JPH02219594A - 肺癌に対するモノクローナル抗体および細胞表面抗原 - Google Patents

Abstract

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め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ この発明は、肺の小細胞癌の抗原に対するモノクローナ
ル抗体、これらの抗体を産生ずるハイブリッド・セルラ
インおよびこれらのモノクローナル抗体の使用方法に関
するものである。

［従来の技術］ 肺癌は、現在西側諸国において最も死亡率の高い悪性疾
患に含まれ、当面この状態は続くと予想される。肺癌の
５つの主要群のうち、小細胞癌（ＳＣＣ）のみ化学的お
よび放射線感受性の高いことが観察されているが、ＳＣ
Ｃ患者の予後は依然として非常に悪い状況である。ＳＣ
Ｃ患者の約６０％では最初に症状が現れた時点で転移し
ており、手術または放射線治療の使用が制限されるため
、化学療法の使用に強（頼ることになる。ＳＣＣの予後
が悪いのは、初期に広範な転移が見られ、成長速度が高
く、処理後に化学耐性が現れることと関連している。

この侵襲性は、ＳＣＣに対する全身的効果を有する新規
薬剤の開発の必要性を示している。

他方、悪性疾患の診断、イメージングおよびさらに治療
におけるモノクローナル抗体（Ｍａｂｓ）の使用は、ま
すます現実的な目標となっている。すなわち免疫療法、
例えば放射能免疫療法によるモノクローナル抗体を用い
たＳＣＣの処置は、特に魅力的な提案として考えられる
。

不幸にして、これらの適応症に適したモノクローナル抗
体は非常に稀である。すなわち、例えば放射能免疫療法
の場合、現在利用可能なモノクローナル抗体よりも望ま
しい特性を有する、例えば踵よう対血液および腫よう対
組織の比率が高いモノクローナル抗体が要望されている
。また、これらの短所は、ネズミモデルにおいて成長さ
けたヒト腫よう異種移植片の放射能免疫治療処置により
これまで達成された成果が制限されていることにより立
証されている。−試験では、放射能感受性神経芽腫の完
全除去が報告されているが、他の症例は、腫ようが発生
してからの時間に対する高い依存性を示しており、充分
確立された試験では成長の阻害が制限されているにすぎ
ない。

ＳＣＣの表面抗原に対して生成されるモノクローナル抗
体は、それらの標的抗原の性質および発現性並びに他の
免疫学的特徴に従い分割され得ろ。

ＳＣＣに関するインターナショナル・ワークショップ（
ロンドン、１９８７年）では、クラスター（Ｃ１ｕｓｔ
ｅｒ）と呼ばれる５つの群が定義された［ザ・ランセッ
ト（Ｔｈｅ　ＬａｎｃｅｔＸ　１９　Ｂ　７年８月８日
）３２５頁コ。それらのクラスターの一つは、クラスタ
ーｗ４である。

［発明の構成］ この発明は、肺の小細胞癌の診断および免疫療法での使
用に適し、ＳＣＣに関するインターナショナル・ワーク
ショップ（ロンドン、１９８７年）で定義されたクラス
ターｗ４に属する例えばＩｇＧアイソタイプのモノクロ
ーナル抗体を提供する。

この発明のさらに別の目的は、クラスターｗ４に属する
、例えばＩｇＧアイソタイプのモノクローナル抗体を用
いた肺の小細胞癌の診断および処置方法、例えばそれら
の抗体を用いた動物における肺の小細胞癌の抑制方法の
提供である。

さらにこの発明ば、これらのモノクローナル抗体を産生
するハイブリッド・セルライン並びにこれらのモノクロ
ーナル抗体の使用法および製造法を包含する。

さらにこの発明は、上記モノクローナル抗体が結合する
新規抗原を提供する。

この発明の新規モノクローナル抗体は、非常に高いイン
ビボ局在能、非標的器官における比較的低い保持性およ
び標的腫ようにおける持続性を特徴とする。これらの特
性を有することから、それらは、診断、および特に例え
ばＳＣＣのイメージングまたは治療を目的とする細胞毒
または同位体の選択的送達用担体（ビヒクル）としての
治療適用に適している。

好ましいものは、モノクローナル抗体ＳＷＡ１１．ＳＷ
Ａ１２およびＳＷＡ２２、特にＳＷＡ　１１である。

肺の小細胞癌とは反応性を示すが、非小細胞癌および正
常組織との反応性は限られているモノクローナル抗体の
能力は、これらの腫ようの検出およびこれらのモノクロ
ーナル抗体の免疫療法的使用に関して非常に重要である
。

［好ましい実施態様コ この発明は、ＳＣＣに関するインターナショナル・ワー
クショップ（ロンドン、１９８７年）で定義されたクラ
スターｗ４に属する、好ましくはＩｇＧ１例えばＩｇＧ
２ａ、ＩｇＧ２ｂまたは１ｇＧ３アイソタイプのモノク
ローナル抗体に関するものである。これらのモノクロー
ナル抗体は、肺の小細胞癌において選択的に発現され、
他の肺癌および非肺癌および正常組織においてはほとん
ど発現性を示さず、他の既知抗原と一致するとは思われ
ない腫よう関連抗原を認識する。ヒト末梢血液軟膜の全
白血球集団の約５％については何等かの抗体反応性が観
察される。この反応性は、成熟か粒球の約４０％に制限
される。

それらのモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ
の一般的生産方法は、当業界における通常熟練者によく
知られている。使用される技術の例には、［キャンサー
・リサーチＪ（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、）４６（１９８
６年）２０７７頁に記載されているものがある。簡単に
述べると、ＢＡＬＢ−ＣマウスをＳＷＡ２小細胞癌セル
ラインの生存可能な細胞により免疫化する。動物を殺し
た後、ひ臓細胞をＮ５−１ミエローマ・セルラインと融
合させ、ＳＷ２セルラインを用いてハイブリドーマをそ
れらの抗体産生能についてスクリーニングする。

標準方法に従い、高いインビボ局在能、非標的器官にお
ける低い保持性および標的腫ようにおける持続性の測定
を含めてさらにスクリーニングを行うと、クラスターｗ
４、特にＳＷＡＩＩ、ＳＷＡ２１およびＳＷＡ２２に属
するモノクローナル抗体を分泌する一群のハイブリドー
マ・セルラインが選択される。

例えばＳＷＡＩＩを含む第一サブグループは、ヌードマ
ウスにおいて成長させた異種移植片への非常に強い局在
性により立証されたところによると、ＳＷ２標的細胞に
関する高い親和力を示し、会合定数Ｋａが約Ｉ　Ｘ　１
０’モルー１またはそれより高いことを特徴としている
。

例えばＳＷＡ２１およびＳＷＡ２２を含む第二サブグル
ープはＳＷ２標的細胞に関してより低い親和度を示し、
親和定数Ｋａが約１０７および約ｌＯｓモル−１の間で
あることを特徴としている。

ＳＷＡＩＩを分泌するハイブリドーマ・セルラインは、
ブダペスト条約の規定の下、１９８８年８月４日に寄託
番号８８０８０３０１としてヨーロピアン・コレクショ
ン・オブ・アニマル・セル・カルチャーズ（ＥＣＡＣＣ
Ｘイギリス国、ボートン・ダウン）に寄託された。

上述のスクリーニングについては［実施例コにおいて詳
しく説明する。この発明のモノクローナル抗体、特にＳ
ＷＡＩＩは、特に、 一セルライン反応性の例外的パターン、すなわち、ＳＷ
ＡＩＩがこれまで試験された全てのＳＣＣセルラインと
反応する点、 インビボでのＳＣＣ腫よう（ヌードマウス異種移植片）
に対する顕著な組織特異性、 −高い結合親和力、 一標的腫ようにおける持続性 の点から、ＳＣＣの診断および特に治療における使用に
非常に適していることが示された。

この発明のモノクローナル抗体は、本質的に当業界で公
知の方法に従い使用され得る。

それらは、例えば誘導体化され得る。

すなわち、抗イデイオタイプ抗体が製造され得、その場
合の技術は当業界の通常熟神者の能力の範囲内であるこ
とが予想される。簡単に述べると、抗イデイオタイプ抗
体は、興味の対象である抗体上に存在する特有の決定基
を認識する抗体である。

すなわち、モノクローナル抗体、例えばＳＷＡＩＩを動
物に注入し、それをそのまま原モノクローナル抗体産生
細胞の供給源として使用した。免疫化された動物は、免
疫抗体のイディオタイプ決定基を認識し、これらのイデ
ィオタイプ決定基に対する抗体（抗イデイオタイプ抗体
）を産生ずることにより応答する。これらの抗イデイオ
タイプ抗体は、興味の対象である特定抗原にそれ自体特
異的なモノクローナル抗体に特異的であり、別の宿主に
注入された場合、抗（抗イデイオタイプ）抗体の産生を
刺激する。抗（抗イデイオタイプ）抗体は、原モノクロ
ーナル抗体と同じ特異性を示し、それら自体興味の対象
である抗原を同定する。そのようなシステムを使用する
利点は、興味の対象である抗原を有する最終宿主で産生
された抗体がその宿主に内在するものであり、非常に大
量に自然生産され得ることである。また、非常に少量の
抗イデイオタイプ抗体を最終宿主に投与するだけでよく
、それらの量は免疫応答を刺激するだけで充分である。

また抗イデイオタイプ抗体は、この発明のモノ、クロー
ナル抗体の特異性を有するモノクローナル抗体を分泌す
る他のハイブリドーマ・セルラインの単離に使用され得
る。この抗イデイオタイプ・スクリーニングは、当業界
の一通常熟練者により容易に達成され得る。簡単に述べ
ると、抗イデイオタイプ抗体は、前記に従い製造され、
単一ハイブリドーマにより産生されたモノクローナル抗
体に特異的である、これらの抗イデイオタイプ抗体を用
いることにより、免疫化に使用されるハイブリドーマの
抗体と全く同じイディオタイプを有する他のクローンの
同定が可能である。２種のハイブリドーマのモノクロー
ナル抗体間のイディオタイプ同一性は、２種のモノクロ
ーナル抗体が同じエピトープ性決定基を認識する点に関
して同じであることを立証している。すなわち、モノク
ローナル抗体上のエピトープ性決定基に対する抗体を用
いることにより、同じエピトープ特異性を示すモノクロ
ーナル抗体を発現する他のハイブリドーマの同定が可能
である。抗体において、これらのイディオタイプ決定基
は、所定のエピトープに結合する高変異性領域に存在す
る。

第二受容者の種類における１種の外来ドナーモノクロー
ナル抗体の使用は、普通インビボ免疫療法または免疫診
断における要素ではないが、生じ得る潜在的問題は、ド
ナー抗体に存在する抗原決定基に対する宿主による副免
疫応答の発生である。

この副応答は、宿主におけるドナー抗体のインビボ使用
を縮小させるほど激しい場合もあり得る。

さらに、この副宿主応答は、ドナー抗体の悪性腫よう抑
制効果の妨害を助長し得る。宿主において生じる副免疫
応答の可能性を打破し得る一方法は、キメラ抗体の使用
による方法である（バイブリド−ｖ（Ｈｙｂｒｉｄｏｍ
ａ）５．　Ｓ　１７０９８６］およびバイオテクニック
ス（Ｂ　１ｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）　４．２１４［１
９８６］）。キメラ抗体は、抗体型および軽鎖の様々な
領域が１種を越える種類からのＤＮＡによりコードされ
る抗体である。代表的には、キメラ抗体は、望ましい抗
原特異性を有する抗体を産生ずるドナ一種に由来する重
（Ｖ　）および軽（ＶＬ）鎖■ の様々な領域並びに宿主受容音種に由来する重（ＣＨ）
および軽（Ｃ，）＊の不変抗体領域を含む。ドナー抗体
領域上の抗原決定基に対する宿主免疫系の暴露を減らす
ことにより、受容音種において生しる反免疫応答の可能
性は縮小されると考えられる。すなわち、例えば、ヒト
におけるインビボ臨床使用を目的とするキメラ抗体であ
って、ＳＷＡ１１産生セルラインから単離されたＤＮＡ
によりコードされるマウスＶｎおよびＶＬ領領域びにヒ
ト細胞から単離されたＤＮＡによりコードされるＣ　お
よびＣＬ領領域含むキメラ抗体の製造が可能である。

ある種の環境下では、特定種類のモノクローナル抗体が
、診断または治療効果の点で異なる種類のらのよりも好
ましい場合があり得る。例えば、１ｇＭクラスの抗体を
利用する場合に、組織染色における高い交差反応性、乏
しい組織貫通性および定量的生化学的操作、例えば免疫
コンジュゲートの製造に付随する困難さを含む問題が伴
い得る。

同様に、特定アイソタイプのモノクローナル抗体が別の
モノクローナル抗体よりも好ましい場合があり得る。こ
の点で、アイソタイプ　ガンマ−２ａ、ガンマ−２ｂお
上びガンマ−３のマウスモノクローナル抗体は、ガンマ
−１アイソタイプの場合よりも腫ようの成長阻害に有効
であることが知られている。この相異なる効力は、これ
らのアイソタイプが腫よう細胞の細胞融解性破壊により
能動的に参加する能力に起因するものであると考えられ
る。モノクローナル抗体の特定アイソタイプは、初期ハ
イブリドーマ融合から選択することにより直接的に製造
されるか、または異なるアイソタイプのモノクローナル
抗体を分泌し、例えばＳＷＡ１１と同じ特異性を有する
クラス−スイッチ変異体を選択するハイブリドーマから
二次的に製造され得る。

この発明のモノクローナル抗体または同じ特異性を有す
るかまたは同じ特異性を有する抗体の産生を刺激する抗
イデイオタイプまたはキメラ抗体は、各々任意の動物に
おいて使用され得、インビトロまたはインビボ免疫診断
または免疫療法での投与が望ましい。この明細書で使用
されている「動物」なる語は、ヒトおよびヒト以外のも
のを全て包含するものとする。

この明細書で使用されている「抗体」なる語は、エピト
ープ性決定基に結合し得る、無傷の分子およびそのフラ
グメント、例えばＦａｂおよびＰ　（ａｂ’　）２を含
むものとする。

「本質的に非反応性」なる語は、これがこの発明のモノ
クローナル抗体および抗原間の反応性の特性検定に使用
されている場合、行なわれ得る反応は全て抗体の診断的
または治療的有用性を制限する点では微々たるものであ
ることを意味する。

また、この発明のモノクローナル抗体は、それらが液相
中または固相担体に結合した形で使用され得るイムノア
ッセイにおける使用に適している。

さらに、これらのイムノアッセイにおけるモノクローナ
ル抗体は、様々な方法により検出可能な形で標識され得
る。この発明のモノクローナル抗体を用い得るイムノア
ッセイのタイプには、例えば競合的または非競合的イム
ノアッセイがあり、般例には放射能免疫測定法（ＲＩＡ
）および固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）がある。モ
ノクローナル抗体に関する多くの異なる標識および標識
方法があり、当業界の熟練者であれば、それら自体を知
っているか、または常用の実験を用いてそれらを確認す
ることができ、標準的技術を用いて結合を達成させ得る
。

抗原のインビボ検出を目的としてこの発明のモノクロー
ナル抗体を使用する場合、検出可能標識モノクローナル
抗体は、診断上有効な用量で与えられる。「診断上有効
な」なる語は、検出可能標識モノクローナル抗体の量が
、モノクローナル抗体が特異性を示す小細胞癌抗原を有
する部位の検出を可能にするのに充分な量で投与される
ことを意味する。投与される検出可能モノクローナル抗
体の濃度は、腫よう部位への結合が、基底値シグナルと
比べて検出可能となるのに充分な濃度とすべきである。

さらに、検出可能標識モノクローナル抗体を急速に循環
系から一掃させることにより、最善の腫よう対基底値シ
グナル比を達成するのが望ましい。

概して診断用検出可能標識モノクローナル抗体の用量は
、個体の年令、性別および病気の程度といった要素によ
り変化する。モノクローナル抗体・の用量は、約ｌｏＭ
ｇ〜約１０９、好ましくは約１０ｍ９〜約１９の範囲で
変化し得る。

また、この発明のモノクローナル抗体は、動物での免疫
療法において単独または治療剤と組み合わせた形で使用
され得る。これらの薬剤は、この発明のモノクローナル
抗体に直接的または間接的に結合され得る。免疫療法を
目的としてこの発明のモノクローナル抗体に結合され得
る治療剤の例としては、例えば薬剤、放射性同位元素、
免疫調節剤、レクチンまたは毒素がある。

例えば、リシンは免疫治療的に使用されている毒性レク
チンであり、これは、リシンのα−ベブチド鎖（その毒
性に関与する）を抗体分子に結合させて毒性作用の部位
特異的デリバリ−を可能にすることにより達成される。

同様に、毒素、例えば微生物コリネバクテリウム・ジフ
テリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｓ　ｄｉｐｈｔ
ｈｅｒｉａｅ）により生産されるジフテリア毒素フラグ
メントＡは、抗体に結合され、毒素分子の部位特異的デ
リバリ−に使用され得る。

それらの毒素フラグメントはリンカ−分子または類似技
術を用いて抗体に結合され得るか、または別法として、
ハイブリッド蛋白質の遺伝子融合および発現により直接
的に製造され得る。

予備試験では、２形態の植物毒素リシンにコンジュゲー
シヨン後、小細胞癌細胞を選択的に殺す能力について抗
体ＳＷＡＩＩを試験した。

第一の試験では、抗体をリシンのＡ鎖にコンジュゲート
することにより、インビトロで腫よう細胞を殺し得る免
疫コンジュゲートを製造した。そのＬ　Ｃｓ。（致死濃
度５０：結果的に標的細胞の５０％を殺す免疫コンジュ
ゲートの濃度）は４Ｘ１０−１°モルであったが、対照
コンジュゲートは＞ＩＸｔｏ−’モルのＬ　Ｃｓ。を示
した。重要なことに、この試験システムでは、明らかに
本質的に全ての細胞が免疫コンジュゲートに感受性を示
した。

第二の試験では、毒素結合部位の化学的遮断後、抗体Ｓ
ＷＡ１１を全リシン分子に結合させた。この形態では、
ＳＷＡＩＩ免疫コンジユゲートは７ｘｔｏ−”モルのＬ
　Ｃｓ。を示したが、対照コンジュゲートは約ｌＸｌ０
−”モルのＬ　Ｃｓ。を示した。

この発明のモノクローナル抗体に結合され得る他の治療
剤は、公知であるか、または当業界の通常熟練者により
容易に確認され得る。

この発明のモノクローナル抗体の投与に関する用量範囲
は、小細胞癌の症状を改善させる所望の効果を生じるの
に充分な広い範囲である。ただし、副作用、例えば望ま
しくない交差反応、アナフィラキシ−反応などを誘発す
るほど大きい用量とすべきではない。一般に、用量は、
患者の年令、状態、性別および病気の程度により異なり
、当業界の通常熟練者により決定され得る。用量は、約
１０次９〜約１０９、好ましくは約１０ａ＋９〜約１９
の範囲で変化し得る。抗体は、注射または時間をかけた
漸進的潅流により非経口投与され得る。この発明のモノ
クローナル抗体は、単独またはエフェクター細胞と組み
合わせた形で、静脈内、腹膜内、筋肉内、皮下、腔内ま
たは経皮投与され得る。

すなわち、この発明はまた、肺の小細胞癌の一部の細胞
表面膜上に選択的に発現される腫よう関連抗原であって
、 一部グリコシル化の前の分子量が約４５０００および後
の分子量が約１５０００〜約１７０００であり、 一部グリコシル化後に依然として抗体ＳＷＡＩＩとの反
応性を示し、 −ツニカマイシンによる処理後に依然として細胞に存在
する 糖蛋白質であることを特徴とする抗原を含む。

上記特性面については実施例５においてさらに詳しく試
験を行う。

この発明はまた、肺の小細胞癌の抑制に充分な損の上記
モノクローナル抗体および医薬用担体を含有する医薬組
成物を含む。

またこの発明は、医薬として使用、特に肺の小細胞癌の
抑制に使用される上記モノクローナル抗体を含む。

またこの発明は、肺のＳＣＣを有する疑いのある試料を
、上記検出可能標識モノクローナル抗体の診断有効量と
接触させ、前記抗体が前記試料に結合しているか否かを
測定することから成る、肺の小細胞癌の検出方法を含む
。

さらにこの発明は、処置を必要とする対象に、治療有効
量の上記モノクローナル抗体を投与することを含む、肺
の小細胞癌の抑制方法を含む。

さらにこの発明は、上記モノクローナル抗体および医薬
用担体を混合することを含む、医薬組成物の製造方法を
含む。

この発明の抗原、ｓＧＰ＊ｓについて、下記の要領で特
性検定を行った。

この発明の一モノクローナル抗体の取り込みのインビボ
分析において、抗体ＳＷＡＩＩをヨードゲン方法に従っ
て１１５１により標識すると、約７０％の生物活性を保
持することが見出された。ＳＷＡ２異種移植片を有する
ヌードマウスに静脈内注射した場合、ＳＷＡＩＩは異種
移植片に優先的に局在し、対照免疫グロブリンよりも８
倍高いレベルに到達することが見出された。局在するＳ
ＷＡｌｌの絶対値は、腫よう１ｇ当たり１１％の注射用
量であった。すなわち、ヌードマウスにおける小細胞癌
異種移植片における抗体の選択的取り込みが立証された
。第２８および２ｂ図は、通常標識１ｇＧと比較した、
投与後の様々な組織における標識モノクローナル抗体Ｓ
ＷＡＩＩの局在性を示す。最大パーセンテージのＳＷＡ
ＩＩが腫よう組織に見出されることは容易に認められ得
る。

この発明の抗原、５ＧＰｉｓは、肺の小細胞癌の細胞表
面において優先的に発現される。凍結組織片とのｓｗＡ
ｔｔの反応性の試験は、抗体が試験下の７つの小細胞癌
全てを均一に染色し、幾つかの腎臓、胃、腸、胸部およ
びすいｌｌｌ１ようと反応することを示した。また不均
一反応性が、腸、胆汁、導管、皮膚および甲状腺に生ず
る正常組織により観察された。

間接免疫蛍光染色法は、５ＧＰ４ｓが肺の小細胞癌の細
胞の細胞表面膜に位置することを示し、実験を行うこと
により、抗原が会合する膜のフラクションを測定した。

シリカゲル薄層クロマトグラフィーを用いた結果、粗グ
リコリピド抽出物には抗原は全く観察されなかった。オ
ーファレルの緩衝系を用いた還元条件下、１５％５ＤＳ
−ポリアクリルアミドゲルによる小細胞癌細胞抽出物の
電気泳動を行い、６モル尿素、３モル尿素および移動緩
衝液中におけるゲル中で蛋白質を復元しくワイベル等、
キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、）、４
７［１９８７年コ３７６６−３７７０頁）、次いでオツ
ターの方法（アナリティカル・バイオケミストリー（Ａ
ｎａｌ、　Ｂｆｏｃｈｅｍ、）　１６２　［１９８７年
コ３７０頁）に従い、低電流密度での低分子量分子の溶
離から始め、次いで高電流密度での長い電気移動を行わ
せる２段階工程で、電気泳動的に蛋白質を０．２μｌニ
トロセルロース上に移動させ、抗体上清およびアフィニ
ティー精製アルカリ性ホスファターゼ−コンジュゲート
やぎ抗マウスＩｇＧとインキユベーシゴンすることによ
り、小細胞癌細胞膜の蛋白質成分中の抗原の検出を行っ
た。色素展開試薬ＢＣＩ（５−ブロモ−４−クロロ−３
−インドリルホスフェート・ｐ−トルイジン）およびＮ
ＢＴにトロテトラゾリニウム・ブルー・クロリド）を基
質として用いたアルカリ性ホスファターゼ活性の測定に
より抗原の存在が立証された。

生化学特性検定により、抗原５ＧＰ４Ｓは糖蛋白質であ
ることが立証された。それらの技術には、酵素ノイラミ
ニダーゼによる単離抗原の脱グリコシル化、ベリオデー
トまたはトリフルオロメタンスルホン酸による抗原の化
学的脱グリコシル化があり、抗体がこの方法で処理され
た抗原と依然として反応性を示すか否かを測定する。抗
原性は、これらの処理後にも依然として無傷であった。

第５図に示されている通り、抗早５ＧＰ４５は、モノク
ローナル抗体５ＷＩＩを用いた復元イムノブロッティン
グ技術の下、分子量的４５０００において幾つかの分子
量バンドを生じる。

トリフルオロメタンスルホン酸による５ＧＰ４５の化学
的脱グリコシル化の結果、低分子量（分子量１５０００
−１７０００）の抗原が生成された。

抗原の性質を立証するため、１０μ９／１１２ツニカマ
イシン含有培地中でＳＷ２細胞を培養した。

抗生物質は、グルコサミン（Ｇ　ｌｃ）　−Ａｓｎ（ア
スパラギン）−結合糖単位の形成を妨げる。生細胞にお
ける間接免疫蛍光法により立証されたところでは、ｓｗ
Ａｔｔにより認識される抗原は、依然としてツニカマイ
シン処理細胞に存在していたが、抗原ｓＧＰ＋ｏｏ（Ｓ
ＷＡ２０ＸＥＰ３２３８０２）および抗原５ＧＰｓ。−
１゜（ＬＡＭ８）は完全に失われていた。これらの発見
は、ＳＷＡＩＩにより認識される抗原が、前記抗原、例
えばｓＧＰ＋。。およびｓＧ　Ｐ　５ｏ−１ｓｓとは異
なることを明らかに示している。

例えばＳＷＡＩＩが反応性を示す抗原の単離および特性
検定により、抗原との反応性を示す追加のモノクローナ
ル抗体の事実上無制限の生成の可能性がもたらされるも
のとする。これは、当業界で公知の方法に従い実施され
得る。

また、抗原自体は、小細胞癌の治療、例えば適当なワク
チンの製造において適用され得る。

以上の記載事項は、この発明を概説したものである。具
体的な後記実施例によりさらに完全な理解が得られるは
ずである。それらは説明を目的としているだけであって
、この発明の範囲を制限するものではない。

第１図：　　ＳＷＡＩＩに関するｎおよびＫａ値の評価
。グラフは、ＳＷ２細胞（＊）、Ｋ５６２細胞（口　）
およびヒト末梢血軟膜（ｏ）におけるＳＷＡＩＩ結合部
位の数およびそれらの相互作用の各会合定数の測定結果
を示す。

第２ａ）およびｂ）図二　図は、ｌＯμＣｉ放射性標識
材料の静脈内注射の第２．３．４および７日後における
抗体Ｓ　ＷＡ　１１　（ａ）および対照抗ＣＥＡ（抗癌
胚抗原）抗体（ｂ）に関する組織対血液比を示す。

Ｔｕ−腫よう、Ｌｉ＝＋肝臓、Ｋｉ＝腎臓、Ｓｐ＝ひ臓
、Ｌｕ＝＝肺、Ｈｅ＝心臓、Ｔｈ＝甲状腺、Ｆｅ＝大腿
、Ｍ　ｕ　＝筋肉、Ｂｒ＝脳。

第３ａ）およびｂ）図：　図は、１００μＣｉ”’１−
標識ＳＷＡＩＩの静脈内注射後のガンマ・シンチグラフ
ィーを示す。ａ）は、ＳＷ２異種移植片を有するヌード
マウスへの注射の２日後、ｂ）は注射の４日後である。

第４図工　腫ようの成長に対する放射性標識ＳＷＡＩＩ
の効果ニゲラフは、ＳＷＡＩＩ単独（口　）、１３１１
−標識ＳＷＡＩＩ（３００μＣ１：Δ　、６００μＣｉ
：ｗｍ　）、１３′■−標識抗ＣＥＡ（３００μＣｉ：
　　Ｏ）または希釈剤単独（＊）の静脈内注射後のＳＷ
２異種移植片の成長速度を示す。

第５図：ＳＷＡ１１のイムノプロットは、尿素によるＰ
ＡＧＥ後に復元された、肺細胞のＳＷ２小細胞癌のＮ−
ドデシル−Ｎ、Ｎ−ジメチルアンモニオ−３−プロパン
スルホネート（スルホベタイン１２）抽出物の分子量（
＝レーン５Ｗ２）を示す（レーンＭ＝分子量マーカー、
ｋｄ）。

［実施例］ 実施例１ モノクローナル抗体ＳＷＡＩＩ、ＳＷＡ２１およびＳＷ
Ａ２２の製造および精製。

常用手順に従い、１ミリモルのグルタミンおよび１０％
胎児うし血清を補ったＲＰＭＩ培地中でＳＣＣセルライ
ンＳＷ２を成長させた。前記方法に従い、抗体ＳＷＡＩ
　１．−２１および−２２を製造した［スターヘル等、
インターナショナル・ジャーナル・オブ・キャンサー（
Ｉｎｔ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ）３５（１９８５年）１
１頁］。

次いで、抗体を次の要領で精製した。３０−５５％硫酸
アンモニウムフラクションを培養上清から取り出し、Ｐ
ＢＳ中プロティンＡに吸着させた。

吸着したＩＫＧを１００ミリモルくえん酸緩衝液（ｐＨ
４，５）により溶離し、次いで０．ＯｌミリモルＣａＣ
１を含有１０ミリモル燐酸緩衝液（ｐＨ６，８）に対し
て透析した。次いで、抗体をヒドロキシルアパタイト・
カラム（バイオ−ゲルＨＰＨＴ、パイオーラド、リッチ
モンド、カリフォルニア）に適用し、次に３５０ミリモ
ル燐酸に対する一次勾配により溶離した。

実施例２ インビトロ特性検定。

ｌ、免疫蛍光法および赤血球凝集による生存可能細胞と
の反応性。

間接免疫蛍光法により、ＳＷＡＩ　１，ＳＷＡ２１およ
びＳＷＡ２２と一群（パネル）のインビトロＳＣＣライ
ン、気管支上皮および末梢白血球の一次培養との反応性
を測定した。細胞を燐酸緩衝食塩水（ＰＢＳＸＩ％うし
血清アルブミン、０．０２％アジド）中で３回洗浄し、
ｌ管当たり１０’細胞の割合で分配し、３７℃で３０分
７４１００μＱの培養上清とインキュベージジンした。

さらに洗浄後、細胞を３７℃で３０分間５０μＱのやぎ
抗マウス・フルオレスセインイソチオシアナート（ＦＩ
ＴＣ）コンジュゲート（１／２０希釈率）とインキユベ
ーションした。ツァイス・エビ蛍光顕微鏡を用いて表面
抗原の指標であるリム・パターン蛍光を観察した。標準
直接赤血球凝集検定法により、定められた血液群抗原を
発現する一群の赤血球との反応性を評価した。第１表は
、抗体ＳＷＡＩＩ、−２１および−２２とセルラインお
よび正常組織との反応性を示す。

第１表 間接免疫蛍光法および放射線免疫検定法によるセルライ
ンおよび正常組織との抗体反応性。

ＷＡ セルライン ■ 小細胞癌（肺） Ｗ２ ＋ ＋ ＋ ＨＩ Ｈ３ ＣＯＲＬ４７ Ｌ２ 腺癌（肺） ＬＣ５２ ａＬｕ６ へん平上皮（肺） ｏｔｚ ＳＫ−Ｍｅｓ−１ 大細胞（肺） ＬＣ６ Ｌ２３ 中皮腫（肺） ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＰＣ７８ ＰＣ２１２ 白血病 に５６２ ＥＭ 正常組織 骨髄 末梢血 気管支上皮 ＋ ＋／− ＋／ ＋ ＋／− ＋／ ＋ 十／− ＋／ 十／−＝小比率の細胞が不均一染色を示す。

第１表から明らかな通り、間接免疫蛍光法によって、Ｓ
ＷＡＩＩは試験下の９種の小細胞癌うイン全てと反応す
ることが判った。他の肺由来のラインについては、腺癌
由来の４ラインのうちの！、３へん平上皮のうちの１．
２大細胞のうちの０および２中皮腫のうちの１において
反応性が見られた。また、反応性は３種の白血病セルラ
インのうちの１種に見られた。セルライン反応性のパタ
ーンに関して、３種の全抗体間に明確な相同性が見られ
た。

抗体ＳＷＡＩＩは正常気管支上皮細胞の一次培養とは反
応性を示さなかったが、正常ヒト末梢血軟膜および骨髄
に対しては、不均一染色が見られ、軟膜に関する蛍光活
性化細胞ソーター分析は、これが、全白血球集団の５％
との交差反応性によるものであることを示した。この反
応性は成熟か粒球の約４０％に制限される。赤血坪凝集
検定法によって、赤血球Ａｌ５Ａ２、Ｂ、０１ｒｉｈ−
ｈｒｑケル（Ｋｅｌｌ）、ダフィ−（Ｄｕｆｆｙ）、キ
ッド（Ｋｉｄｄ）、Ｘ−結合、ルイス（Ｌｅｗｉｓ）、
ＭＮＳまたはＰ抗原を有する細胞に対するＳＷＡＩＩの
反応性は検出されなかった。

抗体ＳＷＡ２１およびＳＷＡ２２の応答は本質的に類似
していた。

２、放射線免疫検定法 ２、！、放射能標識 全ての場合において、ヨードゲン技術により放対性ヨウ
素によりＳＷＡＩＩ抗体を標識した。ヨードゲン０　、
１　ｍｇを０　、２　肩Ｑのクロロホルムに溶かし、１
１１２ガラス瓶に加えた。溶媒を濃縮し、次いで０．２
５１１２の水中抗体を加えた（０．５１９の総蛋白質）
。次いで、ヨウ素を加え、反応を１０℃で撹はんしなが
ら１５分間続行した。ＰＢＳにより平衡状態にしたプレ
パックしたセファデックス０５０カラムに反応混合物を
適用することにより反応を終結させた。０４２２ミクロ
ンのフィルターを用いたろ過により溶液を滅菌した。

２．２．競争的固相放射線免疫検定法 これは、抗体ＳＷＡＩＩ、−２１および−２２が同じエ
ピトープを認識するか否かを調べるために行なわれた。

９６ウエル・プレートに標的細胞を固定した。

プレートをポリーＬ−リジンにより被覆し、グルタルア
ルデヒドを用いて５Ｘ１０’細胞を各ウェルに固定した
。１％うし血清アルブミンおよび０゜２％ナトリウムア
ジドを含むＰＢＳ中でプレートを３℃で貯蔵した。使用
前に、プレートを３０分間洗浄緩衝液とインキュベーシ
ョンすることにより、非特異的結合を阻止した（トリス
−緩衝食塩水、５％脱脂乳および１％ゼラチン）。ＳＷ
Ａ　１１と同じ組織反応性パターンを示す非標識抗体Ｓ
ＷＡ２１およびＳＷＡ２２を、陽性対照として作用する
ＳＷＡＩＩを含むプレートに飽和濃度で加えた。インキ
ュベーションを３７℃で１時間行い、次いでプレートを
ＰＢＳおよび１％うし血清アルブミンにより４回洗浄し
た。次いで、放射性標識ＳＷＡＩＩを、競争の非存在下
に半最大結合を与える濃度で加え、さらに３７℃で１時
間インキュベージぢンを行った。最終洗浄後（４回）、
個々のウェルを切り離し、ガンマ・カウンターで計数し
た。

結果を第２表に示す。

第２表 ＳＷＡＩＩ、ＳＷＡ２１およびＳＷＡ ２２間のきっ抗的結合検定。

標識抗体　　　　非標識抗体　　　　結合％゛ＳＷＡ　
１１　　　　無し　　　　　　　　１００ＳＷＡ１　１
　　　　　　　１０．９ ＳＷＡ２１１１．ｌ ＳＷＡ２２２３．０ °きっ抗する抗体の非存在下におけるＳＷＡＩＩの結合
パーセントとして表現。

飽和濃度での非標識ＳＷＡＩＩは、放射性標識ＳＷＡＩ
Ｉの結合を１０．９％に減少させたが、ＳＷＡ２１およ
びＳＷＡ２２は各々１１．ｌおよび２３．０％に結合を
減少させた。これは、３種のモノクローナル抗体が同じ
エピトープを認識する可能性が非常に高いことをさらに
示すものである。

２．３．インビトロ免疫反応性。

放射性標識ＳＷＡＩＩの生物学的活性を測定するために
、ＳＷ２細胞をＰＢＳ（５％脱脂乳、０゜０５％アジド
）中で３回洗浄し、次いで、変化する細胞数を固定量の
放射性標識抗体と４℃で２時間インキュベーションした
。洗浄後、細胞沈澱における活性を数えた。非結合状態
のカウント数を細胞数の逆数に対してプロットした。

ヨードケン放射性標識試薬を常用手順で用いることによ
り、０．５〜１．Ｏｎ＋ｃｉ／ｍｇの範囲の比活性を有
するヨウ素化ＳＷＡＩＩを製造した。標識抗体の生物学
的活性は、一般に６５−７０％であった。続いてこの数
字は、ＳＷ２細胞の抗原の数および相互作用のＫａに関
する計算において使用された。

２．４．結合親和力（ｎおよびＫａの測定）。

また、ＳＷＡＩＩと相互作用し得るＳＷ２細胞の表面上
の抗原の数、ｎおよび会合定数Ｋａを評価した（トルッ
コおよびデ・ベトリス、イミュノロジカル・メソッズ（
ＩｍＩＩｌｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ）２　［１９８
１コ１頁）。ＳＷ２細胞をＰＢＳ（５％脱脂乳、０．０
５％アジド）中で３回洗浄し、次いで１管当たり５ｘｌ
Ｏ’細胞の割合で分配した。放射性標識ＳＷＡＩＩの系
列２倍希釈を行い、各管に１００μＱを加えた。総反応
体積は０　、５　ｘＱであった。

４℃で２時間インキュベーションを行い、次いで細胞を
前記と同様に５回洗浄した。得られたデータを操作する
ことにより、ｒ／Ａ−Ｘに対するｒのプロットを作成し
た（ｒは１細胞当たりに結合した抗体分子の数であり、
Ａ−Ｘはｃｐｍとして表された遊離抗体である）。また
、間接免疫蛍光試験により観察された軟膜および骨髄の
不均一染色の重要性を評価する試みにおける同じ技術を
用いてＳＷＡＩＩと白血病セルラインに５６２およびヒ
ト末梢血軟膜との相互作用を評価した。

ＳＷＡＩＩとセルラインＳＷ２およびに５６２並びにヒ
ト末梢血軟膜との相互作用から得られたデータをプロッ
トした。ｙ軸（＝Ｋｎ）およびＸ軸（＝ｎ）上の切片か
ら、Ｋａの値は容品に得られる。第１図では、抗原部位
の数ｎは、ＳＷ２、Ｋ５６２およびヒト軟膜に関してｌ
細胞当たり各々６゜１ｘｌＯ’、１．１ｘｌｏ’および
１．２Ｘ１０’に等しく、ＳＷＡＩＩにより認識される
抗原がＳＷ２セルラインにおいて優先的に発現されるこ
とを示している。各会合定数Ｋａは、１．２Ｘ１０”。

６．８Ｘ　１０”および５．６Ｘ　１０”モル−’であ
＃）、特にＳＷＡＩＩについては、高い結合親和力、す
なわち局在化剤としての高い可能性を示している。

実施例３ インビボ特性検定。

１、腫ようの局在性。

ＳＷ２異種移植片 ＳＷ２小細胞ラインをＮ　Ｍ　ＲＩ　　ｎｕ／　ｎｕ？
ウスにおいて皮下異種移植片として成長させた。２２−
３ｉ”片の腫ようを４−６週令のマウスに移植すると、
約３週間以内で腫ようは使用できる状態となった。全動
物を病原体不含有食物および酸性飲用水により維持した
。

インビボ局在性 異種移植片モデル・システムにおけるインビボ分布を、
１３１１−標識ＳＷＡＩＩおよび１′■−標識抗ＣＥＡ
対照抗体の同時静脈内注射により測定した。両抗体はＩ
ｇＧ２ａアイソタイプに属するものであった。注射の２
．３．４および７日後にマウスを解剖し、様々な器官を
ＰＢＳ中でリンスし、次いで秤量し、２チヤンネル・ガ
ンマカウンターで計数した。抗体の局在性を、組織ｔｇ
に対する注射用量のパーセンテージとして絶対項で、ま
た組織対血液比として相対項で表した。

第２．３．４および７日目におけるＳＷＡＩＩおよび対
照抗ＣＥＡの組織対血液比を第２８およびｂ図にグラフ
で示す。抗ＣＥＡの選択的局在性は観察されなかったが
、第２．３．４および７日目でのＳＷＡ１１に関する腫
よう対血液比は、各々２．４：１，５．３：１、？、５
：ｌおよび８．０：１であった。第４８目に、腫よう蓄
積ＳＷＡＩＩのレベルは、肝臓、腎臓およびひ臓の場合
よりも各々１９．２２および１２倍高かった。腫ようお
よび様々な器官におけるＳＷＡＩＩの絶対レベルを第３
表に示す。ＳＷＡ１１は、第２日日に高い局在性を示し
、腫よう１ｉ当たり１０．５％注射用量である。抗体は
腫ように結合した状態であり、第３および４日目には８
％注射用量／９を推持し、次いで第７０目に４．８％注
射用量／９に低下する。

第３表 抗体ＳＷＡＩＩの組織分布。

日 腫よう　　１０．５　　　＋１．０　　　８．０血液　
　　４．２　　１．５　　　１．１肝臓　　　１．９　
　０，７５　　０．５４．８ ０．６０ ０．２２ 筋肉　　　０．８　　０．３５　　０，１８　　０．０
４脳　　　　　０．２５　　０．１０　　　０．０５　
　　０．０１３°組織１ｇ当たりの総注射用量パーセン
トとして表す。

２、ガンマ・シンチグラフィー 異種移植されたマウスに、ｌＯＯμＣｉの１３１１−標
識ＳＷＡ１１（１００μＣｉ／１００μ９）を静脈内注
射した。第２および４８目に、標的動物から９ｃｍの位
置に設けたピンホール・コリメーターを用いてイメージ
ングを行い、次いでピッカー・ダイナ・カメラ４に連結
した。各画像は、３６４ｋｅＶ付近に２５％集中したエ
ネルギー・ウィンドーを用いて得られた５００００カウ
ントから形成された。基底値控除および甲状腺ブロッキ
ングは用いなかった。イメージング中、動物には０．５
ｍＱネンブタール（ＰＢＳ中ｌ：１０希釈）の腹腔的注
射により麻酔をかけた。

注射の２および４日後のＳＷ２異種移植片におけるＳＷ
ＡＩＩの選択的蓄積は、各々第３ａおよびｂ図に示した
通り、外部ガンマ・シンチグラフィーにより確認された
。第２目前に、腫ようは、既に胸部の内臓器官における
血液プールにまだ存在する活性の基底値に対して明視化
されていた。第４日日までに、基底値レベルは著しく低
下したが、腫ようは画像明暗度の点では比較的一定した
状態であった。ブロックされなかった甲状腺は、遊離＋
３１　Ｈの蓄積および相対保持性故にこの時点では見る
ことができた。

従って、上記結果は、ＳＷＡＩＩのＳＣＣ異種移植片に
対する例外的局在能を示すものである。

実施例４ ”’　Ｉ　−ＳＷＡ　１１を用いたＳＣＣ異種移植片の
放射線免疫療法。

０．５−１．０ｃｍ”の範囲の確立した腫ようを有する
ヌードマウスに対する３００μＣｉのＩｌｌ　１−標識
ＳＷＡＩＩの静脈内注射により、ＳＣＣ異種移植片の放
射線免疫療法を行った。第０白目に動物体重および腫よ
う直径を２次元で記録し、続いてモニターした。下式を
用いて腫よう体積を計算した。　　　　　　　　ｄ３π （式中、　　Ｖ＝腫よう体積 ｄ＝平均腫よう直径） 腫よう体積に対する顕著な効果は、注射の約・１日後か
ら明らかになった。対照は、ＳＷＡＩＩ抗体単独、３０
０μＣｉの１３１１−標識した無関係の抗体および未処
置動物を含んだ。

結果を第４図に示す。ＳＷＡＩＩによる何益な効果は数
週間続き、３００μＣｉの場合、少なくともｔｍ月より
長く続く。

腫よう組織構造： 腫ようが過度に増大したため、注射後第１６日日に対照
動物を殺した。また、腫よう組織構造の直接比較を容易
にするため、”Ｊ−ＳＷＡＩＩにより処置した２動物を
この時点で殺した。腫よう試料を４％ホルムアルデヒド
に固定し、次いで切開および染色した。

未処置腫よう：　これらは、特徴的なＳＣＣ組織を有す
る非常に激しく成長している腫ようであると思われた。

多様な形の特徴を有する小細胞が密集した大きな領域が
存在し、それらの大きな腫ようから予想されるように実
質的壊死領域であった。

放射性標識対照抗体により処置した腫よう：これらは、
密集し、急速に分割している小細胞の大きな領域および
壊死領域を有する未処置腫ようと概ね類似していた。し
かしながら、放射線傷害の幾つかの証拠が、細胞分割に
おいてブロックされたと思われる悪性腫よう由来の大細
胞形態で存在していた。

放射性標識ＳＷＡＩＩにより処置した腫よう：これらの
腫ようは、はぼ完全に壊死しており、残っている悪性細
胞の数はごく僅かにすぎなかったが、それらは全て非常
に大きく、−集団の未知のクローン生成（ｃ　ｌｏｎｏ
ｇｅｎ　ｉｃ）の可能性を示している。ネズミ由来の豊
富な増殖線維形成組織が存在した。

実施例５ 抗原の検出および特性検定。

１．９Ｗ２セルラインからの抗原の抽出。

ウェスタン・プロット分析を行うため、細胞をＰＢＳ（
燐酸緩衝食塩水）中で１回洗浄し、水冷ＰＢＳ中０．２
％Ｎ−ドデシル−Ｎ、Ｎ−ジメチルアンモニオ−３−プ
ロパンスルホネート、１ミリモルのフェニルメチルスル
ホニルフルオリド、０゜１ミリモルのロイペプチンおよ
び５０μ９／ｊＩ（！のペプスタチンＡにより３０分間
可溶化した。４℃で１時間１０００００ｇで遠心分離後
、上清を９７℃で３０分間加熱し、前記と同様に遠心分
離し、ＳＷＡＩＩ抗原のウェスタン・プロット分析にこ
の上清を用いた。

２．５ＤＳ−／７’ルからニトロセルロースへ移される
抗原。

オーファレルの緩衝系を用いた還元条件下、１２．５％
または１５％５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにおいて
電気泳動を行った。オッターの方法に従い（アナリティ
カル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ、）　１６２　［１９８７］＄　７０頁）、１０７細
胞のアリコートを０．２μ友ニトロセルロースに電気泳
動的に移動させた。移動前、ゲルを６モル尿素中で２０
分間、３モル尿素中で２０分間および移動緩衝液中で２
０分間インキュベーションすることにより、抗原を復元
した。１時間低電流密度（１ｍＡ　７ｃｍりでの低分子
量分子の溶離から始まり、次いで移動緩衝液（４９ミリ
モルのトリス、３８４ミリモルのグリシン、２０％メタ
ノール（ｖ／　ｖ）および０．０１　　Ｎ−ドデシル−
Ｎ、Ｎ−ジメチルアンモニオ−３−プロパンスルホネー
ト）中、高電流密度で長時間（２０時間）電気移動させ
る２段階手順で電気移動を達成させた。電気移動後、ニ
トロセルロース・シートをオーブン乾燥しく１００℃／
１５分間）、５％脱脂粉乳を含むトリス緩衝食塩水（Ｔ
ＢＳ：２５ミリモルのトリス、０゜５モルＮａＣｌ５ｐ
Ｈ８）中でインキュベーション（３０分間）することに
よりクエンチングした。次いで、シートを４℃で２４時
間連続回転させなからＳＷＡＩＩとインキュベーション
した。クエンチング緩衝液および０．０５％トウィーン
２０により洗浄後（３回、１０分間）、このコートを、
ＰＢＳ中１：３０００に希釈したアフィニティー精製ア
ルカリ性ホスファターゼやぎ抗マウスＩｇＧおよび１０
％正常やぎ血清（ｐＨ６，５）と１時間インキュベーシ
ョンした。前記と同様に洗浄後（ただし、ｐＨ６、５で
）、ＢＣＩ　Ｐ／ＮＢＴ（５−ブロモ−４−クロロ−３
−インドリルホスフェート・ｐ−トルイジン／ニトロテ
トラゾリヌム・ブルー・クロリド）を色素展開溶液とし
て用いることにより、５０ミリモルのエタノールアミン
、１．０ミリモルＭｇＣＩｔ（＋）８９　、８　）にお
いてアルカリ性ホスファターゼが立証された。

３、薄層クロマトグラム（こおける抗原。

次の要領でＳＷ２細胞からグリコリピドを分離した。細
胞沈澱物（１０７細胞）をＰＢＳにより２回洗浄し、７
凍結乾燥した。クロロホルムおよびメタノール（体積に
して２：ｌ）を用いて３回２分間の音波処理により脂質
を抽出した。抽出物を０゜２２μＭフィルターによりろ
過し、スピード・バック濃縮器により濃縮した。粗脂質
を、クロロホルム：メタノール：０．２５％ＫＣＩ（５
：４：ｌ）中、高速薄層クロマトグラフィー・シリカ・
プレートにおいてクロマトグラフィーにかけた。風乾後
、プレートをニンヒドリン噴霧試薬により展開するが、
または次の要領で免疫染色した。クロマトグラムを室温
で２時間ＰＢＳおよび５％脱脂粉乳に浸すことにより、
非特異結合をクエンチングした。プレートをＳＷＡＩＩ
上清中で一夜インキユベーションし、前記と同様に３０
分間２回洗浄し、ＰＢＳ中１：５００に希釈したアフィ
ニティー精製ペルオキシダーゼ−コンジュゲートやぎ抗
マウスＩｇＧおよび１０％馬血清と２時間インキュベー
ションした。前記と同様に洗浄後、基質として４−クロ
ロー１−ナフトールを用いてペルオキシダーゼ活性が立
証された。

４、ＳＷ２細胞の懸濁液における免疫蛍光法。

ＳＷ２細胞を、ＲＰＭＩ（ルーズベルト・パーク・メモ
リアル・インスティテユート）培地およびｌＯ％ＦＣ９
（胎児牛血清）、またはＲＰＭＩ培地、１０μ９ＩＲＱ
ツニカマイシンおよび１０％ＦＣＳ中で成長させた。間
接免疫蛍光法によりスクリーニングするため、細胞をＰ
ＢＳ、０．１％ナトリウムアジドおよび１０％馬血清に
より洗浄した。細胞をアリコートに分けて管に入れ、８
００ｇで５分間遠心分離した。上清を吸引後、１００ｕ
（１（１）ＳＷＡ　１１，ＳＷＡ２　Ｌ　ＳＷＡ２２．
ＳＷＡ２０またはＬＡＭ８を適用した。管を軽く渦状に
回し、３７℃で１時間インキュベーションした。細胞を
ＰＢＳおよび１０％馬血清により２回洗浄し、上清を吸
引し、３０μＱの第２抗体（ｍｌＴＣ（フルオレスセイ
ンーイソチオシアナート）標識やぎ抗マウスＩｇＧの１
＝２０希釈液）を適用した。管を軽く渦状に回し、３７
℃で１時間インキュベーションした。前記と同様に洗浄
後、カバー・スリップで被覆したスライドに細胞を加え
た。ライツ顕微鏡において緑色蛍光により抗体反応性が
観察された。

５、放射線免疫検定法。

ＳＷ２細胞を、放射線免疫検定の標的として９６ウエル
・プレートに結合させた（ホイサー等、メソッズ・イン
・エンザイモロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ
、）７３　［１９８１］４０７）。ポリ−し一リジンに
よりウェルを被覆し、グルタルアルデヒドにより各ウェ
ル？こ固定した。プレートをＰＢＳ中夏％ＵＳＡおよび
０．２％ナトリウムアジドと共に４℃で貯蔵した。標的
細胞に結合する抗体のきっ抗的阻害のため、最大結合濃
度の半分を用いて抗体の最適濃度を滴定した。レクチン
とのきっ抗性を試験するため、標的プレートをＰＢＳ中
で１時間０　、１　ｘｇレクチン／ウェルとブレインキ
ュベーションし、ＰＢＳおよび１％ＢＳＡ中で２回洗浄
し、１００μ（２のＰＢＳおよび１％ＢＳＡ中、６量の
抗体とインキュベーションした。酵素の影響を試験する
ため、ウェルを３７°Ｃで１時間１単位の酵素とインキ
ュベーションし、ＰＢＳおよび１％ＢＳＡ中で２回洗浄
し、１００μＱのＰＢＳおよび１％ＢＳＡ中、６量の抗
体とインキュベーションした。抗原のベリオデート処理
のため、ウェルを室温で１５分間２０ミリモルのベリオ
デートとインキュベーションし、エチレングリコールに
より反応を止め、ウェルをＰＢＳおよび１％ＢＳＡ中で
２回洗浄し、１００μＱのＰＢＳおよび１％ＢＳＡ中、
容量の抗体とインキュベーションした。

第４表 レクチン、酵素またはべりオデートにより前処理した５
Ｗ２ｆｉ的細胞において固相ＲＴＡを用いることによる
抗体ＳＷＡＩＩ、ＳＷＡ２１およびＳＷＡ２２により認
識されるエピトープの特性検定。

ＳＷＡ２０と比較した小細胞癌セルラインにおける結合
パーセントとして結果を表す。

酵素処理 ノイラミニダ ーゼ（１単位）　　　９０　　１０５　　１０６トリブ
シン （１単位）　　　　　７５　　５０　　　６５キモトリ
プシ ン（１単位）　　　　３４　　２５　　　２５レクチン
・プレインキュベーション ソラヌム・ツ ベロスム　　　　６０　　６０　　　７０トリチクム・ ブルガリス　　　１５　　１６　　　１８ペリオデー ＦＬＬ（２０ｍＭ）　　　８０　　１１２　　１２０＊
ＥＰ３２３８０２ 第５表 正常培地中で培養した細胞および１０μ９／嵯ツニカマ
イシンを補った培養中で培養した細胞を用いたＳＷ２生
細胞における間接免疫蛍光法によって、抗体ＳＷＡＩＩ
、ＳＷＡ２１，ＳＷＡ２２およびＳＷＡ２０およびＬＡ
Ｍ８により認識されるエピトープの特性検定。蛍光強度
で結果を表す（ｌ＝弱い、４＝強い）。

５ＮＡＩＬ　　ＳＷ＾２１　ＳＷＡ２２　ＳＷＡ２０＊
ル＾Ｍ８正常ＳＷ ２細胞　　　＋４　　　＋４　　　＋４　　　＋３（均
一）（均一）（均一）（不均一） ツニカマイ シン処理 細胞　　　　＋４＋４＋４０ 第３図のａは放射能標識抗体ＳＷＡＩＩのマウス静脈内
注射後２臼目のシンチグラフィー、ｂは同じく４日目の
シンチグラフィーである。

第４図は、腫瘍の成長と放射能標識抗体ＳＷＡｌｌの注
射後日数の関係を示すグラフである。

第５図は、抗体ＳＷＡＩＩのＰＡＧＥ後のイムノプロッ
トを示す図である。

＊ＥＰ３２３８０２

【図面の簡単な説明】

第１図は、抗体ＳＷＡＩＩに関するｎとＫａ値の推定法
を示すグラフである。 第２図のａは抗体ＳＷＡＩＩ濃度の組織対血液比を示す
棒グラフ、ｂは対照抗体ＣＥＡの組織対血液比を示すグ
ラフである。 特許出願人　サンド・アクチェンゲゼルシャフト代理人
　弁理士　青　山　葆　ほか１名（→ （Ｑ−） 第２図 第３図 （す

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. （１）肺の小細胞癌の腫よう関連細胞表面膜発現抗原に
   特異的なモノクローナル抗体またはその機能的フラグメ
   ントであって、 −ＳＣＣ（小細胞癌）に関するインターナショナル・ワ
   ークショップで定義された（ロンドン、１９８７年）ク
   ラスターｗ４に属し、 −高いインビボ局在能を示し、 −非標的器官での保持性が低く、 −標的腫ようにおいて持続性を呈し、 −糖蛋白質抗原であって、 −分子量が、脱グリコシル化の前には約４５０００およ
   び後には約１５０００〜約１７０００であり、 −脱グリコシル化後に依然として抗体ＳＷＡ１１との反
   応性を示し、 −ツニカマイシンによる処理後に依然として細胞に存在
   する との特性を有する抗原に結合する ことを特徴とする抗体。
2. （２）ＩｇＧアイソタイプに属する請求項１記載の抗体
   。
3. （３）ハイブリドーマ、セルラインＥＣＡＣＣ８８０８
   ０３０１により生産される、請求項１記載の抗体。
4. （４）細胞傷害剤に結合される、請求項１記載の抗体。
5. （５）請求項１記載のモノクローナル抗体を産生し得る
   ハイブリドーマ・セルライン。
6. （６）ＥＣＡＣＣ８８０８０３０１である、請求項７記
   載のセルライン。
7. （７）肺の小細胞癌の一部の細胞表面膜で選択的に発現
   される腫よう関連抗原であって、 −分子量が脱グリコシル化の前には約４５０００および
   後には約１５０００〜約１７０００であり、 −脱グリコシル化後に依然として抗体ＳＷＡ１１との反
   応性を示し、 −ツニカマイシンによる処理後に依然として細胞に存在
   する 糖蛋白質であることを特徴とする抗原。
8. （８）肺の小細胞癌の抑制に充分な量の請求項１記載の
   モノクローナル抗体および医薬用担体を含有する医薬組
   成物。
9. （９）医薬として使用される、請求項１〜４のいずれか
   １項記載のモノクローナル抗体。
10. （１０）処置を必要とする対象に、請求項１記載のモノ
    クローナル抗体の治療有効量を投与することを含む、肺
    の小細胞癌の抑制方法。