JPH07506364A - 新しい抗腫瘍性サイトカイン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

発明の名称　新しい抗腫瘍性サイトカイン且ユニ豊見 且豆ユ立互 本発明は一般的にはサイトカインに関連する。より具体的には、本発明は幅広い 抗腫瘍性作用を有する新しいサイトカインに関するものである。 洗」」１亘１日を町 細胞成長は成長刺激性と成長抑止性分子との間のバランスによって規制されると 見られる。これら成長規制サイトカインの間のインバランスは腫瘍成長における メカニズムのひとつと考えられている。 腫瘍細胞および正常な細胞の成長を刺激するいくつかのサイトカインについても 明らかにされている。これらのサイトカインには、エビダーマル成長因子（ＥＧ Ｆ）　、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）　、血小板誘導成長因子（ＰＤＧＦ）　 、インシュリン状成長因子（ＩＣＦ）　、インターロイキン（ＩＬ）　、コロニ ー刺激性因子（Ｃ３Ｆ）　、および形質転換因子（ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β ）などを含んでいる。 対照的に、他のサイトカインは一定の腫瘍細胞の成長を抑止する。これらのサイ トカインには、例えば、イターフエロン（ＩＦＮ）　、リンフォトキシン（ＬＴ ）　、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、オンコスタチンＭ１アムフイレグリン、インタ ーロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）　、およびＴ ＧＦ−βなどが含まれる。 これらの成長刺激性および成長抑止性サイトカインはそのソース、その物理−化 学的性質、およびその基本構造が相互に異なっている。したがって、成長規制サ イトカインの確認とその特徴付けは、腫瘍の成長を含めて、細胞の成長の理解に とって決定的な重要性をもっている。 且ユニ亙監 本発明のひとつの実施例においては、新しい組成物が提供される。この新しい組 成物はオンコインヒピンと名づけられており、ヒト胎児赤芽球細胞によって分泌 され、分子量は５ＤＡ−ＰＡＧＥで２８ｋＤａ程度で、種々の抗腫瘍性作用を有 している。 ひとつの実施例において、本発明はオンコインヒピンと称される新しいヒト・サ イトカイン調製する方法を提供する。 この方法は、ヒト胎児赤芽球細胞を培養するステップと、オンコインヒビンの形 成を誘発するステップと、そして条件づけられた細胞上澄液を取り出すステップ とで構成されている。 本発明のさらに別の実施例においては、ヒト・オンコインヒビンを精製する方法 が提供される。この方法はヒト・オンコインヒビンを含む条件づけられた細胞上 澄液を限外ろ過するステップで構成される。その後、ヒト・オンコインヒビン内 で限外ろ過を透析する。その後、ＤＥＡＥアフィゲル・ブルー・グロマトグラフ イー、ナトリウムドデシルスルフェート−ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動、 および逆相高性能液体クロマトグラフィーを行ってヒト・オンフインヒビンを精 製する。 本発明の別の実施例で、リンフオサイド、モノサイト、おおよびニューロフィル を活性化して、腫瘍細胞を殺す新しい免疫調節子が提供される。この新しい免疫 調節子はヒト・オンコインヒビンを含んでいる。また、正常な細胞の成長を刺激 するための新しい成長因子が提供される。この成長因子はヒト・オンコインヒビ ンを含んでいる。 本発明の他の実施例においては、オンコインヒビンの医薬品組成物と、有効な量 のオンコインヒビンを投与するステップで構成される、腫瘍細胞を措置する方法 が提供される。 １皿五墨工皇盈豆 上に述べた、およびそれに関連して明らかになる他の、本発明の特徴、利点およ び目的をさらに詳細に理解できるように、その実施例を示す図面を以下に示す。 これらの図面は、本明細書の一部を構成するものである。しかしながら、以下の 図面は本発明の好ましい実施例を示すもので、したがって本発明の範囲を限定す るものではない。本発明においては他に同様に有効な実施例をつくることも可能 である。 図１は、Ｋ−５６２細胞条件付は上澄液がＭＣＦ−７細胞の成長を抑止すること を示している。 図２は、オンコインヒビンに関する標準的な生物検定を示している。 図３は、血清が存在する状態と、存在しない状態での、Ｋ−５６２細胞によるオ ンコインヒビンの生産を示している。 図４は、オンコインヒビンの誘発に対するフォルボールエステルの影響を示して いる。 図５は、オンコインヒビンの作用に対する限外ろ過の影響を示している。 図６は、ゲル浸透グロマトグラフイーによるオンコインヒビンの特徴付けを示し ている。 図７は、ＳＤＳポリアクリルアミド・ゲル電気泳動によるオンコインヒビンの作 用を示している。 図８は、オンコインヒビンの５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示してし）る。 図９は、ＤＥＡＥアフィゲル・ブルー（上側パネル）およびＱ−セファロース・ カラム（下側パネル）からのオンコインヒビン活性の結合溶離（ｂｉｎｄｉｎｇ 　ｅｌｕｔｉｏｎ）を示してνする。 図１Ｏは、オンコインヒビンおよびＴＮＦの用量に依存した抗増殖効果を示して いる。 図１１は、正常なヒト包皮線維芽細胞に対するオンコインヒビンの用量に依存し た増殖効果を示している。 図１２は、アクチマイシンＤで処理したマウスＬ−９２９細胞に対するオンコイ ンヒビンの影響を示している。 図１３は、フォルボールエステルで処理した、あるいは処理していないに一５６ ２細胞の丁ＮＦおよびＬＴに関するノーザン・プロット分析を示す。 図１４は、ヒト悪性腫瘍Ａ３７５細胞に対するオンコインヒビン（パネルＡ）お よびオンコスタチンＭ（パネル卸の成長抑止効果の比較を示している。 図１５は、正常な線維芽細胞に対するオンコスタチンＭおよび比−６の成長抑止 効果を示している。 図１６は、ヒト乳房腫瘍（ＭＣＦ−７）細胞に対するＩＬ−６効果を示している 。 図１７は、ヒト乳房腫瘍細胞（ＭＣＦ−７）に対するオンコインヒビンの作用へ の、インターフェロン−γに対する抗体の影響を示している。 図１８は、ヒト包皮線維芽細胞上のオンコインヒビン（下側パネル）ではなく、 ＴＮＦ　（上側パネル）に対するインターフェロン−γの抑止効果を示している 。 図１９は、オンコインヒビンの存在下および不存在下

【こおけるヒト乳房腫瘍Ｍ ＣＦ−７細胞の成長速度を示している。 図２０は、ＭＣＦ−７細胞のオンコインヒビンに対する露出時間の影響を示して いる。 図２１は、ヒト乳房腫瘍ＭＣＦ−７細胞の形態に対するオンコインヒビンの影響 とＴＮＦの影響との比較を示している。 １阜二韮朧ｌ盈里 マウス結合繊維細胞株Ｌ９２９　（ＣＣＬ　ｌ）　、　Ｋ−５６２（ＣＣＬ−２ ４３）　、　Ｕ−９３７（ＣＲＬ−１５４３）　、　ＨＬ−６０（ＣＣＬ−２４ ０）　、ラジ（ＣＣＬ−８６）　、ジュルカット（ＣＲＬ−８１６３）　、　Ｂ Ｔ　２０　（ＨＴＢ−１９）　。 ＭＣ：Ｆ−７（ＨＴＢ−２２）　、　５Ｋ−ＢＲ−３（ＨＴＢ−３０）　、　Ｚ Ｒ−７５−Ｌ　（ＣＲＬ−１５００）　、　ＰＲＭＩ　７９５１　（ＨＴＢ−６ ６）　、　Ａ３７５　（ＣＲＬ−１６ｉ９）　、　Ａ−４３１（ＣＲＬ−１５５ ５）　、　ＭＥ−１８０（ＨＴＢ　８３）　、　ＯＶ（：ＡＲ−３（ＨＴＢ−１ ６１）　。 Ｈｅ　Ｌａ　（ＣＣＬ−２）　、　Ｈｅｐ−２（ＨＢ−８０６５）　、およびＮ ＩＨ３Ｔ３　（ＣＲＬ−１６１８）を含む種々の細胞株がアメリカ・タイプ・カ ルチャー・コレクション（ミツドランド州ロックビル）からめられた。ＴＮＦ− 抵抗性ＮＩＨ３Ｔ３細胞は、Ｋ、　Ｔｏｔｐａｌ、　Ｒ，ＬａＰｕ５ｈｉｎ、Ｈ ９Ｎ、　ＪｌａｎｔｈａｓｗａｍｙおよびＢ、Ｂ、Ａｇｇａｒｗａｌ、　Ｌｙｍ ｐｈｏｋｉｎｅおよびＣｙｔｏｋｉｎｅ　Ｒｅｓ、　１０　（１９９１）　３５ ９−３６７にのべられているように分離された。　Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ　（カリ フォルニア州すンディエゴ）から購入したバイオ・アッセイ・キットを用いて、 マイコプラズマ汚染に関するテストを行った。 すべての細胞培養物は、週ごとの継代を通じて継続的な指数的成長状態で維持さ れた。細胞の一部は、週に二度、継代培養された。細胞は加湿培養器内で１．空 気中５％ＣＯ１の存在下、グルタミン（２ｍＭ）、ペニシリン（１００ユニツト ／ｍｌ　）、およびストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）　、およびウシ胎 児血清（１０％）で補足したＲＰＭＩ　１６４０培地内で培養した。 条件付けを行ったヒト胎児赤芽球培養株に−５６２は、ヒトの乳房腫瘍細胞株Ｍ ＣＦ−７に対する成長抑止的作用をつくりだす。 腫瘍細胞の成長は抑止するが、正常な細胞の成長は抑止しないその能力により、 この作用は「オンコインヒビン（腫瘍抑止因子）ｊと呼ばれている。 オンコインヒビンの生産および導入のために、ヒト赤芽球細胞株に−５６２を、 グルタミン（２ｍＭ）、ペニシリン（１００ユニツト／ｍｌ）　、およびストレ プトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）でおぎなった１０％胎児性仔ウシ血清を含む ＲＰＭＩ　１６４０培地内で培養した。細胞の密度が０，８ＸＩＯ“細胞／ｍｌ に達すると、遠心分離で細胞を取り出し、細胞を血清なしの培地で一度洗浄し、 その後血清を含まない状態で、グルタミン、ペニシリン、およびストレプトマイ シンを含むＲＰＭＩ−１６４０培地に移した。オンコインヒビンをつくりだすた めに、これらの細胞の１×ｌＯ“／ｍｌを、血清を含まないＲＰＭＩ　１６４０ 培地内で定常培養条件の下で、Ｔ１７５フラスコ（Ｆａｌｃｏｎ）内で４８時間 培養し、その後、フォルボールエステル（１００ｎｇ／ｍｌ　）で３７℃の温度 下、４８時間培養した。その後、遠心分離で条件づけられた細胞上澄液を採取し 、０．２２ミクロン・フィルター（Ｆａｌｃｏｎ）によってろ過し、さらに特徴 付けを行うまで、４℃の温度で保存した。 オンコインヒビンを濃縮するために、Ｋ−５６２細胞株からの条件付けを行った をＰＭ−１０薄膜（Ａｍｉｃｏｎ　Ｃｏｒｐ、）によって限外ろ過し、そして、 ２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、　ｐＨ８，０で透析した。 図１で、腫瘍細胞成長の抑止作用が３つの別個の方法で調査された。これらの方 法とは、（１）トリパン・ブルー染色後、血球計算盤上で細胞を数える方法と、 （２）結晶バイオレット染料摂取法、および（３）三重水素化チミジン組み込み 法、の３つであった。オンコインヒビンは、これら３つの方法のいずれにおいて も、用量に依存する方法で、明らかに細胞の成長を抑止する。簡便さと感度の両 方の理由がら、オンコインヒビンに関する生物検定を行うための標的として、Ｍ ＣＦ−７細胞株を用いた。オンコインヒビンによる三重水素化チミジンの取り込 みの抑止は、このサイトカインを検出する上で、高度に鋭敏な方法であることが 分かった。 オンコインヒビンに関する生物検定は５ＸＩＯ″個の細胞を９６ウエル平底ウエ ルプレートに入れて、ＣＯ１培養器内で３７℃の温度で、Ｏ，１ｍｌのＲＰＭＩ 　１６４０培地で一墨夜培養することによって行われる。そして、培地を取り出 して、テストサンプルの２倍希釈液を最終的な体積が００１ｍ１になるように加 えて、３７℃の温度で、２４時間、培養が続けられた。最後の６時間に、三重水 素化チミジン（０，５μＣ１１０，０５ｍ１／ｗｅｌｌ）を加えた。２４時間の 培養時間後、培養液を取り出し、細胞を、Ｏ，１ｍｌのトリプシン（０，５％） およびＥＤＴＡ　（５，３ｍＭ）を用いて、３７℃の温度下、３０分間の処理を 行って、細胞を取り出した。円（Ｄカムブリッジ細胞ハーベスタを用いて、細胞 を取り出し、ベータ・カウンターを用いて、細胞に組み込まれた放射性を潤定し た。 データは、オンコインヒビンの存在下で細胞に取り込まれたｄｐｍの量を培養液 だけが存在している状態で取り込まれたｄｐｍの量で割って、その量に１００を 掛けた量で表現された。細胞の成長可能性を５０％抑止するのに必要なオンコイ ンヒビンの量をサイトカインの１ユニツトと定義した。図１に示されているよう に、オンコインヒビンは、これら３つの方法のすべてによって示されるように、 細胞の成長を用量に依存する形態で抑止する。 図２で、２４時間以内の期間では、ＭＣＦ−７のオンコインヒビンに対する用量 に依存した作用が観察できる。シミジンの取り込みにおける５０％抑止を達成す るのに必要なサンプルの希釈率の逆数がオンコインヒビンの１ユニツトとして定 義された。 図３で、血清を含まない状態での、オンコインヒビンの生産に関する調査が行わ れた。血清を含まない状態が選ばれたのは、血清を含むサンプルからの蛋白質の 精製が困難だからである。これらの結果は、明らかに、血清が存在しない状態で もオンコインヒビンかに一５６２細胞から分泌されることを示している。 我々は、種々の作用因子がオンコインヒビンの生産を誘発するかどうか調べた。 カルシウムイオン泳動、コンカナヴアリンＡ、フィトヘマググルチニン、および フォルボールエステルについての調べられた。図４はフォルボールエステルがオ ンコインヒビンの生産量を増大することを示している。したがって、フォルボー ルエステルはに一５６２細胞からのオンコインヒビンの生産を最適化するために 用いることができる。 細胞をフォルボールエステル（１００ｎｇ／ｍｌ　）に露出させた場合、オンコ インヒビンの生産量が４倍程度増大することが観察された。オンコインヒビンの 誘発が最も活発なのは、細胞をフォルボールエステルで４８時間（表１）、そし て培養液１ｍｌあたり１×】０“個の細胞密度（表■）で培養を行った場合であ った。 以下余白 ｌ フオルボールエスールによる旦ΣＫ　−５６２鳳皇からのオンコインとビンの” 　と　の　イフオルボールエステル（１００ｍｇ／ｍｌ　）の存在している状態 と、存在していない状態の両方で、Ｋ−５６２細胞（１×１０”／＋＋＋１　） を血清を含まない培地（ＲＰＭｌ−１６４０）で、ＣＯ，培養器内で、３７℃の 温度下、時間を変えて培養し、条件付けをおこなった培地を遠心分離で取り出し た。サンプルを「材料と方法Ｊに示したように、ＭＣＦ−７細胞上でｌ：２倍の シリアル希釈でテストした。 ０、１　８９　５６ ０．５　６５　４１ 零　Ｋ−５６２細胞は血清を含まない培地（ＲＰＭＩ−１６４０）で、表に示し た細胞密度で７２時間、ＣＯ３培養器内で３７℃の温度下で培養された。条件づ けられた培地を遠心分離で取り出して、ＭＣＦ−７細胞上でアル希釈でテストし た。 図５で、オンコインヒビンの特徴付けと精製を行うために、細胞で条件付けした 培地を１０，０００分子量カット・オフ（ＰＭ−１０）薄膜を用いて限外ろ過に より濃縮した。フィルター（フロー・スルー、またはＦＴ）によって捕らえられ なかったフラクションの活性は低かったのに対して、補足されたフラクションあ るいは濃縮物（Ｃ）の活性は標準バッファー（開始物質、ＳＭ）の場合より比例 的に高かった。この結果はオンコインヒビンの活性が保持され、濃縮されたこと を示している。 これら３つのテスト結果も、オンコインヒビンの分子量が１０．０００以上であ ることを示した。 図６に示すゲル透過高速蛋白質液体グロマトグラフィー実験のパネルａとパネル ｂで、オンコインヒビンのサンプルを。 ０．１％仔ウシ血清アルブミンおよび０．０１％ナトリウムアジドを含むフォス フェート緩衝食塩水で予め均衡させたスベロース−６カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉ ａ）上に入れた。二〇カラムを室温で、１分あたり０．５ｍｌの流速で作動させ 、各フラクションのサイズを０．５ｍｌとした。このカラムは分子量標準（Ｓｃ ｈｗａｒｚ／Ｍａｎｎ。 Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、　ＭＡ）で較正した。後者はアポフェリチン（４８０ｋＤ ａ）、アルファ・アミラーゼ（２０ｋＤａ）　、ガンマ−グロブリン（１６０ｋ Ｄａ）　、仔ウシ血清アルブミン（６７ｋＤａ）　、オーバルアルブミン（４５ ｋＤａ）　、キモトリプシノゲン（２４ｋＤａ）　、およびサイトクロムＣ（１ ２，４ｋＤａ）を含んでいた。 図６で、オンコインヒビンの分子量は２５ｋＤａ程度と見られある。オンコイン ヒビンの分子量は非変性条件下でスペロースー６上でゲル透過高速蛋白質グロマ トグラフイーで検査された。フォスフェート緩衝食塩水、ｐＨ７，４で行ったゲ ルろ過の結果は２つの顕著な活性ピークを示し、ひとつは排他容積（ｅｘｃｌｕ ｄｅｄ　ｖｏｌｕｍｅ）と一致し、２番目のピークはほぼ２５ｋＤａ程度の分子 量と対応していた（図６、パネルＢ）。図７および８に示すナトリウムドデシル スルフェート−ポリアクリルアミド・ゲル泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ　）の実験で は、基本的に１５％ポリアクリルアミド・ゲルはくここに引例として採用した、 Ｎａｔｕｒｅ　２２７　（１９７０）　６８０−６８５による）　ＩＪ、　Ｋ、 　Ｌａｅｍｍｌｉにしたがって行われ、銀染色で蛋白質が見えるようにされた。 予備的なゲル泳動および活性の溶離（ｅｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｃｔｉｖｉｔｙ ）を行うために、固定、染色を行う前にゲルの一部をカミソリの刃で４０以」二 の異なった断片にスライスし、５０ｍＭの重炭酸アンモニウムを一昼夜分散させ た試験管内で溶離させ、そのフラグジョンを２０ｍＭ　トリス、ｐ）１８．０で 透析し、その生物学的活性の評価を行った。 図７で、オンコインヒビンの分子量をさらに正確に確認するだめに、５ＤＳ−Ｐ ＡＧＥ分析を行った。電気泳動後、ゲルをスライスし、５０ｍＭ重炭酸重炭酸ア ンモニウム夜溶離させ、オンコインヒビンの活性を評価した。適用されたオンコ インヒビンの活性の５０％以上は、３０ｋＤａ程度の分子量領域で再現された（ ｒｅｃｏｖｅｒｅｄ）。ダイ・フロント近くの領域でも、ｌＯ％程度以下の活性 が認められた。 図８で、５ＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色したゲル上での生物学的に活性を示した フラクションで再度テストを行ったところ、２８ｋＤａ程度の分子量のところで 、単一の顕著な帯が確認された。 図９、パネルａおよびパネルｂで、オンコインヒビンのアニオン交換樹脂への結 合、およびそれからの溶離を調べた。 ひとつのカラム（１ｃｍ＋Ｘ５ｃｍ）をアニオン交換樹脂Ｑ−セファロースを充 填し、２０ＩｎＭトリス、ｐＨ８，０で均衡化させた（均衡緩衝液）。均衡緩衝 液で透析したオンコインヒビンのサンプルを０．５ｍｌ／分の流速でカラムに負 荷した。そのカラムを均衡化緩衝液ですすいでから、ＮａＣ１の濃度を変えて（ ０−ＩＭ）溶かした。種々のフラクションの蛋白質濃度と生物学的活性について 調べた。 ＤＥＡＥアフィゲル・ブルー・クロマトグラフィー：第二のカラム（１ｃｍｘ５ ｃｍ）をＤＥＡＥアフィゲル・ブルー樹脂を充填して、その後、２０ｍＭ　トリ ス、ｐＨ８，０（均衡化緩衝液）で均衡化させた。透析で均衡化緩衝液に対して 予め均衡化させたオンコインヒビンのサンプルを、０．５ｍｌ／分の流速でカラ ムに負荷した。このカラムを均衡化緩衝液ですすいで、その後濃度を変えた（０ −ＬＭ）のＮａＣ１に溶かした。種々のフラクションについて、その蛋白質濃度 と生物学的活性が調べられた。 図９のパネルａとパネルｂは、オンコインヒビンがアニオン交換樹脂に結合する と共に、それから溶離することができる。Ｑ−セファロースおよびＤＥＡＥアフ ィゲルの両方に対して、２０ｍＭ　トリス、ｐＨ８，０緩衝液内でオンコインヒ ビンの結合活性が示された。結合したオンコインヒビンはＤＥＡＥアフィゲル・ ブルーから２０１１ＩＭトリス緩衝液内に０．２Ｍ　ＮａＣ１を加えたもの、お よびＱ−セファロースからは０．５Ｍ　ＮａＣ１を用いてそれぞれ溶離された。 オンコインヒビンは広範な腫瘍細胛の成長を抑止した（表■）６オンコインヒビ ンの抗増殖作用は三重水素化チミジンと取り込みによって調べた。 １旦 ＴＮＦとオンコインヒビンとの間の 腫瘍細胞に対する特性の差 赤芽球症細胞株（Ｋ５６２　）９４　２組織球リンパ腫（Ｕ−９３７）　５４　 １組織球リンパ腫（Ｕ−９３７−ＣＦ−１）　＋３　０骨髄腫促進性リンパ腫（ ＨＬ−６０）　ｔｏｏ　ｌパーキット・リンパ腫（ラージ）７６０Ｔ細胞リンパ 腫（ジャーケラト）　７４　３６骨髄性白血病（ＫＧ−１）　４３　８ 骨髄性白血病（ＫＧ−１ａ）　６０　１３骨髄性白血病（ＭＬ−１ａ）　５９　 ０．１骨髄性白血病（ＭＬ−１ｂ）　３５　０．１単球白血病（ＴＨＰ−１）　 ８１　１ 乳房悪性腫瘍（ＢＴ２０）　２４　２ 乳房悪性腫瘍（ＢＴ２０ＴＮＦＲ）　６０　３乳房悪性腫瘍（ＭＣＦ７）１０ 乳房悪性腫瘍（ＳＫ−ＢＨ３）　５２　０乳房悪性腫瘍（ＺＲ−７５−１）　６ 　１黒色腫（ＲＰＭＩ　７９５１）　７３　０黒色腫（Ａ３７５　）７６　０ 表皮悪性腫瘍（Ａ−４３１）　８２　０歯頚部悪性腫瘍（ＭＥ−１８０）　２０ 　０子宮悪性腫瘍（ＯＶＣＡＲ−３）　２７　１歯頚部悪性腫瘍（ＨｅＬａ）　 ５５　１４肝臓癌（ＨｅｐＧ−２）　８３　２０ 網膜腫（Ｗｅｒｉ−Ｒｂ−１）　６０　３３網膜腫（Ｙ−７９）　９２　４６ 膠芽腫（ＬＧ）　’　８４　２．３ マウス線繊芽細胞（ＮＩＨ３Ｔ３）　１１　３５マウス線繊芽細胞（ＬＴＲＩ　 ０００）　８５　２７マウス線繊芽細胞（Ｌ９２９）　０　１正常なヒト包皮線 維芽細胞　３１＋　１８９腫瘍細胞（５０００／ウエル）をＴＮＦ　（０，２， ｃｚｇ／ｍｌ）またはオンコインヒビン（フォルボールエステルで誘発し、濃縮 ）で、３７℃の温度下、７２時間培養し、その後で、上に述べたチミジン取り込 みを基準としてそれぞれの細胞成長可能性（％）の判定を行った。 図１Ｏ、パネルＡ−Ｄで、表■に示した細胞株の一部でのオンコインヒビンの用 量に依存した作用を調べ、ＴＮＦと比較した。表■および図１０に示した結果か ら、ＮＣＦ−７に加えて、オンコインヒビンがいくつか異なった種類の白血病、 黒色腫、および肝臓癌の成長を抑止できることは明らかである。マウスの細胞の 成長も抑止された。したがって、インターフェロンの場合とは違って、オンコイ ンヒビンは特定の腫瘍に限って効果を発揮するものではないと見られる。 成長検定に関する図１１および１２で、細胞は９６−ウェル・ファルコン・プレ ートで０．１ｍｌの培地（１０％ＦＢＳを含むＩ’ｌＰＭＩ−１６４０）で一旦 夜培養された。その後、培地を取り出し、ヒト・オンコインヒビンのシリアル希 釈液をＯ，１ｍｌの体積で入れた。 ３７℃の温度下、７２時間培養した後、培地を取り出して、Ｂ、Ｂ。 Ａｇｇａｒｗａｌ、　Ｈｕｍａｎ　Ｉｙｍｐｈｏｔｏｘｉｎ、　Ｍｅｔｈ、　ｏ ｆ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、、　１１６　：４４１−４４８　（１９８５）　（引用に より本文に組み入れ）に述べられているような結晶バイオレット染色によって、 成長可能な細胞についての測定を行った。細胞の成長可能性を調べる染料取り込 み法は、トリプシン溶液による分離および血球計算盤によるカウンティングによ って判定される細胞数と関係している。それぞれの細胞成長性の割合はテスト・ サンプルが存在している状態での光学密度をテスト・サンプル（培地）が存在し ない場合の光学密度で割って、Ｉｏｏをかけたものである。ＬＴおよびＴＮＦの 場合、細胞毒性検定は、２ｏ　ｘ　＋ｏ’　Ｌ　−９２９細胞をアクチノマイシ ンＤ（１Ｍｇ／ｍｌ　）で培養した後、サイトカインで２４時間培養することを 除いて、成長抑止検定の場合とほぼ同様に行われた。 細胞成長刺激検定。細胞成長刺激検定は、基本的には、に引用により本文に組み 入れているＶｉｌｃｅｋ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｅｘｐ。 Ｍｅｄ、１６３　：　６３２−６４３　（１９８６）に述べられている手順にし たがって行われた。簡単にいうと、パッセージ・レベル＋２−１６（集団倍加レ ベル２４−３２程度に相当）での融合ヒト２倍体包皮線維芽細胞を、細胞成長刺 激検定に用いた。ヒト・オンコインヒビンの影響を調べるために、細胞（８ＸＩ Ｏ”／ウェル）を９６−ウェル・ファルコン・プレートで培地（ＲＰＭＩ−１６ ４０＋　１０％ＦＢＳ）　０．１ｍｌに入れた。ＣＯ３培養器内で、３７℃の温 度下で一昼夜培養し、その後、培地を取り出して、サイトカインのシリアル希釈 液を０．２ｍｌの容積で層状に入れた。５日間培養した後、メディアを静かに注 いで、結晶性バイオレットで染色した。すべての判定は三重に行われた。細胞成 長性の割合は、成長性検定の場合と同様に計算された。 ［′ト１］ＴｄＲ組み込み検定を行うために、ヒトの線維芽細胞を培養し、サイ トカインで５日間処理した。最後の２４時間に、三重水素化チミジン（６，７Ｃ ｉ／ｍモル；　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ。 Ｂｏｓｔｏｎ、　ＭＡ）をそれぞれのウェル（０，５μＣｉ／ウェル）に加えた 。その後、培養培地を取り出して、ウェルをリン酸緩衝食塩水で二度洗浄し、Ｅ ＤＴＡ　（５，３ｍＭ）を含むトリプシン（０，５％）溶液を加えて、細胞を切 り離した。その後、ＰＩ−ＩＤ細胞ハーベスタ−（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ　Ｔｅｃ ｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｃ、Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ、　ＨＡ）の助けをかりて細胞懸 濁物を取り出し、希釈水に二度すすいだ。 液体シンチレーション・カウンター（モデル１６００ＴＲ；　ＰａｃｋａｒｄＣ ｏｌＭｅｒｉｄｅｎ、　ＣＴ）で、フィルターについた放射能を測定した。こう した方法で判定されたヒト線維芽細胞のチミジン取リ込み量は細胞の成長性と関 係している。腫瘍細胞成長抑止に関する研究では、細胞を最終体積０．　Ｉ＋ｉ ｌとなるまで、サイトカインで３日間培養し、その後、チミジン取り込み量で判 定した。 図１１で、オンコインヒビンは通常のヒト包皮線維芽細胞の成長を刺激すると見 られる。オンコインヒビンは腫瘍細胞の成長は抑止するが、通常のヒト包皮線維 芽細胞の増殖は増進した。 図１２で、ＴＮＦおよびＬＴの場合と同様、オンコインヒビンはアクチノマイシ ンＤで処理したＬ−９２９細胞を細胞溶解する。 Ｌ−９２９細胞に対するオンコインヒビンの抗腫瘍性作用は抗ＬＴおよび抗ＴＮ Ｆ抗体のいずれによっても中性化されない（表■参照）。つまり、オンコインヒ ビン調剤においては、ＥＬＩＳＡ検定で、有意な量のＴＮＦあるいはＬＴは検出 されなかった（表Ｖ）。表■は、ＴＮＦ／ＬＴに抵抗性のあるいくつかの種類の 細胞（ＳＫ−ＢＲ−３，）ＩｅＬａ、　Ａ４３１．０ＣＡＶＲ−３，Ａ３７５お よびＲＰＭＩ−７９５１など）はオンコインヒビンに対しては非常に敏感である 。オンコインヒビンは、ＴＮＦ／ＬＴ　（ＮＩＨ３Ｔ３−ＬＴＲおよびＢＴ−２ ０７ＮＦＲ）に対する抵抗性で分離され、オンコインヒビンに対して感作性があ ると認められた細胞株でも、ＴＮＦ／ＬＴがら区別することができる（表ｍ参照 ）。 １Ｕ又 サンプル　抗　体　相対細胞成長性％　中性化％オンコインヒビン　なし　５８ 　Ｑ ＋抗−ＴＮＦ　５８　０ ＋抗−ＬＴ　６０　０ ＋抗−ＴＮＦ十抗ＬＴ　５６　４ ＴＮＦ　なし　３９　Ｑ ＋抗−ＴＮＦ　１００　１００ ＋抗−ＬＴ　４４　５ ＋抗−ＴＮＦ　３８　０ 置したＬ−９２９細胞に対する、残存している中性化ＴＮＦまたはＬＴ活性の影 響に関する検定を行った。 以下余白 、五Ｎ− 玉二匹１綴蓼堕ソ１制Ｌユａ≦オ企≦ＬＬ之よ」Ｌｚのｌ・°Ｊ［１の一々のサ イトカインの一１″、＊ＴＮＦ−β　（ＬＴ）　２＋０ 血清を含まないに一５６２細胞で条件づけた培地を、オンコインヒビンの供給源 をして用い、標準的なＥｌ、ＩＳＡ検定（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍ）によって、種々 のサイトカインのレベルの判定を行った。ＮＤの判定は行われていない。 ＴＮＦおよびＩ７■はそれぞれモノサイトおよびリンフオサイドの生成物で、さ まざまな細胞の成長を抑止する。オンコインヒビンの場合と同様、リンフォトキ シンとＴＮＦはＭＣＦ−７細胞の成長を抑制するが、大きな濃度のＴＮＦおよび ＬＴ　（１０，０００ユニット／ｍ１）が必要である。 オンコインヒビンがＴＮＦでもＬＴでもないことをさらに確認するために、いず れかのサイトカインに関する遺伝子を捜すために、ノーザン・プロット検定を行 った。ノーザン・プロット分析では、Ｋ−５６２細胞株で処理したフォルボール エステルと、処理しないフォルボールエステルを、それぞれ７５−　ｃｍフラス コ内でｌＸｌ０’細胞／ｍｌでシードし、蛋白質キナーゼＣアクチベータで２４ 時間培養し、その後、遠心分離で取り出した。引用により本文に組み入れたＣｈ ｉｒｇｗｉｎ、　ｅｔ　ａｌ、。 Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１８　：　５２９４−５２９９　（１９７９）およびＭａｎ ｉａｔｉｓ、　ｅｔ　ａｌ、。 Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　１８８−２０９　（１９８２）によって 示されているグアレジニウムイソシアネートフェノール−クロロフォルム法によ って、細胞から総ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡの比率を２６０ｎｍ／２８０ｎｍと して、１．９以上の吸収率と、２０　Ｘ　１０“個の細胞あたり１００μｇ　Ｒ ＮＡの産出率が確認された。 電気泳動を行うために、７５−１００Ｖで２．２Ｍのフォルムアルデヒドを含ん でいる０、８％アガロース・ゲル上で３時間程度培養して、２０μｇのＲＮＡを 分別した。その後、ゲルを６８℃の温度で１時間、ジエチルピロカーボネート処 理水に露出し、その後、ＲＮＡをＨｙｂｏｎｄナイロン薄膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ 　Ｃｏｒｐ、、　ＡｒｌｉｎｇｔｏｎＨｅＡｒｌｌｎ、　ＩＬ、　）に移した。 移送後（３時間）、フィルターをＳＳＣ（ＳＳＣ：　０．１５Ｍ塩化ナトリウム 、１５ｕ＋Ｍ酢酸ナトリウム、１５關クエン酸ナトリウム、ｐＨ７、Ｏ）で二度 すすぎ、マイクロシール・バッグに入れ今。 ７％ＳＤＳ、　５００ｍＭリン酸ナトリウム、１　ｍＭ　ＥＤＴＡを含む緩衝液 、ｐＨ７，２（ハイブリダイゼイション緩衝液）内で、６５℃の温度下、１時間 、予備ハイブリダイゼイションを行った。その後、フィルターをＴＮＦまたはＬ Ｔ　ｃＤＮＡプローブ（特殊活性２ＸＩＯ″ｃｐｍ／μｇＤＮＡ）でハイブリダ イズした。ハイブリダイゼイション後、薄膜をサーモン精液ＤＮＡ　（２００μ ｇ／＋ａｌ　）を含んだハイブリダイゼイション緩衝液内で６５℃の温度で、数 度洗浄した。このフィルターをＫｏｄａｋ　ＸＡＲ−５フイルムに一７０℃の温 度で１−３日間露出した。予備ハイブリダイゼイション、ハイブリダイゼイショ ン、洗浄、そしてフィルター取り出しの連続的なサイクル手順を実行した。エチ ジウム・ブロマイド（ｅｔｈｉｄｉｕｍ　ｂｒｏ＋ｃｉｄｅ）染色後のゲルの検 査と、同じフィルターのアクチンまたはグリセルアルデヒド３−フォスフェート デヒドロジェナーゼ（ＧＡＰＤＨ）のいずれかに関するｃＤＮＡとのリハイブリ ダイゼイションによって、レーンが同じように付加されることが示された。プロ ット分析計ベータスコープ６０３　（Ｂｅｔａｇｅｎ　Ｃｏｒｐ、、　Ｗａｌｔ ｈａｍ、　ＭＡ）を用いて放射能カウントを行うためのフィルターの走査か、走 査密度計（ＨｅｌｅｎａＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｉｎｃ、ＢｅａｕｍｏｎＬ 、ＴＸ）を用いた光学密度用走査オートラジオグラムによって、バンド密度測定 を行った。図１３に示されているように、Ｋ−５６２細胞でＬＴおよびＴＮＦの いずれに関しても、ｍＲＮＡの表現は観察されなかった。さらに、ゲルろ過およ び５ＤＳ−ＰＡＧＥ実験により、オンコインヒビンの分子量がＴＮＦおよびＬＴ のいずれとも異なっていることが確認される。 図１９で、ヒト乳房腫瘍細胞が培地の培養株で急速に成長することが示されてい る。しかしながら、培養株にオンコインヒビンを加えると、これらの細胞の成長 は認められなかった。 これらの細胞の成長を抑止するのに必要な露出時間について判定するために、こ れらの細胞を異なった時間オンコインヒビンに露出した。図２０で、培地からサ イトカインを取り出すと、オンコインヒビンの成長抑止効果が中止された。これ らの結果は、オンコインヒビンの継続的存在の必要性を示唆している。 図２１で、ＭＣＦ−７細胞の形態をオンコインヒビンで措置した後に調べ、　Ｔ ＮＦと比較した。その結果、ＴＮＦとオンコインヒビンがそれぞれ乳房腫瘍細胞 の成長を抑止する方法が異なっていることが示された。ＴＮＦは細胞のラウンド −アップ（ｒｏｕｎｄ−ｕｐ）を誘発し、それが培養皿からの分離を引き起こす が、オンコインヒビンは細胞の拡大、あるいは膨張を引き起こす。 後者は細胞の透過性に対するオンコインヒビンの影響の結果かもしれない。オン コインヒビンはまた、ヒト乳房腫瘍細胞のコロニー形成も抑止する。 オンコインヒビンの安定性に関する研究。オンコインヒビンを有機溶剤（アセト ニトリルまたはメタノール、またはプロパツール）、酸性法ｉ　（ＨＣＩ、トリ クロロ酢酸、または酢酸）、アルカリ性溶液（Ｎａ０１！、水酸化アンモニウム ）、または界面活性剤（ＳＤＳ、　Ｔｗｅｅｎ　１０）で、室温下、２時間処理 して、その後、冷温室で、−昼夜、２０ｍＭ　ｈリス塩酸、ｐＨ８，０で透析し て、生物学的活性についての評価を行った（表■および■）。 熱安定性に関する実験では、オンコインヒビンを異なった時間、異なった温度に 露出して、その生物学的活性を直接判定した。オンコインヒビンの生物学的活性 は８０℃の温度下で６０分間は安定しているが、１００℃の温度に３０分間露出 するとその活性の５０％程度の喪失が観察された（表■）。 表ユ 々のご　でのオンコインヒビンの１、゛・４　６０　２５６　＋００ 表■で、オンコインヒビンをプロナーゼＥ、トリプシン、キモトリプシン、およ びＶ８スタフ・プロテアーゼで処理し、その後、その生物学的活性を分析した。 その結果、オンコインヒビンがプロテアーゼＥで完全に消失できること、したが って、それが蛋白質であることが示された。その活性はトリプシンによる処理に は部分的に影響を受け、キモトリプシンおよびｖ８プロテアーゼには完全に抵抗 性を示すことが認められた。デオキシボヌグレアーゼはオンコインヒビンの活性 には何の影響も示さなかった。 以下余白 １Ｃユ オンコインヒビンの　主に文・する　白　、の−酵−−一襄　１−一一一叉　差 」」ｕ幻］ａな　し　１０％　（Ｗハυ　１００ プロナーゼＥ　１０％（Ｗ／Ｗ）　０．２トリプシン　１０％（Ｗ／Ｗ）　５０ Ｖ８スタフ・プロターゼ　１０％（Ｗ／Ｗ）　＋００キモトリプシン　１０％（ Ｗ／Ｗ）　＋００デオキシボヌクレアーゼ　１０％（Ｗ／Ｗ）　１００オンコイ ンヒビンを種々の酵素と共に、３７℃の温度下で、２０ｍＭ　トリス緩衝液、ｐ Ｈ８，０内で２４時間培養して、その後、１０％血清を追加して反応を中止させ 、オンコインヒビンの活性についての評価を行った。 洗浄剤に対するオンコインヒビンの安定性：オンコインヒビンのサンプルを種々 の濃度のＳＤＳ、負電荷洗浄剤あるいはＴｗｅｅｎ　２０、中性洗浄剤を用いて ２時間処理し、透析し、そして、生物学的活性を評価した。同じ洗浄剤で処理し た胎児血清アルブミンをコントロールとして用いた。これらの実験の結果を表Ｖ に示す。ＳＤＳあるいはＴｗｅｅｎ　２０のいずれかで蛋白質を処理した場合、 生物学的活性の喪失は認められなかった。 ＳＤＳの場合、オンコインヒビンの生物学的活性は用量に比例する形でかなり増 大することが見られた。Ｔｗｅｅｎ　２０の場合、この増大傾向は有意なもので はなかった。 ノい！ 洗浄亙工世膝側ル８−　による　の オンコインヒビンの　−　に・　る 硫酸ドデシルナトリウム　な　し　１９　１０００．０１％　２３　１２４ ０．０５％　４５　２４３ ０．１０％　６１　３３０ ０．５０％　５９　３１９ Ｔｗｅｅｎ−２００，０１％　２４　１３００．０５％　２４　１３０ ０．１０％　１６　８８ 旦旦すよ［ グリシン　ｐｌ（２，００，１Ｍ　２４０　３００酢　酸　ｐＨ２，４１，０Ｍ 　２５６　３２０酢酸ナトリウム　ｐＨ４，００，ＩＭ　８３　１０４酢酸ナト Ｉ功ム　ｐＨ６，ｏ　Ｏ，１Ｍ　７６　９５トリス塩酸　ｐＨ８，ｏ　Ｏ，０２ Ｍ　８０　１００ＮａＨＣＯ，Ｉ）旧０．０　０．ＩＭ　９２　１１．５ＮＨ， ＯＨｐ）＋１１．４　１．０Ｍ　１８５　２３１メタノール　５０％　８１／２ 　＋９８プロパツール　５０％　５６／３　１４０アセトン　７０％　２３７２ ６　１１７エタノール　７０％　５６／４　１４３アセトニトリル　５０％　＋ ５３７４　３７４オンコインヒビンサンプルを種々の試薬で処理し、透析オンコ インヒビンサンプルは２０訃トリス緩衝液、ｐＨ８，０内で、種々の試薬と共に １時間、室温で培養して、その後、−昼夜透析してから、残存している生物学的 活性に関する評価を行った。ＳおよびＰはそれぞれ上澄液とペレットを示してい る。 還元剤に対するオンコインヒビンの安定性：オンコインヒビンを種々の濃度のジ チオトレイトールで２時間処理し、その後、透析して、生物学的活性の評価を行 った。これらの実験の結果を表■に示す。オンコインヒビンの活性がＤＴＴによ る措置に対して不安定であることは明らかである。１ｍＭＤＴＴで処理した場合 、５０％の活性喪失、また、ｌｏｏｍＭ　ＤＴＴで処理した場合は、６７％の活 性喪失が認められた。 ｌユ 々の　に文　るオンコ　ンヒビンの“ ｕｌ−皮　五−一一　盈 還元剤（ＤＴＴ）　２５６　１００ １ｍＭ　１２８　５０ １０ｍＭ　９６　３８ １００ｍＭ　８４　３３ トリクロロ酢酸　５％Ｓｕｐ、　１１　４Ｐｐｔ、　２５６　９６ 硫酸アンモニウム　７０％Ｓｕｐ、１１　２Ｐｐｔ、　５３８　９８ ング肺（ＣＣＬ−６４）細胞に対しては活性を示さなかった。オンし、その後で 、生物学的活性に関する評価を行った。 オンコインヒビンはトリクロロ酢酸および硫酸アンモ二つムによって濃縮するこ とができる。オンコインヒビンを種々の濃度のＴＣＡまたはＮＨ，Ｓｏ、で処理 し、遠心分離して、再懸濁透析し、その後、生物学的活性の評価を行った。表■ に示１結果は、オンコインヒビンのすべての活性が５％ＴＣＡか７０シ（ＳＡＳ ）硫酸アンモニウムによって沈降されることを示している。したがって、これら の結果はまた、オンコインヒビシの蛋白質との結合性をも示している。 アンフイレグリンはフォルボールエステルで処理したＭＣＦ７細胞から分離され 、Ａ４３１細胞の成長を抑止する糖蛋白質である。アンフイレグリンは２２．５ ｋＤａの見かけ分子量をもっている。オンコインヒピンとオンフィレグリンの両 方とも、腫瘍細胞の成長を抑止する。しがしながら、オンコインヒヒンはフォル ボールエステルで処理したＭＣＦ〜７細胞によってＩＪ生産されない。第二に、 オンフィンとピンとアンフィレグリンの両方ともＡ４３１細胞に対して抗増殖性 を示すが（表ｍ参照）、アンフイレグリンはオンコインヒビンとは対照的に、ヒ ト黒色腫（Ａ３７５）　、ヒトの乳房の腺悪性腫瘍（ＺＲ−７５−１またはＭＣ Ｆｉ）、ヒトの肺の腺悪性腫瘍（Ａ−５４９）　、ヒト結朋悪性腫瘍Ｄ（３３４ ７）　、ヒト・リンパ腫Ｔ細胞（ＣＥＭ）　、ヒトＩＢＶ形質転換Ｂ細胞、ヒト 喉頭表皮悪性腫（）Ｉｅｐ２）、仔ウシ胎児心臓内皮細胞（ＣＲＬ−１３９５） 　、マウスＢＡＬＢ／３Ｔ３、およびミコインヒビンの場合と同様、アンフイレ グリンはヒト腺維芽細胞の増殖は刺激する。ヒト腺維芽細胞に加えて、アンフイ レグリンはヒト脳下垂体腫瘍細胞（ＣＲＬ　７３８６）　、ヒト卵巣悪性腫瘍細 胞（ＨＴＢ　７７）　、アフリカ・ミドリザル腎臓細胞（ＢＳＣ−１）、および ラット腎臓細胞（ＮＲＫ）など、いくつかの腫瘍細胞の成長を刺激する。しかし ながら、オンコインヒビンの分子量はアンフイレグリンの分子量とはかなり違っ ており、後者の成熟した形態は８４アミノ酸長蛋白質である。 オンコインヒビンは２．０−１０．０のｐＨ領域で、酸性およびアルカリ性の両 方の状態に対して安定している（表■参照）。 ＩＦＮ−α、　ＩＦＮ−β、　ＩＩ、−２、ＩＬ−４、ＩＬ−８、Ｃ３Ｆ−１、 ＧＭ−Ｃ５Ｆ、　ＴＧＦ−β、コンスタンチンＭ、およびアンフイレグリンなど 、いくつかのサイトカインはｐ１］２でも安定性を示すことが報告されている。 コンスタンチンＭ、アンフイレグリン、Ｃ３Ｆ−１およびＩＬ−４はアルカリ状 態（ｐＨ１２）に対しても安定性を示す、二とが確認された。最近、分子量６　 ｋＤａ程度の蛋白質である類脂質溶解促進因子（ＬＰＦ）がＡ３７５骨髄腫細胞 株から分離されたが、これは９６℃で１０分間の加熱、プロテアーゼＫ（１０Ｍ ｇ／ｍｌ）　、トリプシン、プロナーゼ、ＲＮａｓｅ、　ＤＮａｓｅおよび過ヨ ウ素酸塩による酸化に対して安定性を示す。ＬＰＦは生物学的活性をまったく伴 わずに、トリクロロ酢酸（１０％）で沈降させることができる。オンコインヒビ ンは８０℃での３０分間の加熱に対しても安定していることが確認され、１００ ℃の加熱で、活性の一部だけが失われた（表■）。オンコインヒビンをトリプシ ンｌＯ％（Ｗ／Ｗ）で３７℃の温度下、２４時間処理したところ、生物学的活性 の一部が失われた。これはＣ３Ｆ−１、ＧＭ−ＣＳＦおよびＬＴで観察されたこ とと同様である。オンコインヒビンの生物学的活性は０．５％ＳＤＳに対しても 安定であった。 オンコインヒビンは、ＴＫＦが塩基性蛋白質（ｐｉ　８−９．０）であり、ゲル ろ過による見かけ分子量が５６ｋＤａであり、０．４Ｍα−メチルマンノシドを 用いてコンコナバリンＡ−セパロースから分離できる点で、ヒト・マクロファー ゼーモノサイト・ハイブリドーマから分離されるサイトカインである腫瘍致死因 子（ＴＫＦ）とは異なっている。 オンコスタチンＭはフォルボールエステルで処理したＵ−９３７細胞から分離し たサイトカインで、チミジン取り込み検定で、ヒト骨髄腫細胞株Ａ３７５の成長 を抑止する。刺激を与えないＵ−９３７はこの遺伝子を表現せず、こうした活性 を示さない。フィトヘマググルチニンで活性化したヒト抹消向Ｔリンパ腫はこの 遺伝子を表現し、またこうした活性を示す。オンコスタチンＭは５ＤＳ−ＰＡＧ Ｅで測定して２８ｋＤａ、またゲルろ過で測定して！８ｋＤａの分子量を有する 糖蛋白質である。これはＴＧＦ−βとは相乗効果を発揮するが、インターフェロ ンとは相乗効果を示さない。オンコスタチンＭはＨＴＢ　１０神経腫瘍細胞、Ａ −５４９肺悪性腫瘍細胞と、Ａ３７５およびＳＫＭＥＬ−２８骨髄腫細胞の成長 を抑止することが示されているが、Ｌ−９２９細胞の増殖は抑止しない。対照的 に、オンコインヒビンはフォルボールエステルの存在している状態と、存在して いない状態との両方でに一５６２細胞によってつくりだされる（　Ｕ−９３７細 胞ではつくりだされない）そしてＬ−９２１細胞に影響する。さらに、オンコイ ンヒビンとは対照的に、オンコスタチンＭはＡ３７５細胞に対しては比較的弱い 成長抑止性しか示さない（図１４）。 形質転ｍ成長因子ｆｊ　（ＴＧＦ−β）　ハ５ＤＳ−ＰＡＧＥ上テ分子量２５ｋ Ｄａのホモ２量体であり、ヒト血管表皮細胞、ＴおよびＢリンパ腫を含むいくつ かの種類の表皮性および腸間膜由来の細胞株の成長を抑止するサイトカインであ る。Ａ−５４９、ＭＣＦ−７細胞もａｕｔｏｃｒｉｎｅ的形態でＴＧＦ−βによ って、その成長が抑止された。しかしながら、オンコインヒビンの場合とは違っ て、ＴＧＦ−βは血小板、骨質、リンパ球など広範な細胞によってつくりだされ 、その作用を調べる前に、酸活性化を必要とする。 加えて、ＴＧＦ−βは還元状態下で、５ＤＳ−ＰＡＧＥ上で１２．５ｋＤａの分 子量を有している。 サイトカインＥＬＩＳＡ検定：オンコインヒビン調剤における公知のサイトカイ ン（ＴＮＦ、　ＬＴ、　ＩＬ−１、ＩＬ−６およびＩＬ−８）の存在を調べるた めに、市場で入手できる（Ｒ＆Ｄ　５ｙｓｔｅａ＋）定量的「サンドウィッチ」 酵素免疫検定手法を用いた。この会社が提示している標準的な手順を用いた。簡 単に言うと、種々のサイトカインに特殊性を発揮するモノクローナル抗体をマイ クロタイター・プレート上にコートして、−昼夜放置し、抗体を不活性化した。 その後、サンプルをピペットでウェルに入れ、サイトカインがあった場合、不活 性化された抗体で捕らえた。結合していないサンプル蛋白質を洗い流した後、特 定のサイトカインに特性を示す酵素結合ポリクローナル抗体をウェルに加えて、 最初の培養で結合されていたサイトカインと結合させた。結合していないポリク ローナル抗体−酵素試薬を除去するために洗浄を行った後、基質溶液をウェルに 加えたところ、最初の段階で結合したサイトカインの量に応じて、色が発生した 。テストされたサンプルと共に、公知のサイトカイン濃度標準を用いて、一連の ウェルを作成した。光学密度とこれらの標準ウェルにおけるサイトカイン濃度の 関係を示す曲線が、これらサンプルの光学密度とこの標準曲線との比較によって 作成された。その後、未知のサンプルのサイトカインの濃度を計算した（表Ｖ） 。 インターロイキン−１は活性化モノサイトおよび線維芽細胞によってつくりださ れるサイトカインであり、分子量は１７ｋＤａ、卵巣悪性腫瘍、Ａ３７５骨髄種 、Ｋ−５６２およびある種の乳房腫瘍細胞株を含む腫瘍細胞株の成長を抑制する 。しかしながら、オンコインヒビンはその供給源、分子量、および腫瘍特殊性に おいてインターロイキン−１と違っている。オンコインヒビンの粗製剤を、ＥＬ ＩＳＡでＩＬ−Ｉの存在に関して調べた。 表Ｖに示す結果は、我々の調製したオンコインヒビンにはＩＬ−１蛋白質は含ま れていない。 インターロイキン−６はいろいろな種類の刺激へ反応して、広い範囲の種類の細 胞によってつくりだされるサイトカインである。特に、ＩＬ−６も、通常のヒト 線維芽細胞、Ｕ−９３７、ヒト骨髄腫細胞株Ａ３７５、ＲＰＭＩ−７９５１など によってつくりだされる。ＩＬ−６は骨髄性白血病、および乳房悪性腫瘍細胞株 の成長を抑止する。供給源、誘発方法、および腫瘍細胞標的特性に基づいて、Ｉ Ｌ−６はオンコインヒビンのものとは異なったサイトカインのようである。さら に、通常オンコインヒビンの標的として用いられるＭＣＦ−７細胞はインターロ イキン−６の影響は受けないようである（図１６参照）。また、オンコインヒビ ンとは対照的に、ＩＬ−６は通常のヒト線維芽細胞の成長を抑止することも認め られた（図１５）。 ５ＤＳ−ＰＡＧＥで分子量が２０−２５ｋＤａの範囲のサイトトキシンであるイ ンターフェロン−γは種々のミトーアンで活性化された場合Ｔ−リンパ球によっ てつりだされ、ある腫瘍の腫瘍細胞株の成長を抑止する。このサイトカインは酸 性領域のｐＨに対しては非常に敏感である。オンコインヒビンはその供給源、誘 発方法、およびｐＨ安定性がインターフェロン−γとは異なっている。インター フェロン−γはまた、ヒト線維芽細胞に対する影響においてもオンコインヒビン とは異なっている。 オンコインヒビンＴＮＦ−誘発線維芽細胞の増殖を促進するのに対して、インタ ーフェロン−γはそれを抑止する（図１８）。 さらに、インターフェロン−γにはオンコインヒビンの活性を低下させず、かえ ってそれを強化する（図１７）。 したがって、本発明は広範な抗腫瘍性作用を示す新しいサイトカインを提供する ものである。このサイトカイン、つまりオンコインヒビンはヒトの赤芽球腫細胞 によって分泌され、５ＤＳ−ＰＡＧＥでの分子量は２８ｋＤａ程度である。オン コインヒビンの生産はフォルボールエステルが存在していると、増進されるよう である。オンコインヒビンはまた、広範な物質に対して安定性を示し、また、広 いｐ＋１領域と、高温に対しても安定している。 その多様な抗腫瘍活性から、オンコインヒビンは悪性腫瘍およびリンパ腫を３む 多様な腫瘍性疾患の治療に用いることが考えられる。オンコインヒビンは、薬学 的に受け入れ可能な基質を含む医薬品組成物の一部としてヒトおよび動物に投与 することも可能であろう。その多様な抗腫瘍活性から、オンコインヒビンは腫瘍 性疾患の再発の防止においても有益であろう。加えて、腫瘍性細胞を有するホス トへのオンコインヒビンの投ｌすは、そうしたホストの生き残り時間を延長する 可能性もある。また、腫瘍性細胞は、インビトロで、つまり、腫瘍性細胞を含む 骨髄の措置と治療において、オンコインヒビンによって措置することも可能であ ろう。ここに述べたような腫瘍性細胞の治療法は従来の癌化学治療において良く 知られており、したがって、当業者は、過度に実験を繰り返さなくても、オンコ インヒビンの適当な用量、および投与経路について判断することができるであろ う。 オンコインヒビンはまた、新しい免疫調節子としても有益である可能性がある。 オンコインヒビンは腫瘍細胞を殺すリンパ球、モノザイト、そしてニュートロフ ィルを活性化する。 加えて、オンコインヒビンは成長因子として臨床的な有用性を示す可能性もある 。オンコインヒビンは通常の細胞の成長を促進する。 結論として、本発明およびここに開示されている本願に述べられている目的と課 題の達成によく適合している。本発明の精神と範囲を逸脱せずに、方法や装置に 一定の修正を加えることは可能である。また、変更が可能であり、さらに、申請 される請求項に述べられている各要素またはステップは基本的に同じ、あるいは 同様の方法で基本的に同じまたは同様の結果を達成するための、すべての同等の 要素またはステップにも適用されるものである。本発明はその原理が適用可能な あらゆる形態で適用されるものとする。したがって、本発明は上にのべた課題と 目的の達成と利点の提供、およびそれらと本質的に関連する課題および目的の達 成、および利点の提供に良く適合している。 （％） （％） １：６４　１：３２　１：１６　１：８　１：４　１：２１：５１２１：２５６ １：１２８１＝６４に８２１：１６１＝８１：４１：２ＦＩＧ、　５ （ＣＶ；　Ａ３７０　ｎＭ） Ｇｕｍ／ｎ’１１Ｐ、ＩＥ　） （′［ｕＩＰ） ＭＷＳＭＩ　２．　３　３　２　１ＳＭＦＩＧ、　８ ＴＮＦ　ＬＴ ３°　ＦＩＧ、　１３ ＦＩＧ、　９Ｂ ＴＮＦ ＮＦ ＴＮＦ ＴＮＦ ＴＮＦ ＮＦ ＴＮＦ ＴＮＦ （％） （％） １：６４　１；３２　１：１６　１：８　１：４　１：２（Ｕ／ｍｌ） ０　１：６４　１：３２　１：１６　１：８（υ／ｍ１） ＦＩＧ、　１７ ＮＦ フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｐ　２１１００ 　Ｋ　９２８２−４Ｂ／／（Ｃ１２Ｐ　２１１００ Ｃ１２Ｒ１：９１） Ｉ

Claims (26)

【特許請求の範囲】
1. １．ヒト赤芽球細胞によって分泌される蛋白質で、分子量が２８，０００ｋＤａ 程度、そして、抗腫瘍活性を示す蛋白質を含む組成物。
2. ２．該蛋白質が基本的には不純物を含んでいない請求項１の組成物。
3. ３．該蛋白質の生産がフォルボールエステルによって促進される請求項１８の組 成物。
4. ４．該蛋白質がオンコインヒビンに関する標準検定で活性を示し、ＳＤＳ−ＰＡ ＧＥによって基本的に均一である請求項１の組成物。
5. ５．該蛋白質が約２から約８のｐＨ領域で安定しており、さらに、約４℃から約 １００℃の温度範囲で安定している請求項１の組成物。
6. ６．悪性腫瘍、およびリンパ腫で構成されるグループから選択される疾患を措置 するための請求項１の組成物の使用。
7. ７．悪性腫瘍を治療するための、そして上記悪性腫瘍が、乳房悪性腫瘍、黒色腫 、子宮頚悪性腫瘍、卵巣悪性腫瘍、および肝臓癌で構成されるグループから選択 される請求項１の組成物の使用。
8. ８．ヒト赤芽球細胞を培養するステップと、オンコインヒビンを誘発させるステ ップと、そして条件づけられた細胞上澄液を採取するステップとで構成される、 ヒト・オンコインヒビンの調製する方法。
9. ９．さらに、その上澄液を濃縮するステップを含んでいる請求項８の方法。
10. １０．請求項８の方法によって調製されたヒト・オンコインヒビン。
11. １１．さらに、フォルボールエステルでオンコインヒビンの生産を増進するステ ップを含む請求項８の方法。
12. １２．該赤芽球細胞が細胞株Ｋ５６２からのものである請求項８の方法
13. １３．該細胞がＲＰＭＰ培地で培養される請求項８の方法。
14. １４．オンコインヒビンの生産が血清を含まない培地で誘発される請求項８の方 法。
15. １５．さらに、薬学的に許容可能な担体を含む請求項１の医薬品組成物。
16. １６．請求項１５の組成物を有効な量だけ投与するステップを含む腫瘍細胞を措 置するための方法。
17. １７．上記腫瘍細胞が、リンパ腫、乳房悪性腫瘍、黒色腫、子宮頚悪性腫瘍、卵 巣悪性腫瘍、および肝臓癌で構成されるグループから選択される請求項１６の方 法。
18. １８．該腫瘍細胞がヒトまたは動物の体内で発生する請求項１６の措置法。
19. １９．該組成物が種瘍状態の再発を防ぐ請求項１６の措置法。
20. ２０．該組成物が該腫瘍細胞のホストの生き残り時間を延長する請求項１６の措 置法。
21. ２１．該腫瘍細胞がイン・ビトロである請求項１６の措置法。
22. ２２．ヒト・オンコインヒビンを含む条件づけられた細胞上澄液を限外ろ過する ステップと、 限外ろ過された上澄液を透析するステップと、ＤＥＡＥアフィゲル・ブルー・ク ロマトグラフィーを実施するステップと、 ナトリウムドデシルスルフェートーポリァクリルァミド・ゲル電気泳動を実施す るステップと、そして逆層高性能液体クロマトグラフィーを実行するステップ とで構成されるヒト・オンコインヒビンを精製する方法。
23. ２３．請求項２２の方法で調製されたヒト・オンコインヒビン。
24. ２４．ヒト・オンコインヒビンを含む、腫瘍細胞を殺すリンパ球、モノサイト、 およびニューロフィルを活性化するための免疫調節子。
25. ２５．ヒト・オンコインヒビンを含む、正常の細胞の成長を促進するための成長 因子。
26. ２６．該正常細胞が線維芽細胞である、請求項２４の成長因子。