JPH02147954A - ヒトの血清または血漿におけるオステオカルシンの決定法 - Google Patents
ヒトの血清または血漿におけるオステオカルシンの決定法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明はヒトの血清または血漿におけるオステオカルシ
ンの決定法に関する。その方法は以下詳しく説明される
オリゴペプチドトレーサの一定量と決定されるべきｈ−
オステオカルシンを含む血ＩＮまたは血漿の試料を培養
する免疫検定法であり、オリゴペプチドトレーサは適当
な物理的検出法により検出できる標ａ基を含有し、オス
テオカル７ンとオリゴペプチドトレーサのための特殊な
結合剤を表示する抗体と共に培養される。その後抗体に
結合したオリゴペプチドトレーサの比率をその標識に基
づいて測定し、これから自消または血漿に含まれるｈ−
オステオカルシンの量を計算により決定するものである
。
ンの決定法に関する。その方法は以下詳しく説明される
オリゴペプチドトレーサの一定量と決定されるべきｈ−
オステオカルシンを含む血ＩＮまたは血漿の試料を培養
する免疫検定法であり、オリゴペプチドトレーサは適当
な物理的検出法により検出できる標ａ基を含有し、オス
テオカル７ンとオリゴペプチドトレーサのための特殊な
結合剤を表示する抗体と共に培養される。その後抗体に
結合したオリゴペプチドトレーサの比率をその標識に基
づいて測定し、これから自消または血漿に含まれるｈ−
オステオカルシンの量を計算により決定するものである
。
（従来技術）
ヒトのオステオカルシンは、ビタミンに一依存性骨タン
パク質またはγ−力ルボキシグルタミン酸含有タンパク
質（またはｂｏｎｅ Ｇｌａ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＢＧＰ
））とし呼ばれ、・目マトリックスを構成する特殊なペ
プチドである。そのペプチドは４９のアミノ酸から成り
、次のアミノ酸配列順序を持っている。
パク質またはγ−力ルボキシグルタミン酸含有タンパク
質（またはｂｏｎｅ Ｇｌａ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＢＧＰ
））とし呼ばれ、・目マトリックスを構成する特殊なペ
プチドである。そのペプチドは４９のアミノ酸から成り
、次のアミノ酸配列順序を持っている。
Ｔｙｒ −Ｌｅｕ −Ｔｙｒ −Ｇｌｎ −Ｔｒｐ −
Ｌｅｕ −Ｇｌｙ −Ａｌａ −Ｐｒｏ −Ｖａｔ −
Ｐｒｏ −Ｔｙｒ −Ｐｒｏ−八ＳＰ −Ｐｒｏ −Ｌ
ｅｕ−Ｇｌｕ −Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ａｒｇ −Ｇｌａ
−Ｖａｔ −Ｃｙｓ −Ｇｌａ −Ｌｓｕ−＾ｓｎ −
Ｐｒｏ−＾５ｐ−Ｃｙｓ−＾ｓｐ −Ｇｌｕ −Ｌｏｕ
−Ａｌａ−＾ｓｐ−＾ｒＢ −１１ｅ −Ｇｌｙ −
１”ｈａ −Ｇｌｎ −ＧｌｕＡｌａ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ
−Ａｒｇ Ｐｈｅ−ＬＬ！ニーＧｌｙ−Ｐｒｏ −Ｙ
ａｌ番・ そのペプチドは骨芽細胞によって合成され、生成された
オステオカルシンの小分画は血液のなかに放出される。
Ｌｅｕ −Ｇｌｙ −Ａｌａ −Ｐｒｏ −Ｖａｔ −
Ｐｒｏ −Ｔｙｒ −Ｐｒｏ−八ＳＰ −Ｐｒｏ −Ｌ
ｅｕ−Ｇｌｕ −Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ａｒｇ −Ｇｌａ
−Ｖａｔ −Ｃｙｓ −Ｇｌａ −Ｌｓｕ−＾ｓｎ −
Ｐｒｏ−＾５ｐ−Ｃｙｓ−＾ｓｐ −Ｇｌｕ −Ｌｏｕ
−Ａｌａ−＾ｓｐ−＾ｒＢ −１１ｅ −Ｇｌｙ −
１”ｈａ −Ｇｌｎ −ＧｌｕＡｌａ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ
−Ａｒｇ Ｐｈｅ−ＬＬ！ニーＧｌｙ−Ｐｒｏ −Ｙ
ａｌ番・ そのペプチドは骨芽細胞によって合成され、生成された
オステオカルシンの小分画は血液のなかに放出される。
１ｍ １ｆｆｌのなかのこのオステオカルシンの濃度決
定は骨の代謝についての成る貴重な結論を引き出すこと
ができ、これに対して１．ｉａｎ、 Ｊ、 Ｂ。
定は骨の代謝についての成る貴重な結論を引き出すこと
ができ、これに対して１．ｉａｎ、 Ｊ、 Ｂ。
及びＧｕｎｄｂｅｒｇ Ｃ，Ｉｌｌ による報告が引
用される。臨未整形外科及び関連研究２２６．２８７−
２９１頁（１９８８）。
用される。臨未整形外科及び関連研究２２６．２８７−
２９１頁（１９８８）。
これに関連して、ヒトの血清または血漿におけるオステ
オカルシンの濃度決定は骨代謝の疾患の治療及び診断に
助けとなる情報を得ることができる。
オカルシンの濃度決定は骨代謝の疾患の治療及び診断に
助けとなる情報を得ることができる。
種々の免疫診断方法と（に放射線標識免疫検定法がオス
テオカルシンの濃度測定に開発されて来た。本発明はア
メリカ特３’９４．４３１１．２０８の教示に基づく免
疫診断検出法の開発に関するものであり、実際の応用可
能性のために重要である。アメリカ特許によれば、完全
なｈ−オステオカルシンの代表的なフラグメントを表示
する種々なオリゴペプチド、とくに（ｈ−オステオカル
シン（ｈ−ｏｓＬｅｏｃａｌｅｉｎｅ ３７ ４９ ）
）のＣ−末端トリデカペプチドが完全なｈ−オステオカ
ルシン１−４９の決定のために放射線標識免疫検定法に
使用し、ヒトのオステオカルシンのこのペプチドセグメ
ントに対して向けられている抗体を起させるのに使用さ
れる。公知の競争原理が作用する免疫学的検査法におけ
るトレーサとして使用されるときに、オリゴペプチドト
レーサは標識されたオステオカルシン３７−４９を表示
し、または次の構造を持つ、オリゴペプチドをオステオ
カルシン３８−４９類似体トレーサとして表示する。
テオカルシンの濃度測定に開発されて来た。本発明はア
メリカ特３’９４．４３１１．２０８の教示に基づく免
疫診断検出法の開発に関するものであり、実際の応用可
能性のために重要である。アメリカ特許によれば、完全
なｈ−オステオカルシンの代表的なフラグメントを表示
する種々なオリゴペプチド、とくに（ｈ−オステオカル
シン（ｈ−ｏｓＬｅｏｃａｌｅｉｎｅ ３７ ４９ ）
）のＣ−末端トリデカペプチドが完全なｈ−オステオカ
ルシン１−４９の決定のために放射線標識免疫検定法に
使用し、ヒトのオステオカルシンのこのペプチドセグメ
ントに対して向けられている抗体を起させるのに使用さ
れる。公知の競争原理が作用する免疫学的検査法におけ
るトレーサとして使用されるときに、オリゴペプチドト
レーサは標識されたオステオカルシン３７−４９を表示
し、または次の構造を持つ、オリゴペプチドをオステオ
カルシン３８−４９類似体トレーサとして表示する。
Ｔｒｙ”−Ｇｌｎ −Ｇｌｕ−＾１−ａ−Ｐｈｅ−Ａｒ
ｇ−Ａｒｇ −ＰｈｅＩ”ｈｅ−Ｇｌｙ−Ｉ’ｒｏ −
Ｖａｌ”抗オステオカルシン３７−４９抗体に対するこ
の類似体トレーサの結合は研究された試料におけるオス
テロカルジン１−４９の濃度が増加するにつれて減少す
る。培養混合物の試料に存在するオステオカルシン！−
４９の量はそれ故にオステオカルシン３７−４９の標準
プロットを使用する慣習のやり方により測定することが
できる。アメリカ特許４．４３８．２０８において、こ
の型の検定が例えばヒトの血清におけるオステオカルシ
ンの決定に適するものと似定している。
ｇ−Ａｒｇ −ＰｈｅＩ”ｈｅ−Ｇｌｙ−Ｉ’ｒｏ −
Ｖａｌ”抗オステオカルシン３７−４９抗体に対するこ
の類似体トレーサの結合は研究された試料におけるオス
テロカルジン１−４９の濃度が増加するにつれて減少す
る。培養混合物の試料に存在するオステオカルシン！−
４９の量はそれ故にオステオカルシン３７−４９の標準
プロットを使用する慣習のやり方により測定することが
できる。アメリカ特許４．４３８．２０８において、こ
の型の検定が例えばヒトの血清におけるオステオカルシ
ンの決定に適するものと似定している。
完全なオステオカルシンに対する抗体の使用によりまた
はオステオカルシンｌ−４９トレーサの使用により行わ
れる免疫検定法と比較してアメリカ特許４．４３８．２
０８の方法は、多くの重要な利点がある。即ち抗体は、
ヒトのオステロカルジン、主にそのＣ−末端部分の成る
領域に一致するアミノ酸配列順序に向けられている。
はオステオカルシンｌ−４９トレーサの使用により行わ
れる免疫検定法と比較してアメリカ特許４．４３８．２
０８の方法は、多くの重要な利点がある。即ち抗体は、
ヒトのオステロカルジン、主にそのＣ−末端部分の成る
領域に一致するアミノ酸配列順序に向けられている。
この部分にはカルシウム結合の場所はなく、結果として
、オステオカルノン１−４９／抗体の相互作用はカルシ
ウムｍ変に無関係である。
、オステオカルノン１−４９／抗体の相互作用はカルシ
ウムｍ変に無関係である。
さらに上述の３８−４９類似体トレーサが使用できる。
後者はただ１つのチロシン単位を含有する類似体ペプチ
ドである。これは例几ば公知のクロラミンＴ法を使用す
る放射性ヨウ素化の後に高性能液体クロマトグラフィ（
ＨＰ ＬＣ）により試料を純粋な形で容易に得られるこ
とを意味している。オステオカルシン！−４９は５つの
チロシン単位を含有している。オステロカルジン３７−
４９オリゴペプチドですらなお２つのチロシン単位を含
有している。これらのペプチドの放射性ヨウ素は幾つか
の別々に標識された生成物を通常生成しているのでトレ
ーサとして使用するには分離しなければならないという
問題がある。
ドである。これは例几ば公知のクロラミンＴ法を使用す
る放射性ヨウ素化の後に高性能液体クロマトグラフィ（
ＨＰ ＬＣ）により試料を純粋な形で容易に得られるこ
とを意味している。オステオカルシン！−４９は５つの
チロシン単位を含有している。オステロカルジン３７−
４９オリゴペプチドですらなお２つのチロシン単位を含
有している。これらのペプチドの放射性ヨウ素は幾つか
の別々に標識された生成物を通常生成しているのでトレ
ーサとして使用するには分離しなければならないという
問題がある。
しかしながら、ヒトの血清または血漿におけるオステオ
カルシンを決定する試みにおいて測定されたレベルは、
培養条件に依存して異なり、検定されるべき試料におけ
るみがけのオステオカルシンレベルはしばしば余りに高
いということが認められてきた。
カルシンを決定する試みにおいて測定されたレベルは、
培養条件に依存して異なり、検定されるべき試料におけ
るみがけのオステオカルシンレベルはしばしば余りに高
いということが認められてきた。
本発明はｈ−オステオカルシンの決定法の作成を目的と
している。その決定法において決定されるべきオステオ
カルシンを含有する生物学的液体の試料は適当な検出方
法により検出可能な標識基を含みオリゴペプチドトレー
サとくにオステオカルノン３８−４９類似体トレーサの
一定量とオステオカルシン及びオリゴペプチドトレーサ
の特殊な結合剤を表示する抗体と共に培養し、その後そ
の標識を基にして抗体に結合したオリゴペプチドの比率
を測定しこのことから血清または血漿中に含まれるオス
テオカルシン量を計算により決定するものである。ヒト
の血清または血漿のながのｈ−オステオカルシンの信頼
性のあるそして再現性のある決定がそのようなやり方に
おいて可能となるのである。
している。その決定法において決定されるべきオステオ
カルシンを含有する生物学的液体の試料は適当な検出方
法により検出可能な標識基を含みオリゴペプチドトレー
サとくにオステオカルノン３８−４９類似体トレーサの
一定量とオステオカルシン及びオリゴペプチドトレーサ
の特殊な結合剤を表示する抗体と共に培養し、その後そ
の標識を基にして抗体に結合したオリゴペプチドの比率
を測定しこのことから血清または血漿中に含まれるオス
テオカルシン量を計算により決定するものである。ヒト
の血清または血漿のながのｈ−オステオカルシンの信頼
性のあるそして再現性のある決定がそのようなやり方に
おいて可能となるのである。
この目的は、特許請求の範囲第１項記載の前おき部にお
ける方法で特徴部において記載した測定により達成され
る。
ける方法で特徴部において記載した測定により達成され
る。
特許五、１求の範囲第１項による基本的な方法の好まし
い有利な具体例は従属特許請求項に記載されている。
い有利な具体例は従属特許請求項に記載されている。
本発明による方法の基礎は不正確な測定結果及びヒトの
血清または血漿の試料において測定されたオステオカル
シンの余りにも高いレベルがトレーサ、抗体及び試料の
培養の間で類似体トレーサを急速に分解するプロテアー
ゼ（タンパク質分解酵素）を含むという事実から導かれ
ることを発明者が認識したことである。このことにより
生成された類似体トレーサのフラジメントは、もはや抗
体とは結合しないので抗体に結合するトレーサの量が減
少するために検定されるべき試料における見かけのオス
テオカルシンのレベルは不正確になり、余りにも高くな
っている。オステオカルシン３７−４９のオリゴペプチ
ドはまた類似体トレーサの速度と同様な速度でヒトの血
清または血漿の試料のなかで破壊されるということが同
時に確認された。これらの研究の結果は、測定された不
正確な測定結果を説明し、アメリカ特許４．４３８．２
０８の方法を使用してヒトの血清または血漿における直
接オステオカルシンを信頼性よく決定できないという結
論が引き出せる。
血清または血漿の試料において測定されたオステオカル
シンの余りにも高いレベルがトレーサ、抗体及び試料の
培養の間で類似体トレーサを急速に分解するプロテアー
ゼ（タンパク質分解酵素）を含むという事実から導かれ
ることを発明者が認識したことである。このことにより
生成された類似体トレーサのフラジメントは、もはや抗
体とは結合しないので抗体に結合するトレーサの量が減
少するために検定されるべき試料における見かけのオス
テオカルシンのレベルは不正確になり、余りにも高くな
っている。オステオカルシン３７−４９のオリゴペプチ
ドはまた類似体トレーサの速度と同様な速度でヒトの血
清または血漿の試料のなかで破壊されるということが同
時に確認された。これらの研究の結果は、測定された不
正確な測定結果を説明し、アメリカ特許４．４３８．２
０８の方法を使用してヒトの血清または血漿における直
接オステオカルシンを信頼性よく決定できないという結
論が引き出せる。
しかしながら、ひとたび問題が使用されたオリゴペプチ
ドトレーサのタンパク質加水分解的破壊であると認識さ
れるや、この問題を解決するためのやり方が開発され、
このことは最終的に本発明による方法を産出する結果と
なった。もしもオリゴペプチドトレーサのタンパク質加
水分解的破壊が解決されるべき問題を表示するならば、
すくなくともトレーサ、抗体及びｌｌ’ｌｌ清／血漿の
培養の期間でトレーサが安定に留まるような程度にトレ
ーサを破壊するタンパク質分解酵素の活性を減少させる
よう試みることはやってみる価値があるように思われる
。
ドトレーサのタンパク質加水分解的破壊であると認識さ
れるや、この問題を解決するためのやり方が開発され、
このことは最終的に本発明による方法を産出する結果と
なった。もしもオリゴペプチドトレーサのタンパク質加
水分解的破壊が解決されるべき問題を表示するならば、
すくなくともトレーサ、抗体及びｌｌ’ｌｌ清／血漿の
培養の期間でトレーサが安定に留まるような程度にトレ
ーサを破壊するタンパク質分解酵素の活性を減少させる
よう試みることはやってみる価値があるように思われる
。
種々の手段はタンパク分解酵素の活性を減少できるよう
に思われる。かくして例尤ば血清または血漿の試料から
オステオカルシンを抽出することにより、測定されるべ
き′オステオカルシンからタンパク分解酵素を分離する
ことが想像できた。しかしながら、患者の血清／血漿の
抽出は手のこんだ方法であり、時間がかかり、費用もか
さみ、それ故実際の使用に対して殆んど満足できないも
のと思われる。
に思われる。かくして例尤ば血清または血漿の試料から
オステオカルシンを抽出することにより、測定されるべ
き′オステオカルシンからタンパク分解酵素を分離する
ことが想像できた。しかしながら、患者の血清／血漿の
抽出は手のこんだ方法であり、時間がかかり、費用もか
さみ、それ故実際の使用に対して殆んど満足できないも
のと思われる。
他の想像できる方法は熱変性及びタンパク分解酵素の不
活性化であった。しかしながら、血清／血漿の熱処理は
、ただ５８℃の温度まで可能であり、血清／血漿におい
て、成分が凝集し、オステオカルシンの放射線標識免疫
検定法の精度に負の結果を与える。しかしながら、この
関連において５８°Ｃ，１時間で処理された血清は観察
されたオステオカルシン３８−４９ （類似体トレーサ
）の破壊活性に関して本質的に変化を示さないことが明
らかになった。かくして血清の熱処理に対して可能な５
８゛Ｃの最高昌度は試料のなかに含まれたタンパク分解
酵素を不活性にすることは不充分である。
活性化であった。しかしながら、血清／血漿の熱処理は
、ただ５８℃の温度まで可能であり、血清／血漿におい
て、成分が凝集し、オステオカルシンの放射線標識免疫
検定法の精度に負の結果を与える。しかしながら、この
関連において５８°Ｃ，１時間で処理された血清は観察
されたオステオカルシン３８−４９ （類似体トレーサ
）の破壊活性に関して本質的に変化を示さないことが明
らかになった。かくして血清の熱処理に対して可能な５
８゛Ｃの最高昌度は試料のなかに含まれたタンパク分解
酵素を不活性にすることは不充分である。
考尤られる他の可能な手段は適当な阻害剤を添加してタ
ンパク分解酵素を阻害することである。
ンパク分解酵素を阻害することである。
ヒトのタンパク分解酵素がヒトの血清及び血漿のなかに
存在し、オステオカルシン３Ｂ−４９（類似体トレーサ
）の分裂に”関して活性であることは知られてなかった
ために、この型の手段が適当な阻害剤によりタンパク分
解酵素を阻害することが可能であるかどうかを予言する
ことはもしも所望の目的を達成するために阻害剤が有効
であるとしてらできなかった。
存在し、オステオカルシン３Ｂ−４９（類似体トレーサ
）の分裂に”関して活性であることは知られてなかった
ために、この型の手段が適当な阻害剤によりタンパク分
解酵素を阻害することが可能であるかどうかを予言する
ことはもしも所望の目的を達成するために阻害剤が有効
であるとしてらできなかった。
表１に集約された広汎な研究から、未変化のオステオカ
ルシン３８−４９ （類似体トレーサ）の破壊を１．１
１−のタンパク分解酵素阻害剤の添加することにより禁
止させることが可能でないことを明らかにしている。ヒ
トの血清または血漿が１つ以−Ｌのタンパク分解酵素を
含みオリゴペプチドトレー−＋を破壊することをこれか
ら結論するときに、及びその後タンパク分解酵素阻害剤
の混合物を研究されたどきに本発ダｊが枳り！とする目
的を達成する方法が明らかになった。
ルシン３８−４９ （類似体トレーサ）の破壊を１．１
１−のタンパク分解酵素阻害剤の添加することにより禁
止させることが可能でないことを明らかにしている。ヒ
トの血清または血漿が１つ以−Ｌのタンパク分解酵素を
含みオリゴペプチドトレー−＋を破壊することをこれか
ら結論するときに、及びその後タンパク分解酵素阻害剤
の混合物を研究されたどきに本発ダｊが枳り！とする目
的を達成する方法が明らかになった。
これはロイペプチド及びアマスタチンの混合物からオリ
ゴペプチドの破壊を禁止するためただ１つでは充分でな
く、オリゴペプチドトレーサの破壊を防止することを確
認した理由である。
ゴペプチドの破壊を禁止するためただ１つでは充分でな
く、オリゴペプチドトレーサの破壊を防止することを確
認した理由である。
次の表１からこの結果は明らかである。
表 １
１″５１−オステオカルシン３８−４９ （類似体トレ
ーサ）の加水分解に及ぼす種々のタンパク分解酵素阻害
剤の効果阻害剤 濃 度 対照の加水分解 速度の％ 対照 エチレンジアミン四酢酸 ジイソプロピルフルオロ燐酸塩 フェニルメチルスルホニルフルオライドｐ−クロロ水銀
フェニルズルホン酸 ／ ０ｍＭ １ｍＭ １ｍＭ １ｍＭ Ｎ−エチルマレイミド ベスタチン アマスタチン ペプスタチン エラスタチナール ロイペプチン ホスホラミドン ベンザミジン トラシロール ヘパリン トリシン阻害剤（大豆） アンチスロムビン■ 熱処理（ｌｈ１５８℃） ロイペプチン プラス アマスタチン １ｍＭ １ｍＭ １００μＭ １００μＭ １００μＭ １ｍＭ １ｍＭ １ｍＭ １．６Ｘｌｏ“単位／ｍｆｆ ５ｍｇ／ｍ１２ ０．１ｍｇ／ｍＱ ｏ、ｉ単位／ｍ１２ ／ １ｍＭプラス １００μＭ ＜２ この関連において１６′１により標識されたオステオカ
ルシン３８−４９ （類似体トレーサ）のタンパク質加
水分解の研究は後の実施例において詳述するように行わ
れた。
ーサ）の加水分解に及ぼす種々のタンパク分解酵素阻害
剤の効果阻害剤 濃 度 対照の加水分解 速度の％ 対照 エチレンジアミン四酢酸 ジイソプロピルフルオロ燐酸塩 フェニルメチルスルホニルフルオライドｐ−クロロ水銀
フェニルズルホン酸 ／ ０ｍＭ １ｍＭ １ｍＭ １ｍＭ Ｎ−エチルマレイミド ベスタチン アマスタチン ペプスタチン エラスタチナール ロイペプチン ホスホラミドン ベンザミジン トラシロール ヘパリン トリシン阻害剤（大豆） アンチスロムビン■ 熱処理（ｌｈ１５８℃） ロイペプチン プラス アマスタチン １ｍＭ １ｍＭ １００μＭ １００μＭ １００μＭ １ｍＭ １ｍＭ １ｍＭ １．６Ｘｌｏ“単位／ｍｆｆ ５ｍｇ／ｍ１２ ０．１ｍｇ／ｍＱ ｏ、ｉ単位／ｍ１２ ／ １ｍＭプラス １００μＭ ＜２ この関連において１６′１により標識されたオステオカ
ルシン３８−４９ （類似体トレーサ）のタンパク質加
水分解の研究は後の実施例において詳述するように行わ
れた。
オステオカルシン３３８−４９（似体ペプチド）の分裂
に関してロイペプチン及びアマスタチンの組合せの驚異
的な有効性は同一の生物学的液体におけるオステロカル
ジン３Ｂ−４９と同様に後の研究から明らかにされるよ
うにロイペプチン及びアマスタチンの公知の阻害作用の
ためにオリゴペプチドトレーサの分裂が１つ又は種々の
エンドベブチターゼ（ロイペプチンはエンドベプチター
ゼ阻害剤である）及び１つ又は種々のアミノペブチター
ゼ（アマスタチンはアミノベブチターゼ阻害剤である）
の両方によってもたらされるという結論が引き出された
。
に関してロイペプチン及びアマスタチンの組合せの驚異
的な有効性は同一の生物学的液体におけるオステロカル
ジン３Ｂ−４９と同様に後の研究から明らかにされるよ
うにロイペプチン及びアマスタチンの公知の阻害作用の
ためにオリゴペプチドトレーサの分裂が１つ又は種々の
エンドベブチターゼ（ロイペプチンはエンドベプチター
ゼ阻害剤である）及び１つ又は種々のアミノペブチター
ゼ（アマスタチンはアミノベブチターゼ阻害剤である）
の両方によってもたらされるという結論が引き出された
。
アミノベブチターゼはＮ−末端アミノ酸のアミ７基が遊
離の形で存在するときのみペプチドを引裂することが知
られているので、本発明による目的を達成するためには
他の変形を見い出すべきであった。すなわち、例えばア
セチル化によって遊離のアミノ基を封鎖することにより
、アミノベプチターゼによる破壊からオリゴペプチドを
保護することができる。かくしてもしもＮ−末端の保護
されたアミノ基を持つオリゴペプチド、同時に例えばロ
イペプチンのエンドベブチターゼの阻害剤を使用するな
らば、同様に保護された形で使用されたオリゴペプチド
トレーサの破壊を防止できる。
離の形で存在するときのみペプチドを引裂することが知
られているので、本発明による目的を達成するためには
他の変形を見い出すべきであった。すなわち、例えばア
セチル化によって遊離のアミノ基を封鎖することにより
、アミノベプチターゼによる破壊からオリゴペプチドを
保護することができる。かくしてもしもＮ−末端の保護
されたアミノ基を持つオリゴペプチド、同時に例えばロ
イペプチンのエンドベブチターゼの阻害剤を使用するな
らば、同様に保護された形で使用されたオリゴペプチド
トレーサの破壊を防止できる。
保護されたオリゴペプチドが血清／血漿において急速に
分裂することを続けるあいだ、この場合、この破壊を完
全に禁止するためには、ただロイペプチンを加丸るだけ
で充分である。
分裂することを続けるあいだ、この場合、この破壊を完
全に禁止するためには、ただロイペプチンを加丸るだけ
で充分である。
次の表２はこれらの結果を集約している。これによれば
（目’Ｉ）−Ｎ−アセチル−オステオカルシン（３８−
４９）（類似体ペプチド）は血清／血漿において急速に
分裂される。しかしながら必要とされる最小濃度のロイ
ペプチンの添加はこの破壊を禁止している。
（目’Ｉ）−Ｎ−アセチル−オステオカルシン（３８−
４９）（類似体ペプチド）は血清／血漿において急速に
分裂される。しかしながら必要とされる最小濃度のロイ
ペプチンの添加はこの破壊を禁止している。
表 ２
１１＠ｌ Ｎ−アセチル−オステロカルジン３８−４
９（類似体ペプチド）の破壊に及ぼすロイペプチンの効
果 阻害剤 濃度 対照の加水分解速度の
％ 対照 ／ １００ ロイペプチド ５０μＭ０ その破壊は実施例に詳述されている。
９（類似体ペプチド）の破壊に及ぼすロイペプチンの効
果 阻害剤 濃度 対照の加水分解速度の
％ 対照 ／ １００ ロイペプチド ５０μＭ０ その破壊は実施例に詳述されている。
本発明による目的は、オリゴペプチドトレーサのタンパ
ク質加水分解の破壊を妨げる１つまたはそれ以上のタン
パク質加水分解阻害剤の存在においてヒトの血清または
血漿の試料中のオステオカルシンの決定を行うことによ
って達成される。
ク質加水分解の破壊を妨げる１つまたはそれ以上のタン
パク質加水分解阻害剤の存在においてヒトの血清または
血漿の試料中のオステオカルシンの決定を行うことによ
って達成される。
もしも保護されてないオリゴペプチドトレーサ、例えば
オステオカルシン３８−４９ （類似体ペプチド）のオ
リゴペプチドトレーサが使用されるならば、アミノペプ
チダーゼと同様にヒトの血清または血漿に存在するエン
ドペプチダーゼに対する適当なタンパク質加水分解阻害
剤を使用することが必要である。この関連において、こ
れらのタンパク質加水分解阻害剤は、培養混合物におい
て有効な阻害に必要な適切な最小濃度で使用されねばな
らない。
オステオカルシン３８−４９ （類似体ペプチド）のオ
リゴペプチドトレーサが使用されるならば、アミノペプ
チダーゼと同様にヒトの血清または血漿に存在するエン
ドペプチダーゼに対する適当なタンパク質加水分解阻害
剤を使用することが必要である。この関連において、こ
れらのタンパク質加水分解阻害剤は、培養混合物におい
て有効な阻害に必要な適切な最小濃度で使用されねばな
らない。
エンドペプチダーゼ阻害剤のロイペプチドの場合にはこ
の最小濃度は５ｏｎＭであり、アミノペプチダーゼ阻害
剤アマスタチンの場合にはこの最小濃度は２５μＭであ
る。
の最小濃度は５ｏｎＭであり、アミノペプチダーゼ阻害
剤アマスタチンの場合にはこの最小濃度は２５μＭであ
る。
上述のタンパク質加水分解阻害剤のロイペプチン及びア
ミスタチンは公知の物質であり、また市販され、入手で
きる。アマスタチンは例几ば次の文献に記述されている
。１９８６年Ｅｌｓｏｖｉｅｒ ５ｃｉｅｎｃｅＰｕｂ
ｌｉｓｈｅｒｓ ＢＹ （生物医学部門旧ｏｍｅｄｉｃ
ａｌ Ｄｉｖｉｓ １ｏｎ）発行のＢａｒｒｅｔＬ及び
５ａｌｖｅｓｅｎにより編集された「プロテアーゼ阻害
剤」における Ｊａｍｅｓ Ｃ。
ミスタチンは公知の物質であり、また市販され、入手で
きる。アマスタチンは例几ば次の文献に記述されている
。１９８６年Ｅｌｓｏｖｉｅｒ ５ｃｉｅｎｃｅＰｕｂ
ｌｉｓｈｅｒｓ ＢＹ （生物医学部門旧ｏｍｅｄｉｃ
ａｌ Ｄｉｖｉｓ １ｏｎ）発行のＢａｒｒｅｔＬ及び
５ａｌｖｅｓｅｎにより編集された「プロテアーゼ阻害
剤」における Ｊａｍｅｓ Ｃ。
Ｐｏｗｏｒ及びＪ、 ｆａｄａ １ｌａｒｐｅｒｌこよ
る［メタロプロテアーゼ阻害剤］の論文に記載されてい
る。ロイペプチンは同様に公知のプロテアーゼ阻害剤で
あり、例えば！９８３年ｄｅ Ｇｒｕｙｔａｒの［コン
サイス エンサイクロペディアオブバイオケミストリ」
の［ペプチド阻害剤」に記述さ′れている。
る［メタロプロテアーゼ阻害剤］の論文に記載されてい
る。ロイペプチンは同様に公知のプロテアーゼ阻害剤で
あり、例えば！９８３年ｄｅ Ｇｒｕｙｔａｒの［コン
サイス エンサイクロペディアオブバイオケミストリ」
の［ペプチド阻害剤」に記述さ′れている。
本発明による方法はその場合オリゴペプチドトレーサが
１曹％Ｉの放射性同位体で標識された放射線標識免疫検
定法（ＲＩ Ａ）として行われる。しかしながら、上述
の放射線標識の代りにまた他の免疫診断学の分野で使用
されている他の標識、例えば他の放射性核種、酵素、蛍
光ラジカル、化学燐光ラジカル、磁性粉末、安定な遊離
ラジカル等々が使用できる。
１曹％Ｉの放射性同位体で標識された放射線標識免疫検
定法（ＲＩ Ａ）として行われる。しかしながら、上述
の放射線標識の代りにまた他の免疫診断学の分野で使用
されている他の標識、例えば他の放射性核種、酵素、蛍
光ラジカル、化学燐光ラジカル、磁性粉末、安定な遊離
ラジカル等々が使用できる。
本発明による方法に用いられる抗体はポリクロナール及
びモノクロナール抗体の両方が使用できる。
びモノクロナール抗体の両方が使用できる。
この抗体は分散または懸濁の形で存在できるが結合相及
び遊離相の分離を容易にする適当な固相に結合させるこ
とにより固定される。公知の二抗体法（ｄｏｕｂｌｅ
ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）が均一相にお
いて操作するときに使用される。
び遊離相の分離を容易にする適当な固相に結合させるこ
とにより固定される。公知の二抗体法（ｄｏｕｂｌｅ
ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）が均一相にお
いて操作するときに使用される。
本発明の決定法について以下詳しく説明する。
１″町−オステオカルシン ３８−４９（類似体トレー
サ）類似体トレーサは、市販製品（Ｂａｅｈｅｓ＋）と
して得られるオステオカルシン３８−４９を使用し公知
のクロラミンＴ法゛法による放射性ヨウ素化によって製
造された。
サ）類似体トレーサは、市販製品（Ｂａｅｈｅｓ＋）と
して得られるオステオカルシン３８−４９を使用し公知
のクロラミンＴ法゛法による放射性ヨウ素化によって製
造された。
１１６１−Ｎ−アセチル−オステオがルシン３８−４９
類似体トレーサ最切にオステオカルシン３８−４９ （
類似体ペプチド）は末端窒素を保護したＮ−アセチル−
オステオカルシン３８−４９類似体ペプチドを製造する
ために無水酢酸と反応させた。末端の窒素を保護したＮ
−アセチル−オステオカルシン３８−４９類似体ペプチ
ドはそこで逆相高圧液体クロマトグラフィ（ＲＰ ＬＣ
）により精製した後、公知のクロラミンＴ法により放射
性ヨウ素化した。
類似体トレーサ最切にオステオカルシン３８−４９ （
類似体ペプチド）は末端窒素を保護したＮ−アセチル−
オステオカルシン３８−４９類似体ペプチドを製造する
ために無水酢酸と反応させた。末端の窒素を保護したＮ
−アセチル−オステオカルシン３８−４９類似体ペプチ
ドはそこで逆相高圧液体クロマトグラフィ（ＲＰ ＬＣ
）により精製した後、公知のクロラミンＴ法により放射
性ヨウ素化した。
放ｑ、Ｉ性ヨウ素化生成物はかわるがわるＲＰＬＣによ
り精製された。
り精製された。
関する研究
１“″１−オステオカルシン３８−４９ｆｆｌ似体ペプ
チド、Ｎ−アセチル−１町−オステオカルシン３Ｂ−４
９類似体ペプチド及び＋ｔｓ１−オステロカルシン３７
−４９はそ゛れぞれ２ Ｘ １０＠ｃ■ｐを４０μＱの
緩衝液（２５ｍＭの燐酸ソーダ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０
．１％のＮａｐｓ、ｐＨ７，８）と、５μＱの水のなか
に混合した。純粋な緩ｉＩｉ液は対照測定に用いられた
。種々のタンパク質加水分解の阻害剤の研究に純粋な緩
衝液が加丸られ、培養混合物のなかに表１または表２に
明記された濃度において生じる濃度のなかに、Ｉｔ ｌ
ｉ 液と５μＱのヒトの血清または血漿が加えられた。
チド、Ｎ−アセチル−１町−オステオカルシン３Ｂ−４
９類似体ペプチド及び＋ｔｓ１−オステロカルシン３７
−４９はそ゛れぞれ２ Ｘ １０＠ｃ■ｐを４０μＱの
緩衝液（２５ｍＭの燐酸ソーダ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０
．１％のＮａｐｓ、ｐＨ７，８）と、５μＱの水のなか
に混合した。純粋な緩ｉＩｉ液は対照測定に用いられた
。種々のタンパク質加水分解の阻害剤の研究に純粋な緩
衝液が加丸られ、培養混合物のなかに表１または表２に
明記された濃度において生じる濃度のなかに、Ｉｔ ｌ
ｉ 液と５μＱのヒトの血清または血漿が加えられた。
これは３７℃で１０分間培養された。反応を０．２Ｎの
ＩＩｃＩの１００μＱを加丸で停止させた。生じた反応
混合物はペプチドの破壊について研究された。使用され
た特殊なペプチド及びその破壊生成物の分析は０．４Ｘ
３Ｑｃ■のマイクロＢｏｎｄａｐａｋＣｒａカラムを使
用して高性能液体クロマトグラフ（ＤＰＩ、Ｃ）によっ
て行われた。
ＩＩｃＩの１００μＱを加丸で停止させた。生じた反応
混合物はペプチドの破壊について研究された。使用され
た特殊なペプチド及びその破壊生成物の分析は０．４Ｘ
３Ｑｃ■のマイクロＢｏｎｄａｐａｋＣｒａカラムを使
用して高性能液体クロマトグラフ（ＤＰＩ、Ｃ）によっ
て行われた。
物質はアセトニトリル：水ニトリフルオロ酢酸を容積で
５：９５：０．１の比率から成る溶剤Ａ （ｓｏｌＡ）
及びアセトニトリル：水ニトリフルオロ酢酸容積比で９
０＋ １０： ０．１から成る溶剤Ｂ （ｇｏｌＢ）か
らつくられたグラジェントを使用して次のように溶離さ
れる。
５：９５：０．１の比率から成る溶剤Ａ （ｓｏｌＡ）
及びアセトニトリル：水ニトリフルオロ酢酸容積比で９
０＋ １０： ０．１から成る溶剤Ｂ （ｇｏｌＢ）か
らつくられたグラジェントを使用して次のように溶離さ
れる。
３分間に線形’ｔ’ １００／ Ｏ（Ｖ／ Ｖ） （＠
ｏｌＡ／ｓｏｌ［３）から８５ ／ ｌ ５ ５ｏｌＡ
／ ５ｏｌＢまで及び１４分間に線形で５０／ ５−
Ｏ５ｏｌＡ／５ｏｌＢまで溶離し、その流れ速度は分当
り１．５ｍ１２であった。
ｏｌＡ／ｓｏｌ［３）から８５ ／ ｌ ５ ５ｏｌＡ
／ ５ｏｌＢまで及び１４分間に線形で５０／ ５−
Ｏ５ｏｌＡ／５ｏｌＢまで溶離し、その流れ速度は分当
り１．５ｍ１２であった。
溶離液の放射能は連続的に放射性モニター（ＲａｙＬｏ
ｓＬ）を使用して行った。放射性ペプチド（変換百分率
）の破壊は計算機プログラム（Ｒａｙｔｅｓｔ）を使用
して得られた破壊パターンから決定された。
ｓＬ）を使用して行った。放射性ペプチド（変換百分率
）の破壊は計算機プログラム（Ｒａｙｔｅｓｔ）を使用
して得られた破壊パターンから決定された。
破壊試験に使用されたペプチドがＨＰＬＣにより研究さ
れたときにそのフラジメントの大多数から分離できるの
で、ペプチドの破壊の研究は容易に可能であることが明
らかになった。特殊な条件の下で、タンパク質加水分解
阻害剤の添加なしに、または不適当なタンパク質加水分
解阻害剤の添加のとき使用されたトレーサの約８０％の
破壊が３７℃、１０分間で血清または血漿による培養の
後に観察されている。
れたときにそのフラジメントの大多数から分離できるの
で、ペプチドの破壊の研究は容易に可能であることが明
らかになった。特殊な条件の下で、タンパク質加水分解
阻害剤の添加なしに、または不適当なタンパク質加水分
解阻害剤の添加のとき使用されたトレーサの約８０％の
破壊が３７℃、１０分間で血清または血漿による培養の
後に観察されている。
この破壊は、もしもロイペプチン及びアマスタチンが特
別な阻害剤の前記の最小濃度特性の濃度において培養混
合物に同時に加丸られるならば、保護されてないペプチ
ドの場合において９９％以」二禁止されている。血清ま
たは血漿と共にペプチド（トレーサ）の培養の時に阻害
剤の最小濃度はロイペプチドではすくなくとも５０μＭ
でなければならず、アマスタチンではす（なくとし２５
μＭでなければならない。
別な阻害剤の前記の最小濃度特性の濃度において培養混
合物に同時に加丸られるならば、保護されてないペプチ
ドの場合において９９％以」二禁止されている。血清ま
たは血漿と共にペプチド（トレーサ）の培養の時に阻害
剤の最小濃度はロイペプチドではすくなくとも５０μＭ
でなければならず、アマスタチンではす（なくとし２５
μＭでなければならない。
ロイペプチド及びアマスタチンの混合物の阻害作用はま
た他の培養条件の下で研究された。その条件はオステオ
カルシンの放射線標識免疫検定法を行なう通常の条件に
一致している。４°Ｃｌ２Ｏ時間のこの型の培養におい
てさえ、上述のタンパク質加水分解阻害剤の混合物の存
在においてトレーサの破壊は観察されなかった。
た他の培養条件の下で研究された。その条件はオステオ
カルシンの放射線標識免疫検定法を行なう通常の条件に
一致している。４°Ｃｌ２Ｏ時間のこの型の培養におい
てさえ、上述のタンパク質加水分解阻害剤の混合物の存
在においてトレーサの破壊は観察されなかった。
表１は、３７℃での培養の結果を要約している。
使用されたタンパク質加水分解阻害剤は市販され、括弧
内にその販売元を明記した。アマスタチン（Ｎｏｖａ
Ｂｉｏｃｈｅｍ） ；ロイペプチン（Ｂａｃｈｅｍ）
；ベスタチン（Ｂａｃｈｅｓ） ；エラスタチナール
（Ｓｉｇｍａ） ；ペプスタチン（Ｎｏｖａ ｌ１ｉ
ｏｃｈｅｓ） ；ホスホラミトン（Ｎ。
内にその販売元を明記した。アマスタチン（Ｎｏｖａ
Ｂｉｏｃｈｅｍ） ；ロイペプチン（Ｂａｃｈｅｍ）
；ベスタチン（Ｂａｃｈｅｓ） ；エラスタチナール
（Ｓｉｇｍａ） ；ペプスタチン（Ｎｏｖａ ｌ１ｉ
ｏｃｈｅｓ） ；ホスホラミトン（Ｎ。
ｖａ Ｂｉｏｃｈｅａ） ：ベンサミジン（Ｓｉｇｍ
ａ） ； ）ラシロール（Ｂａｙｃｒ） ；大豆か
らのトリプシン阻害剤（Ｓｉｇｍａ） ；アンチスロ
ムビンＩＩＩ （Ｓｉｇｍａ）。
ａ） ； ）ラシロール（Ｂａｙｃｒ） ；大豆か
らのトリプシン阻害剤（Ｓｉｇｍａ） ；アンチスロ
ムビンＩＩＩ （Ｓｉｇｍａ）。
３７°Ｃ，１０分間の上述条件下、ヒトの血清または１
ｒ１１漿と共の培養において使用されたアセチル化され
た類似体ペプチドの約７０％は破壊されている。
ｒ１１漿と共の培養において使用されたアセチル化され
た類似体ペプチドの約７０％は破壊されている。
もしも最小濃度５０μＭのロイペプチドが培養混合物に
加えられるならば、この破壊は完全に禁止されている。
加えられるならば、この破壊は完全に禁止されている。
保護されていないペプチドの場合のようにロイペプチン
の存在は、オステオカルシンの放射線標識免疫検定法を
行う条件下でさえ保護された類似体トレーサの破壊を完
全に防止している。
の存在は、オステオカルシンの放射線標識免疫検定法を
行う条件下でさえ保護された類似体トレーサの破壊を完
全に防止している。
これらの結果は表２に要約されている。
放 ）１！免 定法
Ｎ−アセチル−１１！−オステオカルシン３８−４９類
似体ペプチド（保護された類似体トレーサのため）のた
め結合プロブトがオステオカルシンの放射線標識免疫検
定法において使用されたときに保護されてないオステオ
カルシン３８−４９１１似体ペプチドの結合プロットと
非常によく類似しているのでアセチル化類似体トレーサ
はまたこの型の標識放射線免疫検定法におけるオリゴペ
プチド類似体トレーサとして使用できる。
似体ペプチド（保護された類似体トレーサのため）のた
め結合プロブトがオステオカルシンの放射線標識免疫検
定法において使用されたときに保護されてないオステオ
カルシン３８−４９１１似体ペプチドの結合プロットと
非常によく類似しているのでアセチル化類似体トレーサ
はまたこの型の標識放射線免疫検定法におけるオリゴペ
プチド類似体トレーサとして使用できる。
アマスタチン及びロイペプチドの添加がトレーサのタン
パク質加水分解の破壊を防止するとはいえオステオカル
シンの放射ｉ標識免疫検定法に他の注目に値するなんら
の効果を持っていない。
パク質加水分解の破壊を防止するとはいえオステオカル
シンの放射ｉ標識免疫検定法に他の注目に値するなんら
の効果を持っていない。
すべての放射ｎ標識免疫検定法の研究は放射線標識免疫
検定法で明記された指示書によりヘニングベルリン ゲ
ーエムベーハーによって供給されたｒｏ Ｓ ＣＡテス
ト−オステオカルシン（３７４９）ヒト（Ｂｏｎｅ Ｇ
ｌａ Ｐｒｏｔｅｉｎ、 ＢＣＩ’） Ｊを使用して行
われた。
検定法で明記された指示書によりヘニングベルリン ゲ
ーエムベーハーによって供給されたｒｏ Ｓ ＣＡテス
ト−オステオカルシン（３７４９）ヒト（Ｂｏｎｅ Ｇ
ｌａ Ｐｒｏｔｅｉｎ、 ＢＣＩ’） Ｊを使用して行
われた。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、決定されるべきオステオカルシンを含有する血清ま
たは血漿の試料を、適当な物理的検出法により検出でき
る標識基を含むオリゴペプチドトレーサの一定量と、前
記オリゴペプチドトレーサ及び前記オステオカルシンの
ための特別な結合剤を表示する抗体と共に培養し、その
後前記抗体に結合したオリゴペプチドトレーサの比率を
その標識にもとづいて測定し、このことから血清または
血漿に存在する前記オステオカルシン量を計算により決
定するヒトの血清または血漿におけるオステオカルシン
の決定法において 前記オリゴペプチドトレーサのタンパク質加水分解的破
壊を防止するために使用される１つまたはそれ以上のタ
ンパク質加水分解阻害剤が前記オリゴペプチドトレーサ
の添加の前または添加と共にヒトの血清または血漿の試
料に加えられることを特徴とするオステオカルシンの決
定法。 ２、前記オリゴペプチドトレーサは標識オリゴペプチド
であり、前記オリゴペプチドトレーサは１０から１６の
アミノ酸の配列順序からなりそれ自身よくしられており
、ヒトのオステオカルシンのＣ−末端アミノ酸を含有し
、この型の１つのアミノ酸取替えの最大がＰｈｅ／Ｔｙ
ｒまたはＧｌｕ／Ｇｌａ取替えでないという条件で他の
アミノ酸によって取替えできる３つのアミノ酸までを含
有すること及び前記タンパク質加水分解阻害剤がエンド
ペプチダーゼ阻害剤及びアミノペプチダーゼ阻害剤であ
り、いずれの場合においても必要とされる最小濃度で混
合されることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載に
よるオステオカルシンの決定法。 ３、アマスチンの最小濃度が２５μＭであり、ロイペプ
チドの最小濃度が５０μＭであるような前記アマスチン
及び前記ロイペプチドの混合物が使用される前記オリゴ
ペプチドトレーサ、抗体及び試料を含有する混合物のな
かに存在することを特徴とする特許請求の範囲第２項記
載によるオステオカルシンの決定法。 ４、次のアミノ酸配列順序の（ｈ−オステオカルシンフ
ラジメント３８−４９類似体）オリゴペプチドは Ｔｙｒ＾３＾ａ−Ｇｉｎ−Ｇｌｕ−Ａｉａ−Ｐｈｅ−Ａ
ｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｖａ
ｌ＾４＾ａ であり、そのＴｙｒ残基に放射性ヨウ素により標識され
たものがオリゴペプチドトレーサとして使用されること
を特徴とする特許請求の範囲第２項及び第３項記載のい
ずれか１つによるオステオカルシンの決定法。 ５、前記オリゴペプチドトレーサは標識オリゴペプチド
であり、ヒトのオステオカルシンのＣ−末端アミノ酸を
含有するアミノ酸１０から１６の配列順序からなり、こ
の型のアミノ酸取替えの最大がＰｈｅ／ＴｙｒまたはＧ
ｌｕ／Ｇｌａ取替えでないという条件で他のアミノ酸に
より３までのアミノ酸によって取替えできること及びそ
のＮ−末端アミノ酸が保護された形で存在し、適当なエ
ンドペプチド阻害剤が必要とされる最小濃度においてタ
ンパク質加水分解阻害剤として使用されることを特徴と
する特許請求の範囲第１項記載によるオステオカルシン
の決定法。 ６、次のアミノ酸配列順序を有するオリゴペプチド、そ
のＮ−末端アミノ酸は（Ｎ−オステオカルシンフラジメ
ント３８−４９類似体）に保護されているオリゴペプチ
ドは Ｔｙｒ＾３＾８−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａ
ｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｖａ
ｌ＾４＾ａ であり、そのＴｙｒ残基を放射性ヨウ素により標識され
たものがオリゴペプチドトレーサとして使用されること
を特徴とする特許請求の範囲第５項記載によるオステオ
カルシンの決定法。 ７、Ｎ−末端アミノ酸のアセチル化により保護されたオ
リゴペプチドが使用されることを特徴とした特許請求の
範囲第５項から第６項記載のいずれか１つによるオステ
オカルシンの決定法。 ８、ロイペプチンがエンドペプチダーゼ阻害剤として最
小濃度の５０μＭのロイペプチンで、試料、オリゴペプ
チドトレーサ及び抗体を含有する混合物に存在するよう
な濃度で使用されることを特徴とする特許請求の範囲第
５項から第７項記載のいずれか１つによるオステオカル
シンの決定法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3833936.6 | 1988-10-05 | ||
| DE3833936A DE3833936C1 (ja) | 1988-10-05 | 1988-10-05 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02147954A true JPH02147954A (ja) | 1990-06-06 |
Family
ID=6364464
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1258638A Pending JPH02147954A (ja) | 1988-10-05 | 1989-10-03 | ヒトの血清または血漿におけるオステオカルシンの決定法 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5168041A (ja) |
| EP (1) | EP0362773B1 (ja) |
| JP (1) | JPH02147954A (ja) |
| AT (1) | ATE110854T1 (ja) |
| DE (2) | DE3833936C1 (ja) |
| ES (1) | ES2057045T3 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1992006377A1 (en) * | 1990-10-04 | 1992-04-16 | Teijin Limited | Method and kit for immunoassay of propeptide of osteocalcin and proosteocalcin |
| JP2009236789A (ja) * | 2008-03-28 | 2009-10-15 | Yamasa Shoyu Co Ltd | ジアセチルポリアミンの分解防止法 |
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| DE4340597C2 (de) * | 1993-11-29 | 1995-11-30 | Brahms Diagnostica Gmbh | Verfahren zur Verhinderung des Abbaus von Osteocalcin in humanem Serum oder Plasma f}r seine nachfolgende Bestimmung sowie Instrumente und Probengef{ße zur Durchf}hrung dieses Verfahrens |
| DE69433427T2 (de) * | 1993-12-09 | 2004-09-16 | The University Of Utah Research Foundation, Salt Lake City | Zusammensetzungen und kits zur fluoreszenzpolarisierungsdosierung von grossen molekülen |
| US20040259167A1 (en) * | 1997-08-15 | 2004-12-23 | Jukka Hellman | Isolated osteocalcin fragments |
| DE19903336C2 (de) * | 1999-01-28 | 2000-12-14 | Brahms Diagnostica Gmbh | Gebrauchsfertige Kalibratoren für die Bestimmung von Procalcitonin |
| CH695985A5 (de) * | 2002-01-21 | 2006-11-15 | Straumann Holding Ag | Oberflächenmodifizierte Implantate. |
| DE10231574A1 (de) * | 2002-07-11 | 2004-01-29 | Sartorius Ag | Membran, Vorrichtung und Verfahren zum Entfernen von Proteasen aus Flüssigkeiten |
| WO2008089226A2 (en) * | 2007-01-16 | 2008-07-24 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Assessing mammals for vascular diseases |
Family Cites Families (5)
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