JPH021544A - 生物学的試験に用いる方法と装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は生物学的試験、特に適当に調製したＤＮＡ、Ｒ
ＮＡまたは蛋白質サンプル内に含まれる特定の巨大分子
の存在を明らかにするために用いる「ブロツチング（ｂ
ｌｏｔｔｉｎｇ）」として知られる方法に関連した生物
学的試験に用いる方法と装置に関する。

プロッチングとは、分離ゲルからＤＮＡ。

ＲＮＡまたは蛋白質を通常は膜としての固体サポートに
移すために用いる特定の方法に与えられた名称である。

調製したサンプルから電気泳動によって巨大分子を分離
する、すなわち電流を用いてサンプル中のフラグメント
を分離し、フラグメントの長さまたはサイズに基づいて
分離ゲル中の種々な間隔を置いた位置に分配する。

アガロースゲルからニトロセルロース膜へのＤＮＡ転移
方法はサザン（Ｓ　ｏｕｔｈｅｒｎ）（１９８５年）に
よって述べられており、現在「サザンプロット法」と呼
ばれている。このアプローチのＲＮＡ転移への拡大（「
ノザンプロット法」アルヴイン等。

１９７９年）と蛋白質転移への拡大（「ウェスタン・プ
ロット法」トウビン（Ｔｏｗｂｉｎ）等、１９７９年）
が充分に確立されている。

サザンが述べている方法（１９７５年）はゲルからニト
ロセルロースへＤＮＡを移すことによって、ゲル中のＤ
ＮＡフラグメント・パターンのニトロセルロース膜への
レプリカを製造するために、アガロースゲルとニトロセ
ルロース膜から吸着性ペーパー・スタックへの塩溶液の
毛細管拡散を利用している０例えば放射能によって適当
に標識した、研究中の核酸系列に対して特異的なプルー
プをこの場合にニトロセルロース膜上のＤＮＡにハイブ
リッド化する。このプルーブは相補的系列を含むフラグ
メントに結合し、次のニトロセルロース膜のオートラジ
オグラフィーが研究中の核酸系列を含む、最初のサンプ
ル中のＤＮＡフラグメントのみを表す帯のパターンを明
らかにする。

サザン・プロット法の広範囲な使用が本来のサザン法の
変形である多くのプロット法の発表をもたらしている。

ナイロン膜［ボール（Ｐａｌｌ）。

１９８０年］または化学的に改質したもしくは活性化し
たペーパー［例えばノイエス（Ｎ　ｏｙｅｓ）とスター
ク（Ｓ　ｔａｒｋ）　１９７５年；シード（Ｓｅｅｄ）
。

１９８５年］をニトロセルロースの代りに、ＤＮＡまた
はＲＮＡの保持に用いることができる。

本来の塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム溶液（ＩＯ
ＸＳＳＣ）の代りに、例えば水酸化ナトリウム［リード
（Ｒｅｅｄ）とマン（Ｎａｎｎ）　１９８５］、酢酸ア
ンモニウム［スミス（Ｓｎｉｔｌ＋）とサマーズ（Ｓ　
ｕｍｍｅｒｓ）　、　１９８０年］またはリン酸塩１ａ
ｕｙｒ剤のような、広範囲なトランスファー溶媒が用い
られている。

ＤＮＡの毛細管拡散転移はゲルと転移膜とからの溶媒の
取出しに真空を適用することによって［ベフエロエン（
Ｐｅｆｅｒｏｅｎ）等、１９８２年］または溶媒の押出
しに重いおもりを用いることによって助成される。

分離ゲルから膜への巨大分子の転移は電気泳動プロット
法を用いても促進される０分層した巨大分子を含む適当
に処理したゲルを膜と接触させて、本来の分層方向に対
して適用電流が９０度をなすように電極間に挿入すると
、巨大分子が最初の分離で得られたパターンを維持しな
がら膜に移される。

電気泳動プロット法（電気泳動トランスファーまたはエ
レクトロブロッチングとも呼ばれる）は蛋白質をゲルか
ら膜上に移るために最も一般的に用いられる手段である
。この方法による転移は拡散法または毛細管法よりも効
果的であり、帯の拡散が少なく生ずる。蛋白質の電気泳
動プロット法は、蛋白質が低イオン強度の溶液中のニト
ロセルロースに結合するので、可能である。核酸は高電
流を生ずる従って過熱を生ずるような条件下でニトロセ
ルロースに結合するにすぎないが、ＤＮＡは低い塩条件
下で誘導体化ニトロセルロースまたはナイロン膜に電気
プロットされる。電気プロッチングの装置と方法は商業
的に入手可能である。

現在用いられている電気プロツチングは幾つがの不利な
特徴を有している。電気泳動による初期分間と、電気泳
動による次の移動のために別々の装置が必要であり、電
気泳動後にゲルを製造し、取ｎける方法が不便であり、
比較的熟練した、労力集中操作である。核酸の場合には
、ゲル製造が２〜３時間を要し、ゲル処理と転移ＭｖＲ
溶液中での最終的なゲル平衡化とによるＤＮＡの脱プリ
ンと変性を含む、蛋白質と核酸の両方の電気転移（ｅｌ
ｅｅｔｒｏｔｒａｎｓｆｅｒ）のためには、ゲルをフィ
ルター膜に均一に接触させて全ての気泡を完全に除去す
るために、フィルター膜に密接に接触させなければなら
ない、このような均一な接触は経験ある実酸者によって
容易に達成されるが、自動化は困難である。

本発明は巨大分子の電気泳動分離と電気泳動転移との間
でゲルを処理または調製する必要性を省くことを目的と
する。

本発明の方法では、サンプル中に含まれる巨大分子を電
気泳動によって最初に分離し、次に電気泳動によって膜
上に転移させるが、この際にゲルまたは膜の処理または
移動を行わない。プレキャスト・ゲルを用いることがで
きるが、ゲルを電気泳動の前に膜上に注入することが好
ましい０本発明の１実施態様では、巨大分子の分離と転
移とを単一ｕＩ画液中で実施することができる０本発明
の池の実施態様では、ＤＮＡの分層と転移が転移後に膜
上で変性する二本鎖ＤＮＡによって実施される。

ＤＮＡの場合には、ＤＮＡを異なる長さのフラグメント
に切断して、これらのフラグメントをサイズに基づいて
電気泳動の第１段階で分離するために、ＤＮＡを１種類
以上の制限酵素によって処理する。

本発明の成果は、ゲル電気泳動とプロッチングの全過程
を転移膜またはゲルを動かすことなく、または溶液を変
えることなく、単に２対電極を連続的に結合することに
よって実施できることである。プロッナングの自動化が
本発明によって促進され、電子タイマーと切換え装置を
加えることによって達成されることは明らかである。

本発明は本発明の方法の実施装置をも提供する；前記装
置は前記膜とゲルとから成るサンドイッチ横遺体を取付
ける手段；ゲル中のサンプルに含まれる巨大分子を分す
るように操作可能な第１方向の第１電流を供給する第１
電極手段；及びゲル内で分離された巨大分子を膜上に転
移させるための第１方向を横断する第２方向の第２電流
と供給する第２電極手段から成る。前記第２方向は第１
方向の面に対して突貫的に直角であることが好ましい。

本発明の実施態様では、サンドイッチ構遺体を膜から成
るサンドイッチ構造体面を支持する多孔質材料の硬質プ
レートによって支える。このような硬質プレートの使用
は膜をプレートの上部に置くことを可能にし、適当な壁
によって縁の周囲を限定して、膜上にゲルを直接注入す
ることを可能にする。ゲル／膜すンドイッチ構遺体は垂
直方向に配向することができるが、以下で述べるような
特定の形状の装置では、硬質多孔質プレートが使用時に
一最に水平であり、膜を最初に挿入する浅いトレーの底
部を形成し、この後にトレー中にゲルを注入する。次に
、２段階電気泳動操作を実施するために、トレーを適当
な＃ｌＩｉ液中に浸せきする。

このような装置の使用時には、第１電極手段に最初に電
圧を印加する手段を設けて、前記第１電流を供給して、
通常はゲルの片面に存在する孔中に含まれる、適当に調
製したサンプル中の異なる長さのフラグメントをゲル中
に分離し、フラグメントをサイズに応じてゲル中に分離
する。第１段階の終了時に、第１電流を切り、第２電極
手段に電圧を印加して、第２電流を与えてゲル中のフラ
グメントをゲルから膜へ移し、フラグメントは膜上にゲ
ル上のフラグメントのパターンを再現するように置かれ
る。

電気泳動に用いる電極は、例えば白金製のプレート、単
一ワイヤー、複数ワイヤーまたはワイヤーのグリッドの
形状をとりつる。

硬質多孔質プレートは電場に対するゆがみを避けるため
にハネカム構造を有することが有利であるとしても、電
気的多孔質（ｅｌｅｃｔｓｏｐｏｒｏｕｓ）である必要
がある。このことは以下でさらに詳細に説明する。孔質
プレートはゲルの側面からのサンプルの損失を妨ぐため
に、大きい分子に対して不透過性であることがさらに有
利であることがわかる。

本発明の１実施悪様では、第１プレートに対して平行で
はあるがゲル／膜すンドイッチｔｉ遺体の反対側に、前
記硬質多孔質プレートの第２プレートを設ける。除去可
能なこの第２プレートは、ゲルと膜を密接に接触させて
維持するために用いられ、これによって電極を支持し、
電極をゲルから間隔をおいて保持することができる０両
方の硬質多孔質プレートは使い捨て可能な性雪である。

フィルター膜は例えば核酸に対してはナイロン、蛋白質
に対してはニトロセルロースのような、適当な多孔質材
料製である。

上述したように、ゲルはプレキャスト形で提供されるか
、その場で注型することができ、後者の方法の方が多く
の利点を有する。アガロースゲルの注型（Ｃａｓｔｉｎ
ｇ）は簡単であるが、ポリアクリルアミドゲル（蛋白質
の電気泳動に用いる）の注型は異なるアプローチを必要
とする。１つの問題はポリアクリルアミドゲルが膜の孔
に浸透する傾向があるため、転移後の収出しが困難であ
ることである。この問題は例えばセルローズ・トリアセ
テート製の特別な膜をゲルと膜の間に挿入することによ
って克服される。このことは注型中のポリアクリルアミ
ドのゲル化を停止させる効果を有するが、次の分離また
は転移を妨害することはない。これに代りうる配置では
、ゲルをその多孔質支持プレート上に直接入れ、膜を下
部多孔質プレートとゲルとの間に差し込む代りに、ゲル
の反対面に貼布する。この場合には、ゲル内の分離巨大
分子は下部多孔質プレートの方向へではなく、下部多孔
質プレートとは反対方向に転移する。

本発明をさらに充分に理解するために、その２実施態様
を単に例として、添付図面を参照して説明する。

図面を参照すると、電気泳動装置はパースベクス（Ｐ　
ｅｒｓｐｅｘ）　’ｆＪの一最に角タンク１を含む。こ
のタンクは底部２、側壁３及び端壁４を有する。タンク
内部の中央部分はタンクの幅を完全に横切って伸びる突
起５を有し、それによってタンクはそれぞれ電気泳動電
解質溜めを形成するコンパ−メントロ、７に分割される
。各タンクには電気泳動分屋のために白金電極８を備え
、電極は各端子（図示せず）によって外部回路（これも
図示せず）に連結する。

突起５はタンクの底部２と共に下部室９を形成し、下部
室っけ底部２に固定され端子によって外部回路（図示せ
ず）に連結する、電気泳動転移のための白金型ｆｆ１２
０を含む、突起の上面は装置使用中は図示したように水
平であり、多孔質材料製硬質プレート１１から形成され
る。このプレートは妥当に液体不透性の連結を形成する
ために縁周囲に設けられた適当なフランジによって支え
られる。

４１［１のバースペクスブロック１３〜１６がプレート
周囲に、図示するように、ブロックの縁をやや重複して
配置される。これらのブロックは共に、その底部として
プレートを含む浅いトレー１７を限定する。ブロックは
ボルトのような適当な手段によって適所に固定すること
ができるが、明白であるように要素の組立てを可能にす
るために収りはずし可能でなければならない。

代替構造（図示せず）では、ブロック１３〜１６の代り
に、ブロック１３と１４が占める（立置に等しい両端を
有し、外縁すなわち電極８に面する縁において最も高い
、傾斜の小さい孔を堀削した、長方形のパースベクスを
用いる。これらの孔は電流の通過を可能にし、パースベ
クスの長方形を適所に留めて、系の便利性を高めること
を可能にする。これらのブロックまたはパースベクスの
長方形はアガロースゲルの注型に適しているが、−ｍに
用いられるポリアクリルアミドゲルに対しては適切では
ない。ポリアクリルアミドゲルにより良好に適し、装置
デザインに組入れられる系は第３図と第４図に認められ
る、これについては後に詳述する。

電気泳動転移のために用いる第２白金電極２１は、バー
スベクスフレーム２２に収ｆ寸ける第２多孔質プレート
２３の表面に取付ける。電気泳動分離中は存在する必要
のないこの電極は端子を介して外部回路（図示せず）に
連結する９図示した装置では、電極２１分りやすさのた
めに、プレート２３から分離しているように示す、しか
し、我々は現住宅Ｆｉｉ２１をプレート２３上で直接支
えるが、プレート上部の上方に電極２１を高めることが
有利であると考えられる。

この装置を核酸ゲルに用いるためには、ブロック１３〜
１６を最初に除き、適当な転移膜（図示せず〉を多孔質
プレートの上部に置く、膜は、適当な孔が存在するなら
ば、ブロックの収ｆ寸けに用いるスタッド（図示せず）
上に配置する。膜はプレートの実質的に全表面を被覆し
、その１部は確実にブロックを超えて露出されなければ
ならない。

適当な電気泳動ゲル層を膜の上部に置き次にブロック１
５．１６を元の位置に置くこともできるが、アガロース
ゲルに対して確実に有用である、より良好な方法は膜の
設置後に全てのブロックを元の位置に戻してから、液体
としてのゲルをブロックによって液体を限定しながら直
接膜上に注型することができる。アガロースゲルは空気
と接触すると気泡を含まない密接な′ｙｌＡ／ゲル界面
を形成するが、これは必要に応じて分離することができ
る。

ゲルの注型中に、マルチツース・コーム（図示せず）を
トレー１７中に懸吊して、トレーの１端すなわち端部１
８に接近した孔ラインを限定する。

コームを除去した後に、孔はゲルの上面に開口した、カ
ップ状凹みの形となり、被検サンプルの受容に用いられ
る。この方法は技術上周知であるもので、これ以上説明
しない。

このようにして装置をセットした後に、２コンバーメン
トロ、７に電気泳動電解質を充てんし、電８１１ｉ８を
適当な電源に連結することによって電気泳動を開始する
。コンパーメントはブロック上面のすぐ上のレベルまで
充てんするので、両方の溜めは突起５の上方の薄い液層
を介して実際に液中連絡する。ゲル上面に形成した孔に
サンプルを導入し、分雛電ｆ！８に電位を与えることに
よって分離泳動を開始する。ブロック１３．１４がこの
ときに適所に存在するならば、電気泳動の開始前に除去
すべきであり、フレーム２２と電極２１も同様に除かな
ければならない。

分離電気泳動の終了時に、電源を電極８から取去り、バ
ースペクス・ブロック１３．１４を元に戻し、電極２１
、フレーム２２及びプレート２３から成る転移構造をブ
ロック１３〜１６の上部の適所に配置する。

電気泳動転移を開始する前に、電気泳動電解質が電極２
１の上方に存在することを保証する必要がある。電源を
転移電極２０．２１に連結すると、陰性に荷電した巨大
分子がゲルを通って陽極２０方向に移動し、ゲル内のパ
ターンに一致するパターンで膜上に保持される。電気泳
動転移は約２００■または２００ｍＡにおいて１５〜１
８０分間実施する。正確な電気泳動条件はゲルの組成、
割合及び厚さに応じて変動するが、慣習的な商業的電気
転移装置と同じような条件の変化が可能である。

電気的転移後に、パースペクス・ブロック１３〜１６、
フレーム２２、多孔質プレート２３及び転移電極２１を
装置から除去し、ＪＢＩ／ゲル楕遺体の取出しを可能に
する０次に膜をゲルから分離し、適当に処理する。ＤＮ
Ａの場合には、膜上のＤＮＡを変性させて、次のハイブ
リッド形成をＤＮＡが受けやすいようにする条件に膜を
さらすことができる。

系の作動を示したが、電極２０．２１の位置は最適化さ
れているわけではない；電極をゲルから等距離に配置す
ると分解能をやや高めることができる。

次に、核酸の分薄と転移のためのこの装置の使用例を説
明する。

電気泳動の作用は充分に知られているので、ここでは詳
述しないことにする。一般的に述べると、孔に導入した
ＤＮＡサンプルに対して、ＤＮＡを１種類以上の制限酵
素との反応によって切断して、梯々な長さのフラグメン
トを形成する。電気泳動の作用はこれらのフラグメント
をそのサイズに基づいて分離して、ゲルに沿って陽極方
向に移動する帯のパターンを形成することである。

ナイロンまたはニトロセルロース膜上のＤＮＡの変性は
、膜をアルカリ性溶液に浸せきすることによって達成さ
れる。ハイボンド（Ｈｙｂｏｎｄ）　Ｎに吸取らせたＤ
ＮＡを用い、０．５Ｍ　Ｎ　ａｏ　Ｈに５〜１０分間浸
せきする場合には、１．５Ｍ　ＮａＣ１が最適であるが
、２本鎖ＤＮＡのハイブリッド形成力の改善がアルカリ
条件と塩条件の範囲内での種々な時Ｉｎ後に観察される
。フィルター膜を０．５Ｍ　）リス（ｐ＋−１７，４）
　、０．９Ｍ　　Ｎ　ａＣｌ中に２〜３分間浸せきする
ことによって、アルカリが中和される。

風乾し、焼成するまたは擦準方法によるＵ、Ｖ。

照射による架橋によってＤＮＡを固定させ、通常のハイ
ブリッド形成及びオートラジオグラフィー処置を行うこ
とができる。

以下では、すでにフラグメント化したＤＮＡサンプルの
分析に装置を使用する場合に必要な段階と得られた結果
を説明する。

１）　　　ロースゲルの　　ロン　　　　へのハイボン
ド１ＭＮナイロン膜［孔度０．４５μｍアマ−ジャムイ
ンターナショナル（Ａｍｅｒｓｌ＋ａｍ　　ｃｌｎｔｅ
ｒｎａｔｉｏｎａｌ）］を適当なサイズに切断して、多
孔質プレート１１上の適所に配置する。膜の縁をゲルの
側面に対して型として作用する４個のパースペクスブロ
ック１３〜１６によってシールした。（下記参照）。

アガロース［シグマ（Ｓｉｇｍａ）、タイプ１１］を１
／２ｘＴＢＥ作用１１ｉｆ液（１／２．Ｔ　Ｂ　Ｅは４
５ｍＭ）リスＨＣＩ　　ｐＨ８，３，４５鍮Ｍホウ酸塩
、１．２５ｓＭＥＤＴＡである）中に０．８％まで沸と
うによって溶解させる。溶液を６５℃に冷却し、このア
ガロース溶液を乾燥した膜の中心に徐々に注入すること
によって、５１１１１厚さのゲルを注型する。アガロー
スの注入につれて膜は濡れ、多孔質プレートとの均質な
接触を形成するアガロース溶液をゆっくりと注入すると
、ゲルと膜との間及び膜とプレートとの間に気泡が確実
に形成されないことになる。

この代りに、アガロースを濡れた膜上に注入することも
できるが、膜の下の気泡を細心に確実に除去することが
重要である。

孔の底がナイロン膜の２１上方になるように、コームを
ゲル中に配置する。アガロースを室温に冷却させる。

２）　　　　の　　　′ コーノーをゲルから取り出し、電気泳動条件液（１／２
ｘＴ　Ｂ　Ｅ　）をマーカー染料としてのブロモフェノ
ールブルーとキシレンシアツールまたはオレンジＧと共
に加える。ゲルをランする前にパースペクスブロック１
３と１４を装置から除去しなければならない、ＤＮＡの
電気泳動は分離電極８を電源に連続することによって、
１〜ＩＯＶ／ｃｍにおいて２〜１６時間実施した。

３）　　　の、　・、　− 核酸の分離が終了した時に、電源を分離電極から除去し
、ブロック１３．１４及びフレーム２２、プレート２３
及び転移電極２１から成る構造体を適所に配置した。電
源を電極２０（陽極）と２１（陰極）に連結し、核酸を
１００〜２００Ｖ。

２００ｍＡにおいて３０分間電気転移させた。

４）　す　ロン　　　のＤＮＡの ブロック１３〜１６及びフレーム２２とプレート２３と
電極２１とから成る構造体を装置から除去して、ゲルと
膜を放出する。ｊ漠をゲルから分Ａ１し、０．５Ｍ　Ｎ
ａＯＨ，１，５Ｍ　ＮａＣ１’　　の溶液の表面上に１
０分分間−た０次に膜を１．５Ｍ）リスｐＨ７，４゜０
．９８　　ＮａＣｌの溶液の表面上に２分間宣く。

膜を２分間風乾し、次に紫外線トランスイルミネーター
（ＵＶ波長３０２〜３０５ｎｍ）上でのＵ、Ｖ、照射に
暴露させることによってＤＮＡを架橋する。

５）ハブ 一ジ　　−フ アマ−ジャム　インターナショナルの迅速ハイブリッド
形成系ＲＰＮ１５０３のプロトコールに従って：Ａ製し
て用いるプループによって、ＤＮＡのプロットをプレハ
イブリッド化及びハイブリッド化した。

フィルターを２ＸＳＳＣ１０，１％ＳＤＳ中６５℃にお
いて５分間、４回洗浄し、ｏ、ｚｘｓ　ｓ　ｃ、０．１
πＳＤＳ中６５℃において２回洗浄した。オートラジオ
グラフィは一７０℃においてＸ線フィルムに対して、コ
ルネックス　ライトニング　プラス　インテンシファイ
ング　スクリーン（Ｃｏｒｎｅｘ　　ＬｉｇｂＬｅｎｉ
ｎｇ　　ｐｌｕｓ　　ＩｎｌｅｎｓｉｆｙｉｎｇＳ　ｃ
ｒｅｅｎ）を用いて実施した。

Ｕ−サザン・プロットのオートラジオグラフィは１６時
間暴露後にヒトＤＮＡ中の単一コピー遺伝子検出を示す
、結果は正確な単一コピー帯を示し、バックグラウンド
・シグナルを示さずＤＮＡの良好な分解を示す、これは
標準方法を用いて得た結果と本質的に同じ結果である。

本発明の装置は蛋白質のような他の巨大分子の；気泳動
分離と転移に、及び核酸塩基配列決定に用いるような、
他のタイプのゲル上での核酸の分離にも用いることがで
きる。蛋白質の電気泳動分Ｍとプロツチングには、尿素
ゲル、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル、ドデシル硫酸リ
チウム含有ゲル、非変性ゲル、２次元ゲル、グラジェン
トゲル及びアガロース・ゲルを全て用いることができる
。

最も一般に用いられ、ここに述べる装置によっても用い
られるゲルはポリアクリルアミド・ゲルである。ポリア
クリルアミドゲルは一般にアガロース・ゲルよりも薄く
（４１未満）、通常は重合の発生のために空気中の酸素
遮断を必要とし、従ってゲル注型方法が既述した注型方
法とは異なる。標準ポリアクリルアミドゲルによる装置
の使用を可能にするために、プレキャストゲルが用いら
れる。

第３図と第４図は蛋白質ゲルに適したゲル注型系を示す
、第３図の系では、多孔質プレート１１が変化しないで
留まる。２ｉ１１のスペーサー２４は多孔質プレート２
５．２６を多孔質プレートの上方の一定位置に維持する
。これらのスペーサー２４は種々な厚さで提供されるの
で、種々な容量と種類のゲルの使用が可能になる。転移
膜（図示せず）は２個のスペーサー２４の間の適所に維
持され、多孔質プレート１１からはさえぎられる。

スペーサー２４は固定ねじ３０によって転移膜上に維持
される。要素１１．２４，２５．２６及び３０（転移膜
を含む）を組立て、ポリアクリルアミドゲル溶液を転移
膜と多孔質プレー）２５．２６の間に加える０毛細管作
用がゲル溶液を転移膜と多孔質プレー）２５．２６との
間の空間に誘出する。ゲルが硬化する前に、孔形成体２
７を適所に差し入れる。孔形成体２７は形成体２７のみ
ぞ中に配置され、深さストップ２８にねじ止めされる締
付けねじ２９をゆるめることによって高さを変えること
が可能である。

上部多孔質プレートを別々の要素２５．２６に分割する
ことによって、２種顕のゲルを注型することが可能であ
る０例えば、ゲルの堆積と分離が−ｍに用いられる方法
である。

プレート２５下のゲルは蛋白質を分離するための主要な
ゲルであり、簡単に分離ゲルとして呼ばれる。プレート
２６下のゲルは異なる組成であり、蛋白質サンプルを離
散帯に濃縮するために用いられる：このゲルは通常堆積
ゲルと呼ばれる。

他のアクリルアミド重合方法にはＵＶ活性化架橋剤の混
入がある。これらは空気中での重合過程発生を可能にす
るので、アガロースゲルの上記注型方法を幾つかのポリ
アクリルアミドゲルに適用可能である。

ポリアクリルアミドゲルを電気泳動に実際に用いる方法
はアガロースゲルに関して既述した方法に一最的に従う
が、２つの方法の間の相違は大部分、使用ＭＷＩ剤の選
択に依存する。蛋白質の電気泳動分離に本出願人が用い
た方法［レムリ（Ｌａｅ−麟−１ｉ）、１９７０Ｆでは
、用いる電気泳動Ｍ！Ｉ液が０．１９Ｍグリシン、０．
０２５Ｍトリス、０．１＄Ｓ　Ｄ　Ｓを含む。

電気泳動転移緩衝液は０．１９Ｎグリシン、０．０２５
Ｍ）リス、２０％メタノールを含む０分ｍｌ　ＮＩ街液
を転移プロセスに使用可能であることが判明している。

メタノールの使用は幾つかの利点を有するが、必ずしも
必要ではない［ゲルショーニ（Ｇｅｒｓｂｏｎｋ）とバ
レート（Ｐａｌａｄｅ）、　１９８３　］。２種類のＭ
衝剤系の使用が可能であるが、単一１１％剤系は使用の
容易さ、時間の節約及び分離／転移プロセスの自動化の
可能性の点で多くの利点を有する。

ポリアクリルアミドゲルは分子サイズに基づいて蛋白質
を分離し、このゲル自体がふるい分は効果を有する。蛋
白質は核酸ゲルに関して上述したように、電気泳動的に
分離され、転移する０時間の長さは使用条件によって変
化するが、転移が完成した時点で、ゲルは除去し、膜は
必要に応じて使用することができる。蛋白質は膜（通常
はニトロセルロース）に通常しっかりと結合しているの
で、膜の付加的処理は不必要である。

膜にひと反結合した蛋白質は、サンプルの性質に応じて
、直接総蛋白質染色、レクチン結合、抗体結合、リガン
ド結合及びオートラジオグラフィーを含めた、多くの方
法のいずれかによって検出可能である。これらの方法の
全てが充分に知られている。

以下では、ポリアクリルアミドゲル中の蛋白質の分離と
転移のために上記装置を使用する場合に必要な段階を説
明する。

１）　ボ１　１ル　ミ　　ルの ９．７３＄アクリルアミド、０．２３ｇビスアクリルア
ミド、０．３７Ｍ　ト！Ｊ　スｐＨ８，８，０，０３５
に過硫酸アンモニウム、０．１１　５ＤＳ（ドデシル１
Ｍナトリウム）を含むゲル溶液を調製した。この混合物
に、ＴＥＭＥＤ（Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−テトラメチルエ
チレンジアミン）６０μ！を加え、溶液を混訃し、ゲル
混合物をサブ−セルページ注型系（ｓｕｂ−ｃｅｌｌＰ
ａｇｅ　　ｃａｒｔｉｎｇ　　ｓｙｒｔｅｍ）［バイオ
−ラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、米国特許第４．２４６．２
２２号］に注入した。ゲルが硬１ヒした時点で、ゲルを
ゲル注型系から取り出した。

ハイボンド１ＭＣニトロセルロースＭ（孔度０．４５μ
ｍ、アマ−ジャムインターナショナル）を適当なサイズ
に切断し、多孔質プレート１１上の適所に互いた。ポリ
アクリルアミドゲルを適当なサイズに切断して、ニトロ
セルロースの上部に載せた。

コンパートメント６．７が満たされ、液体レベルがゲル
の縁に達するまで電気泳動分離１ｆｆＪ液（０，１９Ｍ
グ！Ｊ　シン、０．．２５Ｍ　）リス、０．１１３ＤＳ
）を加えた。

２）　　　の−゛ 蛋白質サンプルを１＄Ｓ　Ｄ　Ｓ　、０．０２５ｇブロ
モフェノールブルー、５％グリセロール、０．１＄β−
メルカプトエタノール、０．１２５Ｎ　　トリスル８６
．８中で可溶化させ、２分間沸とうさせた。サンプル１
０μｌを各孔に装入した。次に電極８を適当な電源に連
結し、分離電気泳動を１〜５Ｖ／ｃａで４５分間〜２時
間実施した。

３）　　　　−ｉ、’・ 蛋白質分離が完了した時点で、電源を分離電極から遮断
した。

次に電気泳動転移緩衝液を用いて、コンバートメントロ
、７及び室９を満たした。ゲ、ル、ニトロセルロース膜
及び多孔質プレート１１を気泡の捕捉を避けるように注
意しながら、元の位置に戻した。多孔質プレート２３．
フレーム２２．電極２１を適所に配置した。次に電気泳
動転移ＭＷＩ液を加えて、タンクを満たした０次にタン
クのふた（図示せず）を圧力が下方のプレート２３上に
作用するようなやり方で、元の位置に戻した。これはゲ
ルと膜との密接な接触の維持を保証した。電源を電極２
０（陽極）と２１（陰極）に連結して、蛋白質を２００
ｍＡにおいて１時間電気転移させた。電流を一定に維持
し、電圧を変化させた（５０■から低下させた）。

４）　　　゛　　　　た　ンプルの 電気泳動転移が完了した後に、多孔質プレート２３、フ
レーム２２及び電極２１から成る構造体を除去した。ゲ
ルを棄却し、ニトロセルロース膜を５錦ＭトリスｐＨ７
，６，１３７ｍＭ塩化ナトリウム。

０．１１ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）１Ｍ２０中ですすぎ洗
いした。ニトロセルロース膜上の蛋白質をアマ−ジャム
インターナショナルのプロッチング検出キット、ＲＰＮ
２２を用いて可視化した。

結」し−検出キットによる蛋白質可視化は２１１類の装
置の使用に匹敵しうる感度（すなわち、転移効率）を示
した。正確な位置に存在する蛋白質帯が示され、バック
グラウンドシグナルは示されず、蛋白質の良好な分解が
生じた。

２段階電気泳動のために必要な特別な電極を含める結果
として直面する問題は、電場のゆがみの問題である。こ
の問題は電気泳動分離中に上部転移電極２１（上述）を
除去し、電気泳動転移中にゲル／膜サンドイッチ構造体
の上下に多孔質ポリエチレンシートを用いることによっ
て解決する。多孔質プレート１１の上記ハネカム構造も
重要であると考えられる。

電界の影響を最少にするように意図した電極構造を第５
図に説明する。第５図では、４個の電極（２個は分解用
、他の２個は転移用）に今までと同じ参照番号を与える
；ゲル／ＩＩＩサンドイッチ楕遺体は参照番号３１で図
示する。上部及び下部転移電極はそれぞれダイオードＤ
を介して連続的に連結した複数の平行ワイヤーから成る
。

電場のゆがみを最少にする池の方法は、上部転移電１２
１を適所に固定するが電解液レベルが分解電気泳動中型
ｆｉ２１の下方に維持され、分解と転移の間ではこのレ
ベルが上昇して電極と接触するように配置することであ
る。しかし、電界の影響が克服される場合には、４電極
全てを溶液中に浸して装置をランすることが望ましい、
上述のように、電極列にダイオードを用いることも役に
立つ、これを実施する場合には、室９をタンクの残りの
部分から分離する必要がもはや無くなり、このことは装
置の使用を容易にし、装置のデザインをよりシンプルに
する。

導電性液体に電流を通す場合に、電極にガスが発生する
ことは周知の現象である。気泡が上昇することは不可避
であり、これは下部型ｆ！２０から放出される気泡にと
って問題である。これらの気泡は多孔質プレート１１の
下方に集積して、生ずる電界に干渉し、電界強度の低い
または高い局部を形成する。この問題を克服するために
、下部型［Ｉ２０と多孔質プレート１１との間に第３多
孔質プレート（図示せず）を挿入することができる。こ
の第３多孔質プレートは斜めに傾けて、気泡を偏向させ
、非干渉領域に気泡を移すことができ、同時にそれ自体
は発生する電界に不利な効果を与えない。

上述の系では、また殆んど全てのく全てでは無いとして
も）市販の系においても、各電極ワイヤーは等しい電流
量を有する。転移電極２０．２１の各ワイヤーを別々の
電極として処理することによって、電流にバイアスをか
けである領域の電界をより強くすることが可能である［
ゲルショ一二（Ｇｅｒｓｈｏｎｉ）等、１９８５］、こ
のことは、小さい蛋白質または核酸の大きい蛋白質また
は核酸よりも迅速に移動するので、電気泳動転移にとっ
て重要である。実際に、均一な電界では、小さい巨大分
子が迅速にゲルから出て、膜に接触し、電流に絶えず暴
露されながら膜を通過する。大きい巨大分子は電流に長
く暴露される必要があり、この場台にも転移は低効率で
行われるにすぎない、電極列の電界強度はバイアスをか
けることによって、巨大分子はサイズにｒｆｌＪｆｌＡ
なく、均一に転移することができるようになる。

ここに述べた方法は、下記の特徴を結合して有する点で
、既存のプロッチング法を凌駕する利点を有する： １、転移時間が短い；１５〜６０分間の転移時間は標準
蛋白質電気プロッチングで観察される転移時間及び核酸
の真空補助転移で主張されている転移時間に等しい。

２、分離と転移の間でゲル処理の必要がない。

３、分層と転移の間でゲルまたは膜を取扱う必要がない
。

４、電気泳動分離と電気泳動転移を単一＃ｌ１ｉＩ液中
で実施可能である。

５、分離に必要な装置の他に、転移のための装置を必要
としない（すなわち、付加的な転移装置、パワーバック
または制御真空源を必要としない）。

６、再現性と便利さのために望ましいプロッチング・プ
ロセスの完全な自動化が容易である。

７、アガロース・ゲルとアクリルアミド・ゲルの両方か
らの蛋白質及び核酸の転移を促進するために、装置と方
法を容易に適用可能である。

８、この系を用いて、ゲノム核酸塩基配列決定も実施可
能である。

１１文１ Ａｌｗｉｎｅ　　　Ｊ、Ｃ，、Ｋｅｅｐ　　Ｄ、Ｊ、、
Ｐａｒｋｅｒ　　Ｂ、Ａ、。

Ｒｅ５ｉｅｒ　Ｊ、、Ｒｅｎａｒｔ　Ｊ　　、、５ｔａ
ｒｋ　Ｇ、Ｒ，およびＷａｈｌ　Ｇ、Ｍ、　（１９７５
）　ｉｎ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎＥ　ｎｚｙ曽ｏｌｏ１
１ｙ、６　８ヨ、　　　ｐ２２０−２４２．ＷｕＲ，（
ｅｄ）Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　Ｉｎｃ、、Ｌｏ
ｎｄｏｎおよびＮｅｗ　　ｙｏｒｋ、　Ｂｅｒｓ　　Ｇ
、および　ＧａｒｆｉｎＤ、　（１９８５）、Ｂｉｏｔ
ｅｅｈｎｉｑｕｅｓ、３．ｐ２７６−２８８゜Ｇｅｒｓ
ｈｏｎｉ　　Ｊ　、　Ｍ、、Ｄａｖｉｓ　　Ｆ　、Ｅ　
、およびＰａ１ａｄｅ　　Ｇ　、Ｅ　、　（１９８５）
Ａｎａｌ、　Ｂ　１ｏｃｌ＋ｅｍ、。

Ｌ先４．９３２−４０゜ Ｇｅｒｓｈｏｎｉ　　Ｊ　、Ｍ　、およびＰａ１ａｄｅ
　　Ｇ、Ｅ。

（１９８３）、Ａｎａｌ　Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ、、１１Ｌ
、ｐｌ　−１５。

Ｎｏｙｅｓ　　Ｂ　、Ｅ　、および５ｔａｒｋ　　Ｇ、
Ｒ，（１９７５）。

Ｃｅ１ｌ、５Ｊ３０１　　３１０　。

Ｐａ１ｌ　　Ｄ　、Ｂ　、　（１９８０）Ｃｏｌｌｏｉ
ｄｓ　　５ｕｒｆ、　、ｌ−、ｐ２３５−２５６゜ Ｐｅｆｅｒｏｅｎ　　Ｍ、、Ｈｕｙｂｒｅｃｈｔｓ　　
Ｒ，およびＤｅ　　Ｌｏｏｒ　　Ｒ，、（１９８２）Ｆ
ｅｂｓ　　ＬｅｔＬｓ、１先１（２）、ｐ３６９−３７
２゜ Ｒｅｅｄ　　Ｋ、Ｃ，およびＭａｎｎ　　Ｄ　、Ａ　、
　（１９８５）Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅｓ、、
ｌ、ｐ７２０７　７２２１　。

Ｓｍ１ｔｈ　　Ｇ、Ｅ、およびＳｕｍｍｅｒｓ　　Ｍ、
Ｄ、　（１９８０）Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、１０
９．ｐ１２３　　１２９゜５ｏｕｔｈｅｒｎ　　Ｅ、Ｍ
、　（１９７５）Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、。

２」Ｌ、ｐ５０３−５１７　。

Ｔｏｗｂｉｎ　　Ｈ，，５ｔｉｅｈｅｌｉｎ　　Ｔ、お
よびＧ　ｏｒｄｏｎＪ　、　（１９７９）Ｐｒｏｃ、　
Ｎａ１１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、。

Ｕ、Ｓ、Ａ、、７６、−４３５０−４３５４゜

【図面の簡単な説明】

第１図は上部転移ｔＳを含まない本発明の装置を適所に
含む電気泳動装置の平面線図であり；第２図は上部転移
電極を適所に含む第１図の装置の側断面線図であり； 第３図は転移膜の存在下でのポリアクリルアミドゲルの
注型に用いる系の分解線図であり；第４図は第３図の要
素の端面線図であり；第５図は電気泳動転移に適した電
極のｔｆ１構造の１実施例の斜視線図である。 １・・・長方形タンク　　　２・・・底部３・・・側壁
　　　　　　　４・・・端部壁６．７・・・コンパート
メント ８・・・分Ｍ電極　　　　　９・・・下部室１３〜１６
・・・ブロック　１７・・・浅いトレー２０．２１・・
・転移電極 （外４名） Ｆｔａ、１ Ｆｔａ、２ ＦＩｏ、４ ０ｚ今ＺコＺ口 ！ｌ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、電気泳動ゲルと膜から成るサンドイッチ構造体を形
   成する段階；サンプルに第１期電気泳動を行って、サン
   プル中に含まれる巨大分子を第１電場によってサンプル
   含有留溜めから取り出し、それらのサイズ及び／または
   電荷に依存して電気泳動ゲルに沿って間隔をおいた位置
   に分配する段階；次にゲル内に分配した巨大分子に第２
   期電気泳動を行って、分配巨大分子を第１電場を横断す
   る第２電場によって膜に移す段階；及び次に膜とゲルを
   分離する段階から成る生物学試験に用いる方法。 ２、第１期電気泳動を開始する前に電気泳動ゲルを膜上
   で直接注型する請求項１記載の方法。 ３、膜とゲルをプレキャスト形として供給する請求項１
   記載の方法。 ４、サンドイッチ構造体がゲルと膜とを分離する付加的
   な物質層を含む請求項１記載の方法。 ５、第１期電気泳動と第２期電気泳動との間で変化しな
   い共通の緩衝液内に前記電場を設定する請求項１〜４の
   いずれかに記載の方法。 ６、各電極対の間に電位を与えることによって第１電場
   と第２電場を確立し、第１電場を確立するための適当な
   電極対に、試験の進行につれて、第２電場を確立するた
   めの適当な電極対を連続的に連結する請求項１〜５のい
   ずれかに記載の方法。 ７、前記第１電場をゲル面に対して実質的に平行な面内
   に確立し、前記第２電場が前記面を横断する方向を有す
   る請求項１〜６のいずれかに記載の方法。 ８、前記第２電場が前記面に対して実質的に直角に配向
   する請求項７記載の方法。 ９、膜と電気泳動ゲルから成るサンドイッチ構造体を固
   定する手段、ゲル内のサンプルに含まれる巨大分子を分
   離するように操作可能な第１方向の第１電流を供給する
   ための第１電極手段、及びゲル内の分離巨大分子を膜上
   に転移させるために第１方向を横断する第２方向の第２
   電流を供給する第２電極手段を含む、生物学的試験に用
   いるための装置。 １０、前記第１方向がゲル面に実質的に平行な面内に存
   在し、前記第２方向がゲル面を横断する請求項９記載の
   方法。 １１、前記第２方向がゲル面に対して実質的に直角であ
   る請求項１０記載の装置。 １２、膜とゲルから成るサンドイッチ構造体を支えるよ
   うに作用可能な、電気的多孔質材料または導電性材料の
   プレートを含む請求項９〜１１のいずれかに記載の装置
   。 １３、前記プレートが浅いトレーの底部を形成し、トレ
   ー中に最初に膜を入れてからゲルをトレー中に注型して
   前記サンドイッチ構造体を形成する請求項１２記載の装
   置。 １４、前記プレートが前記第２電極手段の１部を形成す
   る電極として機能する請求項１２または１３のいずれか
   に記載の装置。 １５、補助多孔質材料プレートを含み、前記補助多孔質
   材料プレートが最初に挙げたプレートに対して平行であ
   るが、ゲル／膜サンドイッチ構造体の反対側に存在し、
   ゲルと膜とを密接に接触させて維持するように作用可能
   である請求項１２〜１４のいずれかに記載の方法。 １６、前記プレートと前記補助プレート（取付ける場合
   には）が電気的多孔質材料製である請求項１２〜１５の
   いずれかに記載の装置。 １７、前記取付け手段が、前記電場を確立するために前
   記電極手段を浸せきする緩衝液を保持する溜め手段を含
   む請求項９〜１６のいずれかに記載の装置。 １８、前記膜が多孔質材料製である請求項９〜１７のい
   ずれかに記載の装置。