JPH02152995A - ヒト顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子の分離精製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 本発明はヒト顆粒球・マクロファージコロニ刺激因子（
ｈｕｍａｎ　ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｍａｃｒｏｐＨ
ａｇｅｃｏｌｏｎｙｓｔｉｍｕｌａＬｉｎｇ　ｆａｃｔ
ｏｒ　：以下ｈＧＭ−Ｃ３Ｆと略す）の分離精製方法に
関する。

〈従来技術および課題〉 ＧＭ−Ｃ３Ｆは骨髄中に存在する白血球系幹細胞に作用
し４顆粒球−マクロファージへの分化増殖を促進するサ
イトカイユノの一種で、種々の感染症あるいはガンの放
射性療法および制ガン剤の投与等による白血球減少症の
治療に有益であると考えられている。

各種のヒト細胞がｈＧＭ−Ｃ３Ｆを産生じ、これらは天
然型ｈＧＭ−Ｃ３Ｆとよばれているや抗ＣＭ−Ｃ３Ｆ抗
体を用いた免疫学的解析の結果、天然型ｈ　Ｇ　Ｍ　−
ＣＳ　Ｆの分子量は、１６に−３５にの不均一なもので
あり、その主成分の分子量は２５３０にであることが判
明した（Ｒ，ε、　ＤｏｎａｈｕｅらＣｏｌｄＳｐｒｉ
ｎｇ　　１ｌａｒｂｏｒ　　５ｙＩｌｌｐｏｓｉａ　　
ｏｎ　　ＱｕａｎｔｉｔａＬｉｖｅＢｉｏｌｏｇｙ　５
１’Ｊ　６８５ｉ　　１０００年）、一方、ｈｃＭ−Ｃ
３Ｆ遺伝子は既にクローニングされており（ＧＷｏｎｇ
ら５ｃｉｅｎｃｅ、　２２８巻８１０頁　１９８５年＋
　Ｆ−ＬｅｅらＰｒｏｃ、　Ｎａｐ、　Ａｃａｄ、　Ｓ
ｃｉ、　　８２巻　４３６０頁１９８５年）、遺伝子工
学的手法により、大腸菌や酵母或いは動物細胞を宿主と
してｈｃＭ−Ｃ３Ｆが生産されているが、天然型のｈＧ
Ｍ−Ｃ３ＦにはｔＪ！ａが存在することから、天然のｈ
ＧＭ−ＣＳＦにできるだけ近い構造の組換えｈＧＭ−Ｃ
３Ｆの生産には、宿主として動物細胞を用いることが望
ましい、宿主動物細胞としては、サル腎臓由来のＣＯ３
細胞チャ・イニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）
ヒトリンパ芽球様ナマルバ細胞などが用いられているが
、これらの動物細胞に由来する遺伝子組換えｈＧＭ−Ｃ
５Ｆにおいても糖鎖構造の不均一性が知られている。

動物細胞で産生したｈＧＭ−Ｃ３Ｆには、Ｍｉ換え型、
天然型にかかわらず、１分子当たり０−２個のＮ−グリ
コシド結合糖鎖及び複数個の０−グリコシド結合ｔＪｈ
鎖が存在し、分子量の不均一性は主として１１Ｇ　Ｍ　
　ＣＳ　Ｆに付加したＮ−グリコシド結合糖鎖数に起因
する。（Ｋ、にａｕｓｈａｎｓｋｙらりｏｃＪ＋ｅｍｉ
ｓＬｒｙ、　２６巻、　４８６１頁、　１９８７年）、
ｈＧＭＣ３ＦをＮ−グリコシド結合糖鎖の付加数に応し
て分用すると、２ケ所とも付加したものを２Ｎ体、１ケ
所のみ付加したものをｌＮ体、Ｏ−グリコシド結合のみ
が付加したものを０Ｎ体と区別でき、それらの分子量は
、おおよそ２Ｎ体：２３−３５に、ｌＮ体：１８−２３
に、０Ｎ体：１６−１８にである。

しかし、これらの分子量は産生細胞及び培養条件もしく
は検出方法などにより変動する可能性がある。ｈＧＭ−
Ｃ３ＦにおけるＩＪ！鎖の意義はほとんど解明されてい
ないが、産生細胞からの分泌の効率化のみならず、生体
内での安定性やｍＷ分布、シグナル伝達に関与している
ことが予想される。

一方、ｈＧＭ−Ｃ８Ｆを治療目的で使用する場合、治療
効果の最も高い糖鎖構造を有するｈＧＭ−Ｃ３Ｆの開発
が望まれるのは言うまでもない、そのためには糖鎖構造
によるｈＧＭ−ＣＳＦの分離が必要となるが、１．ＩＴ
鎖構造の相違に基づく分離技術が確立されていないのが
現状である。即ら、動物細胞培養液からのｈＧＭ−Ｃ３
Ｆの精製法として、多くの場合逆相クロマトグラフィー
が用いられるが、逆相クロマトグラフィーでは高い分離
能を得るためトリフルオロ酢酸などの酸を啓動相に含む
ことが多く、ｂＧＭ−Ｃ３Ｆの糖鎖の末端に存在するシ
アル酸が酸水解により脱離する恐れがあり、また培養液
中に産生された不均一な分子量を持つｈＧＭ−Ｃ３Ｆを
その糖含量により分画することは困難であった。

一方、Ｗ蛋白質の精製法として、コンカナバリンＡ　（
Ｃｏｎ　Ａ　）や小麦胚芽レクチン（ＷＧＡ）などのレ
クチンを不溶性担体に固定化したアフィニイティクロマ
トグラフィーは通常用いられており、ｈＧＭ−Ｃ３Ｆの
場合でもＣｏｎＡ　（Ａ、　Ｊ、　Ｌｕ５ｉｓらＢｆｏ
ｏｄ　５７巻、１３頁、　１９８１年）やＷ　Ｇ　Ａ　
（Ｐ、　ＭｏｏｎｅｎらＰｒｏｃ、　Ｎａｔｉ、　Ａｃ
ａｄ、　Ｓｃｉ、、　８４巻、　　４４２８頁、　　１
９８７年）を用いた報告例がある。しかし、これらの報
告例は、ｈＧＭ−Ｃ３Ｆ含有培養液から夾雑蛋白質を除
き、ｈＧＭ−Ｃ５Ｆを部分的に精製する過程であり、部
分精製されたｈＧＭ−Ｃ３Ｆは純度が低く、まだ多くの
夾雑蛋白を含んでおり、叉、０Ｎ体、１Ｎ体、２Ｎ体の
カラムでの挙動が不明である。従って、本発明の方法と
は明らかに異なり、ｈＣ；Ｍ　　Ｃ３ＦをＮ　　７’Ｊ
コシド結合１！ｔ１の付加数により分離、精製すること
は困難であった。

従って動物細胞により産生されたｈＧＭ−Ｃ３Ｆの精製
法において、その糖鎖構造を損なうことなく、しかも糖
鎖含量により分画できる分離精製法を確立することは、
ｈＧＭ−Ｃ３Ｆを治療薬として開発する上で極めて有意
義である。

〈課題解決の手段〉 本発明者らは、鋭意研究した結果、２１％ｍのカラムク
ロマトグラフィーを組み合わせることにより、動物細胞
で生産した糖鎖含量の異なるｈＧＭＣＳＦのその糖鎖含
■に応じ、分離精製する方法を見出し、本発明を完成し
た。

即ら、例えばゲルｉ１１過クロマトグラフィー、イオン
交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフ
ィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー１疎
水性クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーなど
の多種の蛋白質精製の手段のうち、小麦胚芽レクチン（
ＷＧＡ）を用いた固定化レクチンアフィニティークロマ
トグラフィー及び疎水性クロマトグラフィーを組合せる
ことにより、糖鎖含量の異なるｈＧＭ−ＣＳＦのその糖
鎖含量に応じ、分Ｍ精製できることを見出した。

本発明は、動物細胞が産生したｂＧＭ−Ｃ５Ｆを、小麦
胚芽レクチンアフィニティークロマトグラフィーに供し
、次いで疎水性クロマトグラフィーを用いて、当該分子
に結合したＮ−グリコシド結合糖鎖数によりｈＧＭ−Ｃ
３Ｆを分離精製する方法を提供する。当該方法により分
離精製されたｈｃＭ−Ｃ３ＦはＩ又は複数個の０−グリ
コシド結合糖鎖を含有するが、その結合数は一様には決
まらない。

本発明に供する動物細胞としては、ヒト由来細胞株、例
えば単球性細胞株Ｕ−９３７や白血病細胞Ｍｏなどや、
各種のヒト細胞や組織、例えばＴ細胞、単球、マクロフ
ァージ、繊維芽細胞、内皮細胞、胎盤細胞、肺、膀胱な
ど、或いは遺伝子工学的にｈＧＭ−Ｃ３Ｆを産生するよ
うに形質転換された、例えばＣＯ５細胞、Ｃｌ−１［細
胞、ナマルバ細胞などの動物細胞が挙げられる。工業的
には遺伝子工学的に形質転換された動物細胞が好ましい
。これらの細胞が自然に、もしくは何らかの刺激、例え
ば植物性レクチンやフォルボールエステル類或いはカル
シウムイオノフオアなどの刺激下に産生するｈＧＭ−Ｃ
３Ｆを含む培養液より」−記の蛋白質精製の一般的手段
もしくはその組み合わせを用いて、純化或いは部分純化
されたｈＧＭ−Ｃ３Ｆがいずれも本発明の出発材料とし
て用いることができる。２Ｎ体を分離精製する場合には
、ｈＧＭ−Ｃ３Ｆの純度が１０％（Ｗ／Ｗ）程度以−に
である（即ち、ｈＧＭ−Ｃ３Ｆを１０％（Ｗ／Ｗ＞程度
以上含有する）試料溶液が使用可能であるが、さらに０
Ｎ体、１Ｎ体についても分離精製する場合には、ｈＧＭ
−Ｃ３Ｆの純度が７０％（Ｗ／Ｗ）程度以上、更に好ま
しくは９０％（Ｗ／Ｗ）以上になるよう純化された試料
溶液が好ましい。ｈｃＭ−Ｃ３Ｆ試料溶イ佼は、蛋白Ｍ
精製の一般的手段もしくはその組み合わせを用いて調製
できるが、例えば、以下のようにして調製できる。　ｈ
ｃ；Ｍ−Ｃ３Ｆ産生細胞をウシ胎児血清（Ｆ　ＣＳ）を
含むＲＰＭＩ−１６４０培地、無皿清培地等の適当な動
物細胞培ｌ用培地で数日間培養する。培養終了後、遠心
分離及び濾過等により細胞を除去し、培養上清を得る。

この培養上漬を限外濾過、硫酸アンモニウム沈澱法等の
手段を適宜用いて濃縮する。′ａ縮液を抗ｈｃＭ−Ｃ３
Ｆモノクローナル抗体吸着カラム、ゲル濾過カラム、陰
イオン交換カラム等に添加し、該カラムを洗浄後、適当
な溶出液を用いて１＋　Ｇ　Ｍ　−ＣＳ　Ｆを７容出す
る。

得られた純化或いは部分純化されたｈ　Ｇ　Ｍ　−ＣＳ
Ｆ含有試料溶液を、食塩含有トリス−塩Ｍ緩ＩＩｉ液、
食塩含有ＨＥＰＥＳ　（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）
ピペラジン−Ｎ″　−２−エタンスルホン酸）緩衝液、
食塩含有リン酸１１街液等の通常用いられる１１　ｆＪ
ｉ　’ｔ＆で平衡化したＷＧＡ固定化アフィニティーカ
ラムに添加する。担体としては、アガロースやセルロー
スなど通常のカラムクロマトグラフィーに用いられる担
体が利用できるが、処理速度や再現性の高さから超硬化
アガロースや合成高分子ポリマー或いはシリカゲルなど
通常高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に用いら
れる担体、およびアガロースが好ましい、ＷＧＡを結合
した担体としては例えばＷＧＡ−アガロース（生化学工
業社）やＷＧＡ−セファロース（ファルマシア社）など
、好ましくはＷＧＡ−アガロース（生化学工業社）を用
いることができる。ｈＧＭ−Ｃ３Ｆ含有試料溶液は、例
えば、ｐ１１４〜９程度で、数／／ｇ／ｍｆ〜数ｍｇ／
ｍ　Ｎ程度のｂ　Ｇ　Ｍ　−ＣＳ　Ｆを含有しているこ
とが好ましいが、特にこれらに限定されない。試料？８
液に用いる緩衝液は通常の緩ｉ！ｉ液が使用できる。試
料は、例えばＩＯμｇ〜１０ｍｇ　／　＋ｎ　ｅｍ体程
度に添加することが好ましいが、特にこれらに限定され
ない。

該Ｗ　Ｇ　Ａ固定化アフィニティーカラムは２Ｎ体ｈＧ
ＭＣ３Ｆを吸着するが、０Ｎ体および１ＮＮＯ２−Ｃ３
Ｆはその大部分が吸着されない。

該カラムを平衡化に用いた緩衝液で洗浄後、吸着された
２Ｎ体ｈＧＭ−Ｃ５Ｆを溶出する。溶出液としてＮ−ア
セチルグルコサミンまたはＮ−アセチルノイラミン酸を
含む緩衝液を用いることが重要である。糖濃度は特に限
定されないが、一般に１ｍＭ程度以上が好ましく、さら
に好ましくは０゜２Ｍ以上を用いる。緩衝液は、例えば
、１″ＯＯ〜２００ｍＭ程度の食塩を含有し、好ましく
はｐ１１４〜９．５〜１００ｍＭ程度のトリス−塩酸緩
？ｌｉ液、ＨＥ　ｒ’ＥＳ緩衝液、リン酸緩衝液等が例
示されるが、この他、通常のカラムクロマトグラフィー
に用いられるものを適宜使用できる。食塩濃度は非特異
的吸着をさける範囲であれば、上記濃度に限定されるも
のではなく、叉、暖衝液濃度も、緩ｆＪｉ作用があれば
、Ｌ記範囲に限定されるものではない、カラムサイズは
、例えば直径約５ｍｍ〜５ｃｍ、、長さ５ｃｍ〜１ｍ程
度の通常のアフィニティークロマトグラフィーに用いら
れるものが使用できる。流速は、カラムのサイズにより
異なるが、試料の添加、洗浄、溶出とも、例えば、線流
速で１〜１０００ｎ　ｆｆ／ｃｍ”／ｈｒ程度で行うこ
とが好ましい。その際、カラム容積の５〜５０倍程度、
好ましくは５〜１０倍程度の洗浄液、およびカラム容積
の数倍程度、好ましくは２〜５倍程度の溶出液を用いる
ことができる。これらの条件についても、通常の一？フ
ィニティークロマトグラフイーの範囲で行うことができ
る。カラム温度は、例えば５０°Ｃ以下、好ましくは４
　”Ｃ〜室温程度に設定するが、試料が失活しない程度
の温度範囲であれば、特に制限はされない０次いで、疎
水性クロマトグラフィーを用いて、上記にて得た２Ｎ体
ｈＧＭ−Ｃ３Ｆ含Ｗｉ８液中に、まだ若干混入の認めら
れる０Ｎ体及び１ＮＮＯ２−Ｃ３Ｆを分離し、また非吸
ｉｆｆ分中に含まれる０Ｎ体ＧＭ−Ｃ３Ｆと１ＮＮＯ２
−ＣＳ　Ｆとを分離する。

２Ｎ体ｈＧＭ−Ｃ３Ｆ含有溶出画分、又は非吸着画分に
後述する緩衝液−を加え、得られた当該２Ｎ体ｈＧＭ−
Ｃ３Ｆ含有溶液を、当該緩衝液で平衡化した疎水性カラ
ムクロマトグラフィー、例えばフェニル・スーパーロー
ズなどに添加する。平衡化に用いた緩衝液でカラムを洗
浄後、緩衝液中に含まれる塩濃度を下げるに従い、糖鎖
含量の差によるｈＧＭ−Ｃ３Ｆの疎水性の差に基づき、
分子量の大きいｂＧＭ−Ｃ３Ｆからｌ１ｉｉ１に？８出
される。

その結果、０Ｎ体、１Ｎ体および２Ｎ体ＧＭ−Ｃ５Ｆを
分離精製できる。

疎水性クロマトグラフィーに用いるリガンドとしては、
例えばフェニル基或いはネオペンチル基、ブチル基、エ
チル基等の炭素数Ｃ０〜Ｃ４゜の疎水性官能基の中から
選ばれたものが使用できるが、さらに好ましくはフェニ
ル基を用いる。結合不溶性ｌｕ体としては、前述のアフ
ィニティークロマトグラフィーと同様に、通常のカラム
クロマトグラフィーに用いられる担体が利用できるが、
通常高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に用いら
れる担体が好ましい。そのような担体を結合した例とし
ては、フェニル・スーパーローズ（ファルマシア社）や
Ｔ　Ｓ　Ｋ　ｇｅｌ　Ｐｈｅｎｙｌ　５ＰＷ（東ソー社
）などがある、平１鮒化の際の緩衝液の塩濃度が１．０
Ｍ以上、好ましくは１．５〜２Ｍ程凌であることが大切
である。　緩衝液としては、例えば、硫酸ナトリウム、
クエン酸ナトリウム、硫酸アンモニウム等を含有する、
好ましくは硫酸アンモニウムを含有する緩衝液、好まし
くはｐ　Ｈ４〜９付近の、１０〜１００ｍＭ程度のリン
酸緩衝液等が挙げられるが、これらに限定されない。

塩を含まない緩衝液の比率を上げていくことにより、塩
濃度を低下する。例えば、１５〜６０ｍ１ｎ、好ましく
は３０ａｉｎ程度でグラジェントをかけ、ｈＧＭ−Ｃ３
Ｆをを８出できる。カラムサイズにより異なるが、試料
の添加、洗浄、）８出は例えば、線流速で１〜１０００
ｍ　ｊ！／ｃｍ”／ｈｒ程度で行える。

この時、例えば５〜５０倍程度の洗浄液が用いられ、試
料は、例えばＩＯμｇ〜１００ｍｇ／ｒｎｆ担体程度に
添加することが好ましいが、特にこれらに１坂定されな
い。溶出液墳はカラムサイズ、流速およびグラジェント
時間から適宜決定される。

カラム温度は、ｖ：、ｔ：＋が失活しない程度の温度範
囲に設定する。カラムサイズは、例えば直径約５ｆｆｉ
Ｉ１１〜５ｃｍ、長さ５ｃｍ〜１ｍ程度の通常のものが
使用できる。これらの条件は、通常の疎水性クロマトグ
ラフィー、好ましくはＨＰ　Ｌ　Ｃを用いた疎水性クロ
マトグラフィーの条件の範囲で行うことができる。

以上の方法で得られた、２Ｎ体、１Ｎ体、０Ｎ体、ｂＣ
；Ｍ−Ｃ３Ｆは上記の緩衝液中に存在するが、当該緩衝
液は通常用いられる方法、例えば透析やゲル濾過などの
方法により容易に他の目的とする緩衝液に置換すること
が可能である。

疎水性クロマトグラフィーにより分離精製された２Ｎ体
、　　１Ｎ体及び０Ｎ体ｈＧＭ−Ｃ３Ｆはポリアクリル
アミド電気泳動で各々単一バンドを呈し、ここに０〜２
Ｎ体の混合物であるｈＧＭ−Ｃ３Ｆから、２Ｎ体、１Ｎ
体及び０Ｎ　（＊ｈ　Ｇ　Ｍ　−ＣＳ　Ｆを各々分離精
製することが確認される。

次に実施例により本発明を更に詳しく説明する。

しかし、本発明は、これのみに限定されるものではなく
、本発明の技術分野において通常行われる変更をするこ
とができる。

実施例 本実施例において、ｈＧＭ−Ｃ３＋弓よ以下の２つの方
法で定量した。

（］）ハムス　−　　　　のコロニー ハムスター大腿骨を無菌的に摘出し、２％生胎児血〆ｎ
含有ａ　　ＭＥＭ培！？＆（Ｓｔａｎｎｅｒｓ、　ｃ、
　ｐ−＋＋ｒＬ、　ａ＋、、　Ｎａｔｕｒｅ　Ｎｅｗ旧
ｏｌｏｇｙ、　２３０：５２（１９７２）（Ｆｌｏｗ社
製））を注入し、骨髄細胞を洗い出す、この細胞をピペ
ッティングでばらばらにし、３分間静置する。細胞浮′
ｉｌ！液をとり、同じ培ｉｌ液で洗浄した後、４０％牛
脂児血清含育α−ＭＥＭ培養液で１×１０／ｍ１の細胞
濃度に調製する。この１１・肺細胞）γ透液および２％
生胎児血清含有α−ＭＥＭ培養液で段階的に希釈したヒ
トＧＭ−Ｃ５Ｆをウェルに１００μＰずつ入れて、３７
°Ｃ，５％−酸化炭素の条件下で培養する。培養４２時
間後にα−ＭＥＭ培養液で４０ｐｃｉ／ｆＩｄｌに調製
したトリチウム標識チミジンを２５μ２ずつ各ウェルに
添加しさらに６時間項ａ後、細胞に取り込まれた放射活
性を測定する。

（ＣＶ／ＣＣ）／２のトリチウム１ｍチミジン取り込み
を誘導するＣＭ−Ｃ３ＦＩＩを５０単位／ｄと定義して
ＧＭ−Ｃ５Ｆの比活性を求めた。但し、ＣＭは最大トリ
チウム標識チミジン取り込み量、ＣＣはＣＭ−ＣＳＦ非
存非存在数り込まれたトリチウム標識チミジン量を表わ
す。

（２）抗ｈＧＭ−Ｃ５Ｆモノクローナル抗体を用いたサ
ンドインチ法ラジオイムノアッセイ（Ｉｍｍｕｎ。

Ｒａｄｉｏｍｅｔｒｉｃ　Ａｓ５ａｙ：　ＩＲＭＡ）抗
ｈＧＭ−Ｃ５Ｆモノクローナル抗体を固定化したポリス
チレンボール（第一抗体固定化ボール）１個ニツき、ｈ
Ｃ；Ｍ−Ｃ３Ｆ含有試料ＬＯＯｕｌ。

０．２５％５％ランｎ　７　／Ｉ／　７゛ミ７（ＢＳＡ
）および０．０２％ＮａＮ、含有ノ０．０３ＭＩＪ　７
酸緩衝液（Ｐｆ１７．４）　４００　ｕ　ｌの混合溶液
を加え、３７゛ｃで２４時間インキュヘーヒトる。その
後、０．８５％ＮａＣｌ２ｍ１！で３回ボールを洗浄し
、Ｉｔ’、（ｌ］ｐｉｌｌ第二抗体溶１１００μｆｆｉ
および０．２５％Ｂ　Ｓ　Ａ　・０．０２％ＮａＮ　３
含有０．０３Ｍリン酸緩衝液（Ｐ１１７．４）４００μ
Ｅの混合液を加え、４°Ｃで１８時間、さらに３７°Ｃ
にて５時間インキュベー１・する。

その後、ボールを０．８５％ＮａＣＩ２ｍＲで３回洗浄
し、第一抗体固定化ボールへ結合した１ｔ５１−第二抗
体の放射能をＴ−カウンターでｆｌｌｌｌ定する。　４
ｍ！準物質として濃度既知のｈＧＭ−Ｃ３Ｆを用いて検
量線を作製し、この検ＩｖＡから試料中のｈｃＭ−ｃｓ
Ｆ濃度を算出する。

また蛋白量はウシ血清アルブミンを標準物質としてバイ
オラ・ンド社製プロテインア・ンセイキントを用いて測
定し、電気泳動は３％濃縮ゲル、　１２．５％分離ゲル
を用いＬａｅｓｍｉらの方法（Ｎａｔｕｒｅ、　２２７
Ｓ６８０頁　１９７０年）に従って行った。

実施例１ ｈ　Ｇ　Ｍ　−ＣＳ　Ｆからの２Ｎ体、１Ｎ体および０
Ｎ体ＧＭ−Ｃ８Ｆの分離主＃製 く工程ｌ〉 工念Ｍ二見Σ■久１１ 組換えｈＧＭ−Ｃ３Ｆ産生ナマルバ細胞（特願昭６３−
０２９５５５参照）を１０％ウシ胎児血清（Ｆｅ２）を
含むＲＰ旧−１６４０培地で、５％二酸化炭素存在下３
７゛Ｃで数日間培養し、培養終了後遠心分離及び、Ｉν
過により細胞を除去した培養上清を得た。この項四上清
を限外濾過または硫酸アンモニウム沈澱１ノ二で′ａ縮
後、リン酸緩衝生理食塩水（Ｐ　Ｂ　Ｓ）で平衡化（４
°Ｃ）　した抗ｈＧＭ−Ｃ３ＦモノクＩ：Ｊ−ナル抗体
吸着カラム（特願昭６３−８７５５４参照）（２゜２ｃ
ｍＸ１２．５ｃｍ）に６０ｍ１！／ｈｒの流速で添加し
た。

４８０ａｅのＰＢＳでカラムを洗浄後、０．１Ｍクエン
酸ナトリウム（ｐｈ２．８）でｈＧＭ−Ｃ３Ｆを溶出し
た。溶出液はＳ　ｔａｌｌずつ分画し直ちに２Ｉｄｌゐ
２Ｍトリス−塩酸（Ｐ）１Ｂ、０）を加え中和した。

このようにして抗体吸着カラムにより精製されたｈＧＭ
−Ｃ３Ｆは、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による解析の結果、純度９０％（
−八）以上かつ、分子量１６−３５ＫＤａの２Ｎ体、１
Ｎ体及び０Ｎ体の混合物であった。　（第１図） く工程２〉 Ｗ　Ｇ　Ａ−アガロースカームクロマ　ブーツ工程ｌで
得られたＯ〜２Ｎ体混合物であるＩｔ　ＣＭ　−ＣＳ　
Ｆ（３，８２Ｂ）を、１００ｍＭ　ＮａＣｌを含む２０
＋ｓＭ　）リス−塩酸緩衝液（ｐｌ＋７．２）で平衡化
（４’Ｃ）したＷＧＡ−アガロースカラム（３，２ｃｍ
Ｘ６．２ｃｍ）に２０ｍ１！／ｈｒの流速で添加した。

平衡化に用いた緩衝液４００ｄでカラムを洗浄後、０．
２Ｍ　　Ｎ−アセチルグルコサミン及び１００ｍＭ　Ｎ
ａＣ１を含むトリス−塩酸Ｉ１街ｌｆ！（ｐＨ７，２）
でｈＧＭ−Ｃ３Ｆを？８出した。その結果、溶出画分に
含まれるｈＧＭ−Ｃ３Ｆは大部分が２Ｎ体で、素通り画
分と洗／？Ｉ液を合わせた非吸着画分には２Ｎ体ＧＭ−
Ｃ３Ｆはほとんど検出されなかった。

カラム吸着画分（２Ｎ体）及び非吸着画分（０Ｎ、ｌＮ
体）に回収されたｈＧＭ−Ｃ３Ｆは、各々２．１５１Ｉ
ｇ（［！月収率５６％）　、　１．３９ｍｇ（回収率３
７％）であった。

く工程３〉 フェニル・スーパーローズカームクロマトグー１」ヨコ （１）２Ｎ体ＣＭ−Ｃ３Ｆの精製 工程２で得られた２Ｎ体ｈＧＭ−Ｃ３Ｆ（１゜１９ｍｇ
）を含むＷＧＡ−アガロース溶出画分を、３゜０Ｍ硫酸
アンモニウム　（硫安）を含む１００ｍＭリン酸暖；Ｊ
酸液（ＰＩ＋７．０）で２倍に希釈後、１．５Ｍ硫安を
含む５０＋ｓＭリン酸緩衝ｉ＠１（ＰＩｉ７．０＞で平
衡化（室温）したフェニル・スーパーローズカラム（０
，５ｃｍ＋　ｘ５ｃｍ）に０．５ａｆｆｉ／ｗｉｎの流
速で添加した（ＦａｓｔＰｒｏｔｅｉｎ　Ｌｉｑｕｉｄ
　ＣｈｒｏＩｌｌａｔｏｇｒａｐＨｙ（ＦＰＬＣファマ
ルノア社）を使用）、平衡化に用いた緩衝Ｌ＆５　ｔ＊
１でカラムをｆｃｆｐ液、３０分間で硫安濃度がＯＭに
なるよう直、標的なグラジェントをかけｈＣ；Ｍ−Ｃ３
Ｆを溶出させた。　　１．０−０．８３Ｍの硫安濃度で
溶出するピークを分取することにより、０Ｎ体及び１Ｎ
体ｈＧＭ−Ｃ３Ｆを含まない２Ｎ体ｈＧＭ−Ｃ３Ｆ０．
９９ｍｇ　　（回収率８３％）を得た。さらにＰＢＳで
平衡化したセファデックスＧ２５（）〒フル９フ社）を
用いてゲル濾過することにより、緩衝液をＰＢＳに置換
した。

このようにして精製した２Ｎ体ｈ　Ｇ　Ｍ−ＣＳ　Ｆの
分子量は、５ＤＳ−ＰＡＧＥの結果２３−３５ＫＤａで
あった（第１図）。またハムスター骨髄細胞を用いて測
定した２Ｎ体ｂＣ；Ｍ−Ｃ３Ｆの比活性は約４Ｘ１０’
単位／ＩＩＩｇ蛋白質であった。

（２Ｊ　０Ｎ体及び１ＮＮＯ２−Ｃ３Ｆの分離精製工程
２で得られたＷＣＡ−アガロース非吸着画分を、ＰＭＩ
Ｏメンブレン（アミコン社）を用いた限外濾過により１
５ｍ１に濃縮後、（１）項に示した条件でフェニル・ス
ーパーローズカラムに添加した。

硫安濃度０．７７Ｍ及び０．６５Ｍの溶出位置に二峰性
ピークが認められ、コノうち硫安′ａ度０．８２−０．
７０Ｍで溶出するピークを１ＮＮ体ＧＭ−Ｃ３Ｆ、０．
６８０．５０Ｍで溶出するピークを０ＮＮ体ＧＭ−Ｃ３
Ｆとして分取した。

このようにして分離精製した１Ｎ体及び０ＮＮ体Ｃ；Ｍ
−Ｃ３Ｆの分子量は５ＤＳ−ＰＡＧＥで、各々１８−２
３Ｋ　（１Ｎ体）及び１６−１８Ｋ　（０Ｎ体）であっ
た、　（第１図） 実施例２ ｈＧＭ−Ｃ３Ｆからの２Ｎ体ｈ　Ｇ　Ｍ　−ＣＳ　Ｆの
精製 〈工程１〉 １」辷■二Ｃ３Ｉさ以皿製 無血清培地二ニートリサイト１１（ベーリンガー社）を
含む培地で培養したｈＧＭ−Ｃ３Ｆ産生ナマルバ細胞（
特願昭６３−０２９５５５）の培養上清を、限外濾過及
び８０％飽和硫安沈澱後、５０ｍＭ　ＮａＣ１を含む２
０ａＭ　　Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ａｌ１７．４）で平
衡化したウルトロゲルＡｃＡ３４カラム（２，６ｃｍＸ
９５ｃｍ、　　Ｉ　ＢＦ社）に流速３０ｉｄ／ｈｒで添
加し、ゲル濾過クロマトグラフィーを行った。ｈＧＭ−
Ｃ３Ｆ含有溶出液を、ゲル濾過カラムに用いた緩衝液で
平衡化したモノＱカラム（０，５ｃｍＸ　５　ａｍ、　
　２１１１１９７社）に流速１Ｉ１１／ｓｉｎで添加し
、陰イオン交換クロマトグラフィーを行った。　ＮａＣ
１１１度を４００ａ＋Ｍまで直線的に増加させることに
より蛋白質を）８出させた。

ｈＣ；Ｍ−Ｃ３Ｆ含１８ｉ′溶出液中に含まれるｈＧＭ
Ｃ３ＦＩは１１５μ８．蛋白量は６８０ｊ７ｇで、純度
はｌＯχ（Ｗ／Ｗ）　　程度であり、比活性は培養上清
の約５７倍に上昇した。

〈工程２〉 ｈＧＭ−ＣＳＦ　　”の２Ｎ　　ｈＧＭ−Ｃ３Ｆの拵１ 工程ｌで得られた部分純化ｈＧＭ−Ｃ３Ｆ（１１５ｐｇ
）を、１５０ｍＭ　ＮａＣｌを含む５０ｍＭ　）リスー
塩酸榎衝ｉ＆（ＰＨ７，４）で平衡化したＷＧＡ−アガ
ロースカラム（１，６ｃｍＸ２．５ｃｍ）に４．４ｄ／
ｈｒの流速で添加した。

平ｉ動化に用いた緩衝液２５−でカラムを洗浄後、０゜
２Ｍ　　Ｎ−アセチルグルコサミン及び１５０ｍＭ　Ｎ
ａＣ１を含む５０１１Ｍトリス−塩酸緩衝液でカラムに
吸着した蛋白質を溶出した。カラム溶出画分中に含まれ
る蛋白質のほとんどは２Ｎ体ｈＧＭ−Ｃ５Ｆであったが
、若干の夾雑蛋白質も含まれていた。また抗ｈＧＭ−Ｃ
ＳＦ抗体を用いたウェスタン・プロッティング法により
、カラム非吸着画分には２Ｎ体ＧＭ−Ｃ３Ｆは含まれて
いないことを確認した。

ＷＧＡ−アガロースカラムより回収されたｈＧＭＣ３Ｆ
は３６Ｍｇ（回収率３１％）で、この過程で比活性は約
７倍上昇した。

次に、このｈＧＭ−Ｃ３Ｆ　（２４Ｍｇ）を含むＷＧＡ
−アガロースカラム溶出画分を、３．４Ｍ硫安を含むｌ
ｏｏｓＭリン酸緩衝液（ρ１１７．０）で２倍に希釈後
、１．７Ｍ硫安を含む５０１ＩＭリン緩衝液（ｐｌ＋７
．０）で平衡化したフェニル・スーパーローズカラム（
０，５ｃｍＸ５　ａｍ）に０．５ａ＋ｆｉ／＋＋＋ｉｎ
の流速で添加し、実施例１の工程３（Ｉ）項で示した条
件で直線的に硫安のグラジェントをかけ、カラムに吸着
したｈＧＭ−Ｃ３Ｆを溶出させた１、０−０．８Ｍの硫
安濃度で溶出する単一ピークを分取し、２Ｎ体ｔｔｃ；
Ｍ−ＣＳＦ１９μｇ（回収率７９％）を得た。

このようにして部分純化ｈＧＭ−Ｃ５Ｆから精製した２
Ｎ体ｈＧＭ−Ｃ３Ｆを５ＤＳ−ＰＡＧＥに供したところ
、分子量２５−３５にＯａに単一バンドとして検出され
た。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明により精製されたｔｔＧＭ−Ｃ３ＦのＳ
ＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す、レ
ーンｌは分離精製前の０Ｎ〜２Ｎ体の混合物であるｈＧ
Ｍ−Ｃ３Ｆ、レーン２は２Ｎ体ｈＧＭ Ｃ３Ｆ。 レーン３は１Ｎ体ｈＧＭ ＳＦ。 レーン４は０Ｎ体ｈＧＭ−Ｃ３Ｆの電気泳動結果である
。 第 図 （ＫＤａ） １４．７

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）動物細胞が産生したヒト顆粒球−マクロファージ
   コロニー刺激因子を分離精製する方法において、下記の
   工程（Ａ）および（Ｂ）からなるか、或いは（Ａ）、（
   Ｂ）および（Ｃ）からなることを特徴とするヒト顆粒球
   −マクロファージコロニー刺激因子の分離精製方法 工程（Ａ）；動物細胞が産生したヒト顆粒球−マクロフ
   ァージコロニー刺激因子を、固定化小麦胚芽レクチンア
   フィニティークロマトグラフィーカラムを用いて、主と
   して２Ｎ体ヒト顆粒球−マクロファージコロニー刺激因
   子を含有する吸着画分と非吸着画分に分画する工程 工程（Ｂ）；疎水性クロマトグラフィーを用いて、工程
   （Ａ）の吸着画分から２Ｎ体ヒト顆粒球−マクロファー
   ジコロニー刺激因子を分離精製する工程 工程（Ｃ）；疎水性クロマトグラフィーを用いて、工程
   （Ａ）の非吸着画分中から０Ｎ体或いは１Ｎ体ヒト顆粒
   球−マクロファージコロニー刺激因子のうち少なくとも
   １つを分離精製する工程
2. （２）疎水性クロマトグラフィーのリガントが、フェニ
   ル基或いは炭素数Ｃ＿１〜Ｃ＿１＿０の疎水性官能基の
   中から選ばれたものであることを特徴とする特許請求の
   範囲第１項記載の方法
3. （３）アフィニティークロマトグラフィーの担体が、ア
   ガロース、超硬化アガロース、合成高分子ポリマー或い
   はシリカゲルの中から選ばれたものであることを特徴と
   する特許請求の範囲第１項又は第２項記載の方法
4. （４）疎水性クロマトグラフィーの担体が、アガロース
   、超硬化アガロース、合成高分子ポリマー或いはシリカ
   ゲルの中から選ばれたものであることを特徴とする特許
   請求の範囲第１項、第２項又は第３項記載の方法
5. （５）動物細胞が、ヒト顆粒球・マクロファージコロニ
   ー刺激因子をコードするＤＮＡでヒト顆粒球・マクロフ
   ァージコロニー刺激因子を生産するように形質転換され
   た細胞であることを特徴とする特許請求の範囲第１項、
   第２項、第３項又は第４項記載の方法