JPH02147956A - 酵素免疫測定法 - Google Patents
酵素免疫測定法Info
- Publication number
- JPH02147956A JPH02147956A JP30101688A JP30101688A JPH02147956A JP H02147956 A JPH02147956 A JP H02147956A JP 30101688 A JP30101688 A JP 30101688A JP 30101688 A JP30101688 A JP 30101688A JP H02147956 A JPH02147956 A JP H02147956A
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- Japan
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- enzyme
- polyethylene glycol
- immunological measurement
- glycol derivative
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は、酵素免疫測定法に関する。更に詳しくは、一
般式 ％式％（１） （式中、Ｒ１はリン酸基、アリール若しくはアルキルカ
ルボニル基又は糖残基、ＲはＲ１と同−又はアルキル基
であり、ｎは２以上である。）で表されるポリエチレン
グリコール誘導体及びポリエチレングリコール代謝酵素
を用い更に、前記ポリエチレングリコール誘導体を分解
する酵素を標識酵素として用いる酵素免疫測定法に関す
る。
般式 ％式％（１） （式中、Ｒ１はリン酸基、アリール若しくはアルキルカ
ルボニル基又は糖残基、ＲはＲ１と同−又はアルキル基
であり、ｎは２以上である。）で表されるポリエチレン
グリコール誘導体及びポリエチレングリコール代謝酵素
を用い更に、前記ポリエチレングリコール誘導体を分解
する酵素を標識酵素として用いる酵素免疫測定法に関す
る。
（従来の技術）
酵素免疫測定法（以下ＥＩＡと省略する）における比色
法は汎用されている分光光度計を用い測定できるなどの
簡単な測定法としての利点を有しているものの他の螢光
法、生物発光法、化学発光法に比べ感度が低いことが欠
点であった。この欠点を克服する方法として、酵素とし
てアルカリ性ホスファターゼ、基質としてＮＡＤＰを用
い生成するＮＡＤを酵素的サイクリングにより測定する
方法が開発された。 （Ａ、 Ｊｏｈａｎｎｓｓｏｎ
ら、Ｃｌ１ｎ。
法は汎用されている分光光度計を用い測定できるなどの
簡単な測定法としての利点を有しているものの他の螢光
法、生物発光法、化学発光法に比べ感度が低いことが欠
点であった。この欠点を克服する方法として、酵素とし
てアルカリ性ホスファターゼ、基質としてＮＡＤＰを用
い生成するＮＡＤを酵素的サイクリングにより測定する
方法が開発された。 （Ａ、 Ｊｏｈａｎｎｓｓｏｎ
ら、Ｃｌ１ｎ。
Ｃｈｅｍ、 Ａｃｔａ、 １４８． １１９−１２４
、 （１９８５））。
、 （１９８５））。
（発明の解決しようとする問題点）
しかしながら、前記方法は、蛍光法を上回る感度を得る
ことができるが、使用するＮＡＤ及びＮＡＤＰは、特に
アルカリ溶液中で不安定であり、容易に取り扱うことが
できない。また、両者は共に高価である。更に生体内、
特に血中に存在するＮＡＤまたはＮＡＤＨによりブラン
ク値の上昇がみとめられ正確な測定を行うことができな
いという欠点を有していた。
ことができるが、使用するＮＡＤ及びＮＡＤＰは、特に
アルカリ溶液中で不安定であり、容易に取り扱うことが
できない。また、両者は共に高価である。更に生体内、
特に血中に存在するＮＡＤまたはＮＡＤＨによりブラン
ク値の上昇がみとめられ正確な測定を行うことができな
いという欠点を有していた。
（問題点を解決するための手段）
これら問題点を解決するため、本発明者等は、前記一般
式（１）で表されるポリエチレングリコール誘導体及び
ポリエチレングリコール代謝酵素を用い、更に前記ポリ
エチレングリコール誘導体を分解する酵素を標識酵素と
して用いるＥＩＡを見出し、本発明を完成させた。本発
明は、前記一般式（１）で表されるポリエチングリコー
ル誘導体を基質として用い酵素免疫測定を行うものであ
る。
式（１）で表されるポリエチレングリコール誘導体及び
ポリエチレングリコール代謝酵素を用い、更に前記ポリ
エチレングリコール誘導体を分解する酵素を標識酵素と
して用いるＥＩＡを見出し、本発明を完成させた。本発
明は、前記一般式（１）で表されるポリエチングリコー
ル誘導体を基質として用い酵素免疫測定を行うものであ
る。
前記一般式（１）で表されるポリエチレングリコール誘
導体のＲ′として表される基としてはリン酸基、アリー
ル若しくはアルキルカルボニル基又は糖残基、ＲはＲ’
と同−又はアルキル基であり、ｎとしては２以上の重
合度のものを使用することができる。より具体的には ＣＨ３０（ＣＨ２−Ｃ１１２０）、１−ＣＨｚＣＨｚ−
ＯｐＨ＋”ＣＨ：＋０（ＣＨｚ−ＣＨｚＯ） 、 −Ｃ
ｔｌｚＣｌｌｚ−ＯＧａｌＣＨａＯ（ＣＨｚ−ＣＨｚＯ
）、１−ＣＨｚＣＨｚ−ＯＧＩＵＣＨｉＯ（ＣＨｚ−Ｃ
ＨｚＯ）ｎ−ＣＨｚＣＨｚ−ＯＡｃＣＨｘＯ（Ｃｆｂ−
ＣＨｚＯ）、１−ＣＨｚＣＨｚ−ＯＢＺ等を挙げること
ができる。（式中、Ｇａｌ はガラクトース基、Ｇｌｕ
はグルコース基、八Ｃはアセチル基であり、Ｂｚはベン
ゾイル基である。ｎは２〜１０００である。） 前記一般式（Ｉ）で表されるポリエチレングリコール誘
導体は、抗原抗体反応径測定系に存在する標識酵素によ
り分解されポリエチレングリコールに誘導される。この
際使用される標識酵素は前記ポリエチレングリコールｍ
８体のＲ又はＲ１で表される基に依存し選択される。そ
の酵素としては。
導体のＲ′として表される基としてはリン酸基、アリー
ル若しくはアルキルカルボニル基又は糖残基、ＲはＲ’
と同−又はアルキル基であり、ｎとしては２以上の重
合度のものを使用することができる。より具体的には ＣＨ３０（ＣＨ２−Ｃ１１２０）、１−ＣＨｚＣＨｚ−
ＯｐＨ＋”ＣＨ：＋０（ＣＨｚ−ＣＨｚＯ） 、 −Ｃ
ｔｌｚＣｌｌｚ−ＯＧａｌＣＨａＯ（ＣＨｚ−ＣＨｚＯ
）、１−ＣＨｚＣＨｚ−ＯＧＩＵＣＨｉＯ（ＣＨｚ−Ｃ
ＨｚＯ）ｎ−ＣＨｚＣＨｚ−ＯＡｃＣＨｘＯ（Ｃｆｂ−
ＣＨｚＯ）、１−ＣＨｚＣＨｚ−ＯＢＺ等を挙げること
ができる。（式中、Ｇａｌ はガラクトース基、Ｇｌｕ
はグルコース基、八Ｃはアセチル基であり、Ｂｚはベン
ゾイル基である。ｎは２〜１０００である。） 前記一般式（Ｉ）で表されるポリエチレングリコール誘
導体は、抗原抗体反応径測定系に存在する標識酵素によ
り分解されポリエチレングリコールに誘導される。この
際使用される標識酵素は前記ポリエチレングリコールｍ
８体のＲ又はＲ１で表される基に依存し選択される。そ
の酵素としては。
例えば、アルカリ性若しくは酸性ホスファターゼ、ガラ
クトシダーゼ、グルコシダーゼ、エステラーゼなどを使
用することができる。
クトシダーゼ、グルコシダーゼ、エステラーゼなどを使
用することができる。
標識酵素により誘導されたポリエチレングリコールは、
ポリエチレングリコール代謝酵素により以下例示にある
様に分解を受ける。
ポリエチレングリコール代謝酵素により以下例示にある
様に分解を受ける。
たとえば、前記一般式（１）で表されるポリエチレング
リコール誘導体として、下記一般式（Ｉ゛）で表される
化合物を用い、標識酵素としてアルカリ性ホスファター
ゼを用いた場合の分解反応は下記の如くである。
リコール誘導体として、下記一般式（Ｉ゛）で表される
化合物を用い、標識酵素としてアルカリ性ホスファター
ゼを用いた場合の分解反応は下記の如くである。
Ｃ）１：＋０（Ｃ１１ｚ−ＣＨｚＯ）ｌｌ−ＣＩｌｚＣ
）ｔｚ−ＯＰＯｚ”（ビ） ＝−）ＣＨ：＋０（ＣＨｉ−ＣＩ（ア０）ｆｉ−ＣＨ２
ＣＨ２−ＯＨＬ−−−ＣＨｚＯ（ＣＨｚ−ＣＨｚＯ）ｎ
−Ｈ＋ Ｃ）ＩＯｃＯＯＨ （ＣＯＯＨ）ｚ （１）アルコールデヒドロゲナーゼ （２）アルデヒドデヒドロゲナーゼ （３）エーテルポンドハイドロゲナーゼ（４）グリオキ
シレートデヒドロゲナーゼ本発明におけるポリエチレン
グリコール代謝酵素は前記（１）〜（４）に例示した酵
素全体を示すものである。これらの酵素の（１）に関し
ては特願昭６２６２３５６号に、（２）に関しては特願
昭６２−６２３５７に、（３）に関しては昭和６３年度
日本農芸化学会大会講演要旨集１２８頁（１９８８）に
、（４）に関して特願昭６１−２６２５７４３号に開示
されているものを好適に使用することができる。
）ｔｚ−ＯＰＯｚ”（ビ） ＝−）ＣＨ：＋０（ＣＨｉ−ＣＩ（ア０）ｆｉ−ＣＨ２
ＣＨ２−ＯＨＬ−−−ＣＨｚＯ（ＣＨｚ−ＣＨｚＯ）ｎ
−Ｈ＋ Ｃ）ＩＯｃＯＯＨ （ＣＯＯＨ）ｚ （１）アルコールデヒドロゲナーゼ （２）アルデヒドデヒドロゲナーゼ （３）エーテルポンドハイドロゲナーゼ（４）グリオキ
シレートデヒドロゲナーゼ本発明におけるポリエチレン
グリコール代謝酵素は前記（１）〜（４）に例示した酵
素全体を示すものである。これらの酵素の（１）に関し
ては特願昭６２６２３５６号に、（２）に関しては特願
昭６２−６２３５７に、（３）に関しては昭和６３年度
日本農芸化学会大会講演要旨集１２８頁（１９８８）に
、（４）に関して特願昭６１−２６２５７４３号に開示
されているものを好適に使用することができる。
本発明は、前記反応式に示した如く、（１）〜（４）の
酵素の存在する反応においてそれぞれ１電子ずつの供給
を受けその電子が電子受容体に捕捉され、その電子受容
体の電子受容量の状態の変化を測定することよにり達成
される。
酵素の存在する反応においてそれぞれ１電子ずつの供給
を受けその電子が電子受容体に捕捉され、その電子受容
体の電子受容量の状態の変化を測定することよにり達成
される。
本発明で使用することのできる電子受容体は、たとえば
、フェリシアン化カリウム、ツェナチアジンサルフェー
ト（ＰＭＳ） 、ジクロロフェノールインドフェノール
（ＰＣＰＩＦ）、ニトロテトラヅリウムブル−（ＮＴＢ
）等である。
、フェリシアン化カリウム、ツェナチアジンサルフェー
ト（ＰＭＳ） 、ジクロロフェノールインドフェノール
（ＰＣＰＩＦ）、ニトロテトラヅリウムブル−（ＮＴＢ
）等である。
電子受容体の電子受容量の状態の変化は、例えば、フェ
リシアン化カリウムの場合にはフェロシアン化カリウム
への変化量をその吸光度より求めることにより行うこと
ができる。
リシアン化カリウムの場合にはフェロシアン化カリウム
への変化量をその吸光度より求めることにより行うこと
ができる。
本発明を実施するにあたっては、通常緩衝液中で行うも
のであり、トリス塩酸緩衝液を好適に使用することがで
きる。
のであり、トリス塩酸緩衝液を好適に使用することがで
きる。
本発明における酵素反応は２０〜４０°Ｃの範囲を選び
行うことができる。
行うことができる。
本発明の測定対象物は、α−フェトプロティン（ＡＦＰ
）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）等の癌関連抗原、ＨＢｓ等
の抗原、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳ Ｈ）などのホルモ
ン、ＩｇＧ、、ＩｇＭ等の抗体を挙げることができる。
）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）等の癌関連抗原、ＨＢｓ等
の抗原、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳ Ｈ）などのホルモ
ン、ＩｇＧ、、ＩｇＭ等の抗体を挙げることができる。
（作用）
本発明は、ＥＩＡにおいてポリエチレングリコール誘導
体およびその代謝酵素を用い増幅作用を行い高感度の免
疫測定を行うものである。
体およびその代謝酵素を用い増幅作用を行い高感度の免
疫測定を行うものである。
（実施例）
以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明する。
実施例１ 甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）の測定１材料
の調整） 抗Ｔ Ｓ Ｈ抗体感作用の１７８インチビーズを、マウ
スモノクローナル抗ＴＳＨ−β抗体で感作した。
の調整） 抗Ｔ Ｓ Ｈ抗体感作用の１７８インチビーズを、マウ
スモノクローナル抗ＴＳＨ−β抗体で感作した。
一方マウスモノクローナル抗ＴＳＨ抗体は、ペプシンに
よりＦ（ａｂ’）ｚとし２−メルカプトエチルアミン（
０，１Ｍ溶液）で還元しＧＭＢ （Ｎ Ｃｒ−ｍａｌｅ
ｊｍｊｄｏｂｕｔｙｒｏｘｙ））化したアルカリ性ホス
ファターゼと反応させ抗体酵素コンジュゲートを作製し
た。
よりＦ（ａｂ’）ｚとし２−メルカプトエチルアミン（
０，１Ｍ溶液）で還元しＧＭＢ （Ｎ Ｃｒ−ｍａｌｅ
ｊｍｊｄｏｂｕｔｙｒｏｘｙ））化したアルカリ性ホス
ファターゼと反応させ抗体酵素コンジュゲートを作製し
た。
被検液および抗体酵素コンジュゲートに用いた緩衝液は
Ｏ，ＬＭ）リス塩酸、１ｍＭＭｇｃ１ｇおよび１％ＢＳ
Ａ（ｐＨ７，５）である。基質緩衝液は０．１ ｍＭ
ＭｇＣ１ｚ （ｐＨ９，５）および基質としてモノメ
トキシポリエチレングリコールリン酸エステル（ｎ＝
１００ （１００ｍｇ／ｍｌ）を用いた。
Ｏ，ＬＭ）リス塩酸、１ｍＭＭｇｃ１ｇおよび１％ＢＳ
Ａ（ｐＨ７，５）である。基質緩衝液は０．１ ｍＭ
ＭｇＣ１ｚ （ｐＨ９，５）および基質としてモノメ
トキシポリエチレングリコールリン酸エステル（ｎ＝
１００ （１００ｍｇ／ｍｌ）を用いた。
（ＴＳＨの測定）
ＴＳＨ含有被検溶液（１５μｌ ）（０，４，８゜１６
．３２μＵ／ｍｌ）を抗体酵素コンジュゲート溶液１３
５μｌと混合し、この溶液の上記のように感作した１ｚ
４インチビーズ１個を加え、室温にて２時間インキュベ
ートした。 その後、ビーズを０．１Ｍ）リス緩衝液（
ｐ Ｈ７，５）で４回洗い、反応試験管へ移した。上記
の基質を含む緩衝液 ２００μｌを試験管に加えた。さ
らに１時間後、Ｏ，１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０
） １ｍｌ中、フェリシアン化カリウム（１０ｌｌｍ
ｏｌ）、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＩＯＵ）、アル
デヒドデヒドロゲナーゼ（ＩＯＵ）およびエーテルボン
ドハイドラーゼ（ＩＯＵ）、グリオキシレートデヒドロ
ゲナーゼ（１００）よりなる反応液中で３７°Ｃ１１時
間反応を行い、０． ５ ｍｌ フエリックヂュバノー
ル液（リン酸９５ ｍｌ 、ＳＤ３ ３ｇ。
．３２μＵ／ｍｌ）を抗体酵素コンジュゲート溶液１３
５μｌと混合し、この溶液の上記のように感作した１ｚ
４インチビーズ１個を加え、室温にて２時間インキュベ
ートした。 その後、ビーズを０．１Ｍ）リス緩衝液（
ｐ Ｈ７，５）で４回洗い、反応試験管へ移した。上記
の基質を含む緩衝液 ２００μｌを試験管に加えた。さ
らに１時間後、Ｏ，１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０
） １ｍｌ中、フェリシアン化カリウム（１０ｌｌｍ
ｏｌ）、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＩＯＵ）、アル
デヒドデヒドロゲナーゼ（ＩＯＵ）およびエーテルボン
ドハイドラーゼ（ＩＯＵ）、グリオキシレートデヒドロ
ゲナーゼ（１００）よりなる反応液中で３７°Ｃ１１時
間反応を行い、０． ５ ｍｌ フエリックヂュバノー
ル液（リン酸９５ ｍｌ 、ＳＤ３ ３ｇ。
Ｆｅ（ＳＯ４）３・ｎＨｚｏ ５ ｇに水を加え１１
とした溶液）を加えて反応を停止させる。さらに３．５
ｍｌの水を加え、２０分間放置し、色素が安定してがら
６６０ｎｍの吸光度を測定した。
とした溶液）を加えて反応を停止させる。さらに３．５
ｍｌの水を加え、２０分間放置し、色素が安定してがら
６６０ｎｍの吸光度を測定した。
比較として、上記抗原抗体反応後洗浄したビーズに１０
ｍＭｐ−二トロフェニルリン酸、０． １Ｍトリス塩酸
緩衝液、１ ｍＭＭ ｇ Ｃ１ｔを含む基質液４００μ
ｍを加え、３７°Ｃ１１時間反応させ、０．２Ｎ Ｎ
ａＯＨ６００μｌを加え反応を停止させ、波長４５０ｎ
ｍの吸光度を測定した。その結果を表１に示した。（Ｐ
ＮＰ法） （発明の効果） 本発明は、ＥＩＡにおいて高感度の測定ができるように
なった。
ｍＭｐ−二トロフェニルリン酸、０． １Ｍトリス塩酸
緩衝液、１ ｍＭＭ ｇ Ｃ１ｔを含む基質液４００μ
ｍを加え、３７°Ｃ１１時間反応させ、０．２Ｎ Ｎ
ａＯＨ６００μｌを加え反応を停止させ、波長４５０ｎ
ｍの吸光度を測定した。その結果を表１に示した。（Ｐ
ＮＰ法） （発明の効果） 本発明は、ＥＩＡにおいて高感度の測定ができるように
なった。
Claims (3)
- （１）一般式 ＲＯ（ＣＨ＿２−ＣＨ＿２Ｏ）＿ｎ−ＣＨ＿２ＣＨ＿２
−ＯＲ＾１で表されるポリエチレングリコール誘導体及
びポリエチレングリコール代謝酵素を用い、更に、前記
ポリエチレングリコール誘導体を分解する酵素を標識酵
素として用いる酵素免疫測定法（式中、Ｒ＾１はリン酸
基、アリール若しくはアルキルカルボニル基又は糖残基
、ＲはＲ＾１と同一又はアルキル基であり、ｎは２以上
である。）。 - （２）標識酵素としてホスファターゼ、ガラクトシダー
ゼ、グルコシダーゼ又はエステラーゼを用いる請求項１
の測定法。 - （３）代謝酵素としてアルコールデヒドロゲナーゼ、ア
ルデヒドハイドロラーゼ、エーテルボンドハイドラーゼ
及びグリオキシレートデヒドロゲナーゼを用いる請求項
１の測定法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP30101688A JPH02147956A (ja) | 1988-11-30 | 1988-11-30 | 酵素免疫測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP30101688A JPH02147956A (ja) | 1988-11-30 | 1988-11-30 | 酵素免疫測定法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02147956A true JPH02147956A (ja) | 1990-06-06 |
Family
ID=17891826
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP30101688A Pending JPH02147956A (ja) | 1988-11-30 | 1988-11-30 | 酵素免疫測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH02147956A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5434051A (en) * | 1991-07-26 | 1995-07-18 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Assay with signal detection in the presence of a suspended solid support |
| WO2012099904A1 (en) | 2011-01-18 | 2012-07-26 | General Atomics | Hydrolase enzyme substrates and uses thereof |
-
1988
- 1988-11-30 JP JP30101688A patent/JPH02147956A/ja active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5434051A (en) * | 1991-07-26 | 1995-07-18 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Assay with signal detection in the presence of a suspended solid support |
| US5654159A (en) * | 1991-07-26 | 1997-08-05 | Dade International Inc. | Assay with signal detection in the presence of a suspended solid support |
| WO2012099904A1 (en) | 2011-01-18 | 2012-07-26 | General Atomics | Hydrolase enzyme substrates and uses thereof |
| US8795979B2 (en) | 2011-01-18 | 2014-08-05 | General Atomics | Hydrolase enzyme substrates and uses thereof |
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