配列の変化が該リポーター遺伝子の発現を抑
   制する、スクリーニング方法。 ２、前記リポーター遺伝子が、真核プロモーターと、調
   節配列と、リポーター遺伝子産物をコードする配列と、
   転写終結シグナルとを有し、前記標的遺伝子の発現によ
   る産物が該リポーター遺伝子の調節配列に結合して、該
   リポーター遺伝子産物をコードする配列の発現を調節す
   る、請求項１に記載の方法。 ３、前記標的遺伝子が、真核プロモーターと、調節分子
   をコードする配列と、転写終結シグナルとを有する、請
   求項２に記載の方法。 ４、前記リポーター遺伝子産物が、生化学的に検出可能
   なタンパクおよび核酸配列からなる群から選択される、
   請求項２に記載の方法。 ５、前記調節配列がオペレーターである、請求項２に記
   載の方法。 ６、前記標的遺伝子の調節産物が、リプレッサーと、前
   記リポーター遺伝子もしくは遺伝子産物に結合可能な核
   酸配列とからなる群から選択される、請求項３に記載の
   方法。 ７、前記リポーター遺伝子の産物がβ−ガラクトシダー
   ゼであり、調節分子がｌａｃリプレッサータンパクであ
   る、請求項６に記載の方法。 ８、前記標的遺伝子およびリポーター遺伝子を真核細胞
   に挿入することをさらに包含する、請求項１に記載の方
   法。 ９、前記真核細胞が、分化の初期段階にある動物胚であ
   る、請求項８に記載の方法。 １０、前記真核細胞が、充分に分化した動物組織にある
   、請求項８に記載の方法。 １１、動物細胞に挿入された前記標的遺伝子およびリポ
   ーター遺伝子のコピー数を制御することをさらに包含す
   る、請求項８に記載の方法。 １２、前記機能性標的遺伝子のコピー数が１つに限定さ
   れる、請求項１１に記載の方法。１３、前記動物細胞を
   化合物に曝露すること；および曝露された該細胞内のリ
   ポーター遺伝子産物の発現を、該化合物に曝露されてい
   ない対照細胞内のリポーター遺伝子産物の発現と比較す
   ることをさらに包含する、請求項８に記載の方法。 １４、胚を化合物に曝露すること；該胚を一定期間、細
   胞分裂させること；および該胚内のリポーター遺伝子産
   物の発現を、該化合物に曝露されていない胚内のリポー
   ター遺伝子産物の発現と比較することをさらに包含する
   、請求項９に記載の方法。 １５、分化した前記動物を化合物に曝露すること；該動
   物に該化合物を代謝させ、かつ細胞分裂させること；お
   よび曝露された該動物由来の組織内のリポーター遺伝子
   産物の発現を、該化合物に曝露されていない対照動物の
   同系統の組織内のリポーター遺伝子産物の発現と比較す
   ることをさらに包含する、請求項１０に記載の方法。 １６、前記リポーター遺伝子がβ−ガラクトシダーゼを
   コードし、 β−ガラクトシダーゼの基質を与え、フェリシアン酸塩
   −フェロシアン酸塩溶液で染色することにより、該リポ
   ーター遺伝子の発現を測定することをさらに包含する、
   請求項８に記載の方法。 １７、酵素を結合した免疫グロブリンを用いてリポータ
   ー遺伝子の発現を測定し、免疫化学的方法で抗原の発現
   を検出することをさらに包含する、請求項８に記載の方
   法。 １８、真核細胞の核酸配列の発現に変異もしくは変化を
   起こさせる化合物を迅速にスクリーニングするシステム
   であって、 標的遺伝子とリポーター遺伝子とを、該リポーター遺伝
   子の発現を調節する配列と組み合わせて包含し、 該標的遺伝子の発現による産物が、該調節配列に結合す
   ることによって該リポーター遺伝子の発現を調節するこ
   とができ、該リポーター遺伝子によってコードされるタ
   ンパクが容易に検出され得、そして、該標的遺伝子ある
   いは該調節配列の変化が該リポーター遺伝子の発現を抑
   制する、スクリーニングシステム。 １９、前記リポーター遺伝子が、真核プロモーターと、
   調節配列と、リポーター遺伝子産物をコードする配列と
   、転写終結シグナルとを有し、前記標的遺伝子の発現に
   よる産物が、該リポーター遺伝子の調節配列に結合して
   、該リポーター遺伝子産物をコードする配列の発現を調
   節する、請求項１８に記載のシステム。 ２０、前記標的遺伝子が、真核プロモーターと、調節分
   子をコードする配列と、転写終結シグナルとを有する、
   請求項１９に記載のシステム。 ２１、前記リポーター遺伝子産物が、生化学的に検出可
   能なタンパクと、リポーター遺伝子配列に対して相補的
   な核酸配列とからなる群から選択される、請求項１９に
   記載のシステム。 ２２、前記リポーター遺伝子産物が、β−ガラクトシダ
   ーゼ、ルシフェラーゼ、ペルオキシダーゼ、および免疫
   化学的に検出可能な抗原からなる群から選択される、請
   求項２１に記載のシステム。 ２３、前記調節遺伝子産物が、リプレッサーと、前記リ
   ポーター遺伝子もしくは遺伝子産物に結合可能な核酸配
   列とからなる群から選択される、請求項２０に記載のシ
   ステム。 ２４、前記調節分子がｌａｃリプレッサータンパクであ
   り、前記調節配列がｌａｃＺオペレーターである、請求
   項２３に記載のシステム。 ２５、ヒストン３．２遺伝子、ヒトリボソームタンパク
   Ｓ１４遺伝子、マウスリボソームタンパクＳ１６遺伝子
   、ラットβ−アクチン遺伝子、サイトメガロウイルス初
   期遺伝子プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ラ
   ウス肉腫ウィルス長末端反復部分、およびモロニー白血
   病ウィルス長末端反復部分からなる群から選択される少
   なくとも１つのプロモーターをさらに包含する、請求項
   １８に記載のシステム。 ２６、真核細胞をさらに包含する、請求項１８に記載の
   システム。 ２７、前記真核細胞が、分化の初期段階にある動物の胚
   である、請求項２６に記載のシステム。 ２８、前記動物細胞が、充分に分化した動物組織にある
   、請求項２６に記載のシステム。