JPH02154697A - 微生物の培養検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は透明容器と、これに挿入される特定のシートか
らなる挿入体との間に存在する成分層の表面および／ま
たは内部に被検液中の微生物を培養させて、透明容器外
から検出し得るようにした簡便な微生物の培養検出方法
に関する。

〔従来の技術〕

食品等の微生物検査で、通常用いられているところの寒
天を用いる混和平面培養法（シャーレ法）は、 １、寒天培地を加熱溶解させる。

２、オートクレーブで加圧滅菌する。

３、被検試料の一連の希釈物の一部をシャーレに入れる
。

４、冷却しであるが、まだ液体状態にある寒天培地をそ
れぞれシャーレに加え、試料と寒天培地が均一に混ざる
ようにシャーレを回転させながら、混和し、放置固化さ
せる。

５、シャーレに蓋をして倒置させた状態で一定温度で培
養を行い、シャーレ中に発育するコロニー数を肉眼で計
測する。

以上の５つの工程により微生物の培養検出を行わなけれ
ばならないため、操作が極めて煩雑であった。

それ故、このための簡易培養検出法として、■寒天表面
で培養する方法。

■吸収材に吸着させ、その表面で培養する方法。

■試験管内面、又はスライドグラス上で培養する方法。

■フィルター表面で培養する方法。

■液体培地を用いる方法。

などが提案された。

上記■の方法としては、固化した寒天上に試料を滴下さ
せるＤｒｏｐ　　ｐｌａｔｅ　　ｍｅｔｈ。

ｄ、コンラージ棒を使用して試料を広げる５ｕｒｆａｃ
ｅ、ｐｌａｔｅ　　ｍｅｔｈｏｄ、又、Ｓｔａｍｐ　　
５ｐｒｅａｄ　　ｍｅｔｈｏｄＳＡｇａｒｓａｕｓａｇ
ｅ　　ｍｅ、ｔｈｏｄなど〔微生物の検査法昭和５６年
８月３０日第二版発行、発行所工業技術会〕がある。

■の方法としては、栄養分を含んでいる濾紙に試料を吸
収させるＢａｃｔｏ　　５ｔｒｉｐ　　ｍｅｔｈｏｄ　
（微生物の検査法昭和５６年８月３０日第二版発行、発
行所工業技術会〕がある。

■の方法としては、微生物をＴｅ５ｔ　　ｔｕｂｅｍｅ
ｔｈｏｄなど〔微生物の検査法昭和５６年８月３０日第
二版発行、発行所工業技術会〕がある。

■の方法としては、微生物をメンブランフィルタ上に捕
捉し、フィルタの逆の面より栄養分を補給して培養する
方法〔微生物の検査法昭和５６年８月３０日第二版発行
、発行所工業技術会〕がある。

更に、最近においては乾燥培養プレートの研究が盛んに
進められており、例えば、特許出廓公表昭５７−５０２
２００号（スリーエム社製、米国、商品名ベトリフイル
ム）が知られている。このものは主として、ベースフィ
ルムに必要な物が含まれかつすぐに使用できる細菌用培
養基が塗布され、表面からポリエチレンフィルムでカバ
ーされている。このベースフィルムは標準的な栄養素、
及び冷水に可溶なゲル化剤も有している。又カバ−フィ
ルムにはゲル化剤の他に計数を容易にするため、２，３
．５−トリフェニルテトラゾリウムクロライド（ＴＴＣ
）が塗布されている。

〔発明が解決しようとする課題〕

しかしながら、前記■の方法は、寒天の表面で培養せし
めるため、技術的な塾練度を必要とし、■の方法は、濾
紙に被検液を吸収させるために、濾紙の細孔に微生物が
入り込む可能性があり、半定量的にならざるを得ない。

■の方法は、操作が煩雑である。更に■の方法は、濾過
操作が必要なために沈澱物のある物は、前処理を必要と
する。

更に、コロニーの計測を容易にするために微生物染色剤
を使用することが行われており、前記のスリーエム社製
のベトリフィルムにもＴＴＣ（トリフェニルテトラゾリ
ウムクロライド）が塗布されている。しかしながら、こ
れら染色剤がある種の微生物に対し毒性を示す場合がし
ばしばあり、培養試薬とＴ　’Ｔ’　Ｃ等のテトラゾリ
ウム化合物とが共存する試験シートにおいては、細胞コ
ロニーの正確な数の把握が困難となる場合がある。この
解決のために、例えば染色剤をマイクロカプセル化する
ことにより徐放性をもたせ、微生物の増殖がある程度進
むまで微生物との接触を妨げさせる等の方法があるが、
満足すべきものではなかった。

〔課題を解決するための手段〕

そこで、本発明者らは、透明容器にゲル化剤および培地
を添加し、これにシートからなる挿入体を挿入するごと
により、透明容器と挿入体との間に存在するゲル中また
はその表面において微生物を培養することに着目した。

上記のシートとしてはシリコン処理分液濾紙を用い、微
生物が増殖する′面とは逆の面、すなわち挿入体の内面
側に呈色剤を塗布することにより、シートの材質と相ま
って微生物の増殖が進行するまで、でき得る限り、呈色
剤と微生物との接触を遅らせ、より正確なコロニーの検
出が実現できるようにして、従来技術の種々の課題を解
決することに成功した。

本発明は上記の知見に基づいて完成されたものであって
、被検液を透明容器に添加し、該透明容器に通気性を有
するが透水性が非常に低くかつ被検液中の微生物より小
さい細孔を存するシートからなる挿入体を挿入し、該透
明容器と挿入体との間に存在する栄養分およびゲル化剤
を含む成分層の表面および／または内部において被検液
中の微生物を培養せしめ、該培養によって増殖した微生
物を透明容器外から検出するようにしたことを特徴とす
る微生物の培養検出方法であって、その目的とするとこ
ろは、従来法に比べてより簡便でしかも応用範囲の広い
極めて筒車かつ正確な培養検出が行えるようにした微生
物の培養検出方法を提供することにある。

更に本発明の目的は、コロニー計測を容易にするための
指示薬が微生物の増殖に悪影響を与えないようにした微
生物の培養検出方法を提供することにある。

先ず本発明の方法を実施するための好適な培養容器につ
いて説明する。

〔実施例〕

本発明の方法を実施するために使用される第１図の第１
実施例に示した培養容器１は、透明容器２と該容器２に
挿入される挿入体３と、これらの開口面に被嵌される例
えばブチルゴムから成型されたＭ４とから構成される。

透明容器２は、有底筒状に形成され、培養後、微生物を
透明容器２外より観察することができるような透明度を
有し、しかもある程度の硬度を持つ材質から成型される
。このような材質としては、例えば成型性がよくコスト
の安いポリスチレン、ポリエチレン樹脂、硬質塩化ビニ
ル樹脂などが挙げられる。挿入体３も前記の透明容器２
と同様に、有底筒状に成型されている。挿入体３として
は、原則的にはある程度の非透水性を有する材質である
ことが必要である。これは挿入体３と透明容器２との間
に形成される間隙５内のゲルの含水率が非常に高いため
で、透水性の高いものを挿入体に用いると培養の間、ゲ
ルの体積が減少し、液面が下がったり、あるいはゲル層
に隙間が出来てしまうからである。また、培養後にコロ
ニーを観察するとき、透明容器外より観察するので、挿
入体は非透明であることが望ましいが、透明の場合には
挿入体の内側に更に別の不透明体を挿入するようにすれ
ばよい。

第１図の培養容器による培養撞作の一例は１１、蓋４を
透明容器２の開口部から外し、透明容器２から挿入体３
を汰き取り、透明容器１内に一定量のゲル化剤、栄養分
を含んだ被検液を流し込む。ここでいう一定量とは、透
明容器２内に挿入体３を挿入し、透明容器２と挿入体３
との間に形成される間隙５に前記被検液の液面が押し上
げられた時、挿入体３内に被検液がこぼれて流れ込むこ
となく、側面に薄層ができる量であり、これは該間隙の
厚さ、容器の大きさにより規定される。間隙５の好まし
い範囲としては、０．０５ｍｍ〜３ｍｍ程度と考えられ
るが、その厚さは、目的に応じて決定すればよい。

第２図の第２実施例に示された培養容器１は、挿入体３
を透明容器２内の適切な位置に保持するため、透明容器
２と挿入体３との底面の中心部に、位置決め機構６が設
けである。この位置決め機構６は、透明容器２の内底面
に形成された凹部７と挿入体３の外底面に突設された凸
部８とから構成され、これらの凹凸関係により、挿入体
３が常に適切な位置に位置決め保持され、間隙５の厚さ
が常に一定とされる。上記の凹部７と凸部８との配置関
係は逆配置であってもよい。Ｍ４は透明容器２と挿入体
３との開口部に装着され、苦４の内面が挿入体３の開口
面に押し付けられることにより、挿入体３がみだりに動
かないようにすること、および培養中における水分の蒸
発を防止する役目を兼ねている。

透明容器２内に挿入体３を安定した状態で保持するため
の位置決め機構の他の例としては、第３図の第３実施例
に示されように構成することもできる。透明容器２の内
底面に環状筒９を突設し、該環状筒９には、円周方向に
適当な間隔を保って中心方向に突き出る突起１０を本例
の場合４個設ける。これらの突起１０に囲まれた空間部
内に挿入体３の下端部を挿入し、四箇所の支持により位
置決め保持せしめる。尚、突起１０は４個に限定されず
、任意に選択できる。

更に、位置決め機構６の他の例としては、第４図の第４
実施例に示す如く、透明容器２の内底面に断面が逆円錐
形状をした凹所１１を設け、該凹所１１に挿入される円
錐凸部１２を挿入体３の外底面に形成する。

更に又、位置決め機構６の他の例としては、第５図およ
び第６図の第５実施例に示す如く、透明容器２の内面に
その上端開口面から内底面にわたり２つの垂直平面１１
．１２を持った扇形状の挿入空間部１３を設ける。この
挿入空間部１３に挿入される挿入体２は２つの垂直平面
１４．１５を持った扇形状に形成される。挿入空間部１
３に挿入体３を挿入せしめ、挿入空間部１３の垂直平面
１１．１２に対して挿入体３の垂直平面１４．１５をそ
れぞれ合致せしめる。すると、透明容器２と挿入体３と
の間隙５は、透明容器２の弧状内周面と挿入体３の弧状
外周面との間に形成されることになる（第５図参照）。

上記の培養容器において、透明容器２と挿入体３との間
に形成された間隙５に薄層ゲルを存在せしめる。このゲ
ル中または／および表面に微生物を培養する場合は、例
えばゲルの固さに関する問題がある。通常、混和平面培
養法にゲル化剤として用いられる寒天は、１．５〜２．
０％程度の濃度がよく用いられている。また、流し込む
培地量としては、食品検査における一般生菌数測定につ
いての公定法を例にとれば９ｃｍの直径のシャーレに約
１５ｍ！である。これは培地の厚さに換算すると約３ｍ
ｍに相当する。この場合、寒天濃度を下げると、ゲルが
軟らかくなり、寒天が凝固し、シャーレを倒置する際、
ゲルが崩れてしまう危険性がある。又、培地量を１５ｍ
１以下にした場合も、予め用意されている被検液に入っ
ているシャーレに寒天培地を加え、静かに回転または前
後左右に傾斜させ混合するのであるが、被検液がシャー
レ全体に分散しなくなる。したがって、培養中コロニー
が出現したときに、コロニーがシャーレのある部分に偏
って、コロニーの計測が困難になる場合も生じる。本発
明による培養方法によれば、上記の問題点はすべて解決
される。すなわち、シャーレを倒置したときに、ゲルが
崩れてしまうような軟らかい場合でも、透明容器と挿入
体との間の間隙により確実にゲルが支持されるので、崩
れることはない。例えば寒天を例にとれば、０３％程度
のｂ：度でも培養が可能となる。また、本発明による透
明容器と挿入体との間にできる間隙の厚さが０．１ｍｍ
程度と薄くても挿入体を透明容器に挿入し、被験液を押
上げるこ志により、検体を均一に分散させることができ
る。

更に、本発明の培養方法に使用される培養容器として、
間隙５の厚さが部分的に異なるように形状を規定するこ
とも可能である。このような例としては、第７図の第６
実施例に示されるように、透明容器２と挿入体３とを四
角柱に形成する。そして、透明容器２内に挿入体３を挿
入することにより、相対向する面、本例においては第７
図において左右方向に間隙４０と４１とを形成する。

方るこ形成される間隙４０の厚さをＤ、他方に形成され
る間隙の厚さをｄとするならば、外部から添加したゲル
化剤を含んだ被検液が、均一でありさえすれば、被検：
夜中のｔ５ｅ細胞数はＤａｄの比率で分配され、一つの
検体で二つの希釈系列として検出できることになり、そ
れだけ細胞数未知の検体の希釈の手間が省けることにな
る。尚、上記の間隙４０．４１は第７図において上下に
形成するようにしてもよい。

更に、第８図に示した第７実施例においては、透明容器
２の開口面を閉しる蓋４が挿入体３と一体に形成しであ
る。透明容器２の開口縁の全周には係止凸部２０が設け
である。この係止凸部２０に係止凹部３０が係脱可能に
係止される。係止凹部３０は挿入体３の開口縁に一体に
設けである。

しかるに、挿入体３を透明容器２内に挿入し、係止凹部
３０を係止凸部２０に嵌め込むことにより挿入体３と一
体の苫４が透明容器２の開口面を閉じることになる。

本発明においては、挿入体の材質としては、完全なる非
透水性かつ非通気性の材質は用いることができない。な
ぜならば、挿入体の内面側に保持される指示薬が、内側
から外側へ移行できないからである。指示薬を挿入体の
内側から外側へ移行させるためには、ご（僅かの水が挿
入体の内外面の間を移動できなくてはならない。そのた
めには、完全なる非透水性ではなく、適度の非透水性を
存する材質に限定される。ここでいう適度の非透水性と
は、挿入体と透明容器との間の間隙でゲル化したゲル中
の水分を微生物の培養が終了するまでの間、ゲルの形を
変形させ得ない程度に保持し得る非透水性という意味で
ある。従って、ゲル化剤の性質、特に保水能と密接にリ
ンクするものである。

このような材質を有する挿入体としては、通気性を存す
るが透水性が非常に低く、かつ細孔が微生物より小さい
シートからなるものである。このシートの例としては、
通気性および透水性を有するシート、例えば紙、布など
のシートを↑８水処理することにより得られる１ａ水処
理シートが挙げられる。

撥水処理する方法としては、前記紙、布などのシートを
シリコンで処理する方法が挙げられる。

前記紙、布などのシートをシリコン処理することにより
、通気性を有するが、透水性が非常に低（なり、その結
果、その細孔は微生物が通過できなくなる程度の大きさ
に変化する。このようなｔθ水処理シートの例としては
、ワットマン社、アトパンチツク東洋社などから市販さ
れているシリコン処理分液濾紙が挙げられる。この分液
濾紙は、通常の濾紙をシリコン処理したものであり、水
をはじく性質を有するため、通気性を有するが、透水性
が非常に低いので、挿入体の材質として本発明に適して
いる。すなわち、液状の状態でゲル化剤および培養源を
含む溶液を透明容器に添加し、該分液濾紙からなる挿入
体を挿入し、ゲル化させる場合、ゲル化剤がゲル化する
までの間、挿入体表面は液体と接するのであるが、該挿
入体は非透水性を有するために、液体は殆ど濾紙にはし
み込まない。また、微生物も挿入体の内部に入り込むこ
とが出来ずにゲル内部に全て止まるので、挿入体の材質
として適している。

上記のシリコン処理シート以外に、それ自体微生物を通
す大きさの細孔を有するような紙、布などのシートであ
っても、ポリマーで処理することにより、通気性を有す
るが、透水性が非常に低く、かつその細孔が微生物より
小さい材質のもとすれば本発明に使用できる。

前記以外の材質を有する挿入体としては、ある特定の材
質を有するメンブランフィルタ−からなる挿入体が挙げ
られる。このメンブランフィルタ−としては、四部ソ化
エチレン樹脂を原料とするメンブランフィルタ−が好ま
しい。このメンブランフィルタ−の孔径は、０．１〜５
μｍの範囲で各種あるが、このように非透水性の強い、
換言すれば吸水性の低い材質を用いた場合、本挿入体と
して使用できる。

本発明においては、増殖した微生物をコロニとして検出
するに際しては、指示薬を用いて検出するのが好ましい
。そのためには、この指示薬をシートからなる挿入体の
内面側、すなわちゲルと接触する面とは逆の面に予め保
持させておき、微生物が増殖する間に、シートの内面側
から外面側に指示薬の一部が移行し、その結果、微生物
と指示薬とが接触し、微生物の作用により該指示薬が検
出可能な成分に変化させればよい。指示薬をシートに保
持させるには、指示薬をシートに塗布してもよいし、接
着してもよい。

指示薬としては、微生物の作用により呈色する呈色剤、
蛍光を呈する蛍光剤あるいは発光を呈する発光剤が挙げ
られる。呈色剤としては、微生物の作用により還元され
て無色の物質が有色の物質に変化するものが好ましい。

例えば、還元時に有色のホルマザン染料になる種々のテ
トラゾリウム化合物、具体的にはトリフェニルテトラゾ
リウムクロライド（ＴＴＣ）　、２−　（ｐ−ヨードフ
ェニル）−３−（ｐ−ニトロソ・エニル）−５−フェニ
ル−２Ｈ−テトラゾリウムクロライド（ＩＮＴ）、３．
３−　（３，３−ジメトキシ−４，４−ジフェニレン）
−ヒス（２−（ｐ−ニトロフェニル）−５−フェニル−
２Ｈ−テトラゾリウムクロライド）、３−（４，５−ジ
メチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ
−テトラゾリウムクロライド（ＭＴＴ）などやニュート
ラルレッドのようなｐＨ変化に感受性のものなどが用い
られる。

蛍光剤としては、微生物の作用、例えば産生されるジア
ホラーゼの作用により還元されて蛍光を発し、ＵＶ照射
などにより検出可能な物質に変化するものが用いられる
。例えばレサズリンなどが挙げられる。このものはレゾ
ルフィンに変化し、この蛍光を測定することによりコロ
ニーを検出する。

発光剤としては、微生物の作用により酸化されて発光を
呈する物質に変化するものが用いられる。例えば、ルミ
ノールなどが挙げられる。

本発明で使用される挿入体がフィルムのように強度がな
い場合、その内側に支持体を設けることもできる。−例
として挿入体の内側に透明容器と同じ材質の支持体を設
ければよい。また、この場合、挿入体をその支持体に接
着することもでき、そのとき、挿入体は底部閉鎖である
必要はない。

挿入体としては、第９図（ａ）に示すように中空円筒状
に形成された支持体４０の全周面に通気孔１３０を形成
したり、また（ｂ）図の支持体４０に示すようにスリ７
）１３１を該支持体の軸線方向に沿って形成し、挿入体
の通気性を損わないようにすればよい。尚、このスリッ
トは軸線方向ではなく、支持体の円周方向に形成するよ
うにしてもよい。第９図（ｃ’）に示す支持体４０は、
日ソド１３２の上下端に円盤１３３．１３４を固定し、
円盤１３３には切り抜き孔１３５を形成する。

次に、本発明の方法により微生物を培養する場合の原理
説明をすると、透明容器に治養に必要な成分を保持せし
める面としては、第１０図に示されるようにする。

符号Ａで示した透明容器２の内面側、符号Ｂで示した挿
入体３の外面側、符号Ｃで示した挿入体３の内面側であ
る。そして、上記符号Ａ、Ｂで示した面にはゲル化剤、
栄養分からなる群より選ばれる一種または二種以上の試
薬を、Ｃの面には細胞染色剤がそれぞれ保持される。

ゲル化剤は、例えばに−カラギーナンやゲランガムなど
のように、Ｋゝ、Ｎａ”などのイオン存左下でゲル化す
るものがあるので、構成としてはそれらを別々に保持、
あるいは一方を保持、もう一方を外部より溶液添加する
ことができる。したがって、ゲル化剤が一種類のときに
おける保持構成としては、透明容器の内面側ずなわら符
号へで示す部分に、挿入体２の外面側すなわち符号Ｂで
示す部分に、更に外部添加の３つの組み合わせからなる
。また、ゲル化剤が２種類のときは、同様に３つの組み
合わせとなり、従って、以下の６通りの組み合わせがあ
る。

■ゲル化剤が被検液と共に外部添加される場合■ゲル化
剤が透明容器の内面側に保持される場合。

■ゲル化剤が挿入体の外面側に保持される場合。

■ゲル化剤の一方が透明容器の内面側に保持され、他方
が外部添加される場合。

■ゲル化剤の一方が挿入体の外面側に保持され、他方が
外部添加される場合。

■ゲル化剤の一方が挿入体の外面側に保持され、他方が
透明容器の内面側に保持される場合である。

前記■のゲル化剤は、−ａに用いられている寒天のよう
に、冷却によりゲル化するものであり、他にに一カラギ
ーナン等がある。■、■および■のゲル化剤が透明容器
または挿入体に保持される場合は、ゲル化剤が乾燥状態
で保持され、被験液が添加されたときにゲル化し、その
時、微生物自体がゲルの網目構造の中へ取り込まれるこ
とが望ましい。例えばゲル化した寒天を乾燥させたもの
に水分を加えても元の状態に復元しないので、ここでは
適当でない。この条件を満足させるものとしては、冷水
で膨潤するゲル化剤粉末がある。ローカストビーンガム
、キサンタンガム、に−カラギーナン、カルボキシメチ
ルセルロース等のゲル化剤は室温の水で溶解するので冷
水で膨潤するゲル化剤粉末として適当である。又、−皮
形成したゲルを乾燥被膜としたものでは、キサンタンガ
ム、ローカストビーンガムの混合物、キサンタンガム、
ローカストビーンガム、に−カラギーナンの混合物、キ
サンタンガム、に−カラギーナンの混合物が適当であっ
た。更に、■および■のゲル化剤の一成分を挿入体３、
透明容器２のいずれか一方に保持させ、一方の成分を外
部から溶液として添加するもので、その組み合わせ例と
しては、Ｋ′″あるいはＮａ”　とに−カラギーナン、
Ｃａ−あるいはＭｇ“あるいはに°或いはＮ　ａ　＋と
ゲランガム、Ｃａ”とアルギン酸ナトリウム等がある。

に−力ラギーナンを用いる場合は、に−カラギーナンを
二つに分配し、一方はイオンを含んだ塩と共に乾燥被膜
として挿入体、透明容器に保持させ、他方は溶液として
外部から添加することができる。その場合、に−カラギ
ーナンの被膜層としては、総に一カラギーナン量に対し
２〜６０％の範囲で可能で、に−カラギーナンがそれ以
上になるとゲルの復元が困難になる。

次に、栄養分の配置構成としては、（１）透明容器の内
面側、（２）挿入体の外面側、（３）外部添加の３通り
である。（１１および（２）の場合は、乾燥状態で保持
させるのが望ましく、粉末または塗布乾燥のどちらかに
より被膜を作ればよい。栄養分の組成については増殖す
べき、微生物の型により変動するので特に限定はされな
い。

各々の成分を、それぞれの透明容器、挿入体に保持する
には、微生物の増殖を阻害しない適当な接着剤を用いれ
ばよく、好適な例としては澱粉、あるいはメチルセルロ
ース、カルボキシメチルセルロースなどのセルロース誘
導体、ポリビニルピロリドン、アラビアゴム、ゼラチン
等の親木性高分子接着剤がある。また、接着剤は、各種
成分と混合した後塗布するか、または別個に塗布するよ
うにすればよい。

次にゲル化剤および栄養分を含む成分層の配置例および
添加例について第１１図ないし第２８図を参照して説明
する。

第１１図に示した添加例は、透明容器２にゲル化剤、栄
養分および微生物を液体状態で外部から同時に添加して
、挿入体３を挿入し、蓋をして培養を行えばよい。第１
２図に示した例は、挿入体３の外面に栄養分が設けられ
、そして這明容器２には外部から微生物とゲル化剤が液
体状態で添加される。第１３図に示した例は、挿入体３
の外周面に栄養分とゲル化剤の一部が設けられ、そして
透明容器２には外部から１敦生物とゲル化剤の一部が液
体状！唄で添加される。第１４図に示した例は、挿入体
３の外周面に栄養分とゲル化剤の一部が設けられ、そし
て透明容器２には外部から微生物とゲル化剤の一部が？
＆体状態で添加される。第１５図に示した例は、挿入体
３の外周面に栄養分とゲル化剤が設けられ、そして透明
容器２には外部から微生物が液体状態で添加される。第
１６図に示した例は、挿入体３の外周面にゲル化剤の一
部が設けられ、そして透明容器２には外部からゲル化剤
の一部と栄養分および微生物が液体状態で添加される。

第１７図に示した例は、挿入体３の外周面にゲル化剤が
設けられ、そして透明容器２には外部から微生物と栄養
分が液体状態で添加される。第１８図に示した例は、透
明容器２の内面にゲル化剤の一部が設けられ、そして透
明容器２には外部から微生物と栄養分およびゲル化剤の
一部が液体状態で添加される。第１９図に示した例は、
透明容器２の内面にゲル化剤が設けられ、そして透明容
器２には外部から微生物と栄養分とが液体状態で添加さ
れる。第２０図に示した例は、挿入体３の外周面に栄養
分が設けられ、かつ透明容器２の内面にはゲル化剤の一
部が設けられ、そして透明容器２には外部から微生物と
ゲル化剤の一部が液体状態で添加される。第２１図に示
した例は、挿入体３の外周面に栄養分が設けられ、かつ
透明容器２の内面にゲル化剤が設けられ、そして透明容
器２には外部から微生物が液体状態で添加される。第２
２図に示した例は、挿入体３の外周面に栄養分とゲル化
剤の一部が設けられ、かつ透明容器２の内面にはゲル化
剤の一部が設けられ、そして透明容器２には外部から微
生物が液体状態で添加される。第２３図に示した例は、
透明容器２の内面に栄養分とゲル化剤の一部が設けられ
、そして透明容器２には外部から微生物とゲル化剤の一
部力９夜体状態で添加される。第２４図に示した例は、
挿入体３の外周面にゲル化剤の一部が設けられ、かつ透
明容器２の内面にはゲル化剤の一部が設けられ、そして
透明容器２には外部がら微生物と栄養分とが液体状態で
添加される。第２５図に示した例は、挿入体３の外周面
にゲル化剤の一部が設けられ、かつ透明容器２の内面に
はゲル化剤の一部および栄養分が設けられ、そして透明
容器２には外部から微生物が液体状態で添加される。第
２６図に示した例は、透明容器２の内面に栄養分が設け
られ、そして透明容器２には外部から微生物とゲル化剤
が液体状態で添加される。第２７図の示した例は、挿入
体３の外周面にゲル化剤の一部が設けられ、かつ透明容
器２の内面に栄養分が設けられ、そして透明容器２には
外部から微生物とゲル化剤の一部が液体状態で添加され
る。第２８図に示した例は、挿入体３の外周面にゲル化
剤が設けられ、かつ透明容器２の内面には栄養分が設け
られ、そして透明容器２には外部がら微生物が液体状態
で添加される。なお、前記の各構造例において挿入体３
の内面に対して任意の指示薬を設けておくことにより、
呈色、蛍光、発光検出が行えることになる。

次に、実験例について説明する。

尖辰■−上 透明容器は透明なスチロール樹脂材料により有底筒状に
射出成型した。透明容器の各寸法は、内底面の内径が３
０ｍｍ、開口面の内径が３２ｍｍ、内底面から開口面ま
での高さが１００ｍｍ、内底面の中心部に凸起（直径２
５．０８ｍｍ、高さ１．５ｍｍ）を設ける。この突起は
、後で説明する挿入体を支持する支持体と結合させるた
めに使用される。

支持体は、スチロール樹脂により射出成型され、その各
寸法は次の通りである。支持体は１．５ｍｍの上げ底を
有する有底筒状に形成しである。

底部の外径は２８．０８ｍｍ、上端開口部の外径は３０
．０８ｍｍ、高さ１００ｍｍ、肉厚１．　５ｍｍである
。上げ底の高さは１．５ｍｍであり、この上げ底によっ
て形成された底部空間部が前記の凸起に対し嵌め込んで
結合される。支持体は、その上端開口面から下方に３ｍ
ｍ、下端開口縁から上方に３ｍｍを除いて周面全体に直
径３ｍｍの孔が多数明けである。支持体は透明容器内に
挿入され、支持体の底部開口部が透明容２ゴの内底面の
凸起に嵌め込まれ、支持体の位置決め保持が行われる。

支持体の外側に挿入接着される挿入体は、東洋ヴこ紙（
株）の分離濾紙Ｎｏ、２３　（厚さ０．２６ｍｍ）を筒
状に丸めたときに支持体の外径に見合う長さに切り取り
、支持体に孔の明けてない部分に相当する部分の重なり
部を水不溶性の接着剤を用いて接着し、それ以外の部分
はカルボキシメチルセルロース（和光純薬裂）により接
着して、挿入体を形成した。

透明容器の中に支持体に接着されている挿入体を挿入し
、透明容器の開口端から蓋をした。透明容器と挿入体と
の密閉間隙は０．７ｍｍである。

このように構成した培養容器をγ線により放射線滅菌し
た。

を 種々の微生物を濃度約１０”　　（ＣＦＵ−コロニー形
成単位）になるよう滅菌水にて希釈し、それぞれ０．５
ｍｆづつ透明容器内にう目土した。

別のＳＣＤブイヨン培地（栄研化学社製）と寒天（和光
純薬社製）の混合物（濃度：３％ブイヨン培地、０．６
％寒天）を加熱）容器した後、オートクレーブにて滅菌
し、４５°Ｃの恒温槽中で保温しておいたものを、それ
ぞれの菌液の入った透明容器内に５ｍｆづつ添加し、菌
液と良く混合するようにン昆ぜ、寒天が固まらないうち
に、透明容器に挿入体を押し込み、蓋をする。このもの
を３７℃、４８時間、ふ卵器中で培養した。

対象として３％ＳＣＤブイヨン培地、寒天の混合物（濃
度３％ＳＣＤブイ９ン培地、１．５％寒天）を同様に滅
菌し、恒温槽中で保温したものを用意し、あらかじめ前
記菌液を０．５ｍ／分注しである直径９ｃｍの滅菌シャ
ーレ（岩城硝子社製）に２０ｍｆ加え、培地と菌液が良
く混合するように十分に混釈し、培地が凝固しン・らシ
ャーレを倒置し、３７゛Ｃ１４８時間、ふ卵器中で培養
した。

両者につき、コロニー数を計測した結果は第１表の通り
であった。

次の４つの方法について比較実験を行った。

尚、■本発明方法、■対照法ｌおよび■対照法２で用い
た培養容器の透明容器と支持体は前記実験例１に記載の
ものと全く同様である。

■本発明方法； ＩＮＴ（同位化学研究所製）とカルボキシメチルセルロ
ースナトリウム（和光純薬社製）の混合溶液を乾燥時に
ＩＮＴｌｍｇ、カルボキシメチルセルロースナトリウム
２０ｍｇを含有するように実験例１に記載の分液濾紙Ｎ
ｏ、２３に塗布し、乾燥したものを、塗布した面が支持
体の外面と向かい合うように前記支持体に接着し、挿入
体とした。

■対照法１； 実験例１に記載の通り、ＩＮＴが含有していない挿入体
を用いた。

■対照法２； 上記の本発明方法において、塗布した面が支持体の外面
とは逆の面、すなわちゲルと接触する面となるよう支持
体に接着したものを挿入した。

■対照法（シャーレ法）； 実験例１と同様にシャーレ法を用いた。

■ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂ
ａｃｔａｒ　　ｃｌｏａｃａｅ、Ｃ１ｔｒ。

ｂａｃｔｃｒ　　　ｆｒｃｕｎｄｉｉ、Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ　　５ｂｔｉｌｉｓおよび５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃ
ｕｓ　　ａｕｒｃｕｓの５種の細菌について菌；・農度
１０２　（ＣＦＵ）になるように滅菌水に希釈し、各々
の菌種について３木づつ透明容器内に分注した。

別にＳＣＤブ・イコン培地と寒天の混合物（ブイヨン３
％、寒天０．６％）を実施例１と同様に滅菌し、４５℃
の恒温槽中で保温した。方法■については、予め水に溶
かした後、マイレクスＧＶフィルター（日本ミリボアリ
ミテッド社製）で除菌したＴＮＴ溶液を終濃度０．２％
になるように上記寒天培地に添加したものを、方法■お
よび■については、上記寒天培地を、それぞれ凹液の入
った透明容器内に５ｍｌづつ添加し、菌液とよく混合す
るように混ぜ、寒天が固まらないうちに、各々挿入体を
押し込み蓋をする。この培養容器を３７°Ｃ１２４時間
、ふ卵器中で培養した。方法■については、シャーレを
用いて、３７”Ｃ，２４時間ふ卵２′：ｒ中で培養した
。

精且 培養した結果は、第２表に示す通りであった。

上記の結果から、呈色剤を用いて微生物を培養検出する
に当たっては、対照法１の如く呈色剤を直接微生物の培
地に加えて培養検出する場合、あるいは対照法２の如く
挿入体の外面、すなわちゲルと接触する側の面に呈色剤
層を設けて培養検出する場合には、最初から微生物と呈
色剤が接触するため、微生物の増殖が妨げられて満足す
べき検出が行えないのに対し、本発明方法の如く呈色剤
層を挿入体の内面に設けて培養検出する場合には、微生
物がその増殖の初期において、直接呈色剤と接触しない
ため、増殖が妨げられることなく、微生物が増殖できる
ので、従来のシャーレ法と同様の再現性のある微生物の
培養検出が行えることを示している。

尖鼓拠−主 実験例２の■の挿入体に、更に外面にに一カラギーナン
（和光純薬社製）、カルボキシメチルセルロースナトリ
ウム、キサンタンガム（輿入社製）、ローカストビーン
ガム（三栄化学工業社製）、ＳＣＤ培地の混合溶液を乾
燥時にに一カラギーナン５５ｍｇ、カルボキシメチルセ
ルロースナトリウム２７．５ｍｇ、キサンタンガム８８
ｍｇ、ローストビーンガム１１ｍｇ、ＳＣＤブイヨン培
地１６５ｍｇとなるように塗布乾燥した。

その他の構成は実験例１と同じ。

を 約１０”　ＣＦＵ／ｍｌ濃度のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
　　ｃｏｌｉ溶液を５０ｒｉｅｌ製し、そのものを透明
容器内部に５ｍｊ２．０．５ｍＪ、０．　０５ｍ１づつ
添加し、滅菌水で合計が５ｍｆｆになるように合わせ、
それぞれ良く混合した。挿入体を押し込み蓋をしてふ卵
器中で３７℃、２４時間培＠後、コロニー数を計測した
。なお、同じ菌液濃度に対し３本づつ実施した。その結
果を第３表に示した。

実験例１と同様の透明容器の内側にに一カラギーナン、
キサンタンガム、ＳＣＤブイヨン培地の混合溶液を乾燥
時にに一カラギーナン５０ｍｇ、キサンタンガム６７ｍ
ｇ、ＳＣＤブイヨン培地１５０　ｍ　ｇになるように塗
布乾燥した。

挿入体は、実験例２と同様にＩＮＴとカルボキシメチル
セルロースナトリウムを、分液濾紙ＮＯ，２３に塗布し
、乾燥したものを塗布した面が支持体の外面と向かい合
うよう前記支持体に接着した。

耐咋 約１０２ＣＦＵ／ｍｎのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃ
ｏｌｉ溶ン夜を５０ｍＡに３周製し、そのものを透明容
器内部に５ｍ６．０．５ｍｌ、０．０５ｍ１づつ添加し
、滅Ｉｌ水で合５１が５ｍｆｆになるように合わせ、そ
れぞれ良く混合した。そして、挿入体を押し込み、苦を
して、ふ部器中で３７°Ｃ１２４時間培養後、コロニー
数を計測した。

対象として、３％ＳＣＤブイコンｌご地、１．　５％寒
天の混合溶液を同様に）成菌し恒温＋１１Ｙ中で保温し
ておいたものを用意して前記菌液および前記１″こ１液
を滅菌水で１０倍に希釈したものを各々０．５ｍ１分注
しである直径９ｃｍの）成苗シャーレに２０ｍ７？を加
え、培地と菌液がよく混合するように十分に混釈し、培
地が凝固したらシャーレを倒置し、３７℃、２４時間、
ふ部器中でｌΔ養した。

本発明においては染色しれコロニーを、対象においては
コロニーをそれぞれ肉眼で計測した。その結果を第４表
に示した。

芽」Ｌ及 実験例２の■挿入体に、更に外面にカルボキシセルロー
スナトリウム、キサンタンガム、ＳＣＤブイヨン培地の
混合溶液を乾燥時にカルボキシメチルセルロースナトリ
ウム２７．５ｍｇ、キサンタンガム８８ｍｇ、ＳＣＤブ
イヨン培地１５０ｍｇになるように塗布乾燥した。

又、実験例１と同様の透明容器の内側にに一カラギーナ
ン、ローカストビーンガムの混合溶液を乾燥時にに一カ
ラギーナン５５ｍｇ、ローカストビーンガム１１ｍｇに
なるように塗布乾燥した。

その他の構成は実験例１に同じ。

■ 実験例３に同じ。その結果を第５表に示した。

実験例２の挿入体に、更に外面にに一カラギナン、ＳＣ
Ｄブイヨン培地の混合溶液を乾燥時にに一カラギーナン
ｌ　Ｑｍｇ、ＳＣＤブイヨン培地１５０ｍｇになるよう
に塗布乾燥した。

その他の構成は実験例工に同じ。

■ 種々の細菌を濃度約１０”ＣＦＵ／ｍｊ２になるように
滅菌水で希釈したものをそれぞれ０．５ｍｌづつ透明容
器内に分注した。０．３％に一力うギーナン溶液をそれ
ぞれの菌液の入った透明容器内に５ｍＡづつ添加し、菌
液とよく混合するように混ぜ、挿入体を押し込み蓋をす
る。このものを３７℃、４８時間、ふ部器中で培養した
。

対象として、実験例１と同）ニド　シャーレによる方法
を行った。本発明においては染色されたコロニーを、対
象においてはコロニーをそれぞれ肉眼で計１ｉｔｌｌ　
Ｌだ。その結果を第６表に示した。

第工議− 実験例１と同様の透明容器の内側に、カルボ・トシメチ
ルセルロースナ１−リウム、に−カラギーナン、ＳＣＤ
ブイヨン培地の混合物を乾燥時にカルボキシメチルセル
ロースナトリム２７．５ｍｇ、に−カラギーナン１０ｍ
ｇ、、ＳＣＤブイヨン培地１５９ｍｇになるように塗布
乾燥した。

その他の構成は実験例２■と同じ。

０１３％に一カラギーナン溶液を用いて、約１０”ＣＦ
Ｕ／ｍ７！濃度のＥｓｃｈｃｒｉｃｈｉａｃｏｌｔＳＥ
ｎｔｅｒｏｂａｃｔｃｒ　　ｃｌｏａｃａｅ、Ｃ１ｔｒ
ｏｂａｃｔｃｒ　　ｆｒｅｕｎｄｉｉの各細菌）′８液
を調製し、それぞれ５ｍ６を透明容器内部に添加し、素
早く挿入体を押し込み、苫をして、ふ部器中で３７℃、
２４時間培養後、染色されたコロニー数を計測した。な
お、同じ菌種につき２本づつ実施した。その結果を第７
表に示した。

辺二し友 実験例１の挿入体の外面にに一カラギーナン（和光純薬
社製）、カルボキシメチルセルロースナトリム、キサン
タンガム（輿入社製）、ローカストビーンガム（三栄化
学工業社製）、ＳＣＤ培地の混合溶液を乾燥時にに一カ
ラギーナン５５ｍｇ、カルボキシルメチルセルロースナ
トリウム２７５ｍｇ、キサンタンガム８３ｍｇ、ローカ
ストビーンガム１１ｍｇ、ＳＣＤブイヨン培地１６５ｍ
ｇとなるように塗布乾燥した。

その他の構成は実験例１と同じ。

を 約１０”　ＣＦＵ／ｍｆｆ濃度のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ　　ｃｏｌｉ溶液を５０ｍｌ調製し、そのものを透明
容器内部に５ｍＡ、０．５ｍｊ２．０．０５ｍ！！づつ
添加し、滅菌水で合計が５ｍＡになるように合わせ、そ
れぞれよく混合した。挿入体を押し込み、蓋をして、ふ
部器で３７°Ｃ１２４時間培養後、コロニー数を計測し
た。なお、同じ菌液濃度に対し３本づつ実施した。その
結果を第８表に示した。

■主表 実験例１と同？、１の透明容器の内側に、に−カラギー
ナン、キサンタンガム、ＳＣＤブイヨン培地混合溶液を
乾燥時に、に−カラギーナン５０ｍｇ、キサンタンガム
６７ｍｇ、ＳＣＤブイヨン培地１５０ｍｇになるように
塗布乾燥した。

その他の構成は実験例１に同じ。

昆作 約１０２ＣＦＵ／ｍｊ！？５度のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ　　ｃｏｌｉ溶液を５０　ｍ　ｅ　１ｆＦＪ製し、そ
のものを透明容器の内部に５ｍＪ、０．５ｍＡ、０゜０
５ｍ℃づつ添加し、滅菌水で合計が５ｍＡになるように
合わせ、それぞれよく混合した。挿入体を押し込み、蓋
をして、ふ部器中で３７℃、２４時間培養後、コロニー
数を計測した。

対象として、３％ＳＣＤブイヨン培地、１．５％寒天の
混合？８液を同様に滅菌し、恒温槽中で保温しておいた
ものを用意して、前記菌液を滅菌水で１０（ｎに希釈し
たものを各々Ｑ、５ｍｐ分注しである直径９　ｃ、　ｍ
の滅菌シャーレに２０ｍ℃を力■え、培地と菌液がよく
混合するように十分に混釈し、培地が凝固したらシャー
レを倒置し３７°Ｃ１２４時間、ふ部器で培養後、コロ
ニーをそれぞボ１、肉眼で計測した。その結果を第９表
に示した。

実験例１と同様の挿入体の外側にカルボキシメチルセル
ロースナトリウム、キサンタンガム、ＳＣＤブイヨン培
地の混合溶液を乾燥時にカルボキシメチルセルロースナ
トリウム２７．５ｍｇ、キサンタンガム８８ｍｇ、ＳＣ
Ｄブイヨン培地１５０ｍｇになるように塗布乾燥した。

又、実験例１と同様の透明容器の内側にに一カラギーナ
ン、ローカスト・ビーンガムの混合溶液を乾燥時にに一
カラギーナン５５ｍｇ、ローカストビーンガム１１ｍｇ
になるように塗布乾燥した。

その他の構成は実験例１に同じ。

を 実験例８に同じ。その結果を第１０表に示した。

実験例１の挿入体の外面にに一カラギーナン、ＳＣＤブ
イヨン培地の混合溶液を乾燥時にに一力うギーナンｌ　
Ｑｍｇ、ＳＣＤブイヨン培地１５０ｍｇになるように塗
布乾燥した。

その他の構成は実験例１に同じ。

■ 種々の細菌を濃度約１０”ＣＦＵ／ｍ７！になるように
滅菌水で希釈したものをそれぞれ０．５ｍＡづつ透明容
器内に分注した。０．３％に一力うギーナン溶液をそれ
ぞれの笛液の入った透明容器内に５ｍＡづつ添加し、菌
液と良（混合するように混ぜ、挿入体を押し込み、蓋を
する。このものを３７℃、４８時間、ふ部器中で培養し
た。

対象として、実験例１と同様、シャーレによる方法を行
った。

コロニーをそれぞれ肉眼で計測した。その結果を第１１
表に示した。

第」二り友 ボキシメチルセルロースナトリウム２７．５ｍｇ、に−
カラギーナンｌＱｍｇ、ＳＣＤブイヨン培地１５０ｍｇ
になるように塗布乾燥した。

その他の構成は実験例１と同じ。

０．３％に一力うギーナン？容）夜を用いてＸ、勺１０
２ＣＦ　Ｕ　／　ｍ　Ｅ　Ｑ５度のＦ、５ｃｈｃｒｉｃ
ｈｉａ　　ｃｏｌｉ、、ＥｎｔｅｒｏｂａｃｔＣｒ　　
ｃｌｏａｃａｅ、Ｃ１ｔｒｏｂａｃｔｃｒ　　ｆｒｃｕ
ｎｄｉｉの各細菌溶液を調製し、それぞれ５ｍｌを透明
溶液内部に添加し、挿入体を素早く押し込み、苦をして
、ふ部器中で３７℃、２４時間培養後、染色されたコロ
ニー数を計測した。なお、同じ菌種につき２本づつ実施
した。その結果を第１２表に示した。

実験例１と同様の透明容器の内側に、カルボキシメチル
セルロースナトリウム、に−カラギーナン、ＳＣＤブイ
ヨン培地の混合物を乾燥時にカル〔発明の効果〕 本発明は以上説明したように、被験液を透明容器に添加
し、通気性を有するが、透水性が非常に低くかつその細
孔が微生物より小さいシートからなる挿入体を透明容器
に挿入し、透明容器と挿入体との間に存在する栄養分お
よびゲル化剤を含む成分層の表面および／または内部に
おいて被験液中の微生物を培養し、該培養によって増殖
した微生物を透明容器外から検出するようにしたので、
以下に列挙する如く種々の効果が得られる。

（１）被験液は単にある一定量を透明容器に添加するだ
けであって、被験液を培養容器に添加する場合の熟練度
を必要としないので、常に均一な培養が行える。

（２）透明容器に挿入体を挿入することにより、被験液
が容易かつ非常に均一に分散されるので、被験液を培地
に均一に分散せしめるための熟練度も必要としない。

（３）透明容器の中で直接被験液の希釈ができるので、
被験液の希釈の手間が簡略化される。

（４）従来の寒天温度（シャーレ法では通常１．５〜２
．０％程度）より低い）震度でも微生物の培養検出が可
能である。

（５）挿入体として使用するシートが安価であるため、
培養容器全体のコストを低減化できる。

（６）微生物の検出結果がシャーレ法との相関性が高く
、従来の簡易培養検出法に比べて検出結果の信頼度が高
い。

（７）自動検出機との連動化が容易である。

（８）培地と接触する挿入体の面の逆の面に指示薬層を
設けることにより、シートの材質と相まって微生物の増
殖が進行するまで、でき得る限り指示薬と微生物との接
触を遅らせることができるので、微生物の増殖が妨げら
れることなく進行するため、指示薬の影響を受けやすい
微生物であっても、シャーレ法との相関性の高いコロニ
ーの検出が行えることになる。

【図面の簡単な説明】

図面ば本発明の方法を実施するための好適な培養容器を
示したものであり、第１図は第１実施による培な容器の
縦断面図、第２図は第２実施例による培養容器の縦断面
図、第３図は第３実施例による培養容器の平面図、第４
図は第４実施例による１、７養容器の縦断面図、第５図
は第５実施例による培養容器の平面図、第６図は第５図
における透明容器の斜面図、第７図は第６実施例による
培養容器の水平断面図、第８図は第７実施例による培養
容器の縦断面図、第９図（ａ）、（ｂ）（ｃ）はそれぞ
れ異なる支持体の斜面図、第１０図は培養成分層の配置
例を説明するための部分説明図、第１１ズないし第２８
図は培養成分層の配置例および添加例のそれぞれ異なる
場合の説明図である符号の説明 １・・・培養容器 ・透明容器 ・挿入体 蓋 間隙 ・支持体 透明容器の内面側に形成した成分層 挿入体の外面側に形成した成分層 挿入体の内面側に形成した指示薬層 １、事件の表示 昭和６３年　特許願　第３０９２５７号２、発明の名称 微生物の培養検出方法 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 住所　静岡県田方郡大仁町三幅６３２番地の１名称　東
洋醸造株式会社 ４、代理人　〒１７０ 東京都豊島区北大塚２−２５〜１ ５、補正の対象 （１）明細書の特許請求の範囲の欄 （２）明細書の発明の詳細な説明の欄 ６、補正の内容 （１）明細書の特許請求の範囲を別紙の通り訂正する。 （２）明細書第９真上から１行目「微生物より小さい細
孔を有する」とあるを「微生物が通過できない」と訂正
する。 （３）明細書第１３真上から１０行口「挿入体２」とあ
るを「挿入体３」と訂正する。 （４）明細書第１６真下から８行目「止凹部３０を係止
凸部」とあるを「止凹部３０を外方向に引っ張り変形さ
せて係止凸部」と訂正する。 （５）明細書第１７真下から９行目ないし８行目「細孔
が微生物より小さい」とあるを「微生物が通過できない
」と訂正する。 （６）明細書第１８頁上から２行目「その細孔」とある
を「細孔」と訂正する。 （７）同真上から３行目「大きさ」とあるを「性質」と
訂正する。 （８）明細書第１９真上から３行目「かつその細孔が・
・・・のもとす」とあるを「かつ微生物が通過てきない
ような材質のもの、例えばその細孔が微生物より小さい
材質のものとず」と訂正する。 （９）明細書第２０真上から１行目「該指示薬が」とあ
るを「該指示薬を」と訂正する。 ００）明細書第２３東上から１１１行目添加される場合
」とあるを「添加される場合。」と訂正する。 ０υ明細書第５３頁表の下から４行目「その細孔が微生
物より」とあるを「被検液中の微生物が通過できない」
と訂正する。 ｌ　−した−一ン゛の、１ 「（１）被検液を透明容器に添加し、該透明容器に通気
性を有するが透水性が非常に低くかつ被検液中の微生物
が血担−象梵ンートからなる挿入体を挿入し、該透明容
器と挿入体との間に存在する栄養分およびゲル化剤を含
む成分層の表面および／または内部において被検液中の
微生物を培養せしめ、該培養によって増殖した微生物を
透明容器外から検出するようにしたことを特徴とする微
生物の培養検出方法。 （２）挿入体の内面側に指示薬を保持してなる請求項１
記載の微生物の培養検出方法。 （３）シートが通気性および透水性１宜す、しかも細孔
が被検液中の微生物よりも大きくてもよいシートを↑θ
水処理することにより得られた撥水処理シートである請
求項１または２記載の微生物の培養検出方法。 （４）氾水処理シートがシリコン処理紙、ポリエチレン
処理紙またはシリコン処理布である請求項３記載の微生
物の培養検出方法。 （５）シリコン処理紙がシリコン処理分液濾紙である請
求項４記載の微生物の培養検出方法。 （６）指示薬が呈色剤、蛍光剤または発光剤である請求
項２記載の微生物の培養検出方法。 （７）微生物が増殖する間に挿入体の内面側に保持して
いる指示薬が成分層に移行して微生物と指示薬とが接触
することにより生じる呈色、蛍光または発光を検出して
なる請求項１．２または６記載の微生物の培養検出方法
。 （８）成分層のゲル化剤が ■被検液と共に外部より添加される場合、■透明容器の
内面側に保持されている場合ユ■挿人体の外面側に保持
されている場合ユ■一方が透明容器の内面側に保持され
、他方が外部より添加される場合ユ ■一方が挿入体の外面側に保持され、他方が外部より添
加される場合、および ■一方が透明容器の内面側に保持され、他方が挿入体の
外面側に保持されている場合ユの群より選ばれた形態で
存在せしめられることを特徴とする請求項１または２記
載の微生物の培養検出方法。 （９）成分層の栄養分が ■被検液と共に外部より添加される場合、■透明容器の
内面側に保持されている場合、および ■挿入体の外面側に保持されている場合工の群より選ば
れた形態で存在せしめられることを特徴とする請求項１
．２または８記載の微生物の培養検出方法。 Ｏωゲル化剤および／または栄養分が透明容器および／
または挿入体に保持される場合には、乾燥状態で保持さ
れることを特徴とする請求項８または９記載の微生物の
培養検出方法。 以」ニ

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. （１）被検液を透明容器に添加し、該透明容器に通気性
   を有するが透水性が非常に低くかつ被検液中の微生物よ
   り小さい細孔を有するシートからなる挿入体を挿入し、
   該透明容器と挿入体との間に存在する栄養分およびゲル
   化剤を含む成分層の表面および／または内部において被
   検液中の微生物を培養せしめ、該培養によって増殖した
   微生物を透明容器外から検出するようにしたことを特徴
   とする微生物の培養検出方法。
2. （２）挿入体の内面側に指示薬を保持してなる請求項１
   記載の微生物の培養検出方法。
3. （３）シートが通気性を有しかつ透水性が非常に低くし
   かも細孔が被検液中の微生物よりも大きくてもよいシー
   トを撥水処理することにより得られた撥水処理シートで
   ある請求項１または２記載の微生物の培養検出方法。
4. （４）撥水処理シートがシリコン処理紙、ポリエチレン
   処理紙またはシリコン処理布である請求項３記載の微生
   物の培養検出方法。
5. （５）シリコン処理紙がシリコン処理分液濾紙である請
   求項４記載の微生物の培養検出方法。
6. （６）指示薬が呈色剤、蛍光剤または発光剤である請求
   項２記載の微生物の培養検出方法。
7. （７）微生物が増殖する間に挿入体の内面側に保持して
   いる指示薬が成分層に移行して微生物と指示薬とが接触
   することにより生じる呈色、蛍光または発光を検出して
   なる請求項１、２または６記載の微生物の培養検出方法
   。
8. （８）成分層のゲル化剤が ［１］被検液と共に外部より添加される場合、［２］透
   明容器の内面側に保持されている場合［３］挿入体の外
   面側に保持されている場合［４］一方が透明容器の内面
   側に保持され、他方が外部より添加される場合 ［５］一方が挿入体の外面側に保持され、他方が外部よ
   り添加される場合、および ［６］一方が透明容器の内面側に保持され、他方が挿入
   体の外面側に保持されている場合 の群より選ばれた形態で存在せしめられることを特徴と
   する請求項１または２記載の微生物の培養検出方法。
9. （９）成分層の栄養分が ［１］被検液と共に外部より添加される場合［２］透明
   容器の内面側に保持されている場合、および ［３］挿入体の外面側に保持されている場合の群より選
   ばれた形態で存在せしめられることを特徴とする請求項
   １、２または８記載の微生物の培養検出方法。
10. （１０）ゲル化剤および／または栄養分が透明容器およ
    び／または挿入体に保持される場合には、乾燥状態で保
    持されることを特徴とする請求項８または９記載の微生
    物の培養検出方法。