JPH02154694A - 肺癌モノクローナル抗体および細胞表面抗原 - Google Patents

Abstract

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め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ この発明は、肺の小細胞癌の細胞表面抗原に対するモノ
クローナル抗体、これらの抗体を産生するハイブリドー
マセルライン、これらのモノクローナル抗体の使用方法
および細胞表面抗原自体に関するしのである。

［従来の技術］ これまで肺の小細胞癌の特性を１凋へる試みにおいて様
々な研究が行なイっれてきた。これらの中には、インビ
トロ成長形態学［キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ
　Ｒｅｓ、）、４０．３５００（１９８０）］、酵素（
例、ドーパミンカルボキ７ラーゼ）の発現［［キャンサ
ー・リサーチＪ（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、）、４０．１
９９０（１９８０）］、ポリペプチドホルモンボンベシ
ンの発現［サイエンス（Ｓｃｉｅｒ＋ｃｅ）、２＋４．
１２４６（１９８１）］および染色体３ｐにおける欠失
［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、１１５．１８１（１
９８２）］に対する研究が含まれる。小細胞癌は、肺の
非小細胞癌から、それらの細胞表面蛋白質発現において
変化していることが示された［ＰＮＡＳ、７９．４６５
０（１９８２）］。それ以来、幾つかの研究により、肺
の小細胞癌の細胞表面抗原に対するモノクローナル抗体
の生産が行なわれている。

これらの細胞表面抗原は組織反応性に従って分類され得
、上皮抗原、神経内分泌抗原、白血球と共有される抗原
および腫よう関連抗原の群が存在する。例えば小細胞癌
において発現される構造並びに正常上皮および他の癌に
おいて発現される構造に対して反応することが見出され
た多くの抗体が報告されている。同様に、正常および悪
性の両方の神経内分泌組織、末梢神経および脳におけろ
抗原を認識する、神経内分泌型抗原に対する抗体の報告
も為されている。

モノクローナル抗体を用いて肺の小細胞癌の特異抗原を
同定および標的とすることにより、幾つかの膜抗原を分
離し、それらの特徴を調べた結果、これらの多くは糖脂
質であることが示された。免疫沈降による特徴は、幾つ
かの他の小細胞癌抗原が蛋白質であることを示唆してお
り、例えば免疫ブロッティング方法による特徴が小細胞
癌抗原Ｍ０Ｃ−１に関して報告されている［キャンサー
・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、）、４５．２１９
２（１９８５）］。同様の免疫沈降試験では、糖蛋白質
を認識すると思われる抗体が報告された。さらに研究を
進めた結果、これは小細胞癌セルラインおよび組織の一
部分の細胞表面膜に存在するシアリル化糖蛋白質である
ことか示された［キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ
　Ｒｅｓ、）、４７．３７６６（１９８７）］。

この抗原はｓＧ　Ｐ　９０−１９５と命名され、それを
同定するモノクローナル抗体はＬＡＭ８と命名された。

この抗体および類似特異性を示す池の抗体、例えば５Ｗ
Ａ４および５ＷＡ２３のさらに別の特徴は、これらが１
ｇＭアイソタイプに属することを示した。

小細胞癌細胞の細胞表面膜がシアロ糖蛋白質を含むとい
う発見およびモノクローナル抗体によりこれらの抗原を
同定し得るということは、肺の小細胞癌の検出および診
断、および恐らくは免疫療法におけるこれらの抗原の臨
床有用性を示している。腫よう細胞の生物学的習性は、
膜糖蛋白質のシアリル化における変化に関連し得るとい
うことが提案された。例えば、ンアル酸の高い膜含有漬
は、ひとおよびマウスのミエローマの低い移植能［イン
ターナショナル・ジャーナル・オブ・ギャンサー（Ｉｎ
ｔ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ）、３６．４６１（１９８６
）］、ねずみ腫よう細胞の高い転移能力［サイエンス（
Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２１２．１５＋４（１９８１）］お
よびナチュラルキラー細胞介在細胞毒性に対する抵抗性
［キャンサー・リザーチ（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、）、
４６．４５４３（１９８６）］に関連していることが見
出された。

［発明が解決しようとする課題］ この発明は、小細胞癌の表面膜特性の記載に焦点を合わ
せている。

この発明の目的は、肺の小細胞癌の特異的細胞表面膜発
現シアロ糖蛋白質抗原と選択的に反応し得るモノクロー
ナル抗体、特にＩｇＧアイソタイプに属するモノクロー
ナル抗体の提供である。

この発明の別の目的は、肺の小細胞癌の診断で使用され
得る、肺の小細胞癌の特異的シアリル化糖蛋白質抗原の
提供である。

この発明のさらに別の目的は、肺の小細胞癌の特異的細
胞表面膜発現シアロ糖蛋白質抗原と選択的に反応するモ
ノクローナル抗体を用いた肺の小細胞癌の診断方法の提
供である。

この発明のさらに別の目的は、肺の小細胞癌の特異的細
胞表面膜発現シアロ糖蛋白質抗原と選択的に反応するモ
ノクローナル抗体を用いた動物における肺の小細胞癌の
抑制方法の提供である。

すなイつち、この発明は、小細胞癌の一部分（ｐｒ。

ｐｏｒｔｉｏｎ）で強力に発現される新たな腫よう関連
シアロ糖蛋白質抗原には特異的であるが、非小細胞癌と
は非反応性である新規モノクローナル抗体に関するもの
である。さらにこの発明は、これらの抗体を生産するハ
イブリドーマセルライン並びにこれらのモノクローナル
抗体の使用および製造方法を含む。

モノクローナル抗体が、非小細胞癌および正常組織とは
本質的に非反応性であり、かつ肺の小細胞癌とは反応し
得るということは、これらの抗原の検出およびこれらの
モノクローナル抗体の免疫治療用途に関して非常に意義
深いことである。

［図面の記載コ 第１図は、正常ＩｇＧ（ＮｒｇＧ）と比較した、投与の
４日後におけるモノクローナル抗体５ＷＡ２０の組織間
の分布を示すグラフである。Ｔｕ−腫よう（１，１）、
Ｌｉ＝肝臓（０，２７）、Ｋｉ＝腎臓（０３７）、ｓｐ
＝ひ臓（０，３８）、Ｈｅ−心臓（０，４２）、Ｔｈ−
甲状腺（０，３９）、Ｌｕ＝肺（０，４３）、Ｍｕ＝筋
肉（０，１５）、Ｂｒ−脳（０，０３８）。

第２図は、抗体ＳＷ、Ａ２０（Ａ）および各々ＬＡＭ８
（Ｂ）による展開面の抗原ｓＧ　Ｐ　＋１０１３５およ
びＳＧＰ、。。に対する様々な酵素の作用を示すＳＷ２
細胞の免疫プロットである。レーンは、次の化合物によ
る処置に対応する。すなわち、 １、Ｌｅａ陽性唾液；　２、トリプシン：３、キモトリ
プシン：４、ノイラミニダーゼ；５、混合グリコシダー
ゼ：６、ペリオデート：７、未処置対照。

分子量マーカー（Ｍ）（数千−１００万未満）は、α、
−マクログロブリン（１８００００）、β−ガラクトシ
ダーゼ（１１６０００）、フルクトース６−燐酸キナー
ゼ（８４０００）、ピルビン酸キナーゼ（５８０００）
、フマラーゼ（４８５００）、乳酸デヒドロゲナーゼ（
３６５００）およびトリオース燐酸イソメラーゼ（２６
６００）である。

〉二個々のレーンマーカー。

第３図は、抗体５ＷＡ２０と結合したパラフィン部分の
免疫ペルオキシダーゼ染色を示す。Ａ）均一染色を呈す
るＳＣＣ，Ｂ）５０％陽性率を示すＳＣＣ，Ｃ）ｌ　０
５未満の散在した陽性細胞を有するＳＣＣ，Ｄ）殆ど陽
性細胞を伴わない正常気管支、Ｅ）１０％未満の陽性細
胞を有する肺へん平上皮細胞癌およびＦ）殆ど陽性細胞
を伴わない肺腺癌。

第４図は、抗体５ＷＡ２０（Ａ）およびＬＡＭ８（Ｂ）
により展開された小細胞癌セルライン抽出物の免疫プロ
ットである。（Ｍ）分子量マーカー。レーンは、ＧＥＭ
９５（レーン１）、ＮＣｌ−Ｈ６９（レーン２）。５Ｗ
２（レーン３）、０Ｈ３（レーン４）およびＮＣｌ−１
−１１２８（レーン５）を含む。

第５図は、異なる抗体により展開され、やぎ抗マウスＩ
ｇＭ（μ）およびやぎ抗マウスＩｇＧにより染色された
免疫吸着Ｌ　Ａ　Ｍ　８抗原の免疫プロットである。

レーンは、ＬＡＭ８による免疫吸着細胞抽出物（レーン
Ｃ）、ＬＡＭ８により展開され、抗１ｇＭで染色された
免疫吸着抽出物（レーン１）、ＳＷ４により展開され、
抗１ｇＭにより染色された免疫吸着抽出物（レーン２）
および５ＷＡ２０により展開され、抗ＩｇＧにより染色
された免疫吸着抽出物（レーン３）のクーマシーブルー
着色を含む。

＞：ＩｇＧおよび１ｇＭ重および軽鎖。

〉〉：抗原ｓＧ　Ｐ　Ｇｏ−＋３５０ ［発明の構成］ この発明は、肺の小細胞癌細胞の一部分の細胞表面膜に
おいて選択的に発現されろ新規抗原を同定する、定義さ
れたアイソタイプに属するモノクローナル抗体に関する
ものである。この抗原のインビボおよびインビトロの両
方での検出は、肺の小細胞癌の診断および恐らくは免疫
療法の両方において有望である。

上皮抗原、神経内分泌抗原および白血球と共存される抗
原を含む、肺の小細胞癌の様々な細胞表面抗原の特徴が
明らかにされている。しかしながら、この発明の抗原は
、肺の小細胞癌においては選択的に発現されるが、他の
肺癌および肺以外の癌並びに正常組織においては本質的
に発現を示さない腫よう関連抗原であることが立証され
た。

様々な組織およびセルラインに関する抗原の正確な分布
は、抗原を特異的に同定し、それと結合するモノクロー
ナル抗体を用いて立証された。それらのモノクローナル
抗体を分泌するハイブリドーマの一般的製造方法は、当
業界の通常の熟練者には周知である。使用される技術の
例としては、「キャンザー・リサーチｊ（Ｃａｎｃｅｒ
　Ｒｅｓ、）、４６（１９８６）２０７７頁に記載され
た方法かある。簡単に述へると、ＳＷ２またはＯＨ−１
小細胞癌セルラインの生存可能な細胞によりＢＡＬＢ−
Ｃマウスを免疫化した。動物を殺した後、ひ株細胞をＮ
５−１ミエローマセルラインと融合し、ＳＷ２または０
Ｈ−１セルラインを用いて抗体産生能についてハイブリ
ドーマをスクリーニングした。さらに、骨髄との陰性反
応性を示すことを含むスクリーニングおよびＩｇＧアイ
ソタイプに関するスクリーニングにより、特異的モノク
ローナル抗体を分泌するハイブリドーマセルラインの選
択を行った。それらのセルラインの例としては、５ＷＡ
２０．５ＥＮ３．５ＥＮＩ　ｌ、５ＥＮ１２および５Ｅ
Ｎ３１と命名された株がある。例えば抗体５ＷＡ２０の
アイソタイプは、うさぎ抗マウス免疫グロブリンに対す
る抗体を含む腹水の二重放射状拡散、および種々のＩｇ
Ｇ抗体のパネルを用いたイムノブロッティング技術「キ
ャンサー・リサーチ」（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、）、４
６（１９８６）２０７７］により［ｇＧ２ａであること
が示された。

この抗体を産生ずる５ＷＡ２０と命名されたハイブリド
ーマセルラインは、１９８８年３月２日にヨーロピアン
・コレクション・オブ・アニマル・セル・カルチャーズ
（ＥＣＡＣＣ）に寄託され、受託番号ＥＣＡＣＣ８８０
３０２０１が与えられた。

また、抗イデイオタイプ抗体も製造され得、それらの技
術は当業界の通常の熟練者の技能の範囲内に含まれると
予測される。簡単に述べると、抗イデイオタイプ抗体は
、関心の対象である抗体に存在する固有の抗原決定基を
認識する抗体である。

すなわち、モノクローナル抗体、例えば５ＷＡ２０を、
例えば本来のモノクローナル抗体産生細胞の供給源とし
て使用された動物に注射する。免疫化された動物は、免
疫抗体のイディオタイプ抗原決定基を認識し、これらの
イディオタイプ抗原決定基に対する抗体（抗イデイオタ
イプ抗体）を生産することにより応答する。これらの抗
イデイオタイプ抗体は関心の対象である特定抗原にそれ
自体特異的なモノクローナル抗体に特異的であり、別の
宿主に注射された場合、抗（抗イデイオタイプ）抗体の
産生を刺激する。これらの抗（抗イデイオタイプ）抗体
は最初のモノクローナル抗体と同じ特異性を呈し、それ
ら自体関心の対象である抗原を同定する。このシステム
を用いる利点は、関心の対象である抗原を担う最終宿主
において生産された抗体はその宿主にとって内在性であ
り、自然状態で非常に大量に生産され得ることである。

また、抗イデイオタイプ抗体を最終宿主に投与する必要
があるのは非常に少量のみてあり、その１１１は免疫応
答の刺激に十分な量であればよい。

まｒこ抗イデイオタイプ抗体は、この発明のモノクロー
ナル抗体の特異性を有するモノクローナル抗体を分泌す
る他のハイブリドーマセルラインの分離にも使用され得
る。この抗イデイオタイプスクリーニングは、当業界の
通常の熟練者であれば容易に行えるものである。簡単に
述べると、抗イデイオタイプ抗体は前述の要領で製造さ
れ、そして、単一ハイブリドーマにより生産されたモノ
クローナル抗体に特異的なこれらの抗イデイオタイプ抗
体を用いることにより、免疫化に使用されたハイブリド
ーマの抗体と正確に同じイディオタイプを有する他のク
ローンの同定が可能である。２種のハイブリドーマのモ
ノクローナル抗体間のイディオタイプの同定は、２種の
モノクローナル抗体が同しエピトープ性抗原決定基のそ
れらの認識に関して同一であることを証明している。す
なわち、モノクローナル抗体のエピトープ性抗原決定基
にχ［Ｊ−ろ抗体を用いることにより、同じエピトープ
特異性を何４゛るモノクローナル抗体を発現する他のハ
イブリドーマの同定が可能である。抗体において、これ
らのイディオタイプの抗原決定基は、所定のエピトープ
に結合する高可変領域に存在する。

第２の受容体種における第１の種の外来ドナーモノクロ
ーナル抗体の使用はインビボ臨床用途または免疫診断に
お、いて普通は必要因子ではないが、生じ得る潜在的問
題は、ドナー抗体に存在する抗原決定基に対する宿主に
よる不都合な免疫応答の発生である。この不都合な応答
が激しすぎるため宿主におけろトナー抗体のインヒポ使
用が短縮され得る場合らある。さらに、この不都合な宿
主応答は、トナー抗体の悪性腫よう抑制効果を妨げろ役
割を果たし得る。宿主において生じる不都合な免疫応答
の可能性を回避し得る一方法は、キメラ抗体を用いる方
法である［サン等、「ハイブリドーマＪ（Ｈｙｂｒｉｄ
ｏｍａ）、５（１）Ｓ　１７（１９８６）および才イ等
、「バイオ・テクニクスＪ（Ｂｉｏ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕ
ｅｓ）、４（３）２１４（１９８６）］。キメラ抗体は
、抗体の重ぢよび軽鎖の様々な領域か、１種類を越えろ
種類から得られたＤＮＡによりコードされる抗体である
。一般的に、キメラ抗体は、望ましい抗原特異性を有す
る抗体を生産するドナ一種に由来する重（Ｖ１□）およ
び軽（Ｖｌ、）鎖を有する可変領域並びに宿主受容体種
に由来するＴｉ（Ｃ，、）および軽（ｃＬ）鎖を有する
不変抗体領域を含む。ドナー抗体領域に存在する抗原決
定基に対する宿主免疫系の暴露を減らすことにより、受
容体種で生じる不都合な免疫応答の可能性も減らされる
と思われる。すなわち、例えば、ＥＣＡＣＣ８８０３０
２０１の番号の下に寄託された５ＷＡ２０セルラインか
ら分離されたＤＮＡによりコードされるマウスＶｎおよ
びＶＬ領領域びにひと細胞から分離されたＤＮＡにより
コードされるＣＨおよびＣ０領域を含む、ひとにおける
インビボ臨床用途に供されるキメラ抗体の製造が可能で
ある。

ある種の環境下では、特定クラスに属するモノクローナ
ル抗体が、診断または治療効果に関して異なるクラスの
モノクローナル抗体よりも好ましいことがあり得る。例
えば組織染色における高い交差反応性、乏しい組織浸透
性および多数の生化学的操作、例えば免疫コンツユゲー
トの製造に伴う困難さを含む問題が１ｇＭクラスの抗体
の使用には伴い得ろ。同様に、特定アイソタイプに属す
るモノクローナル抗体が別のモノクローナル抗体よりも
好ましいことらあり得る。この点に関し、アイソタイプ
ガンマ−２ａおよびガンマ−３に属するマウスモノクロ
ーナル抗体は、ガンマ−１アイソタイプの場合よりも腫
よう増大抑制に効果的であることが知られている。この
効果の差異は、ガンマ−２ａおよびガンマ−３アイソタ
イプか腫よう細胞の細胞溶解的破壊により活動的に参与
し得る点に起因すると考えられる。特定アイソタイプの
モノクローナル抗体は、最初のハイブリドーマ融合から
選択することにより直接製造されろか、または異なるア
イソタイプのモノクローナル抗体を分泌する親ハイブリ
ドーマから、例えば５ＷＡ２０と同じ特異性を有するク
ラス−スイッチ変異型を選択することにより二次的に製
造され得る。

各々同じ特異性を存するかまたは同じ特異性を有する抗
体の生産を刺激するキメラまたは抗イデイオタイプの抗
体を含むこの発明のモノクローナル抗体は、インビトロ
またはインビボ免疫診断または免疫治療における投与が
望まれる動物であれば全てに使用され得る。ここに「動
物」なる語は、ひとおよびひと以外の両方を包含するも
のとする。

この発明で使用されている「抗体」なる語は、エピトー
プ性抗原決定基に結合し得ろ、無傷の分子およびそのフ
ラグメント、例えばＦａｂおよびＰ（ａｂ’）、を含む
ものとする。

「本質的に非反応性（の）」なる語が、この発明のモノ
クローナル抗体および抗原間の反応性の特徴の記載に使
用されている場合、行なわれ得る反応は全て、抗体の診
断または治療有用性の制限に関して重要な反応ではない
ことを意味する。

この発明のモノクローナル抗体は、それらが液相におい
て、または固相担体と結合した状態で使用され得ろ免疫
検定での使用に特に適している。

さらに、これらの免疫検定におけるモノクローナル抗体
は、様々な検出可能な方式で標識され得ろ。

この発明のモノクローナル抗体を用い得る免疫検定のタ
イプの例には、競合的および非競合的免疫検定かあり、
−船釣な例は放射線免疫検定法（ＲＩＡ）および固相酵
素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）である。モノクローナル抗
体に対する多種多様な標識および標識方法が存在し、邑
業界の通常熟練者であれば、それらを知っているか、ま
たは常用の実験法を用いてそれらを確かめることができ
、標ｑ的技術を用いて結合させることができる。

それらの技術を使用してこの発明のモノクローナル抗体
を用いることにより、肺の小細胞癌の細胞における抗原
の所在並びに小細胞癌および非小細胞癌の両方に由来す
るセルラインおよび組織に関するこの発明の抗原の分布
が測定された。小細胞癌シアロ糖蛋白質抗原５ＧＰｓ。

−１３１１の発現に対する研究［キャンサー・リサーチ
（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、）、４７（１９８７）３７６
６］、およびこの抗原が肺の小細胞癌の一部分において
強く発現されるという発見により、この発明の抗原、ｓ
Ｇ　Ｐ　Ｂｏｏの発現の測定における対照としてのこの
抗原の使用が可能となった。

抗原ｓ　Ｇ　Ｐ　＋。。が小細胞癌の細胞表面膜で発現
されるという事実は、間接免疫蛍光染色法を用いて立証
されたが、使用した方法は「キャンサー・リサーチＪ（
Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、）４６（１９８６）２０７７お
よび「インターナショナル・ジャーナル・才ブ・キャン
サーＪ（Ｉｎｔ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ）３５（１９８
５）ｌｌに記載された方法である。これらの技術を用い
ると、モノクローナル抗体５ＷＡ２０と小細胞癌セルラ
インＳＷ２または０Ｈ−１との結合により環状型着色が
生じるが、これは細胞表面膜活性の指標である。他の小
細胞癌セルラインを使用しても同様の結果は得られるが
、非小細胞癌由来のセルラインを用いると陽性結果は得
られない。

この発明のモノクローナル抗体を用いて小細胞癌および
非小細胞癌の両方に由来する様々なセルラインに関する
固相放射線免疫検定法（ＲＩＡ）が行なわれ（使用され
ている方法は、例えば実施例３記載の方法である）、こ
れらは、ｓＧ　Ｐ　＋ｏｏが、使用された８種の小細胞
癌性のうち４種においては強く発現されるが（第４図）
、非小細胞癌セルラインでは発現を示さないことを立証
した。使用された非小細胞癌セルラインは乳癌、結腸癌
および白血病を含み、試験された非癌細胞は、−次培養
から得られた正常な気管支上皮細胞、末梢血液（軟膜）
から得られた白血球および骨髄からの単核細胞を含む。

抗体は、また、赤血球凝集および補体溶解検定において
主血液群抗原を発現する赤血球とは非反応性であった。

この発明の抗原、ｓＧ　Ｐ　＋ｏｏは小細胞癌セルライ
ンに対して特異的であり、かつその発現の特異性はまた
、免疫ペルオキシダーゼ染色法により様々な組織試料に
おいて立証されている。その小細胞癌組織染色法を用い
た最初の実験は、ホルマリン固定、パラフィン埋封組織
における抗原の保護を立証した。染色技術で使用された
方法の例は実施例４に示されている。抗体５ＷＡ２０で
染色された一連の肺癌および肺以外の腫よう組織の中で
、陽性染色は小細胞癌に限定された（第３図）。腺癌、
へん平上皮細胞癌および乳癌から得た腫よう組織試料全
体に散在した１０５未満陽性細胞は、陽性染色を示すが
、池の試料は全て染色されなかった。

試験された異なる１２種の小細胞癌の中で、２例は実質
的に全細胞の均一染色を呈したが、３例は約５０％の陽
性率を示し、２例は約２５％の陽性率を示した。３例は
１０％未満の焦点陽性率を示し２例は全く陰性であった
。

正常の非癌組織、例えば腎臓、ひ臓、下垂体前葉および
肺実質組織もまたこの試験に含まれた。

試験された１６タイプの組織のうち、肺気管支およびす
い臓の（ランゲルハンス）島のごく僅かの陽性細胞並び
に結腸上皮細胞の１０５未満陽性率を除けば、全て完全
に陰性であった。

この発明の一モノクローナル抗体の取り込みのインビボ
分析において、ヨウ素結合技術を用いて抗体５ＷＡ２０
を１２’ｌｌで標識すると、約４６％の生物学的活性を
保持することが見出された。ＳＷ２またはＯＮ　−１小
細胞癌異種移植片をもつヌードマウスに静脈注射を行う
と、ＳＷΔ２０が異種移植片に優先的に局在し、対照免
疫グロブリンよりも４倍高いレベルに達していることが
見出された。局在している５ＷＡ２０の絶対値は腫よう
１ｇ当たり注射用ｍの７％であった（すなわち生物学的
活性材料に関して１５％）。すなわち、ヌードマウスの
小細胞癌異種移植片における選択的抗体取り込みが立証
された。第１１図は、正常標識ＩｇＧの局在状態と比へ
た、投与後の様々な組織における標識モノクローナル抗
体５ＷＡ２０の局在状態を示す。５ＷＡ２０の最大パー
センテージは腫よう組織に見出されることが容易に判る
。

間接免疫蛍光染色法は、ｓＧＰ＋ｏｏが肺の小細胞癌の
細胞の細胞表面膜に存在することを示し、実験を行って
抗原を伴う膜のフラクションを測定した。膜成分を様々
なフラクションに分離した後、シリカゲル薄層クロマト
グラフィーにより粗糖脂質抽出物には抗原は観察されな
かった。オーファレルの緩衝系を用い、還元条件下、小
細胞癌細胞を１０％５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動で分離し、始めに低電流密度で低分子量分子を溶
離させ、次いで高電流密度で長い期間電気移動させる２
段階工程でのオッターの方法［「アナリティカル・バイ
オケミストリーＪ（Ａｎａｌ、　ＢｉｏｃｈｅＩ！＋、
）、１６２（１９８７）３７０］に従い蛋白質を電気泳
動的に０．２μｌニトロセルロース上に移動させ、抗体
上清およびアフィニティー精製ベルオキノダーゼーコン
ジュゲートやぎ抗マウスＩｇＭまたは■ｇＧとインキュ
ベーションすることにより、小細胞癌細胞膜の蛋白質成
分における抗原が検出され得た。抗原の存在は、基質と
して４−クロロ−ｌナフトールを用いたペルオキシダー
ゼ活性の測定により立証された。抗原ｓＧＰ＋ｏｏは、
生化学的特徴により、シアリル化糖蛋白質であることが
立証された。それらの技術は、分離された抗原を酵素ノ
イラミニダーゼで処理してンアル酸残基を炭水化物部分
から開裂し、抗体がこうして処理された抗原との反応性
を残しているか否かを測定することを含む。

第２図で示す通り、抗原ｓ　Ｇ　Ｐ　＋。０は、モノク
ローナル抗体５ＷＡ２０を用いた常用のイムノブロッテ
ィング技術下で、５０−７５％硫酸アンモニウムフラク
ションにより分子ｆｆ１４００００において幾つかの分
子張帯、分子ｍｔｏｏｏｏｏにおいて１本の広い帯およ
び分子ｆｆｉ　Ｉ　８００００において１本の帯を生成
する。

抗原の性質を立証するため、抗体上清およびレクチン類
つレックス・ユーロベウス（Ｕｌｅｘ　ｅｕｒｏｐａｅ
ｕｓ）、トリティク、ム・ブルガリス（Ｔｒｉｔｒｃｕ
ｍ　ｖｕｌｇａｒｉｓ）およびコンカナバリンＡを用い
てＳＷ２セルラインにおいて競合的放射線免疫検定法を
行った。レクチンは、普通植物から単離される蛋白質で
あり、特異的糖部分に検出し、例えばレクチン、ウレッ
クス・ユーロペウスはα−Ｌ−フコース残基および血液
群■（抗原を認識する。５ＧＰｏ。−１□とは反対に、
５ＷＡ２０により認識される抗原は、ごく僅かのトリテ
ィクム・ブルガリスと結合し、コンカナバリンＡとは反
応しない。ＳＧ　Ｐ　ｓｏ−＋３ｓと同様に、レクチン
、ウレックス・ユーロペウスおよびスクシニル化トリテ
ィクム・ブルガリス（スクシニル化トリティクム・ブル
ガリスはノイラミン酸に対するアフィニティーは示さな
いか、Ｎアセチル−β−Ｄ−グルコサミニル残基のみを
認識する）の結合は存在しなかった。同様に検定を行っ
て、抗原に対する様々な酵素の作用を測定した。これら
の検定では、酵素ノイラミニダーゼ［クロストリジウム
・パーフリンゲン（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｐｅｒｆ
ｒｉｎｇｅｎｓ）］および混合グリコノダーゼ［マンノ
ンダーゼ、グリコツダーゼ、ガラクトンダーゼ、フコノ
ダーゼ、キジロンダーゼ、アセチルグルコサミニダーゼ
およびアセチルガラクトサミニダーゼを含むチャロニア
（Ｃｈａｒｏｎｉａ）口蓋腫から得られたエキソグリコ
ンダーゼの混合物］を使用し、プロテアーセトリプンン
（Ｎ−トノルーＬ−フェニルーアラニルクロロメチルケ
トン）およびキモトリプシン（トシル−リジンクロロメ
チルケトン）を用いた検定を実施した。

ｓＧ　Ｉ”　９０−１３５と同様に、抗原ｓＧＩ’＋ｏ
ｏは混合グリコツダーゼに対して抵抗性かあり、ノイラ
ミニダーゼに対して平行感受性を示した。

まｔ二Ｓ　Ｗ　２細胞ら室温で１５分間ベリオデート（
過ヨウ素酸）で処理したか、５Ｇｐｉａ−＋：＋ｓとは
５へなり、この発明の抗原は部分的に抵抗性を示した。

これらの検定を反復したが、たたし５ＤＳ−ＰＡ　Ｇ　
Ｅによる分離および抗体Ｓ’ｖＶＡ２０による展開の而
に先のベリオデートおよび酵素とＳＷ２細胞抽出物との
インキュベーションを行った（第２図）。この場合、ベ
リオデートで処理した結果、分子量４００００および分
子量１０００００での帯は消えたが、分子ｆｉ１８００
００での帯は残留した。ノイラミニダーゼによる処理は
類似効果を示したが、さらに新しい帯か分子［４５００
０のところに現れた。混合グリコンダーゼでの処理によ
り分子ｉ４００００の帯は除かれ、酵素トリブンノおよ
びキモトリプシンでの処理による効果は観察されなかっ
た。これは、ベリオデートおよびノイラミニダーゼによ
る処理後特異帯が全て消え、キモトリプシンにより処理
すると中間範囲の帯の大きさが減少する５ＧＰｓ。−１
３，において同様の処理を行った場合とは対照的である
。

ドツト・プロット検定（小細胞癌抽出物を対照として用
いる）により、抗体Ｌ　Ａ　Ｍ　８および５ＷＡ２０の
主血液群抗原Ｌｅａとの反応性を試験した。ＬＡＭ８は
、Ｌｅａ陽性プロバンドの唾液における成分を認識する
ことが知られているか［「キャンサー・リサーチＪ（Ｃ
ａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、）４７　（１９８７）３７６６］
、モノクローナル抗体５ＷＡ２０はそのような反応性を
示さないことか立証された（第２図）。

抗原５ＧＰｓ。−１３８およびこの発明の抗原ｓＧＰ＋
ｏｊｙ間には類似性、例えばこの試験で使用された小細
胞癌セルラインにおけるこれら２種の抗原の明白な共発
現、両抗原のシアリル化に関する証拠および分子量の類
似性が存すると思われるが、２抗原の間には僅かの相異
が存在する。２種の抗原間の主たる相異は、それらを同
定する抗体の特性により最らよく証明される。すなわち
、これらの相異は、抗原ＳＧＲ＋ｏｏを同定するモノク
ローナル抗体５ＷＡ２０とＬｅａ陽性唾液との反応性の
不在、放射性標識５ＷＡ２０およびＬＡＭ８間の小細胞
癌標的細胞に対する結合競合性の欠如（第１表）並びに
免疫吸着ｓＧ　Ｐ　ｓｏ−＋３ｓと抗体５ＷＡ２０との
反応性の欠如による乙のである［ンユターヘル等、「ラ
ング・キャンサーＪ（Ｌｕｎｇ　Ｃａｎｃｅｒ）、４（
１９８８）ｌ　ｌ　ｌ−１１４、ワイベル等、「キャン
サー・リサーチＪ（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、）４８（１
９８８）４３１８−４３１２１゜抗原自体の間における
相異は、１単位のべりオデートおよびノイラミニダーゼ
による処理後のベリオ、デートに対するｓＧ　Ｐ　＋ｏ
ｏの相対抵抗性およびｓＧＰ＋ｏｏの高分子量帯の残留
により示される。これらの発見は、幾つかの類似性にも
拘わらず、２種の抗体により認識される抗原は互いに相
異するということを明らかに立証している。

第１表 ＳＷ２細胞における放射性標識抗体５ＷＡ２０およびＬ
　Ａ　Ｍ　８を用いた競合的ラノオイムノアソセイ。

標識抗体　非標識抗体　　　　　％結合＊５ＷＡ２０　
　無し　　　　　　　　　＋００ＳＷＡ２０　　　　　
　　　７ ＬＡＭ８　　　　　　　７３ ＬＡＭＳ　　無し　　　　　　　　　＋００ＳＷＡ２０
　　　　　　　９７ ＬＡＭ８　　　　　　　２０ ＊非標識抗体が存在しない場合のパーセント結合として
表現。

抗原ＳＧＰ＋ｏｏおよびｓＧ　Ｐ　ｓｏ−＋、ｌｓが共
に発現する理由および大部分の正常細胞におけるそれら
の発現の欠如はまだ調べられていない。これらの抗原を
発現する小細胞癌細胞は、膜蛋白質の翻訳後シアリル化
に関与する酵素の活性において共通の変性を有すること
が推測され得る。

５ＷＡ２０に加えて、５ＷＡ２０と非常に類似した特性
を何し、同じ抗原を認識する別のモノクローナル抗体が
製造された。これらはそれらのアイソタイプと一緒に下
記の通り示される。

Ｓ　Ｅ　Ｎ　３　　　Ｉ　ｇ　Ｇ　＋ Ｓ　ＥＮ　１１　１　ｓＧ３ ＳＥＮ１２　　ＩｇＣ；２ｂ ＳＥＮ３１　　ＩｇＣ それらについてはさらに詳細に実施例６で記載する。

抗原のインヒポ検出においてこの発明のモノクローナル
抗体を使用する場合、検出可能に標識されたモノクロー
ナル抗体は、診断的に有効な用量で与えられる。「診断
的に有効な」なる語は、モノクローナル抗体か特異性を
示す小細胞癌抗原を有する部位の検出を可能にするのに
十分な壜で検出可能標識モノクローナル抗体が投与され
ることを意味する。投与される検出可能標識モノクロー
ナル抗体の濃度は、腫よう部位との結合が基底値シグナ
ルとの比較により検出され得るのに十分な濃度であるこ
とを要する。さらに、検出可能標識モノクローナル抗体
が循環系から急速に一掃されることにより最善の腫よう
対基底値シグナル比を得ることが望ましい。

概して、診断用の検出可能標識モノクローナル抗体の用
量は、個体の年令、性別および疾患の程度などの因子に
より異なる。モノクローナル抗体の用量は、約Ｌａｇ〜
約１０９、好ましくは約２１１９〜約１７の範囲で変動
し得る。

この発明のモノクローナル抗体はまた、動物の免疫治療
において、単独または治療剤と組合わせて使用され得る
。これらの薬剤は直接的または間接的にこの発明のモノ
クローナル抗体と結合され得る。免疫治療においてこの
発明のモノクローナル抗体と結合され得る治療剤の例と
しては、薬剤、放射性同位元素、免疫調節剤、レクチン
または毒素がある。

例えば、リシン（ｒｉｃｉｎ）は免疫治療的に使用され
ている毒性レクチンであり、これは、毒性に関与してい
るリシンのアルファーペプチド鎖を抗体分子に結合して
毒性作用の部位特異的放出を可能にすることにより行な
われる。実施例２は、この発明の抗体、５ＷＡ２０およ
びリシンのＡ噴量に形成されたイムノトキシンコンジュ
ゲートにより小細胞癌セルラインを処理すると、前記コ
ンジュゲートの細胞毒性作用を示す細胞による３Ｈロイ
ンンの組み込みか大きく低減することを立証している。

同様に、毒素、例えば微生物コリネバクテリウム・ジフ
テリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｄｉｐｈｔ
ｈｅｒｉａｅ）により生産されるジフテリア毒素フラグ
メントＡは、抗体に結合され、毒素分子の部位特異的放
出に使用され得る。これらの毒素フラグメントは、リン
カ−分子またはそれらの技術を用いて抗体に結合され得
るか、または別法として遺伝子融合およびハイブリッド
蛋白質の発現により直接的に製造され得る。

この発明のモノクローナル抗体と結合され得る他の治療
剤は公知であるか、または当業界の一般的熟練者により
容易に確認され得るものである。

この発明のモノクローナル抗体の投与における用量範囲
は、抗原ｓＧＰ、。０を発現する小細胞癌の症状が軽減
される望ましい効果を生じるのに十分な大きさの範囲で
ある。用量は、副作用、例えば望ましくない交差反応、
アナフィラキンー反応等を誘発する程度まで多くてはな
らない。−船釣に、用量は、憬者における年令、状態、
性別および突上の照度に左右されるが、当業界の熟練者
により決定され得る。用量は、約１１Ｎ９〜約１０９、
好ましくは約２Ｈ〜約１９の範囲で変動し得る。抗体は
、注射または時間をかけた漸進的潅流により非経口的に
投与され得る。この発明のモノクローナル抗体は、単独
またはエフェクター細胞と組み合わせて静脈内、腹腔内
、筋肉内、皮下、腔内または経皮投与され得る。

例えば５ＷＡ２０との反応性を示す抗原の単離および特
徴により、その抗原との反応性を示す追加モノクローナ
ル抗体の実質的に無限の生成の可能性が与えられるもの
とする。これは、当業界で周知の方法に従い実施され得
る。

また抗原自体は、小細胞癌の治療、例えば適当なワクチ
ンの製造における適用性を有し得る。

上記開示はこの発明を総括的に記載している。

以下、さらに完全に理解できろように具体的な実施例を
示すが、これらは説明を目的としているだけて、この発
明の範囲を限定ずろ意図はないしのとする。

［実施例］ 実施例１ 抗体の製造および精製 この発明のモノクローナル抗体を産生ずるハイブリッド
セルラインの生成および選択方法は報告されている［［
キャンサー・リサ、−チＪ（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５）±
６＋２０７７（１９８６）および「インターナショナル
・ジャーナル・才ブ・キャンサー（Ｉｎｔ、　Ｊ、　Ｃ
ａｎｃｅｒ）３５　：１１（１９８５）］。簡単に述べ
ると、小細胞癌セルラインＳＷ２の生存可能な細胞によ
りＢＡＬＢ−Ｃマウスを免疫化した。ひ１藏細胞を集め
、Ｎ５−１ミエローマ細胞と融合してハイブリドーマを
形成させた。選択された抗体は、セルラインＳＷ２とは
環状パターンの活性を示すが、白血病細胞（ＯＥＭ）、
肺の腺癌（Ａ５４９）または肺のへん平上皮細胞癌（Ｈ
ＯＹＺ）とは示さない抗体であった。さらに骨髄との陰
性反応性に関するスクリーニングおよびｒｇＧアイソタ
イプに関するスクリーニングにより、モノクローナル抗
体５ＷＡ２０を分泌するハイブリドーマセルラインの選
択を行った。

抗体の精製 結合緩衝液（１，５モルのグリシン／ＮａＯＨ，ＰＨ８
，９および３モルのＮａＣｆ２）中で培養上清の３０−
５５％硫酸アンモニウムフラクノヨンをプロティンＡに
吸着させることにより抗体５ＷＡ２０を精製した。結合
した免疫グロブリンを１００ミリモルのくえん酸緩衝液
（ｐＨ４、５）により脱着し、０、ＯｌミリモルのＣａ
Ｃ１ｔを含むｌＯミリモル燐酸緩衝液（ｐＨ６，８）に
対して透析した。次いで抗体をヒドロキシアパタイトカ
ラム（バイオゲルＨＰＨＴ）に適用し、−次勾配で３５
０ミリモル燐酸に溶離させた。活性フラクションをプー
ルし、ＰＢＳに対して透析し、スピード・バック・コン
セントレータ−で濃縮し、別の用途のため一７０℃で貯
蔵した。

パラームの方法［「メソッズ・イン・エンザイモロジー
Ｊ（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）　
７３　（１９８１）４０７］に従い抗体ＬＡＭ８を精製
した。簡単に述べると、これは、培養上清の３０−５５
％硫酸アンモニウムフラクノヨンをＰＢＳ中スーパロー
ズＩ２プレツブ・カラム（ファルマシア）に適用するこ
とにより行なわれた。ＩｇＭに関して陽性のピークをプ
ールし、５ミリモルのトリス（ｐＨ７）に対する透析に
より沈澱させ、・１℃で１時間４５０００ｇでの遠心分
離により集めた。ＬＡＭ８抗体をＰＢＳに再溶解し、滅
菌ろ過し、後で用いるため４℃で貯蔵した。

クロラミン−Ｔ方法により精製抗体５ＷＡ２０を標識し
て比活性５００μＣ１／ｚｇにした。精製ＬＡＭ８抗体
を固相ヨウ素化システム（プロタッグ−１２３）により
標識して比活性５４μＣ１／ｘｇとした。トリクロロ酢
酸取り込みにより、活性の９６％が沈澱させられた。標
識後の標的取り込みを測定すると、抗体５ＷＡ２０の場
合的５０％および抗体ＬＡＭ８の場合７１％に達した。

実施例２ 抗体−毒素コンジュゲート 漂■的結合技術によりモノクローナル抗体５ＷＡ２０お
よびリンンのＡ消量のイムノトギシンコンジュゲートを
形成させた。生成したイムノトキシンの様々な希釈液を
、５０ナノモルのイオン透過剤Ｈ９Ａ−モネノンを加え
、またはこれを加えずに、９６ウエルマイクロプレート
中１０５細胞の濃度で小細胞癌セルラインＮＣＩ　−ｈ
６９の細胞と一夜インキユベーシコンした。３Ｈ−ロイ
シンを加え、４時間後に取り込みを測定した。

第２表 イムノトキシン　　　　　　　　ＩＣ５゜リノンーＡ及
びＨＳ　Ａ−モネンン　　１０−１′モル５ＷＡ２０−
リンンーＡ　　　　　５ＸｌＯ−’モルＳ胃Δ２０−リ
シンーＡ及びモネンン　５Ｘ　１０−”モル実施例３ セルラインにおける抗原の免疫学的検出ｌ、免疫蛍光染
色法。

この手順は既に報告されている［「キャンザー・リザー
チＪ（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、）４６（１９８６）２０
７７］。簡単に述へると、細胞を１管当たり２×１０５
個のアリコートに分け、２５μＱの上清と６０分１ｊ１
３７°Ｃでインキユベーシヨンし、洗浄し、５０μ夕の
フルオレノン−コンジュゲートやぎ抗マウス抗体とイン
キュベーションした。

２、固相ラジオイムノアッセイ この方法では、標的細胞を９．６ウエルプレートに結合
させた。つ、エルをポリーＬ−リジンで被覆し、５ＸＩ
Ｏ’細胞をゲルタールアルデヒドにより各ウェルに固定
した。プレートをＰＢＳ中１％ＢＳＡおよび０２％アジ
化ナトリウムと共に４°Ｃて貯蔵した。使用前に、ウェ
ルを洗浄媒質（トリス、要衝食塩水、５％脱脂粉乳およ
び１％ゼラヂン）と３０分間インキユベーソヨンするこ
とにより非特異的結合を防いだ。セルラインのパネルに
おける抗体結合を調べるために、ＳＷ２細胞において結
合させる飽和濃度の上滑を使用した。１時間のインキュ
ベーション後、プレートをＰＢＳおよび１％ＢＳＡによ
り４回洗浄し、１．ｓ（−やぎ抗マウスＩｇＧ免疫グロ
ブリン（０，２μＣ１１５０μａ）を各ウェルに加えた
。各プレートを再び前と同様に洗浄し、各ウェルを切り
取り、１分間ガンマカウンターで計数した。同じ実験を
３回行った。

ＳＷ２細胞における１００％抗体結合に対する典型的計
数値は約２００００ｃｐｍであった。

第３表 間接免疫蛍光法（Ｉ　Ｐ）および固相放射線免疫検定法
（ＲＩ　Ａ）により測定された小細胞癌セルラインに対
する抗体５ＷＡ２０の結合（ただし、結果は、小細胞癌
セルラインＳＷ２におけるパーセンテージ結合として表
す）。

セルライン　　　　　ＩＦ　　　　ＲＩＡＳＷ２　　　
　　　　　　＋　　　　１００ＮＧ−１−Ｈ６９＋　　
　　　９０ ０Ｈ−１＋　　　　　８８ ＯＥＭ−９５＋　　　　　　　　３４ ０Ｈ−３０１２ ＺＬ−２０８ ＨＣ−１−Ｈ−１２８０４ ０Ｍ２２２　　　　　　　　　０　　　　　　　　０第
４表 間接免疫蛍光法（Ｉ　Ｆ）および固相放射線免疫検定法
（ｒ（Ｉ　Ａ）により測定された小細胞癌以外の腫よう
セルラインに対する抗体５ＷＡ２０の結合（ただし、結
果は、小細胞癌セルラインにおけるパーセンテージ結合
として表す）。

セルライン　　　　　　　　　　ＩＦ　　ＲＩＡ肺癌： 腺癌　　　　　　Ａ３４９　　　０　　　ｔ。

へん平上皮細胞癌Ｓｋ−Ｍｅｓｌ　　　０　　１５Ｃａ
Ｌｕｌ　　　　　０　　　９ 肺以外の腫よう： 乳癌　　　　　　ＭＣＦ−７０２１ Ｔ４７０　　　　　０　　　　１４ ＺＲ７５−１０９ ＢＴ２０　　　　　０　　　２６ 結腸癌　　　　　５ＷＡ８０　　０　　　５白而病　　
　　　ＣＥＭ　　　　　０　　　０実施例４ 組織における抗原の免疫学的検出 抗原検出を目的とする組織の免疫ベルオキンダーゼ染色
は、２法のうちの一方で実施され得る。

１、アビジン−ビオチン方法。

パラフィン埋封組織ブロックから得られた断片を５μ屑
に切り、ゼラチン被覆ガラススライド上に載せ、３７℃
で１６−１８時間インキユベーンヨンした。次いで断片
をキルン中で脱パラフイン化し、精製アルコールにおい
て再水和し、ＰＢＳ中で洗浄した。続いてインキユベー
シヨンを湿度室において３７℃で行った。１５分間新た
に；Ａ製した１％Ｈ２０ｔ　（メタノール中）により内
在性ベルオキンダーゼ活性をクエンチングした。この切
片をＰＢＳ中で２回リンスした後、正常やぎ（ＬＡＭ８
）または正常うま（ＳＷＡ２０）血清と１０分間インキ
ユベーンヨンすることにより、非特異的基底値染色を減
少さ仕た。６片を１００μＱの抗体（未希釈培谷上ｌｎ
）に２時間暴露し、ＰＢＳ中で十分洗浄し、次いでヒオ
チニル化やぎ抗マウス■ｇＭ（ＬＡＭ８）またはピオヂ
ニル化うま抗マウスＩｇＧ（ＳＷＡ２０）と１０分間イ
ンキユベーンヨンした。試料を再びＰＢＳ中で洗浄し、
アビジンヒオチンコンジュゲート西洋わさびペルオキシ
ダーゼにより１０分間処理した。ＰＢＳ中で洗浄後、切
片を新たに調製したベル、オキシダーゼ基質（３−アミ
ノ−９７エチルカルバゾールＡＢＣ。

Ｈ２Ｏ，、酢酸緩衝液中、ｐＨ５，２）に１５分間暴露
し、ＰＢＳ中で洗浄し、メイヤース・ヘマラウン（Ｍａ
ｙｅｒｓ　ｈｅｍａｌａｕｎ）を用いて対比染色した。

ＰＢＳおよび蒸留水中で洗浄後、切片をグリセリンゼラ
チンに固定した。非免疫マウス血清とインキユベーシヨ
ンした小細胞癌片は陰性対照として用い、両抗体と陽性
染色を示す小細胞癌片は陽性対照として用いた。光学顕
微鏡により評価された赤血球沈澱により陽性反応が示さ
れた。

第５表 抗体５ＷＡ２０による免疫ペルオキシダーゼ染色により
測定された一次肺腫ようおよび正常肺におけるシアロ糖
蛋白質抗原ｓＧ　Ｐ　＋ａｏの発現。

腺癌 大細胞癌 偏平上皮細胞癌 中皮腫 肺カルチノイド 正常な肺気管支 および実質組織 （０）　　（Ｚｏｏ） ＊　小細胞癌として分類された二次切除におけるバイオ
プシー ＋＋＋＋：＞５０％の陽性細胞、 ＋モ＋。１０％〜５０％、 ＋＋：＜１０％゛、 ＋、ごく僅かの陽性細胞、 ０、無し。

２、アルコール−亜鉛−ポルミル溶液に固定した組織を
５μｎ片に切断し、接着スライドに載せた。切片を脱パ
ラフイン化し、メタノールペルオキシドおよび遮断試薬
として２％ぶた血清により処理した。切片を１：５００
以下の希釈率で抗体により被覆し、室温で１時間インキ
ユベーンヨンした。０．０５モルのトリス緩衝液（ｐＨ
７，６）で洗浄後、１．３０の比率で希釈したペルオキ
シダーゼ・コンジュゲートぶた抗うさぎ免疫グロブリン
およびｌ：６０の比率で希釈したペルオキシダーゼ・コ
ンジュゲートぶた抗うさぎ免疫グロブリンを連続的に加
えた。反応を３，３°−ジアミノベンジノン四・−水化
物（２０ｘ９／　１０ｘＱ、トリス緩衝液中）により局
在化した。スライドをヘマトキンリンを用いて対比染色
した。灯！！！＋試験は；１１（関係な抗体との置き換
えを含んだ（抗白血球共有抗原）。

第６表 抗体ＳＷΔ２０を用いた腫よう組織の免疫ベルオギシダ
ーゼ染色。

肺肝よう 小細胞癌 腺癌 へん平上皮細胞癌 大細胞癌 中皮腫 カルチノイド 肺以外の腫よう 乳癌 胃の腺癌 結腸１１１６ 卵巣癌 冑細胞癌 ÷０００００００００ ■φφφΦ◆＋＋００ ｏｏｏｏｏ。

ｏｏｏｏ。

ランゲルハンス島細胞癌 メラノーマ 多形性神経こう腫 寡突起神経こう腫 髄芽細胞腫 神経芽細胞腫 節神経腫 染色陽性細胞の比率：　　ｌ＞５０％ φ＝１０−５０％ ÷＜１０％ ０＝染色せず。

第７表 抗体５ＷＡ２０を用いた正常組織の免疫ペルオキシダー
ゼ染色。

匹蝮縁　　　　　　試験数　反応性 腺気管支　　　　　　ＩＯ希少陽性細胞＊肺実質組織　
　　　　ＩＯ陰性 胃　　　　　　　　　　！　　陰性 結腸　　　　　　　　　２　　陽性、細胞の１０％肝臓 すい臓、外分泌腺 すい臓、島 冑臓 市立腺 ひ臓 リンパ節 皮膚 母斑 下垂体前葉 脳 末梢神経 ＊２％未満の陽性細胞。

実施例５ 抗原の性質分析 陰性 陰性 希少陽性細胞 陰性 陰性 陰性 陰性 陰性 陰性 陰性 陰性 陰性 １．９ＤＳからニトロセルロースへ移された抗原。

オーファレルの緩衝系を用いて還元条件下、■ ０％ＳＤＳ ポリアクリルアミ ドゲルにおいて電 気泳動を行った。移動緩衝液［４９，６ミリモルのトリ
ス、３８４ミリモルのグリシノ、２０％メタノール（Ｖ
／Ｖ）］および０．Ｏ１％ドデシル硫酸リヂウム中にお
いて、始めに低電流密度（１ｍＡ　／　Ｃｌ１１”）で
１時間低分子量分子を溶離させ、次いで高ｙｌ流密度で
（２０時間）長い期間電気移動させる２段階手順でのオ
ッターの方法［「アナリティカル・バイオケミストリー
Ｊ（Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、）、１６２（１９８
７）３７０］に従い、５ｘｌＯ６細胞のアリコートを電
気泳動的に０．２μｌニトロセルロース上に移動させた
。電気泳動後、ニトロセルロースシートを風乾し、５％
脱脱脂乳乳含有トリス緩衝塩水（ＴＢＳ、２５ミリモル
のトリス、０．５モルのＮａｃＱＳｐＨ８）中でインキ
ュベーション（３０分間）することによりクエンチング
した。次いでシートを２４時間４℃で連続回転させなか
らＬ　Ａ　Ｍ　８および５ＷＡ２０上清中でインキュベ
ーションした。

クエンチング緩衝液および０．０５％トゥイーン２０に
より洗浄後（１０分間、３回）、シートを、アフィニテ
ィー精製ペルオキシダーゼ−゛コンジュゲートやぎ抗マ
ウスＩｇＭ（μ鎖特異的）（ＴＢＳおよび２０％胎児う
し血清中１：１０００の比率で希釈）、またはやぎ抗マ
ウスＩｇＧ（１：５００の比率で希釈）と１時間インキ
ュベーションした。萌と同様に洗浄後、基質として４−
クロロ＝■−ナフトールを用いてペルオキシダーゼ活性
が立証された。

２、免疫吸着。

免疫吸着の場合、細胞抽出物を一夜ＬＡＭ８抗体とイン
キュベーションし、やぎ抗マウス１ｇＭアガロースに吸
着させた。大規模洗浄後、抗原を９モル尿素により溶離
し、Ｓ　Ｄ、、Ｓ、−Ｐ　Ａ　Ｇ　Ｅに適用した。ブロ
ッティング後、個々のストリップをＬＡＭ８（ＩｇＭ）
、ＳＷＡ４（ＬＡＭ８ときっ抗しないＩｇＭ抗体）およ
びＳＷＡ２０（ＩｇＧ）とインキュベーションし、前と
同様に展開した。結果を第５図に示す。

３、薄層クロマトグラムにおける抗原。

糖脂質を次の要領で５ＷＡ２細胞から分離した。

細胞沈澱物（１０７細胞）をＰＢＳで２回洗浄し、凍結
乾燥した。３回２分間の音波処理によりクロロホルムお
よびメタノール（２：１体積比）を用いて脂質を抽出し
た。抽出物を０．２２μｌフイルターでろ過し、スピー
ド・バック・コンセントレータ−で濃縮した。粗糖脂質
に対し、クロロホルム、メタノール・０．２５％に、Ｃ
ｆ！（５：４　：　Ｉ　）中、高性能薄層クロマトグラ
フィーシリカプレートによるりａマドグラフィーを行っ
た。乾燥後、プレートをニンヒドリン噴霧試薬により展
開するかまたは次の要領で免疫染色した。クロマトグラ
ムをＰＢＳおよび５％脱脱脂乳乳中室温２時間浸漬する
ことにより非特異的結合をクエンチングした。プレート
を一夜上清中でインキュベーションし、前と同様に２回
洗浄しく３０分間）、アフィニティー精製ペルオキシダ
ーゼ−コンジュゲートやぎ抗マウスＩ　ｇＧ　（Ｐ　Ｂ
　Ｓおよび１０％うま血清中１：５００の比率で希釈）
と２時間インキュベーションした。前と同様に洗浄後、
基質として４−クロロ１〜ナフトールを用いてペルオキ
シダーゼ活性が立証された。

４、ＳＷ２セルラインからの抗原の抽出。

ウェスタン・プロット分析の場合、細胞をＰＢＳ中で１
回洗浄し、水冷ＰＢＳ中５０ミリモルのオクチル−ベー
ターＤ−チオグルコシド、２５ミリモルのオクチルグル
コシド、１ミリモルのＥＤＴＡ、１ミリモルのフェニル
メチルスルホニルフルオリド、０．１ミリモルのロイペ
プチドおよび５０μ９／ｆｆＮのペプスタチンＡに３０
分間可溶化した。１時間１３００００Ｘｇで遠心分離後
、上清を２５％、５０％、７５％および１００％硫酸ア
ンモニウムにより段階的に沈澱させ、ＰＢＳに対して透
析し、スピード・バック・コンセントレータ−で濃縮し
た。５０−７５％硫酸アンモニウムフラクションをＬＡ
Ｍ８および５ＷＡ２０抗原のウェスタン・プロット分析
に使用した。

５、抗原のベリオデートおよび酵素およびレクチン処理
。

ａ）抗原のベリオデート処理の場合、１０’細胞から成
るアリコートを室温で１５分間５ミリモル、１０ミリモ
ル、２０ミリモルおよび４０ミリモルのベリオデート（
ｐＨ７，０）とインキュベーションした。エチレングリ
クールにより反応を止めた。

ｂ）レクチンによる競争的ラジオイムノアッセイの場合
、ウェルを、】ウェル当たり０　、　ｌ　ｍｇのウレツ
クス・ユーロベウス（ＵＩｅｘ　ｅｕｒｏｐａｅｕｓ）
、トリティクム・ブルガリス（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ　ｖｕ
ｌｇａｒｉｓ）またはコンカナバリンＡと６０分間プレ
インキュベーンコンした。

Ｃ）酵素処理の場合、標的細胞を４時間３７℃てｌ単位
のノイラミニダーゼまたはＩＲ９もしくは１０ｍｇの混
合グリコシダーゼまたは１単位のキモトリプシンまたは
１単位のトリプシンとブレインキュベーションした。グ
リコシダーゼは、０．３単位７１０　ｍｇのマンノシダ
ーゼ、０．３単位のガラクトシダーゼ、０．３単位のフ
コシダーゼ、１．７単位のアセデルグルコサミニダーゼ
および０．５単位のアセチルガラクトサミニダーゼを含
むカロニア（Ｃｈａｒｏｎ　ｉａ）口蓋肺由来のエキソ
グリコノダーゼの混合物である。

第８表 ベリオデ−１・らしくけ酵素により前処理またはレクチ
ンとプレインキュベーンヨンされたＳＷ２標的細飽にお
いてＲＩＡを用いた抗体５ＷＡ２０により認識されるエ
ピトープの特徴。小細胞癌セルラインにおけるパーセン
）・結合として表した結果をＬ　Ａ　Ｍ　Ｆ３の場合と
比較する。

５ＷＡ２ＯＬＡＭＢ ベリオデート処理　　５ｍＭ　　　１０３　　６４１０
ｍＭ　　　　８９　　５４ ２０ｍＭ　　　　７５　　３４ ４０ｍＭ　　　　６８　　２７ 酵素処理 ノイラミニダーゼ ０．１単位、１単位 混合グリコシダーゼ０．１ｍｇ １、ＯＲ９ １０、ＯＲ９ レクチン・プレインキュベーン ウレックス・ユーロペウス トリティクム・ブルガリス コン トリティクム・ブルガリス　　９８　　　１００（スク
シニル化） コンカナバリンＡ　　　　　　　９８　　５７実施例６ 別の抗体 実施例Ｉと同様の方法で、さらに別の下記モノクローナ
ル抗体が得られた。

５ＥＮ３　　（ＩｇＧ＋） ＳＥＮｌ　１（ＩｇＧ３） Ｓ　Ｅ　Ｎ　ｌ　２　（Ｉ　ｇＧ　２ｂ）ＳＥＮ３１（
ＩｇＧ、） これらは前記５ＷＡ２０と非常に類似した特徴を有し、
同じ抗原を認識する。このことは下記の事項から明らか
である。

ａ）それらは、１９種の小細胞癌セルライン、すなわち
ＳＷ２、Ｃ０ＲＬ４７、Ｃ０ＲＬ、２４、Ｃ０ＲＬ８８
、ＧＥＭ９５、Ｈ６０、Ｈ６９、ＯＨ１、ＬＸＩ、Ｈｌ
　２８、ＯＨ３、ＺＬ２、Ｄ、Ｃ５７１、Ｈ２４９、Ｎ
４１７、Ｈ５２４、Ｈ４４６およびＨ５２６において等
しいセルライン反応性パターンを有する。

ｂ）＃素に対する抗原の感受性は非常に類似している。

第９表 酵素＋ベリオデートに対する抗原の感受性（％） モノクローナル抗体 ５ＥＮ３５Ｅｌ１１１５ＥＮ１２５ＥＮ３１５ＷＡ２０
酵素 トリプシン（１単位） キモトリプシン （１単位） ノイラミニダーゼ、 （０，２単位） 混合グリコシダーゼ （１肩９） （ｆｏｚｇ） ペリオデート（５ｍＭ） （５０ｎ＋Ｍ） Ｃ）それらはイムノプロットにおいて類似パターンを呈
する。

ｄ）間接免疫検定において、それらはＳ　’、Ｖ　２標
的細、抱結合に関して直接的競合を示ケ。

第１０表 マークしたモノクローナル抗体 ５ＥＮＩｌ＊　　５ＩＥＮＩ２＊　　５ＥＮ３１＊　　
５ｗＡ２０＊Ｓ１ミＮ３　　　４９　　　１５　　４３
　　　２２ＳＥＮＩＩ　　　　１４　　　　７　　２１
　　　　４ＳＥＮ１２　　４３　　　１７　　５７　　
　２５ＳＥＮ３１　　　　７　　　　７　　　９　　　
　４ＳＷＡ２０　　３３　　　１４　　４７　　　　９
＊＝非競合抗体に対して正規化した％結合。

これは上記モノクローナル抗体が全て同じ抗原を認識す
ることを強く示唆している。

【図面の簡単な説明】

第１図は、正常１ｇＧ（ＮＩｇＧ）と比較した、投与の
４日後におけるモノクロナール抗体５ＷＡ２０の組織間
の分布を示すグラフである。 第２図は、抗体５ＷＡ２０（Ａ）および各々Ｌ　ＡＭ８
（＋、（）による展開１７ｉ７の抗原ｓＧ　Ｐ　９０−
１３１１およびＳＧ　ｒ’＋ｏｏに対する様々な酵素の
作用を示すＳ　Ｗ　２；＋ｌ＋胞の免疫プロットの図で
ある。 第３図は、抗体５ＷＡ２０と結合したパラフィンｊＩＬ
Ｉ分の免疫ベルオキンダーゼ染色を示す。 第４図は、抗体５ＷＡ２０（Ａ）およびＩ、　Ａ　Ｍ　
８（Ｉ３）により展開された小細胞癌セルライン抽出物
の免疫プロットの図である。 第５図は、異なる抗体により展開され、やぎ抗マウスＩ
ｇＭ（μ）およびやぎ抗マウスＩｇＧにより染色された
免疫吸着ＬＡＭ８３原の免疫プロットの図である。 特許出願人　サンド・アクチェンゲゼルシャフト代　理
　人　弁理士前　山　葆　はかＩ名図面の／４）古（内
容に変更なし） ＦＩＧ、　　２ 図面の浄８（内容に変更なし） ＦＩＧ、４ 」 図面の浄書（内容に変更なし） 図面の浄書（内容に変更なし］ ＦＩＧ、　５

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. （１）肺の小細胞癌の腫よう関連細胞表面膜発現抗原に
   特異的であり、実質的に非特異的反応性を示さないこと
   を特徴とする、モノクローナル抗体またはそのフラグメ
   ント。
2. （２）肺の小細胞癌の細胞表面膜発現抗原（ただし、こ
   の抗原はシアリル化糖蛋白質であり一連の低および高電
   流密度下、ニトロセルロースフィルター上への電気泳動
   的移動による小細胞癌細胞抽出物の５０−７５％硫酸ア
   ンモニウムフラクションの免疫ブロッティングにより示
   されたところによると、４００００、１０００００およ
   び１８００００の分子量帯を示す）を同定することを特
   徴とする、請求項１記載の抗体または抗体フラグメント
   。
3. （３）ＩｇＧアイソタイプに属する、請求項１記載の抗
   体または抗体フラグメント。
4. （４）ＩｇＧ２ａアイソタイプに属する、請求項３記載
   の抗体または抗体フラグメント。
5. （５）ハイブリドーマセルライン￥ＥＣＡＣＣ￥８８０
   ３０２０１により産生されまたはこれに由来する、請求
   項１記載の抗体または抗体フラグメント。
6. （６）ＳＷＡ２０である、請求項１記載の抗体。
7. （７）シアリル化糖蛋白質であり、一連の低および高電
   流密度下、ニトロセルロースフィルター上への電気泳動
   的移動による小細胞癌細胞抽出物の５０−７５％硫酸ア
   ンモニウムフラクションの免疫ブロッティングにより示
   されたところによると、４００００、１０００００およ
   び１８００００の分子量帯を示すことを特徴とする、肺
   の小細胞癌の一部分の細胞表面膜において選択的に発現
   される腫よう関連抗原。
8. （８）シアリル化糖蛋白質であり、請求項１記載の抗体
   または抗体フラグメントにより同定されることを特徴と
   する、肺の小細胞癌の一部分の細胞表面膜において選択
   的に発現される腫よう関連抗原。
9. （９）請求項１記載のモノクローナル抗体を分泌し得る
   ハイブリドーマセルライン。
10. （１０）セルラインＥＣＡＣＣ８８０３０２０１である
    、請求項９記載のハイブリドーマセルライン。
11. （１１）請求項７または８記載の抗原の検出方法であっ
    て、前記抗原を含む疑いのある材料を、検出可能な手段
    で標識された抗体または抗体フラグメントの診断有効量
    と合わせ、前記抗体が前記材料と結合したか否かを測定
    することを含む方法。
12. （１２）肺の小細胞癌の抑制方法であって、処置を必要
    とする対象に請求項１記載の抗体または抗体フラグメン
    トの治療有効量を投与することを含む方法。
13. （１３）抗体がハイブリドーマセルラインＥＣＡＣＣ８
    ８０３０２０１により生産されるものである、請求項１
    ２記載の方法。
14. （１４）肺の小細胞癌の抑制に十分な量の請求項１記載
    の抗体または抗体フラグメントおよび医薬用担体を含有
    する医薬組成物。
15. （１５）肺の小細胞癌の抑制に使用される、請求項１記
    載の抗体または抗体フラグメント。