JPH05505513A - ルミネセント又はルミノメトリック検定 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ルミネセント又はルミツメトリック　検定本発明は、例えば免疫検定等のルミネ セント又はルミツメトリック生物親和性検定における改良及びそれによりこのよ うな検定を容易に行うことが可能な診断用キットに関する。

免疫検定は、抗体又は抗原である分析物の検出を可能とする。抗原は該抗原に特 有の抗体を使用することにより検出される。また免疫検定は、個々の抗原との特 有の結合を利用することにより、抗体を決定するのに使用することができる。最 初に、抗体又は抗原のいずれかが放射性原子と共育結合的に結合されており、こ の放射性原子は生成抗体／抗原錯体中の！識化合物の定量的検出を可能とする標 識として働く。しかしながら、放射性検出システムは多くの重要な不利益な点を 有している。例えば、必要とされる放射性薬剤は、生来危険なものであり、処理 に問題がある。さらに、通常使用される放射性同位体は、比較的短い半減期を有 するため、これらはほんの限られた期間だけ貯蔵することができる。またこれら の同位体は高価である。

免疫検定システムにおいて標識として放射能を用いるこれらの及び他の不利益の 結果として、少しはある種の代わりの検出システムが開発されてきた。これらの システムのいくつかは、光の放出を生ずる化学反応に関係することができる化合 物を、標識として利用する。この反応により放射された光は、定量的に測定して 、試料中に存在する分析物の料を反映する標識化された免疫反応体結合（ｂｏｕ ｎｄ）の量の正確な概を与えることができ、この検定により定量的に測定される ことを可能とする。

ルミネセント免疫検定の１つの型は、酸化体としての退化合物（例えば過酸化水 素）と、ペルオキシダーゼ触媒と、及びルミネセント２．３−ジヒドロ−１，４ −フタラジンジオン（以下ＤＤＰと略称する）との間の反応に基づいており、こ こではペルオキシダーゼが標識として働いている。

上記ルミネセントシステムの種々の変形や改良が提案されてきた。例えばＣＢ− Ａ−２１６２９４６号（ナショナル・リサーチ・ディベロップメント・コーポレ ーション）、ＥＰ−Ａ−１１６４５４号及びＥＰ−Ａ−８７９５９（セクレタリ ー・オブ・ステート・フォー・ソシアル・サービシス）は、上記反応から生じる 化学ルミネセンスのいわゆる「エンハンサ−（ｅｎｈａｎｓｅｒ）　Ｊとして、 ある種の特定の芳香族化合物を使用することを開示している。ＧＢ−Ａ−２１６ ２９４６号中で述べられたエンハンサ−の１つは、３．３″、５．　５’　−テ トラメチルベンジジン（通常ＴＭＢＺと略称される）である。他はＮ、　Ｎ、　 Ｎ’　、　Ｎ’　−テトラメチルベンジジン（ＮＮＮＮ−ＴＭＢＺ）である。上 記特許出願中に記載された反応においては、光放出は急速に最大強度値まで上昇 し、この値は相当の時間、例えば数分間、一定の、又は「プラトー」値として持 続する。長期にわたって光を一定放出する一つのありうる利益は、化学反応をル ミツメトリック装置の外で行い、次いで光の放出が既に起こっているとき、その 測定装置へと移すことができるということである。一方、長期にわたる光放出は 、ある種の状況では不利益と成り得る。かくして、仮に従来の微量滴定器の溜め （ｗｅｌｌ）の中で一連の試験反応が行われ、かつ長期にわたる光ルミネセンス の結果として、数個の溜めが同時に発光する反応混合物を含むならば、２個又は それ以上の溜めの間の“クロストーク（ｃｒｏｓｓ−ｔａｌｋ）”の危険性があ る。即ち、１個又はそれ以上の隣接した溜めからそれた光が特定の溜めの内容物 について行われるルミネセンスの測定を妨害するという危険性がある。

上記特許において記載された検定手順においては、ベルオキソダーゼ、酸化体、 化学ルミネセントＤＰＤ及び特定の芳香族エンハンサ−の間の反応が単一のステ ップで行われるということは注目されるべきである。

我々は、上記特許出願において開示された検定手順において使用することができ る「エンハンサ−」の１つである芳香族基質、ベルオキダーゼ及び退化合物を第 」ステップで一緒に反応させるならば、中間生成物が得られること、並びに第２ ステツプで適当なｐＨでＤＰＤを引き続いて添加すると、極めて増大した強度を 存し、非常に短い持続期間（ｄｕｒａｔ　１ｏｎ）を育する光の放出に終り、こ の放出は極めて急速にそのピーク値まで上昇するということを見出した。例えば 、このシグナルは５０ミリ秒より少ない間にそのピーク値まで上昇し、約２〜３ 秒の間に０まで戻るかもしれない。

本発明で用いられる好ましい基質の１つはＴＭＢＺである。十分に高い濃度でＴ ＭＢＺを用いる場合には、反応の第１段階で得られる中間生成物を含存する溶液 は青色に着色する。一方、基質としてＮＮＮＮ−ＴＭＢＺ又はルシフェリン（ベ ンゾチアゾール誘導体＝４，５−ジヒドロ−２−（６−ヒドロキシ−２−ベンゾ チアゾリル）−チアゾール−４−カルボン酸）を用いる場合には、中間生成物を 含有する溶液は黄色に着色する。

ＴＭＢＺ、ペルオキシダーゼ及び酸化体としての退化合物の間の第１ステツプの 反応は、ルミネセント検定と対立するものとして、比色定量検定において既に知 られている。

しかしながら、この場合には、第２ステツプで発現した青色溶液に強酸か添加さ れて黄色溶液の形成に終わり、次いでこの溶液は比色定量分析にかけられる。

上記のように、上記特許に開示された反応は単一のステップで起こる。この反応 混合物中では、反応はまず、ペルオキシダーゼの触媒作用を受けて（ｃａｔａｌ ｙｓｅｄ）、退化合物と、いわゆる「エンハサー」との間で起こるものと考えら れる。この最初の反応により、上記中間生成物が生成され、またこの中間生成物 は、ＤＰＤの光ルミネセント酸化を引き起こすのに十分強力な酸化剤である遊離 基含有化合物より成るものとおもわれる。この反応の第１ステツプは比較的遅く 、また第２ステツプは極めて速いものと思われる。かくして、中間遊離基含有化 合物は比較的遅く生成されるが、それが生成されながら、ＤＰＤとほとんど瞬間 的に反応するものと考えられる。従って反応混合物は第１反応ステップが起きて いる全期間中発光しており、そしてその反応混合物中には本質的には中間生成物 のいかなる堆積も存在しない。−力木発明の２ステップ手順では、本反応の第１ ステツプが行われている間、中間生成物が反応混合物中に堆積するものと思われ る。従って、化学ルミネセントＤＰＤを添加することにより、本反応の第２ステ ツプを開始させると、堆積した中間生成物の全てが、実質的には瞬間的にＤＰＤ と反応して、前述の特許明細書中に記載された反応中で達成されたピークより、 もっと強い光の極めて短いフラッシュを生じる。

かくして全反応が上記３つの特許公報に開示された反応と本質的に類似している ようにみえるので、もし本反応の第２ステツプを開始するために化学ルミネセン トＤＰＤが添加されるまで、中間生成物が十分に安定して留まっているのであれ ば、これらの明細書中で開示された、いわゆる「エンハンサ−」のいずれもが本 発明においても効果的であろうことが予測される。上記特許請求の範囲中及び範 囲内に開示された「エンハンサ−」のいずれが、本発明中の芳香族基質として使 用に好適であるかを決定することは、単なる実験上の問題である。

既に述べたように、好適な基質は芳香族アミン、例えばＴＭＢＺ及びＮＮＮＮ− ＴＭＢＺである。他の好適な基質はベンゾチアゾール誘導体、例えば２，２°　 −アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリンスルホン酸）（通常ＡＢＴＳとして 知られている）及び４，５−ジヒドロ−２−（６−ヒドロキシ−２−ベンゾチア ゾリル）−チアゾール−４−カルボン酸（通常ルシフェリンとして知られている ）である。他の可能な基質は、フェニル誘導体（例えば桂皮酸）、ハロフェノー ル（例えばＰ−沃化フェノール）及び置換フェノール（例えばＰ−フェニルフエ ノーノりである。上記特定の例の全てが本発明において効果的であることが示さ れた。

そこで、本発明の１つの態様によれば、次に示すステップより成るルミネセント 又はルミツメトリック測定：（ｉ）選択された酸化体、該酸化体を利用する酸化 反応を触媒すること（ｃａｔａｌｉｚｉｎｇ）が可能な酵素及び該酵素のための 芳香族基質の間の反応を行って、化学ルミネセントＤＰＤのルミネセント酸化を 生じるのに十分な強力な酸化剤から成る中間生成物を得るステップ、 （ｉｉ）上記第１ステツプで生成した中間生成物と、化学ルミネセントＤＰＤと の間の反応を行い、次いでこれにより生じるルミネセントを検出又は測定するス テップ、が提供される。

選択される酸化体は、好ましくは過酸化物（例えば過酸化水素）等の化合物であ り、この際酵素はペルオキシダーゼ、好ましくはセイヨウワサビ（ｈｏｒｓｅｒ ａｄｉｓｈ）ペルオキシダーゼ（以下ＨＲＰと略称する）である。

本反応が２ステツプで行われ、かつ第２ステツプのみが光の放出を生ずるもので あるから、中間生成物の堆積及びそれによりルミネセンスの強度の増幅が可能で ある。

更に第４ステツプは、第２ステツプから生じるルミネセンスの測定に使用される ルミノメータ−の外側で行ってもよい。更に、第２ステツプで得られるルミネセ ンスはほんの短い持続期間しか育しないため、一連の反応は、周囲の溜めからの ルミネセンスが特定の溜めの内容物について行われるルミツメトリック測定を妨 害するという危険性なしに、微量滴定器の溜めの中で行ってもよい。

前述のように、好適な酵素はＨＲＰである。ＨＲＰの触媒効果は、３．６〜８． ８の範囲のｐＨ変化によって影響を受けないことが見出された。そのため本反応 の第１ステツプのｐＨ値は、使用される特定の基質に適合するこの範囲以内で適 宜選択される。

例えば、ＴＭＢＺについては、最適ｐＨ値は５．５であることが見出された。

酵素がＨＲＰで、かつ基質がＴＭＢＺである場合には、ステップ（ｉ）の汲置温 度（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）は好ましくは室温であり 、また温置時間（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ　ｔｉｍｅ）は好ましくは約１時間であ る。ルミネセンスを生じる本反応のステップ（ｉｉ）は、アルカリ条件下に、好 ましくはｐＨ範囲８．５〜１２の弱アルカリ条件下に、より好ましくは１０〜１ １で、特に好ましくは約１Ｏ０６のｐＨ値で行うことが好ましい。

従って、本発明の２ステップ検定手順の他の利点は、両ステップをそれぞれの最 適ｐＨ値で行うことができることであり、これに対し前記特許公報中に例として 記載された単一のステップ手順においては、選択されるｐＨは折衷値でなければ ならない。

過酸化水素か好ましい過化合物であるが、過硼酸塩も本発明において首尾よく使 用された。

本反応のステップ（ｉｉ）において、好ましくは、追加の過化合物（過酸化水素 等）が、前記ＤＰＤに添加される。これは過化合物の過剰量がステップ（ｉｉ） 中に存在し、これが最適ルミネセントシグナルを確保することを保証するためで ある。

好ましいルミネセントＤＰＤはルミノール及びイソルミノールである。使用され るＤＰＤの純度が高ければ高い程、ルミネセントシグナルとテストブランク（即 ち、特にペルオキシダーゼ−凛識化免疫親和性又は生物親和性反応体に結びつく ことができる分析物の存在しない場合に試験が行われるとき）により生じるシグ ナルとの間の比がより良好となる。

本発明の検定は極めて広い適用範囲を有し、極めて高感度であるため、特に非常 に低濃度で生じる物質の検出に適用できる。例えば、遺伝工学技術により修正さ れた細胞により生成される製薬掌上活性なポリペプチド中における不必要な細胞 成分の好ましくない存在を検出するために使用することができる。商業的に優れ た重要性を育するこれらの生成物の１つは大成長ホルモン（ｈＧＨ）である。他 の可能性のある適用例としては、起こり得る（ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）成長ホルモ ン不足時の個体からの尿試料中の大成長ホルモンの定量的検出が挙げられる。そ のような個体からの尿試料中に現れる非常に少量のホルモンは、特に有能な検定 を必要とし、酵素としてＨＲＰが用いられる本発明による検定手順は、アトモル （ａｔｔｏ　ｍｏｌｅ）範囲（即ちＩ　０−１１モル）におけるＨＲＰの検出が できる。

本発明の検定手順は、免疫検定とは異なった生物親和性検定、例えば特定の受容 体か細胞表面から集められ、そして適切な配位子か酵素と結びつく受容体−配位 子検定に適用可能である。

本反応のステップ（ｉｉ）でＤＰＤと反応してルミネセンスを生じる中間生成物 の成分は、明確には同定されていない。しかしながら、我々はステップ（ｉｉ） の間中、酵素（例えばペルオキシダーゼ）の存在は必要とされないことを確かめ た。このこと（前記酵素を必要とする反応）は、ペルオキシダーゼが内側表面に 結合している微量滴定皿溜めの中で、ステップ（ｉ）を行うことにより完了して いる。ステップ（ｉ）が行われた後、ＤＰＤの添加の前に、混合物はペルオキシ ダーゼを含まない第２の溜めに移された。ペルオキシダーゼの存在する元の溜め の中でステップ（ｉｉ）を行うことにより得られたのと実質的に同じ強度のルミ ネセンスが得られた。仮にペルオキシダーゼがステップ（ｉｉ）に必須であった とするならば、いかなるルミネセンスも得られないであろうか、又は中間体溶液 と共に第２の溜めのペルオキシダーゼのいくつかの移動を考慮して、かなり減じ られたルミネセンスが予想されたであろう。

ステップ（■）がＨＲＰの存在と独立していることは、また次の実験を行うこと により示された。透析バッグに入れられたＨＲＰをＴＭＢＺ及び過酸化水素の溶 液に浸漬させた。温室後、生成する中間生成物が透析膜の外側から集められ、ル ミネセント反応のステップ（ｉｉ）を行うため使用された。

勿論、本反応のステップ（ｉ）及び（ｉｉ）は通常同じ溜めの中で行われる。

本反応は２ステップ反応であり、かつルミネセンスは第２ステツプ中でのみ得ら れるのであるから、ルミネセントシグナルの増幅は、化学ルミネセンスＤＰＤの 添加に先立つ第１ステツプの生成物である中間生成物を堆積させることにより得 られる。

以下、本発明を特定の実施例及び添付の図面について非限定的に例示する。

第」図は、使用される酵素がＨＲＰの場合の本反応のステップ（ｉ）について、 最適ｐＨ範囲を説明する曲線である。シグナル強度（ステップ（ｉｉ）で得られ るルミノメータ（ｌｕｍｉｎｏｓｉ　ｔｙ）のレベル）がｐＨに対してプロット されている。最適ｐＨは約ｌ０１６であることが認められるだろう。

第２図は、従来の比色定量ｈＧＨＥＬｌ、ＱＡシステムを使用して得られた大成 長ホルモン（ｈＧＨ）の検出において得られるシグナル強度を、本発明による化 学ルミネセント測定システムの場合（ＣＬ−ＥＬＩＳＡと識す）と比較するグラ フである。

比色定量検定は前述のように達成され、この検定中では、本反応のステップ（ｉ ）が本発明中におけると同様にして行われるが、しかしこの検定中では中間生成 物を含有する生成溶液が硫酸で酸性化されて黄色の溶液を生成し、次いでこれが 比色定量的に分析された。

ＣＬ−ＥＬＩＳＡ検定は、本発明に従ってってステップ（ｉ）で得られた中間体 溶液をＤＰＤと、更に過酸化水素と反応させて行われた。本発明の検定手順及び 従来のＥＬＩＳＡ法により得られた結果を比較することにより、化学ルミネセン トシステムは検出能力において約１０倍の増加を生じることがわかる。

第３図は、前述のように、本反応のステップ（ｉｉ）の間中、酵素が存在してい ることは必要ではないということを示すグラフである。２個の試料シリーズが、 基質温体ステップ（ステップ（ｉ））を含む従来のＥＬＩＳＡ法を使用して等し く処理された。

次いで、化学ルミネセント反応（ステップ（ｉｉ）　）に先立って、試料シリー ズの１個を空の溜めの列へと移すことにより、固相酵素（ＨＲＰ）から分離した 。次いで本反応のステップ（ｉｉ）が行われ、生じるルミネセンスがルミノメー タ−（ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ）で測定された。

２個のシリーズの間でシグナル強度における極めて小さな差異が観察された。こ の極めて小さな差異は多分、溶液を１個の溜めから他の溜めへと移す間における 溶液の少量の損失により説明することができる。

最初に炭酸塩緩衝液（０，０５モル／Ｉｔ、ＤＨ９，６’）中の親和性−精製う さぎｈＧＨ抗体を微量滴定圧に塗被した。その後固相表面上に残存している全て の結合力を封鎖するために、大結成アルブミン（ｈｓＡ、０．５％）２５０μ！ で、後筒被処理を行った。洗浄溶液（０，５％ツイーン２０及び塩化ナトリウム ０．１５モル／ｆ）を用いて非結合試薬を洗浄除去した後、未知試料及び既知対 照（標準液とサンプル）１００μ！が添加され、更に３７℃で１時間温置された 。

更に、非結合抗原を洗浄溶液で洗浄除去し、次いでうさぎ抗−ｈＧＨ抗体のＦａ ｂ′フラグメント及びサンプル緩衝液（燐酸ナトリウム０．１モル／ｌ、塩化ナ トリウム　１１ ０．１５モル／ｌ及び人血清アルブミン０．５％　ｐＨ７，５）中に溶解させた セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）から成る結合体（ｃｏｎｊｕｇａｔ ｅ）が微量滴定圧の溜めに添加され、３７°Ｃで１．５時間温置された。

過剰の試薬を除去するため洗浄溶液で洗浄した後、固相上の特別に結合したＦａ ｂ゛抗−ｈＧＨ／ＨＲＰ結合体の活性が、酢酸ナトリウム緩衝液０．１モル／ｌ 　ｐＨ５，５中の基質ＴＭＢ２０．０７５　ｇ＃（７）１５０　μｉ及び過酸化 水素５０μｆ、　０　、０２％を添加することにより定量された。

基質の温室（約４５分）に続いて微量滴定圧が直ちにルミノメータ−に移され、 ルミノメータ−では、トリス−ベース　０．４モル／Ｉ！中で、ルミノール　５ ミリモル／ｌを含有するルミノール試薬１２６μ！及び更に過酸化水素０．０３ ％を注入することにより、ルミネセント反応が開始された。得られる光シグナル は光ダイオード検出器により記録された。線形回帰（ｌｉｎｅａｒ　ｒｅｇｒｅ ｓｓｉｏｎ）、スプライン関数、ｌｏｇｉｔ　／　ｌｏｇ又は希釈範囲にわたり 受け入れられる曲線フィツトを与える、適当な数学モデルを使用することにより 、未知試料中のｈＧＨ濃度が計算された。

実施例２ 本発明に従ってＨＲＰ−標識化　抗−ｈＧＨ抗体を利用する大成長ホルモンにつ いての検定キットの実施例を以下に示す。

このキットは実施例１に記載されたように使用され、次の物質を含有している。

ａ）免疫ソルベント（ｓｏｒｂｅｎｔ）精製　抗−ｈＧＨ抗体で塗被された微量 滴定圧。

ｂ）ｈＧＨに対する抗体のＨＲＰ−標識化　Ｆａｂ’　−フラグメント。

Ｃ）希釈緩衝液中のｈＧＨ標準液。ｈＧＨの国際漂準標本に対して検量された、 ７倍予備希釈、かつ凍結乾燥・標準液。

ｄ）希釈緩衝液 燐酸ナトリウム　ｏ、ｉｏモル／ｉ 塩化ナトリウム　０．１５モル／１ 人血清アルブミン　０．５％　ｗ／ｖ ｐＨ７，５ ｅ）血清対照 ｈＧＨの好適なレベルを有する凍結乾燥人血清が、品質対照の目的で用意される 。

ｆ）洗浄溶液 使用前に１０倍に希釈されるように、 塩化ナトリウム　１．　５モル／ｌ ツイーン　２０　０．５％　ｖ／ｖ の濃縮溶液 ｇ）基質緩衝液 酢酸ナトリウム　０．　１モル／１ 氷酢酸　８００μｌ／Ｉ！ ｐＨ５，５ ｈ）基質（ＴＭＢＺ） ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の３．　３’　、５．　５’　−テトラメチ ルベンジノン　原液 ＴＭＢＺ　１０ｍｇ／ｍ１ ■）ルミネセンス試薬 水酸化ナトリウム中のルミノール原液 ｊ）ルミネセンス溶媒 トリス−ベース　０．４モル／ｌ ｋ）過硼酸塩タブレット　（退化合物　酸化体）補正書の翻訳文提出書（特許法 第１８４条の８）平成２年１１月１３日

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. （１）次に示すステップより成るルミネセンス又はルミノメトリック検定：（ｉ ）選択された酸化体と、該酸化体を利用する酸化反応を触媒すること（ｃａｔａ ｌｙｚｉｎｇ）が可能な酵素と、及び該酵素のための芳香続基質との間の反応を 行って、化学ルミネセンスＤＰＤのルミネセンス酸化を生じるのに十分強力な酸 化剤から成る中間生成物を得るステップ、 並びに、 （ｉｉ）上記第１ステップで生成した中間生成物と、化学ルミネセンスＤＰＤと の間の反応を行い、次いでこれにより生じるルミネセンスを検出又は測定するス テップ。
2. （２）該酸化剤が遊離基を含有する請求項１に記載の検定。
3. （３）該基質が芳香族アミン、ベンゾチアゾール誘導体、フェニル誘導体、ハロ フェノール又は置換フェノールである請求項１又は２に記載の検定。
4. （４）該基質がＴＭＢＺ，ＮＮＮＮ−ＴＭＢＺ，ＡＢＴＳ，ルシフェリン、桂皮 酸，ｐ−沃化フェノール又はｐ−フェニルフェノールである請求項３に記載の検 定。
5. （５）該酸化体が過化合物であり、かつ該酸素がペルオキシダーゼである請求項 １〜４に記載の検定。
6. （６）該過化合物が過酸化水素である請求項５に記載の検定。
7. （７）該ペルオキシダーゼがＨＲＰである請求項５又は６に記載の検定。
8. （８）該酵素がＨＲＰであり、かつステップ（ｉ）のいずれかがｐＨ範囲３．６ 〜８．８で行われる請求項１〜７に記載の検定。
9. （９）該基質がＴＭＢＺであり、かつステップ（ｉ）がｐＨ５．５で行われる請 求項８に記載の検定。
10. （１０）ステップ（ｉｉ）がｐＨ範囲８．５〜１２で行われる請求項１〜９に記 載の検定。
11. （１１）ステップ（ｉｉ）がｐＨ範囲１０〜１１、好ましくは約１０．６で行わ れる請求項１０に記載の検定。
12. （１２）該ＤＰＤがルミノール又はイソルミノールである請求項１〜１１に記載 の検定。
13. （１３）本発明による検定を行うことが可能なキット。