JPH02154699A - Ｄｎａ配列決定 - Google Patents
Ｄｎａ配列決定Info
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- JPH02154699A JPH02154699A JP1175763A JP17576389A JPH02154699A JP H02154699 A JPH02154699 A JP H02154699A JP 1175763 A JP1175763 A JP 1175763A JP 17576389 A JP17576389 A JP 17576389A JP H02154699 A JPH02154699 A JP H02154699A
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- Japan
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- dna
- series
- polymerase
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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- Y10S436/808—Automated or kit
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- Y10T436/14—Heterocyclic carbon compound [i.e., O, S, N, Se, Te, as only ring hetero atom]
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- Y10T436/143333—Saccharide [e.g., DNA, etc.]
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- Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はＤＮＡ配列決定、特には自動化ＤＮＡ配列決定
法に関する。
法に関する。
良米皇韮藷
ＤＮＡ配列決定はサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）等の方法（
Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ
７ ４巻＋ ５４６３頁、１９７７年）によって行
われるのが普通であり、一本鎖ＤＮＡテンプレート及び
プライマーから一本鎖のＤＮＡを酵素合成することを含
む．第１図を参照すれば、４つの別々の合成を行う．一
本鎖テンプレートを、テンプレートにハイブリダイズす
るプライマーと共に準備する．ＤＮＡポリメラーゼを用
いてプライマーを伸長し、各々の反応を、適当な鎖停止
剤、例えばジデオキシヌクレオチドを加入して特異の塩
基（グアニン、Ｇ、アデニン、Ａ、チミン、Ｔ或はシト
シン、Ｃ）において停止する．この配列決定法に現在用
いられている酵素は下記を含む： Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ Ｃｏｌｉ Ｄ Ｎ Ａポリメラーゼエの大断片
（「クレノー」断片）、逆転写酵素、Ｔａｑポリメラー
ゼ、バクテリオファージＴ７ＤＮＡポリメラーゼの修飾
形。
Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ
７ ４巻＋ ５４６３頁、１９７７年）によって行
われるのが普通であり、一本鎖ＤＮＡテンプレート及び
プライマーから一本鎖のＤＮＡを酵素合成することを含
む．第１図を参照すれば、４つの別々の合成を行う．一
本鎖テンプレートを、テンプレートにハイブリダイズす
るプライマーと共に準備する．ＤＮＡポリメラーゼを用
いてプライマーを伸長し、各々の反応を、適当な鎖停止
剤、例えばジデオキシヌクレオチドを加入して特異の塩
基（グアニン、Ｇ、アデニン、Ａ、チミン、Ｔ或はシト
シン、Ｃ）において停止する．この配列決定法に現在用
いられている酵素は下記を含む： Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ Ｃｏｌｉ Ｄ Ｎ Ａポリメラーゼエの大断片
（「クレノー」断片）、逆転写酵素、Ｔａｑポリメラー
ゼ、バクテリオファージＴ７ＤＮＡポリメラーゼの修飾
形。
なお第１図を参照すれば、４つのＤＮＡ合成反応が４つ
のシリーズのＤＮＡ生成物を生成するに至り、各々は１
つの規定の末端及び１つの可変末端を有する。規定の末
端はプライマー分子で始まる。可変末端は合成反応が停
止するヌクレオチド塩基（Ｇ，Ａ，Ｔ或はＣのいずれか
）についての特異の鎖停止剤で終る．４つの異なるシリ
ーズの生成物は各々高分解能ポリアクリルアミドゲルの
４つの別々のレーンにおいて分離されて４つのシリーズ
のバンドを形成し、ゲル上の各々のバンドはＤＮＡ配列
における特異のヌクレオチドに順次一致する．こうして
、バンドの相対的位置は各々の所定のヌクレオチド塩基
のＤＮＡ配列における位置を識別する．生成するバンド
の検出を容易にするために、ＤＮＡ生成物を標識するの
が普通である。第１図に示す通りに、特定のレーンにお
ける分子量が同じＤＮＡ生成物の全ての数或は濃度に直
接関係し、この数は、生成物がほぼ同じ分子量の場合で
さえ及び同じ鎖停止剤を含有する場合でさえ、生成物か
ら生成物へと変わるので、バンドの強度は単一レーン内
で不均一であるのが普通である。
のシリーズのＤＮＡ生成物を生成するに至り、各々は１
つの規定の末端及び１つの可変末端を有する。規定の末
端はプライマー分子で始まる。可変末端は合成反応が停
止するヌクレオチド塩基（Ｇ，Ａ，Ｔ或はＣのいずれか
）についての特異の鎖停止剤で終る．４つの異なるシリ
ーズの生成物は各々高分解能ポリアクリルアミドゲルの
４つの別々のレーンにおいて分離されて４つのシリーズ
のバンドを形成し、ゲル上の各々のバンドはＤＮＡ配列
における特異のヌクレオチドに順次一致する．こうして
、バンドの相対的位置は各々の所定のヌクレオチド塩基
のＤＮＡ配列における位置を識別する．生成するバンド
の検出を容易にするために、ＤＮＡ生成物を標識するの
が普通である。第１図に示す通りに、特定のレーンにお
ける分子量が同じＤＮＡ生成物の全ての数或は濃度に直
接関係し、この数は、生成物がほぼ同じ分子量の場合で
さえ及び同じ鎖停止剤を含有する場合でさえ、生成物か
ら生成物へと変わるので、バンドの強度は単一レーン内
で不均一であるのが普通である。
上記の方法論を用いて、自動化ＤＮＡ配列分析システム
が開発された。ＥＣ＆Ｇ製の１つのインストルーメント
は３２ｐ標識及びＤＮＡポリメラーゼを用い、生成した
ＤＮＡ生成物をゲル電気泳動によって分離する。トネグ
ッゾ（Ｔｏｎｅｇｕｚｚｏ）等、バイオテクニクス６巻
、４６０頁、１９８８年。
が開発された。ＥＣ＆Ｇ製の１つのインストルーメント
は３２ｐ標識及びＤＮＡポリメラーゼを用い、生成した
ＤＮＡ生成物をゲル電気泳動によって分離する。トネグ
ッゾ（Ｔｏｎｅｇｕｚｚｏ）等、バイオテクニクス６巻
、４６０頁、１９８８年。
ゲルの底部にある１ｚｐ−検出器は、標識がゲルの底部
を通り過ぎるにつれて放射能をスキャンする。第１図に
示す通りに、各々のテンプレートについて配列決定する
のに４つの合成反応を必要とし、並びに各々のゲルに関
して４つのレーンを必要とし、各々の特異の鎖停止剤に
よって停止する生成物について別々のレーンを用いる。
を通り過ぎるにつれて放射能をスキャンする。第１図に
示す通りに、各々のテンプレートについて配列決定する
のに４つの合成反応を必要とし、並びに各々のゲルに関
して４つのレーンを必要とし、各々の特異の鎖停止剤に
よって停止する生成物について別々のレーンを用いる。
カンバラ等、バイオテクノロジー、６巻、８１６頁、１
９８８年は上述した３２ｐ−標識したプライマーを傾向
標識したプライマーに代えた。生成した傾向標識した生
成物をゲルの底部でレーザーによって励起し、蛍光をＣ
ＲＴモニターで検出する。この手順もまた各々のテンプ
レートが配列決定するのに４つの合成反応及びゲルに関
して４つのレーンを必要とする。
９８８年は上述した３２ｐ−標識したプライマーを傾向
標識したプライマーに代えた。生成した傾向標識した生
成物をゲルの底部でレーザーによって励起し、蛍光をＣ
ＲＴモニターで検出する。この手順もまた各々のテンプ
レートが配列決定するのに４つの合成反応及びゲルに関
して４つのレーンを必要とする。
アブライドバイオシステムズは、４つの異なるプライマ
ーを用い、各々を異なる蛍光マーカーで標識するインス
トルーメントを製作している。スミス等、Ｎｕｃ、Ａｃ
１ｄ、Ｒｅｓ、 １３巻、２３９９頁、１９８５年；
及びネーチャー ３２１巻、６７４頁、１９８６年。各
々のプライマーを４つのジデオキシヌクレオチドの内の
１つを含有する別々の反応において用いる。４つの反応
を行った後に、それらを−緒にしてゲルに関し単一レー
ンに流す。ゲルの中を透過或は電気泳動させた後に、ゲ
ルの底部におけるレーザーを用いて蛍光生成物を検出す
る。このシステムは各々のテンプレートについて４つの
別々のアニーリング反応及び４つの別々の合成反応を要
するが、ゲルに関して単一レーンのみを要する。４つ全
てのバンドを単一レーンにおいて有することによって、
配列のコンピューター分析を一層容易にさせる。
ーを用い、各々を異なる蛍光マーカーで標識するインス
トルーメントを製作している。スミス等、Ｎｕｃ、Ａｃ
１ｄ、Ｒｅｓ、 １３巻、２３９９頁、１９８５年；
及びネーチャー ３２１巻、６７４頁、１９８６年。各
々のプライマーを４つのジデオキシヌクレオチドの内の
１つを含有する別々の反応において用いる。４つの反応
を行った後に、それらを−緒にしてゲルに関し単一レー
ンに流す。ゲルの中を透過或は電気泳動させた後に、ゲ
ルの底部におけるレーザーを用いて蛍光生成物を検出す
る。このシステムは各々のテンプレートについて４つの
別々のアニーリング反応及び４つの別々の合成反応を要
するが、ゲルに関して単一レーンのみを要する。４つ全
てのバンドを単一レーンにおいて有することによって、
配列のコンピューター分析を一層容易にさせる。
デュポンは、異なる蛍光マーカーを４つのジデオキシヌ
クレオシドトリホスフェートの各々に結合させるインス
トルーメントを提供する。プローバー（Ｐｒｏｂｅｒ）
等、サイエンス、２３８巻、３３６頁、１９８７年。単
一アニーリング反応、単一ポリメラーゼ反応（４つの標
識したジデオキシヌクレオシドトリホスフェートの各々
を含有する）及び配列決定ゲルにおいて単一レーンを要
する。
クレオシドトリホスフェートの各々に結合させるインス
トルーメントを提供する。プローバー（Ｐｒｏｂｅｒ）
等、サイエンス、２３８巻、３３６頁、１９８７年。単
一アニーリング反応、単一ポリメラーゼ反応（４つの標
識したジデオキシヌクレオシドトリホスフェートの各々
を含有する）及び配列決定ゲルにおいて単一レーンを要
する。
ＤＮＡ生成物における４つの異なる蛍光マーカーを、ゲ
ルに通して電気泳動するにつれて別々に検出する。
ルに通して電気泳動するにつれて別々に検出する。
エングラート（Ｅｎｇｌｅｒｔ）等の米国特許４．７０
７゜２３７号（１９８７年）は、検出手段を有するマル
チチャンネル電気泳動装置を実質的にゲルの幅全体を横
切って配置することを記載し、サンプルを位置させたチ
ャンネル或はレーンを識別している。該装置は、標識し
たＤＮＡ生成物が４つの別々のレーンにおける検出器手
段を通過するにつれて検出することができる。放射性同
位元素標識を用いるのが好ましい。
７゜２３７号（１９８７年）は、検出手段を有するマル
チチャンネル電気泳動装置を実質的にゲルの幅全体を横
切って配置することを記載し、サンプルを位置させたチ
ャンネル或はレーンを識別している。該装置は、標識し
たＤＮＡ生成物が４つの別々のレーンにおける検出器手
段を通過するにつれて検出することができる。放射性同
位元素標識を用いるのが好ましい。
ＤＮＡ配列分析に現在用いられている手順に固有なのは
、放射能か或は蛍光標識したいずれかのＤＮＡ生成物を
ポリアクリルアミド或はその他のゲル電気泳動のような
ゲル透過手順によって分離し、次いでゲルを通る透過或
は移動の軸に沿って互いに対するそれらの位置を検出す
る必要性である。この手順の正確性は、一部ゲル中をほ
ぼ同じ距離透過したバンドにおけるシグナルの均一性に
よって決まる。近接するバンド間のシグナルの強度の差
或は変化はいくつかの問題を生じる。第１に、それらは
方法の感度を低下させ、最も弱いシグナルを含有するバ
ンドを検出する能力により制限される。第２に、弱いシ
グナルを有するバンドが鎖停止剤を加入することによる
真のシグナルであるか、或はポリメラーゼが解離したＤ
ＮＡにおける休止部位によるアーチファクトであるかど
うかを決める際に困難を生じる。第３に、１つのバンド
の強いシグナルはその隣りの弱いシグナルを隠し得るの
で、それらは間隔の密接したバンド間のＤＮＡ配列を決
定する際に正確度を低下させる。
、放射能か或は蛍光標識したいずれかのＤＮＡ生成物を
ポリアクリルアミド或はその他のゲル電気泳動のような
ゲル透過手順によって分離し、次いでゲルを通る透過或
は移動の軸に沿って互いに対するそれらの位置を検出す
る必要性である。この手順の正確性は、一部ゲル中をほ
ぼ同じ距離透過したバンドにおけるシグナルの均一性に
よって決まる。近接するバンド間のシグナルの強度の差
或は変化はいくつかの問題を生じる。第１に、それらは
方法の感度を低下させ、最も弱いシグナルを含有するバ
ンドを検出する能力により制限される。第２に、弱いシ
グナルを有するバンドが鎖停止剤を加入することによる
真のシグナルであるか、或はポリメラーゼが解離したＤ
ＮＡにおける休止部位によるアーチファクトであるかど
うかを決める際に困難を生じる。第３に、１つのバンド
の強いシグナルはその隣りの弱いシグナルを隠し得るの
で、それらは間隔の密接したバンド間のＤＮＡ配列を決
定する際に正確度を低下させる。
光Ｊヱ」生成
本発明は前述した問題を全て解決するものであり、配列
決定反応において、分子量が同様のＤＮＡ生成物をほぼ
同じ量で生成し、こうして、配列決定ゲル、同じレーン
における近接するバンドはほぼ同じ強度になる。
決定反応において、分子量が同様のＤＮＡ生成物をほぼ
同じ量で生成し、こうして、配列決定ゲル、同じレーン
における近接するバンドはほぼ同じ強度になる。
はぼ同じ強度の近接バンドにし得ることは、任意の配列
決定反応の結果を一層容易にかつ一層確実に読み取るの
を可能にするので、有用である。
決定反応の結果を一層容易にかつ一層確実に読み取るの
を可能にするので、有用である。
更に、特異の鎖停止剤との配列決定反応からのＤＮＡ生
成物は、近接するバンドとほぼ同じ強度のバンドを形成
するので、バンド強度それ自体がそのようにして形成し
たシリーズのバンドについて特異の標識になる。所定の
鎖停止剤が生成するほぼ同じ分子量のＤＮＡ生成物の数
は鎖停止剤の濃度に応じて変わる。こうして、合成につ
いて４つの鎖停止剤の各々を異なる濃度で用いることに
よって、１つの鎖停止剤を加入したＤＮＡ生成物は他の
鎖停止剤を加入したほぼ同じ分子量のＤＮＡ生成物と、
数或は量が異なる点で区別される。
成物は、近接するバンドとほぼ同じ強度のバンドを形成
するので、バンド強度それ自体がそのようにして形成し
たシリーズのバンドについて特異の標識になる。所定の
鎖停止剤が生成するほぼ同じ分子量のＤＮＡ生成物の数
は鎖停止剤の濃度に応じて変わる。こうして、合成につ
いて４つの鎖停止剤の各々を異なる濃度で用いることに
よって、１つの鎖停止剤を加入したＤＮＡ生成物は他の
鎖停止剤を加入したほぼ同じ分子量のＤＮＡ生成物と、
数或は量が異なる点で区別される。
よって、ＤＮＡ生成物のバンドを鎖停止剤に関して近接
するバンドの強度に比べて強度により識別することがで
きる。その結果、２或はそれ以上のシリーズのＤＮＡ生
成物であって、各々のシリーズは異なる鎖停止剤を有す
るものを単一レーンでゲルパーミェーションにかけ、各
々のバンドの強度を近接するバンドの強度と比べること
によって識別、すなわち、互いに区別することができる
。
するバンドの強度に比べて強度により識別することがで
きる。その結果、２或はそれ以上のシリーズのＤＮＡ生
成物であって、各々のシリーズは異なる鎖停止剤を有す
るものを単一レーンでゲルパーミェーションにかけ、各
々のバンドの強度を近接するバンドの強度と比べること
によって識別、すなわち、互いに区別することができる
。
その止具なる鎖停止剤を加入したＤＮＡ生成物の合成は
別の容器で別々に行う必要がなく、全てを単一の反応容
器で同時に行ってよく、所望の場合には、各々の鎖停止
剤について標識を変える代りに全ての鎖停止剤について
同じ標識、例えば放射性同位元素、蛍光標識、等を用い
ることができる。しかし、ＤＮＡ生成物はゲル中を透過
するにつれて、全てのバンドの強度は漸減し、移動した
距離が最も短いものが示す強度は移動した距離が最も長
いものより小さいことに注意すべきである。それにもか
かわらず、透過軸に沿った任意の位置における各々のバ
ンドを近接するバンドに比べた相対強度は全体を通じて
ほぼ同じままである。透過の範囲の全体にわたってこの
ように相対強度が維持されることが本発明を可能にする
。
別の容器で別々に行う必要がなく、全てを単一の反応容
器で同時に行ってよく、所望の場合には、各々の鎖停止
剤について標識を変える代りに全ての鎖停止剤について
同じ標識、例えば放射性同位元素、蛍光標識、等を用い
ることができる。しかし、ＤＮＡ生成物はゲル中を透過
するにつれて、全てのバンドの強度は漸減し、移動した
距離が最も短いものが示す強度は移動した距離が最も長
いものより小さいことに注意すべきである。それにもか
かわらず、透過軸に沿った任意の位置における各々のバ
ンドを近接するバンドに比べた相対強度は全体を通じて
ほぼ同じままである。透過の範囲の全体にわたってこの
ように相対強度が維持されることが本発明を可能にする
。
「近接するバンド」とは、透過軸に沿って測定して、当
該バンドの前か或は後のいずれが約２０−３０ｍｍの範
囲内の同じレーン内のものを意味する。近接するバンド
は当該バンドと２０塩基以下で異なる（すなわち質量が
約６．０００ダルトン以下で異なる）ＤＮＡ生成物を含
むのが普通である。
該バンドの前か或は後のいずれが約２０−３０ｍｍの範
囲内の同じレーン内のものを意味する。近接するバンド
は当該バンドと２０塩基以下で異なる（すなわち質量が
約６．０００ダルトン以下で異なる）ＤＮＡ生成物を含
むのが普通である。
通常、発明はＤＮＡポリメラーゼをＤＮＡ配列決定反応
において用いることを特徴とし、ＤＮＡポリメラーゼは
、配列決定反応において、分子量かわずかに異なるＤＮ
Ａ生成物をほぼ等しい量で産生させる。こうして、この
ようなりＮＡ生成物をゲルマトリックスで分離する場合
、近接するバンドがほぼ同じ強度であるバンドを形成す
る。本発明者等は、特有の理論に何ら束縛されるもので
はないが、この強度の均一性が正常のヌクレオシドトリ
ホスフェートと鎖停止剤、例えばジデオキシヌクレオシ
ドトリホスフェートとを区別しないポリメラーゼによる
ものと考える。
において用いることを特徴とし、ＤＮＡポリメラーゼは
、配列決定反応において、分子量かわずかに異なるＤＮ
Ａ生成物をほぼ等しい量で産生させる。こうして、この
ようなりＮＡ生成物をゲルマトリックスで分離する場合
、近接するバンドがほぼ同じ強度であるバンドを形成す
る。本発明者等は、特有の理論に何ら束縛されるもので
はないが、この強度の均一性が正常のヌクレオシドトリ
ホスフェートと鎖停止剤、例えばジデオキシヌクレオシ
ドトリホスフェートとを区別しないポリメラーゼによる
ものと考える。
発明は第１の態様では、ＤＮＡの鎖を準備し；鎖を鎖に
ハイブリダイズすることができるプライマーと共にアニ
ールしてアニールド混合物とし；アニールド混合物をデ
オキシリボヌクレオシドトリホスフェート、ＤＮＡポリ
メラーゼ及び第１鎖停止剤と共に、ポリメラーゼがプラ
イマーを伸長させて伸長したプライマーの長さの異なる
第１シリーズの第１ＤＮＡ生成物を形成し、各々の第１
ＤＮＡ生成物はその伸長端に鎖停止剤を有し、各々の第
１ＤＮＡ生成物の数は長さが１〜２０塩基異なる実質的
に全てのＤＮＡ生成物についてほぼ同じになるような条
件下でインキュベートする工程を含むＤＮＡ鎖を配列決
定する方法を特徴とする。好ましくは、方法は更に、第
１ＤＮＡ生成物をゲルパーミェーションにより分子量に
従って分離して２第１シリーズのバントを形成し、各々
の第１シリーズバンドは所定の分子量の第１ＤＮＡ生成
物を表わし、各々の近接する第１シリーズバンドの強度
は実質的に全ての第１シリーズバンドについてほぼ同じ
であり：及び各々の該第１シリーズバンドの位置を決定
する工程を含む。
ハイブリダイズすることができるプライマーと共にアニ
ールしてアニールド混合物とし；アニールド混合物をデ
オキシリボヌクレオシドトリホスフェート、ＤＮＡポリ
メラーゼ及び第１鎖停止剤と共に、ポリメラーゼがプラ
イマーを伸長させて伸長したプライマーの長さの異なる
第１シリーズの第１ＤＮＡ生成物を形成し、各々の第１
ＤＮＡ生成物はその伸長端に鎖停止剤を有し、各々の第
１ＤＮＡ生成物の数は長さが１〜２０塩基異なる実質的
に全てのＤＮＡ生成物についてほぼ同じになるような条
件下でインキュベートする工程を含むＤＮＡ鎖を配列決
定する方法を特徴とする。好ましくは、方法は更に、第
１ＤＮＡ生成物をゲルパーミェーションにより分子量に
従って分離して２第１シリーズのバントを形成し、各々
の第１シリーズバンドは所定の分子量の第１ＤＮＡ生成
物を表わし、各々の近接する第１シリーズバンドの強度
は実質的に全ての第１シリーズバンドについてほぼ同じ
であり：及び各々の該第１シリーズバンドの位置を決定
する工程を含む。
「実質的に全て」とは、１０の近接するバンドの中から
少なくとも９（或は２０の中から１９）がほぼ同じ強度
を有することを意味する。すなわち、異なる強度を有す
るのはほんの時折にすぎない。この異なる強度はアーチ
ファクトから生じる。このようなアーチファクトの１例
は１つのバンド内での分子量の異なる２或はそれ以上の
生成物のコンプレッションである。そのような２つのコ
ンプレッションの結果を第２図に示し、アーチファクト
のバンドに星印をつける。はぼ同じとは、バンド強度が
高々２倍、最も好ましくは高々１．２倍だけ変わること
を意味する。ゲル透過とは、ＤＮＡ配列決定用に用いる
既存のポリアクリルアミドゲル及び分子量に従ってＤＮ
Ａ生成物を分離するその他の任意の機構を含む。
少なくとも９（或は２０の中から１９）がほぼ同じ強度
を有することを意味する。すなわち、異なる強度を有す
るのはほんの時折にすぎない。この異なる強度はアーチ
ファクトから生じる。このようなアーチファクトの１例
は１つのバンド内での分子量の異なる２或はそれ以上の
生成物のコンプレッションである。そのような２つのコ
ンプレッションの結果を第２図に示し、アーチファクト
のバンドに星印をつける。はぼ同じとは、バンド強度が
高々２倍、最も好ましくは高々１．２倍だけ変わること
を意味する。ゲル透過とは、ＤＮＡ配列決定用に用いる
既存のポリアクリルアミドゲル及び分子量に従ってＤＮ
Ａ生成物を分離するその他の任意の機構を含む。
一実施態様では、はぼ同じ強度の近接するバンドの生成
を、ＤＮＡポリメラーゼをマンガン或は鉄イオンを含有
する溶液中でインキュベートして達成する。
を、ＤＮＡポリメラーゼをマンガン或は鉄イオンを含有
する溶液中でインキュベートして達成する。
一つの好ましい実施態様では、方法は更にアニールド混
合物中に第２鎖停止剤を第１鎖停止剤と異なる濃度で供
給する工程を含み、ＤＮＡポリメラーゼは第２シリーズ
の第２ＤＮＡ生成物の産生を引き起こし、各々の第２Ｄ
ＮＡ生成物はその伸長端に第２鎖停止剤を有し、各々の
第２ＤＮＡ生成物の数は長さが１〜２０塩基異なる実質
的に全てのＤＮＡ生成物についてほぼ同じであり、長さ
が１〜２０塩基異なる実質的に全ての第１及び全ての第
２ＤＮＡ生成物の数は明瞭に異なる。最も好ましくは、
分子量に従うゲルパーミェーションによって分離した際
に、第２シリーズの第２ＤＮＡ生成物は第２シリーズの
バンドを形成し、実質的に全ての近接する第２シリーズ
バンドの強度はほぼ同じであり、第１シリーズの実質的
に全てのバンドの強度は第２シリーズの各々の近接バン
ドの強度と明瞭にかつ区別し得る程に異なり、方法は更
に各々のバンドの位置及び強度を決定する工程を含み、
強度は特定のバンドシリーズを表わす。
合物中に第２鎖停止剤を第１鎖停止剤と異なる濃度で供
給する工程を含み、ＤＮＡポリメラーゼは第２シリーズ
の第２ＤＮＡ生成物の産生を引き起こし、各々の第２Ｄ
ＮＡ生成物はその伸長端に第２鎖停止剤を有し、各々の
第２ＤＮＡ生成物の数は長さが１〜２０塩基異なる実質
的に全てのＤＮＡ生成物についてほぼ同じであり、長さ
が１〜２０塩基異なる実質的に全ての第１及び全ての第
２ＤＮＡ生成物の数は明瞭に異なる。最も好ましくは、
分子量に従うゲルパーミェーションによって分離した際
に、第２シリーズの第２ＤＮＡ生成物は第２シリーズの
バンドを形成し、実質的に全ての近接する第２シリーズ
バンドの強度はほぼ同じであり、第１シリーズの実質的
に全てのバンドの強度は第２シリーズの各々の近接バン
ドの強度と明瞭にかつ区別し得る程に異なり、方法は更
に各々のバンドの位置及び強度を決定する工程を含み、
強度は特定のバンドシリーズを表わす。
明瞭に異なるとは、１シリーズのバンドが他のシリーズ
における近接するバンド（すなわち、長さが１〜２０塩
基異なるバンド゛）と区別し得ることを意味する。すな
わち、特定の分子量のＤＮＡ生成物の数を測定する装置
は２つのシリーズのＤＮＡ生成物を互いに区別すること
ができる。
における近接するバンド（すなわち、長さが１〜２０塩
基異なるバンド゛）と区別し得ることを意味する。すな
わち、特定の分子量のＤＮＡ生成物の数を測定する装置
は２つのシリーズのＤＮＡ生成物を互いに区別すること
ができる。
別の好ましい実施態様では、方法は２つの他の鎖停止剤
を準備することを含み、ポリメラーゼは第２及び第３シ
リーズの第２及び第３ＤＮＡ生成物の産生を引き起こし
、各々の第２及び第３ＤＮＡ生成物の数は長さが１〜２
ｏ塩基異なる実質的に全てのＤＮＡ生成物についてほぼ
同じであり、長さが１〜２０塩基異なる実質的に全ての
第１、全ての第２及び全ての第３ＤＮＡ生成物の数は明
らかに異なる。最も好ましくは、分子量に従ってゲルパ
ーミェーションによって分離する場合、各々の第２及び
第３シリーズの第２及び第３ＤＮＡ生成物は異なるシリ
ーズの第２及び第３バンドを形成し、実質的に全ての近
接する第２シリーズバンドの強度は実質的に同じであり
、実質的に全ての近接する第３シリーズバンドの強度は
実質的に同じであり、異なるシリーズの実質的に全ての
近接バンドの強度は明瞭に異なり、方法は更に各々のバ
ンドの位置及び強度を決定する工程を含み、強度は特定
のバンドシリーズを表わす。
を準備することを含み、ポリメラーゼは第２及び第３シ
リーズの第２及び第３ＤＮＡ生成物の産生を引き起こし
、各々の第２及び第３ＤＮＡ生成物の数は長さが１〜２
ｏ塩基異なる実質的に全てのＤＮＡ生成物についてほぼ
同じであり、長さが１〜２０塩基異なる実質的に全ての
第１、全ての第２及び全ての第３ＤＮＡ生成物の数は明
らかに異なる。最も好ましくは、分子量に従ってゲルパ
ーミェーションによって分離する場合、各々の第２及び
第３シリーズの第２及び第３ＤＮＡ生成物は異なるシリ
ーズの第２及び第３バンドを形成し、実質的に全ての近
接する第２シリーズバンドの強度は実質的に同じであり
、実質的に全ての近接する第３シリーズバンドの強度は
実質的に同じであり、異なるシリーズの実質的に全ての
近接バンドの強度は明瞭に異なり、方法は更に各々のバ
ンドの位置及び強度を決定する工程を含み、強度は特定
のバンドシリーズを表わす。
なお別の好ましい実施態様では、方法はアニルド混合物
中に４つの異なるデオキシリボヌクレオシドトリホスフ
ェート及び４つの異なる鎖停止剤をもたらすことを含み
、ＤＮＡポリメラーゼは第２、第３及び第４シリーズの
第２、第３及び第４ＤＮＡ生成物の産生な引き起こし、
各々の第２、第３及び第４ＤＮＡ生成物の数は長さが１
〜２０塩基異なる実質的に全てのＤＮＡ生成物について
ほぼ同じであり、長さが１〜２０塩基異なる実質的に全
ての第１、全ての第２、全ての第３及び全ての第４ＤＮ
Ａ生成物の数は明らかに異なる。最も好ましくは、分子
量に従ってゲルパーミェーションによって分離する場合
、各々の第２、第３及び第４シリーズの第２、第３及び
第４シリーズはシリーズの第２、第３及び第４バンドを
生成し、実質的に全ての近接する第２シリーズバンドの
強度、或は実質的に全ての近接する第３シリーズバンド
、或は実質的に全ての近接する第４シリーズバンドの強
度はほぼ同じであり、異なるシリーズにおける実質的に
全ての近接するバンドの強度は明瞭に異なり、最も好ま
しくは、方法は更に各々のバンドの位置及び強度を決定
する工程を含み、強度は特定のバンドシリーズを表わす
。
中に４つの異なるデオキシリボヌクレオシドトリホスフ
ェート及び４つの異なる鎖停止剤をもたらすことを含み
、ＤＮＡポリメラーゼは第２、第３及び第４シリーズの
第２、第３及び第４ＤＮＡ生成物の産生な引き起こし、
各々の第２、第３及び第４ＤＮＡ生成物の数は長さが１
〜２０塩基異なる実質的に全てのＤＮＡ生成物について
ほぼ同じであり、長さが１〜２０塩基異なる実質的に全
ての第１、全ての第２、全ての第３及び全ての第４ＤＮ
Ａ生成物の数は明らかに異なる。最も好ましくは、分子
量に従ってゲルパーミェーションによって分離する場合
、各々の第２、第３及び第４シリーズの第２、第３及び
第４シリーズはシリーズの第２、第３及び第４バンドを
生成し、実質的に全ての近接する第２シリーズバンドの
強度、或は実質的に全ての近接する第３シリーズバンド
、或は実質的に全ての近接する第４シリーズバンドの強
度はほぼ同じであり、異なるシリーズにおける実質的に
全ての近接するバンドの強度は明瞭に異なり、最も好ま
しくは、方法は更に各々のバンドの位置及び強度を決定
する工程を含み、強度は特定のバンドシリーズを表わす
。
他の好ましい実施態様では、アニールド混合物にマンガ
ン或は鉄イオンを供給し、イオンはポリメラーゼを鎖停
止剤について非識別性にさせ、ＤＮＡ生成物を４より少
ないレーンのゲルにおいて分子量に従って分離し、各々
のハントの強度をゲル読取り装置によって測定し、ＤＮ
ＡポリメラーゼをＴ７−タイプＤＮＡポリメラーゼ、Ｅ
、ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼＩの大断片及びＴａｑポ
リメラーゼから選び、鎖停止剤はジデオキシヌクレオシ
トトリホスフェートである。
ン或は鉄イオンを供給し、イオンはポリメラーゼを鎖停
止剤について非識別性にさせ、ＤＮＡ生成物を４より少
ないレーンのゲルにおいて分子量に従って分離し、各々
のハントの強度をゲル読取り装置によって測定し、ＤＮ
ＡポリメラーゼをＴ７−タイプＤＮＡポリメラーゼ、Ｅ
、ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼＩの大断片及びＴａｑポ
リメラーゼから選び、鎖停止剤はジデオキシヌクレオシ
トトリホスフェートである。
関連のある態様では、発明は（ａ）ＤＮＡポリメラーゼ
を供給し、ポリメラーゼ及びＤ Ｎ Ａ ’Ａをマンガ
ン或は鉄のイオン及び鎖停止剤を含む溶液中でインキュ
ベートするか或は（ｂ）鎖停止剤について実質的に非区
別性のＤＮＡポリメラーゼを準備するかのいずれかの工
程を含む、ＤＮＡ鎖を配列決定する方法を特徴とする。
を供給し、ポリメラーゼ及びＤ Ｎ Ａ ’Ａをマンガ
ン或は鉄のイオン及び鎖停止剤を含む溶液中でインキュ
ベートするか或は（ｂ）鎖停止剤について実質的に非区
別性のＤＮＡポリメラーゼを準備するかのいずれかの工
程を含む、ＤＮＡ鎖を配列決定する方法を特徴とする。
別の関連する態様では、発明はＤＮＡポリメラーゼを、
マンガン或は鉄イオンを含む溶液に混入する工程を含む
、ＤＮＡ配列決定用ＤＮＡポリメラーゼを生成する方法
を特徴とする。
マンガン或は鉄イオンを含む溶液に混入する工程を含む
、ＤＮＡ配列決定用ＤＮＡポリメラーゼを生成する方法
を特徴とする。
別の態様では、発明はＴ７−タイプＤＮＡポリメラーゼ
、或はＴａｑポリメラーゼ及びマンガン或は鉄イオンを
含む溶液を特徴とする。イオンは０．００５〜１００ミ
リモルの濃度であるのが好ましい。
、或はＴａｑポリメラーゼ及びマンガン或は鉄イオンを
含む溶液を特徴とする。イオンは０．００５〜１００ミ
リモルの濃度であるのが好ましい。
別の態様では、発明はＤＮＡポリメラーゼ、鎖停止剤及
びマンガン或は鉄イオンを有する、ＤＮＡを配列決定す
るキットを特徴とする。
びマンガン或は鉄イオンを有する、ＤＮＡを配列決定す
るキットを特徴とする。
好ましい実施態様では、ポリメラーゼはＴ７−タイプＤ
ＮＡポリメラーゼ、Ｅ、ｃｏｌｉ Ｄ Ｎ Ａポリメ
ラーゼＩの大断片或はＴａｑポリメラーゼであり、鎖停
止剤はジデオキシヌクレオチドであり、キットは更にデ
オキシリボヌクレオシドトリホスフェートを含む。
ＮＡポリメラーゼ、Ｅ、ｃｏｌｉ Ｄ Ｎ Ａポリメ
ラーゼＩの大断片或はＴａｑポリメラーゼであり、鎖停
止剤はジデオキシヌクレオチドであり、キットは更にデ
オキシリボヌクレオシドトリホスフェートを含む。
別の態様では、発明は鎖停止剤について実質的に非区別
性であり、分子量が異なりかつ同じ鎖停止剤によって停
止するシリーズのＤＮＡ生成物の産生を引き起こすポリ
メラーゼを供給することを含む、ＤＮＡの自動化配列決
定方法を特徴とし、ＤＮＡ生成物はほぼ同じ強度の実質
的に全ての近接するバンドを生じる。
性であり、分子量が異なりかつ同じ鎖停止剤によって停
止するシリーズのＤＮＡ生成物の産生を引き起こすポリ
メラーゼを供給することを含む、ＤＮＡの自動化配列決
定方法を特徴とし、ＤＮＡ生成物はほぼ同じ強度の実質
的に全ての近接するバンドを生じる。
実質的に非区別性とは、鎖停止剤をＤＮＡ配列にかかわ
らずにＤＮＡの長さに沿って均一に加入することを意味
する。実質的に同じとは、強度が高々２〜３倍だけ異な
ることを意味する。
らずにＤＮＡの長さに沿って均一に加入することを意味
する。実質的に同じとは、強度が高々２〜３倍だけ異な
ることを意味する。
別の態様では、発明は下記を有する自動化配列決定装置
を特徴とする：単一プライマー及びＤＮＡ鎖から形成さ
れる少なくとも２つのシリーズのＤＮＡ生成物をもたら
す反応装置、シリーズの各々のＤＮＡ生成物は分子量が
異なりかつ一端に鎖停止剤を有し、ＤＮＡ生成物を分離
してシリーズのバンドを形成する分離手段、シリーズに
おける実質的に全ての近接するバンドの強度はほぼ同じ
であり、異なるシリーズにおける実質的に全ての近接す
るバンドの強度は異なる：分離後の各々のバンドの位置
及び強度を決定するバンド読取り手段；及びＤＮＡ鎖の
ＤＮＡ配列をバンドの位置及び強度から直接決定する計
算手段。
を特徴とする：単一プライマー及びＤＮＡ鎖から形成さ
れる少なくとも２つのシリーズのＤＮＡ生成物をもたら
す反応装置、シリーズの各々のＤＮＡ生成物は分子量が
異なりかつ一端に鎖停止剤を有し、ＤＮＡ生成物を分離
してシリーズのバンドを形成する分離手段、シリーズに
おける実質的に全ての近接するバンドの強度はほぼ同じ
であり、異なるシリーズにおける実質的に全ての近接す
るバンドの強度は異なる：分離後の各々のバンドの位置
及び強度を決定するバンド読取り手段；及びＤＮＡ鎖の
ＤＮＡ配列をバンドの位置及び強度から直接決定する計
算手段。
好ましい実施態様では、反応装置にマンガン或は鉄イオ
ン及びＴ７−タイプＤＮＡポリメラーゼを入れる。
ン及びＴ７−タイプＤＮＡポリメラーゼを入れる。
別の態様では、発明はピロホスファターゼ、ＤＮＡポリ
メラーゼ及び鎖停止剤或はｄＩＴＰを含む溶液或はキッ
ト、及びピロホスファターゼを配列決定反応に供給する
ことを含むＤＮＡ配列決定方法を特徴とする。ピロホス
ファターゼを配列決定反応に入れるとピロホスフェート
のレベルを減少させ、近接するバンドのバンド強度の均
一性を改良する。
メラーゼ及び鎖停止剤或はｄＩＴＰを含む溶液或はキッ
ト、及びピロホスファターゼを配列決定反応に供給する
ことを含むＤＮＡ配列決定方法を特徴とする。ピロホス
ファターゼを配列決定反応に入れるとピロホスフェート
のレベルを減少させ、近接するバンドのバンド強度の均
一性を改良する。
上記の態様のいずれにおいても、マンガン或は鉄イオン
を、シトレート或はイソシトレートのようなキレートの
存在において供給するのがよい。
を、シトレート或はイソシトレートのようなキレートの
存在において供給するのがよい。
かかるキレートはＤＮＡ配列決定反応において所望のイ
オンを一層管理したレベルで供給するものと考えられる
。
オンを一層管理したレベルで供給するものと考えられる
。
最終の態様では、発明はＴ７ＤＮＡポリメラーゼ△Ｌｙ
ｓｌ １８−Ａｒｇ１４５及びこのポリメラーゼをエン
コードするＤＮＡを特徴とする。どのポリメラーゼは検
出可能なエキソヌクレアーゼ活性を持たない。
ｓｌ １８−Ａｒｇ１４５及びこのポリメラーゼをエン
コードするＤＮＡを特徴とする。どのポリメラーゼは検
出可能なエキソヌクレアーゼ活性を持たない。
本発明者等はＤＮＡポリメラーゼを改質してＤＮＡテン
プレートの存在において鎖停止剤をプライマーＤＮＡの
伸長末端に加入するそれらの能力を変更し得る条件を見
出した。この能力はＤＮＡ配列決定を−ＮｉｆＡ度の低
い鎖停止剤によって行うことを可能にし、これよりＤＮ
Ａ配列決定反応の費用を大幅に減少させる。更に、本発
明者等はこの能力を有するＤＮＡポリメラーゼが配列決
定ゲルにおいてほぼ均一の強度の近接バンドを生じるこ
とを見出した。すなわち、ポリメラーゼは加入鎖停止剤
と正常なデオキシヌクレオシドトリホスフェートとをも
はや大きい程度に区別しない。
プレートの存在において鎖停止剤をプライマーＤＮＡの
伸長末端に加入するそれらの能力を変更し得る条件を見
出した。この能力はＤＮＡ配列決定を−ＮｉｆＡ度の低
い鎖停止剤によって行うことを可能にし、これよりＤＮ
Ａ配列決定反応の費用を大幅に減少させる。更に、本発
明者等はこの能力を有するＤＮＡポリメラーゼが配列決
定ゲルにおいてほぼ均一の強度の近接バンドを生じるこ
とを見出した。すなわち、ポリメラーゼは加入鎖停止剤
と正常なデオキシヌクレオシドトリホスフェートとをも
はや大きい程度に区別しない。
本発明者等は改質したＴ７ＤＮＡポリメラーゼ、Ｅ、
ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼ■の大断片及びＴａｑポ
リメラーゼを含む少なくとも３つのポリメラーゼをこの
ようにして改質し得ることを示した。これらのポリメラ
ーゼと相同性を有する他のポリメラーゼもまた発明にお
いて働くものと考えられる。
ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼ■の大断片及びＴａｑポ
リメラーゼを含む少なくとも３つのポリメラーゼをこの
ようにして改質し得ることを示した。これらのポリメラ
ーゼと相同性を有する他のポリメラーゼもまた発明にお
いて働くものと考えられる。
本発明の別の利点は、バンド強度が任意の鎖停止剤の濃
度に直接関係しかつ各々の原剤について同じであるので
、配列決定反応において用いる任意の所定の鎖停止剤の
濃度が容易に計算されることである。
度に直接関係しかつ各々の原剤について同じであるので
、配列決定反応において用いる任意の所定の鎖停止剤の
濃度が容易に計算されることである。
４つの鎖停止剤をすべて４つの異なる濃度で含有する単
一配列決定反応のみが必要であるので、本発明の改質ポ
リメラーゼは特にＤＮＡ配列決定反応において有用であ
る。すなわち、任意の特定のＤＮＡテンプレートについ
て使用することができる異なる配列決定反応を４より少
なくすることができる。
一配列決定反応のみが必要であるので、本発明の改質ポ
リメラーゼは特にＤＮＡ配列決定反応において有用であ
る。すなわち、任意の特定のＤＮＡテンプレートについ
て使用することができる異なる配列決定反応を４より少
なくすることができる。
発明のその他の特徴及び利点は下記の発明の好ましい実
施態様の説明及び特許請求の範囲の記載から明らかにな
るものと思う。
施態様の説明及び特許請求の範囲の記載から明らかにな
るものと思う。
ましい の１日
本発明において有用なポリメラーゼはＴ７−タイプＤＮ
Ａポリメラーゼ（例えばＴ７、Ｔ３、φ■、φＩＩ、Ｈ
，Ｗ３１、ｇｈ−１、Ｙ、Ａｌ１２２、或は５Ｐ６）、
Ｅ 、ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼ■の大断片及びＴ
ａｑポリメラーゼを含む相同ポリメラーゼのクラスに属
するものを含む。相同ポリメラーゼとは、マグネシウム
の存在においてデオキシヌクレオシドトリホスフェート
に比べてジデオキシヌクレオシドトリホスフェートを区
別するが、マグネシウムをマンガンに代えた場合、ジデ
オキシヌクレオシドトリホスフェートの区別が減小され
る酵素を意味する。これらのポリメラーゼをＤＮＡ配列
決定反応において、配列決定反応のＤＮＡ生成物をゲル
に流す場合に、ポリメラーゼがほぼ均一な強度（強度が
約１．５〜２．０倍変化する）の近接したバンドを生じ
る条件下で用いる。近接したとは、分子量が６０００、
すなわち２０塩基程多く異なるＤＮＡ生成物を表わすバ
ンドを含む意味である。この強度の実際の値は下記に記
載しかつ図に示す通りにゲルの長さに沿って減少する。
Ａポリメラーゼ（例えばＴ７、Ｔ３、φ■、φＩＩ、Ｈ
，Ｗ３１、ｇｈ−１、Ｙ、Ａｌ１２２、或は５Ｐ６）、
Ｅ 、ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼ■の大断片及びＴ
ａｑポリメラーゼを含む相同ポリメラーゼのクラスに属
するものを含む。相同ポリメラーゼとは、マグネシウム
の存在においてデオキシヌクレオシドトリホスフェート
に比べてジデオキシヌクレオシドトリホスフェートを区
別するが、マグネシウムをマンガンに代えた場合、ジデ
オキシヌクレオシドトリホスフェートの区別が減小され
る酵素を意味する。これらのポリメラーゼをＤＮＡ配列
決定反応において、配列決定反応のＤＮＡ生成物をゲル
に流す場合に、ポリメラーゼがほぼ均一な強度（強度が
約１．５〜２．０倍変化する）の近接したバンドを生じ
る条件下で用いる。近接したとは、分子量が６０００、
すなわち２０塩基程多く異なるＤＮＡ生成物を表わすバ
ンドを含む意味である。この強度の実際の値は下記に記
載しかつ図に示す通りにゲルの長さに沿って減少する。
バンド強度は所定のバンド内のＤＮＡ生成物の数を反映
する。蛍光団或は同位元素等の標識を用いてかかるＤＮ
Ａ生成物の数を反映する強度の検出容易なバンドを生じ
る。すなわち、本発明では、１つの鎖停止剤との１つの
配列決定反応に由来する近接バンドはほぼ同じ数のＤＮ
Ａ生成物、これより均一なバンド強度を有する。配列決
定条件は特定の二価或は三価のカチオン、例えばマンガ
ン（■及び■）第一鉄、第二鉄イオンの存在においてポ
リメラーゼをインキュベートすることを含み、検出可能
な作用を有しない、或はＤＮＡ合成に有害な一価及び二
価カチオンは下記を含む： に、Ｎａ、Ｂａ、Ｂｅ、Ｃａ、Ｃｅ、Ｃｒ、Ｃｏ、Ｃｕ
、Ｎｉ、Ｓｉ及びＺｎ。
する。蛍光団或は同位元素等の標識を用いてかかるＤＮ
Ａ生成物の数を反映する強度の検出容易なバンドを生じ
る。すなわち、本発明では、１つの鎖停止剤との１つの
配列決定反応に由来する近接バンドはほぼ同じ数のＤＮ
Ａ生成物、これより均一なバンド強度を有する。配列決
定条件は特定の二価或は三価のカチオン、例えばマンガ
ン（■及び■）第一鉄、第二鉄イオンの存在においてポ
リメラーゼをインキュベートすることを含み、検出可能
な作用を有しない、或はＤＮＡ合成に有害な一価及び二
価カチオンは下記を含む： に、Ｎａ、Ｂａ、Ｂｅ、Ｃａ、Ｃｅ、Ｃｒ、Ｃｏ、Ｃｕ
、Ｎｉ、Ｓｉ及びＺｎ。
アニオンは重要でなく、例えばクロリド、アセテート及
びスルフェートが適している。これらの条件下で、ジデ
オキシヌクレオシド等の鎖停止剤の要求量をＥ、ｃｏｌ
ｉ Ｄ Ｎ Ａポリメラーゼエの大断片及びＴａｑポリ
メラーゼのような酵素についてほとんど１０００倍、改
質Ｔ７ポリメラーゼについて約１０倍減少させる。有効
な二価金属イオンの濃度の調整を助けるために、キレー
ト化剤もまたこの溶液に供給するのがよい。例えば、シ
トレート或はイソシトレートを供給するのがよい。これ
らのキレートは広範囲のマンガン濃度にわたって、例え
ば遊離マンガンイオンのレベルを濃度１０〜１００μＭ
に保つものと考えられる。すなわち、キレート化剤は緩
衝剤として働く。
びスルフェートが適している。これらの条件下で、ジデ
オキシヌクレオシド等の鎖停止剤の要求量をＥ、ｃｏｌ
ｉ Ｄ Ｎ Ａポリメラーゼエの大断片及びＴａｑポリ
メラーゼのような酵素についてほとんど１０００倍、改
質Ｔ７ポリメラーゼについて約１０倍減少させる。有効
な二価金属イオンの濃度の調整を助けるために、キレー
ト化剤もまたこの溶液に供給するのがよい。例えば、シ
トレート或はイソシトレートを供給するのがよい。これ
らのキレートは広範囲のマンガン濃度にわたって、例え
ば遊離マンガンイオンのレベルを濃度１０〜１００μＭ
に保つものと考えられる。すなわち、キレート化剤は緩
衝剤として働く。
本発明のＤＮＡポリメラーゼはＤＮＡテンプレートの長
さに沿ってジデオキシヌクレオシド類似体とデオキシヌ
クレオシドとを有意に区別しない。すなわち、これらの
ポリメラーゼは、マンガン或は鉄の存在において、３′
ヒドロキシル基を有するヌクレオチドと３′ ヒドロキ
シル基を持たない（すなわち、リボースの３′位に２つ
の水素を有する）ヌクレオチドとを区別することができ
ない、しかし、これらのポリメラーゼは、マンガン或は
鉄の存在においてさえ、ヌクレオシドの他の位置の修飾
を区別する１例えば、蛍光基を結合させたいくつかのジ
デオキシヌクレオシド類似体をデオキシヌクレオシドと
比べて区別する。しかし、ポリメラーゼはジデオキシヌ
クレオシドに修飾が存在する或は存在しないに基づいて
、隣接する或は近接するヌクレオチドを異なる程度に区
別しない。こうして、ポリメラーゼはこれらの類似体を
強く区別し、未修飾のジデオキシヌクレオシドに比べて
ＤＮＡ配列決定反応について一層高い濃度を要するが、
近接するバンドの強度は依然均一になる０例えば、Ｍｎ
の存在において、ジデオキシＧＴＰ （ｄｄＧＴＰ）に
比べてジデオキシＩＴＰ （ｄｄｌＴＰ）をｌＯ倍区別
する。しかし、配列決定反応において生成する全てのバ
ンドは、ＤＮＡテンプレートの長さに沿って区別の差が
ないので、ｄｄＩＴＰと強度が等しい。
さに沿ってジデオキシヌクレオシド類似体とデオキシヌ
クレオシドとを有意に区別しない。すなわち、これらの
ポリメラーゼは、マンガン或は鉄の存在において、３′
ヒドロキシル基を有するヌクレオチドと３′ ヒドロキ
シル基を持たない（すなわち、リボースの３′位に２つ
の水素を有する）ヌクレオチドとを区別することができ
ない、しかし、これらのポリメラーゼは、マンガン或は
鉄の存在においてさえ、ヌクレオシドの他の位置の修飾
を区別する１例えば、蛍光基を結合させたいくつかのジ
デオキシヌクレオシド類似体をデオキシヌクレオシドと
比べて区別する。しかし、ポリメラーゼはジデオキシヌ
クレオシドに修飾が存在する或は存在しないに基づいて
、隣接する或は近接するヌクレオチドを異なる程度に区
別しない。こうして、ポリメラーゼはこれらの類似体を
強く区別し、未修飾のジデオキシヌクレオシドに比べて
ＤＮＡ配列決定反応について一層高い濃度を要するが、
近接するバンドの強度は依然均一になる０例えば、Ｍｎ
の存在において、ジデオキシＧＴＰ （ｄｄＧＴＰ）に
比べてジデオキシＩＴＰ （ｄｄｌＴＰ）をｌＯ倍区別
する。しかし、配列決定反応において生成する全てのバ
ンドは、ＤＮＡテンプレートの長さに沿って区別の差が
ないので、ｄｄＩＴＰと強度が等しい。
こうして、本発明のポリメラーゼは、たとえ加入全体を
区別するとしても、鎖停止剤の加入を均一な効率でもた
らす。
区別するとしても、鎖停止剤の加入を均一な効率でもた
らす。
本発明において有用な鎖停止剤は２’ 、３’ジデオキ
シ構造を有するジデオキシヌクレオシドを含む０発明に
おいて有用なその他の剤はＤＮＡ配列決定反応を特異の
塩基において特異に停止することができるものであり、
かつ上記の条件下でポリメラーゼによって区別を与えら
れない。
シ構造を有するジデオキシヌクレオシドを含む０発明に
おいて有用なその他の剤はＤＮＡ配列決定反応を特異の
塩基において特異に停止することができるものであり、
かつ上記の条件下でポリメラーゼによって区別を与えら
れない。
任意の特定のＤＮＡポリメラーゼが、任意の特定の鎖停
止剤或は配列決定反応混合物の他の成分と組合わさって
本発明において有用であるかどうかを求めるために、標
準の配列決定反応を下記に記載しかつ図面に示す通りに
して行い、配列決定ゲルにおけるバンド形成の程度及び
近接バンドの均一性を調べる。ポリメラーゼ反応は、プ
ライマーを少なくとも２０塩基伸長しないならば、使用
する条件下で適していない、２倍又はそれ以下の範囲内
の隣接バンドの均一性が本発明において有用であり、均
一性は１．０〜１．５倍の範囲内であるのが好ましい、
同様に、最適なカチオン濃度、或は発明において有用な
その他の可能なカチオンの定旦は本配列決定反応を種々
の条件下で用いることによって求める。例えばカチオン
を０．００５〜１００ｍＭの範囲で試験する。このよう
な実験の例は下記の通、っである： ５′末端を３２ｐで標識しかつアニールして一本鎖のｍ
ＧＰｌ−２ＤＮＡにした５ ’ −ＧＴＡＡＡＡＣＧＡ
ＣＧＧＣＣ，ＡＧＴ−３’配列の１７マープライマーに
ューイングランドバイオラボズカタログ番号１２１１）
を用いてＤＮＡ合成を測定する。ティパー（Ｔａｂｏｒ
）等、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｔ、ＵＳＡ
８４：４７６７（１９８７）及びティパー等、Ｊ、Ｂｉ
ｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６２：１６２１２（１９８７）、そ
の他の任意のテンプレートが本発明において同等に有用
である。このプライマー−テンプレートを、ＤＮＡポリ
メラーゼを金属イオンの濃度範囲の存在において含有す
る反応に用いる。
止剤或は配列決定反応混合物の他の成分と組合わさって
本発明において有用であるかどうかを求めるために、標
準の配列決定反応を下記に記載しかつ図面に示す通りに
して行い、配列決定ゲルにおけるバンド形成の程度及び
近接バンドの均一性を調べる。ポリメラーゼ反応は、プ
ライマーを少なくとも２０塩基伸長しないならば、使用
する条件下で適していない、２倍又はそれ以下の範囲内
の隣接バンドの均一性が本発明において有用であり、均
一性は１．０〜１．５倍の範囲内であるのが好ましい、
同様に、最適なカチオン濃度、或は発明において有用な
その他の可能なカチオンの定旦は本配列決定反応を種々
の条件下で用いることによって求める。例えばカチオン
を０．００５〜１００ｍＭの範囲で試験する。このよう
な実験の例は下記の通、っである： ５′末端を３２ｐで標識しかつアニールして一本鎖のｍ
ＧＰｌ−２ＤＮＡにした５ ’ −ＧＴＡＡＡＡＣＧＡ
ＣＧＧＣＣ，ＡＧＴ−３’配列の１７マープライマーに
ューイングランドバイオラボズカタログ番号１２１１）
を用いてＤＮＡ合成を測定する。ティパー（Ｔａｂｏｒ
）等、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｔ、ＵＳＡ
８４：４７６７（１９８７）及びティパー等、Ｊ、Ｂｉ
ｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６２：１６２１２（１９８７）、そ
の他の任意のテンプレートが本発明において同等に有用
である。このプライマー−テンプレートを、ＤＮＡポリ
メラーゼを金属イオンの濃度範囲の存在において含有す
る反応に用いる。
反応を、所定濃度の全４つのデオキシヌクレオチド（ｄ
ＮＴＰＳ、２０−２００μＭ）の存在において及び１つ
のジデオキシヌクレオチドの濃度範囲（ｄｄＮＴＰ、本
例では、ｄｄＧＴＰ１０〜５００μＭ）にわたって行う
。次いで、ＤＮＡ生成物をポリアクリルアミドゲル電気
泳動によって分析し、ＤＮＡ合成をゲルにおける種々の
分子量の増量を表わすプライマー生成バンドの伸長とし
て分析する。
ＮＴＰＳ、２０−２００μＭ）の存在において及び１つ
のジデオキシヌクレオチドの濃度範囲（ｄｄＮＴＰ、本
例では、ｄｄＧＴＰ１０〜５００μＭ）にわたって行う
。次いで、ＤＮＡ生成物をポリアクリルアミドゲル電気
泳動によって分析し、ＤＮＡ合成をゲルにおける種々の
分子量の増量を表わすプライマー生成バンドの伸長とし
て分析する。
特定の例では、各々の反応混合物（１ｏｔｉＩ２）は３
２ｐ−プライマー−テンプレートＯ，ｌμｇ、４０ ｍ
Ｍ トリス−ＨＣｆ２ （Ｉ） Ｈ７，５） 、
５ ｍ Ｍジチオトレイトール（ＤＴＴ）５ ｕＭ 〜
２０ｍＭ金属イオン、１０〜５００μＭ４ｄＮＴＰ、１
〜５００μＭｄｄＮＴＰ及び２単位のＤＮＡポリメラー
ゼを含有した。インキュベーションは３７℃において１
５分間であった。９０％ホルムアミド１０μρ、５０ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ及びブロモフェノールブルー０．１％を
加えて反応を停止した。
２ｐ−プライマー−テンプレートＯ，ｌμｇ、４０ ｍ
Ｍ トリス−ＨＣｆ２ （Ｉ） Ｈ７，５） 、
５ ｍ Ｍジチオトレイトール（ＤＴＴ）５ ｕＭ 〜
２０ｍＭ金属イオン、１０〜５００μＭ４ｄＮＴＰ、１
〜５００μＭｄｄＮＴＰ及び２単位のＤＮＡポリメラー
ゼを含有した。インキュベーションは３７℃において１
５分間であった。９０％ホルムアミド１０μρ、５０ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ及びブロモフェノールブルー０．１％を
加えて反応を停止した。
生成したサンプルを７５℃で２分間加熱した直後に、７
Ｍ尿素、１００ｍＭトリス−ボレート、ｐ Ｈ８，９中
のポリアクリルアミドゲル（アクリルアミド８％、ビス
アクリルアミド０．３％）に添加した。電気泳動は２０
００ボルトにおいて２時間であった。ゲルをメタノール
５０％、酢酸１０％中で３０分間固定し、乾燥し、オー
トラジオグラフィーに暴露した。生成したフィルムの各
々のレーンにおけるバンド強度を、各々のレーンをデン
シトメーターで走査して求めた。使用したデンシトメー
ターは二重光束自記インストルーメント、モデルＭＫＩ
ＩＩＣ（ジイス、ロウグル アンドカンパニー、リミテ
ッド、ゲイツシェッドーオン−タイプ、ＩＩ、イングラ
ンド）であった、ゲルを走査する任意の適当なデンシト
メーターインストルーメントもまた作動する。別法とし
て、ＤＮＡ生成物をゲル内で電気泳動するにつれて走査
することによって、生成するバンドの均一性を求めるこ
とができる。
Ｍ尿素、１００ｍＭトリス−ボレート、ｐ Ｈ８，９中
のポリアクリルアミドゲル（アクリルアミド８％、ビス
アクリルアミド０．３％）に添加した。電気泳動は２０
００ボルトにおいて２時間であった。ゲルをメタノール
５０％、酢酸１０％中で３０分間固定し、乾燥し、オー
トラジオグラフィーに暴露した。生成したフィルムの各
々のレーンにおけるバンド強度を、各々のレーンをデン
シトメーターで走査して求めた。使用したデンシトメー
ターは二重光束自記インストルーメント、モデルＭＫＩ
ＩＩＣ（ジイス、ロウグル アンドカンパニー、リミテ
ッド、ゲイツシェッドーオン−タイプ、ＩＩ、イングラ
ンド）であった、ゲルを走査する任意の適当なデンシト
メーターインストルーメントもまた作動する。別法とし
て、ＤＮＡ生成物をゲル内で電気泳動するにつれて走査
することによって、生成するバンドの均一性を求めるこ
とができる。
いずれか１つの酵素について所定のｄｄＮＴＰを対応す
るｄＮＴＰに比べて加入する能力を、固定範囲で停止す
るＤＮＡ合成を可能にするのに必要なｄｄＮＴＰｄｄＮ
ＴＰの比として測定し、固定分子量以下の生成バンドと
して検出する。すなわち、バンドが反応の終りに配列決
定ゲル中で特定の範囲内で生じた。こうして、１つの酵
素が別の酵素に比べて所定のｄｄＮＴＰを１０００倍大
きく区別するならば、同じゲル範囲で対応する部位で停
止するバンドを得るのにｄｄＮＴＰｄｄＮＴＰの１００
０倍大きい比が必要になる。
るｄＮＴＰに比べて加入する能力を、固定範囲で停止す
るＤＮＡ合成を可能にするのに必要なｄｄＮＴＰｄｄＮ
ＴＰの比として測定し、固定分子量以下の生成バンドと
して検出する。すなわち、バンドが反応の終りに配列決
定ゲル中で特定の範囲内で生じた。こうして、１つの酵
素が別の酵素に比べて所定のｄｄＮＴＰを１０００倍大
きく区別するならば、同じゲル範囲で対応する部位で停
止するバンドを得るのにｄｄＮＴＰｄｄＮＴＰの１００
０倍大きい比が必要になる。
ヱ２」Ｌ乙ユＭｒつ−
以下は、修飾Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ或はＥ、ｃｏｌｉ
Ｄ Ｎ Ａポリメラーゼ■の大断片をＤＮＡ配列決
定反応において用い、Ｍｎを配列決定緩衝剤中に存在さ
せた一連の例である。これらの例は本発明を制限するも
のでなく、単に当業者に本発明のＤＮＡポリメラーゼを
用いるガイドラインを与えるために挙げるにすぎない、
上述した通りに、当業者ならば配列決定反応における鎖
停止剤の加入及び使用の均一性に関して本書に記載する
性質をもたらす本発明のポリメラーゼを生成することが
できる他の条件を容易に決めることができる。
Ｄ Ｎ Ａポリメラーゼ■の大断片をＤＮＡ配列決
定反応において用い、Ｍｎを配列決定緩衝剤中に存在さ
せた一連の例である。これらの例は本発明を制限するも
のでなく、単に当業者に本発明のＤＮＡポリメラーゼを
用いるガイドラインを与えるために挙げるにすぎない、
上述した通りに、当業者ならば配列決定反応における鎖
停止剤の加入及び使用の均一性に関して本書に記載する
性質をもたらす本発明のポリメラーゼを生成することが
できる他の条件を容易に決めることができる。
下記の例で用いる特定の修ｆｉｆｊＴ７ＤＮＡポリメラ
ーゼを遺伝的に改質して検出し得るエキソヌクレアーゼ
を持たないようにした。この遺伝的に改質したＤＮＡポ
リメラーゼは、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼにおいてＬｙｓ
ｌ１８からＡｒｇ１４５までのアミノ酸領域が検出され
るので、△Ｌｙｓ１１８−Ａｒｇ１４５ （△２８）と
称する。このポリメラーゼをエンコードする遺伝子をテ
ィパー等の米国特許４，７９５，６９９号に記載される
プラスミドｐＧＰ５−５の変異型としてプラスミドｐＧ
Ｐ５−８中に構築した。
ーゼを遺伝的に改質して検出し得るエキソヌクレアーゼ
を持たないようにした。この遺伝的に改質したＤＮＡポ
リメラーゼは、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼにおいてＬｙｓ
ｌ１８からＡｒｇ１４５までのアミノ酸領域が検出され
るので、△Ｌｙｓ１１８−Ａｒｇ１４５ （△２８）と
称する。このポリメラーゼをエンコードする遺伝子をテ
ィパー等の米国特許４，７９５，６９９号に記載される
プラスミドｐＧＰ５−５の変異型としてプラスミドｐＧ
Ｐ５−８中に構築した。
第１０図を参照すれば、ｐＧＰ５−８はＢａｍＨＩ及び
ＨｉｎｃＩＩ部位で切り取ったｐＡＣＹＣ１７７、φ１
．ＩＡ及びφ１．ＩＢを含有する塩基５６６７から６１
６６までの７７ＤＮＡ、及び第１０図に示す修飾を有す
る遺伝子５を含有するＴ７ＤＮＡ塩基１４，３０６〜１
６．８６９を含む。
ＨｉｎｃＩＩ部位で切り取ったｐＡＣＹＣ１７７、φ１
．ＩＡ及びφ１．ＩＢを含有する塩基５６６７から６１
６６までの７７ＤＮＡ、及び第１０図に示す修飾を有す
る遺伝子５を含有するＴ７ＤＮＡ塩基１４，３０６〜１
６．８６９を含む。
ｐＧＰ５−８は、初めに３４７−５’ ＣＣＧＧＣＡＡ
ＧＴＴＧＣＣＣＧＧＧＡＴＧＣＴＣＧＡＧＧＡＧＣＡＧ
ＧＧ３ ’ を合成して構築した。このオリゴヌクレオ
チドを、Ｔ７遺伝子５をエンコードするインサートを含
有し及び上記のティパー等に記載されているＭｌ ３ｍ
ＧＰ ５−２の一本鎖のＤＮＡに関するＤＮＡ合成用プ
ライマーとして用いた。ＤＮＡ合成及び突然変異選択を
上記のティパー等に記載する通りにして行った。所望の
突然変異なｍＧＰ５−２に構築した後に、１４．３０６
〜１５，６１０位からＴ７ＤＮＡを含有するＥ ｃ ｏ
ＲＩ −辻且旦Ｉ断片（８４ｂｐ欠失を含む領域を含
む）を分離し、それを結合してｐＧＰ５−５の匹敵し得
る領域にすることによって、８４ｂｐ欠失を含有するＴ
７遺伝子５の適当な領域をｐＧＰ５−５に挿入した。誘
導体ｐＧＰ５−８は、突然変異誘発によって作られるＳ
ｍａ工及びＸｈｏ Ｉ部位の存在により及び８４ｂｐ欠
失を含有する領域のＤＮＡ配列分析により欠失を含有す
ることが確認された。ｐＧＰ５−８をに３８／ｐＴｒｘ
−３株に形質転換してに３８／ｐ Ｔ ｒ ｘ −３／
ｐ Ｇ Ｐ ５−８株を生じた。上記ティパー等に相
似のＫ ３８ ／ ｐ Ｔ ｒ ｘ −３／ ｐ Ｇ
Ｐ５−５株について記載されているのと同じ手順を用い
て、Ｋ ３８ ／ ｐ Ｔ ｒ ｘ −３／ ｐ Ｇ
Ｐ ５−８の誘導及び遺伝的に改変したＴ７ＤＮＡポリ
メラーゼの精製を行った。このポリメラーゼは検出し得
るエキソヌクレアーゼ活性を持たないので、それをＤＮ
Ａ配列決定反応において用いる前にティパー等が記載す
る通りの化学修飾は必要でない。下記の例で用いる遺伝
的に改質したＴ７ＤＮＡポリメラーゼは活性１０００単
位／ｍρを有する製剤であった。
ＧＴＴＧＣＣＣＧＧＧＡＴＧＣＴＣＧＡＧＧＡＧＣＡＧ
ＧＧ３ ’ を合成して構築した。このオリゴヌクレオ
チドを、Ｔ７遺伝子５をエンコードするインサートを含
有し及び上記のティパー等に記載されているＭｌ ３ｍ
ＧＰ ５−２の一本鎖のＤＮＡに関するＤＮＡ合成用プ
ライマーとして用いた。ＤＮＡ合成及び突然変異選択を
上記のティパー等に記載する通りにして行った。所望の
突然変異なｍＧＰ５−２に構築した後に、１４．３０６
〜１５，６１０位からＴ７ＤＮＡを含有するＥ ｃ ｏ
ＲＩ −辻且旦Ｉ断片（８４ｂｐ欠失を含む領域を含
む）を分離し、それを結合してｐＧＰ５−５の匹敵し得
る領域にすることによって、８４ｂｐ欠失を含有するＴ
７遺伝子５の適当な領域をｐＧＰ５−５に挿入した。誘
導体ｐＧＰ５−８は、突然変異誘発によって作られるＳ
ｍａ工及びＸｈｏ Ｉ部位の存在により及び８４ｂｐ欠
失を含有する領域のＤＮＡ配列分析により欠失を含有す
ることが確認された。ｐＧＰ５−８をに３８／ｐＴｒｘ
−３株に形質転換してに３８／ｐ Ｔ ｒ ｘ −３／
ｐ Ｇ Ｐ ５−８株を生じた。上記ティパー等に相
似のＫ ３８ ／ ｐ Ｔ ｒ ｘ −３／ ｐ Ｇ
Ｐ５−５株について記載されているのと同じ手順を用い
て、Ｋ ３８ ／ ｐ Ｔ ｒ ｘ −３／ ｐ Ｇ
Ｐ ５−８の誘導及び遺伝的に改変したＴ７ＤＮＡポリ
メラーゼの精製を行った。このポリメラーゼは検出し得
るエキソヌクレアーゼ活性を持たないので、それをＤＮ
Ａ配列決定反応において用いる前にティパー等が記載す
る通りの化学修飾は必要でない。下記の例で用いる遺伝
的に改質したＴ７ＤＮＡポリメラーゼは活性１０００単
位／ｍρを有する製剤であった。
ＬＬ：マンガン いるＤＮＡ
標準のＤＮＡ配列決定反応方法論を用いてＭｎの存在に
おいてＤＮＡを配列決定する。Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ
についての全般の配列決定工程は上記のティパー等に詳
細に記載されている。簡潔にすると、工程及び条件は下
記の通りである：Ａ、アニーリング反応 アニーリング反応では、下記の溶液を調製した： １０ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐ）１７．５．０．１ｍＭ
ＥＤＴＡ、２ｕ ｇ／ １ｕ Ａ中の配列決定す
るＤＮＡ （例えば、ｍＧＰｌ−２ＤＮＡ） ｔμ
４２５Ｘ ＳｅｑＢｕｆ（２００ｍＭ）リス−ＨＣｌ
ｐＨ７，５，５ｍＭ ＭｎＣ１ｚ・２５０ｍＭ
ＮａＣ１） ２プライマーにュ
ーイングランドバイオラボズー１７マー、Ｃａｔ ＃
Ｉ２１００．５μｍ／ｕ Ｉ２）
ｔｌＯ
μ ℃ この溶液を６５℃で２分加熱し、ゆっくり冷却して室温
にした。
おいてＤＮＡを配列決定する。Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ
についての全般の配列決定工程は上記のティパー等に詳
細に記載されている。簡潔にすると、工程及び条件は下
記の通りである：Ａ、アニーリング反応 アニーリング反応では、下記の溶液を調製した： １０ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐ）１７．５．０．１ｍＭ
ＥＤＴＡ、２ｕ ｇ／ １ｕ Ａ中の配列決定す
るＤＮＡ （例えば、ｍＧＰｌ−２ＤＮＡ） ｔμ
４２５Ｘ ＳｅｑＢｕｆ（２００ｍＭ）リス−ＨＣｌ
ｐＨ７，５，５ｍＭ ＭｎＣ１ｚ・２５０ｍＭ
ＮａＣ１） ２プライマーにュ
ーイングランドバイオラボズー１７マー、Ｃａｔ ＃
Ｉ２１００．５μｍ／ｕ Ｉ２）
ｔｌＯ
μ ℃ この溶液を６５℃で２分加熱し、ゆっくり冷却して室温
にした。
Ｂ、桿ｌしえ応
標識反応では、下記の溶液を調製したニアニーリング反
応混合物 １０μ℃ジチオトレイトール０．
１ Ｍ １［”Ｓ］ ｄＡＴＰ、ニュー
イング ランドニュークリアＮＥＧ−０３４Ｈ１ｄＴＴＰ％ ｄ
ＣＴＰ、ｄＧＴＰ 各々１．５μＭ２ 遺伝的に改質したＴ７Ｄ、ＮＡポリメラーゼ、１単位／
μ℃ （上述した通りの△Ｌｙｓｌ１８− Ａｒｇ１４５） ２１６μβ これを室温で５分間インキュベートした。
応混合物 １０μ℃ジチオトレイトール０．
１ Ｍ １［”Ｓ］ ｄＡＴＰ、ニュー
イング ランドニュークリアＮＥＧ−０３４Ｈ１ｄＴＴＰ％ ｄ
ＣＴＰ、ｄＧＴＰ 各々１．５μＭ２ 遺伝的に改質したＴ７Ｄ、ＮＡポリメラーゼ、１単位／
μ℃ （上述した通りの△Ｌｙｓｌ１８− Ａｒｇ１４５） ２１６μβ これを室温で５分間インキュベートした。
Ｃ−１級ヌ公
終結反応では、４つの反応混合物を下記の通りにして調
製した； Ｇ ＡＴ Ｃ ５Ｘ ５ｅｑＢｕｆ Ｏ，６０，６０，６０，６μ
ｆ２４ｄＮＴＰ（３ｍＭ） ０．３ ０．３ ０．
３ ０．３μｍ２Ｈ２０１，９１，９１，９１，９μ
β ｄｄＡＴＰＯ，２ｍＭ ０．２ μ
ｍ２ｄｄＴＴＰＯ，２ｍＭ
０．２ μ４２ｄｄｅＴＰ０．２ｍＭ
０．２ｎ１
３ ３ ３ ３ μ℃終結混合物を
３７℃において２分間インキュベートし、次いで完了し
た標識反応の３μ℃アリコートを各々の終結混合物に加
えた。生成した溶液を３７℃で５分間インキュベートし
た。
製した； Ｇ ＡＴ Ｃ ５Ｘ ５ｅｑＢｕｆ Ｏ，６０，６０，６０，６μ
ｆ２４ｄＮＴＰ（３ｍＭ） ０．３ ０．３ ０．
３ ０．３μｍ２Ｈ２０１，９１，９１，９１，９μ
β ｄｄＡＴＰＯ，２ｍＭ ０．２ μ
ｍ２ｄｄＴＴＰＯ，２ｍＭ
０．２ μ４２ｄｄｅＴＰ０．２ｍＭ
０．２ｎ１
３ ３ ３ ３ μ℃終結混合物を
３７℃において２分間インキュベートし、次いで完了し
た標識反応の３μ℃アリコートを各々の終結混合物に加
えた。生成した溶液を３７℃で５分間インキュベートし
た。
終結反応を９０％ホルムアミド５μ℃、２０ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ、０．２％ブロモフェノール−プルキシレン−シ
アノール、ｐ Ｈ８，０で停止した。生成したサンプル
を７５℃で２分間加熱し、７Ｍ尿素、１００ｍＭ）−リ
スボレートｐ Ｈ８，９中のポリアクリルアミドゲル（
アクリルアミド８％、ビスアクリルアミド０．３％）に
添加し、２ｏ○０ボルトで２時間電気泳動じた。ゲルを
メタノール５０％、酢酸１０％中で３０分間固定し、乾
燥し、オートラジオグラフィーによってフィルムを暴露
するのに用いた。
ＤＴＡ、０．２％ブロモフェノール−プルキシレン−シ
アノール、ｐ Ｈ８，０で停止した。生成したサンプル
を７５℃で２分間加熱し、７Ｍ尿素、１００ｍＭ）−リ
スボレートｐ Ｈ８，９中のポリアクリルアミドゲル（
アクリルアミド８％、ビスアクリルアミド０．３％）に
添加し、２ｏ○０ボルトで２時間電気泳動じた。ゲルを
メタノール５０％、酢酸１０％中で３０分間固定し、乾
燥し、オートラジオグラフィーによってフィルムを暴露
するのに用いた。
暴露したゲルを現像し、各々のレーンにおける放射性バ
ンドの強度を、各々のレーンをデンシトメーター（ジョ
イス、ロウグルアンドカンパニリミテッド、モデル番号
ＭｋＩＩＩＣ）で走査して求めた。
ンドの強度を、各々のレーンをデンシトメーター（ジョ
イス、ロウグルアンドカンパニリミテッド、モデル番号
ＭｋＩＩＩＣ）で走査して求めた。
同じサンプルを、マンガンに代えてマグネシウムの存在
において実施する場合、下記のトリブレットにおける下
線を施した塩基は、これらのトリブレットが現れる場合
はいつでも隣接する塩基より２〜５倍強い二ＴＣ工、Ａ
Ａ旦、ＧＣΔ、ＣＣＴ。しかし、頂度挙げた例で、頂度
示した全てのトリブレットにおけるあらゆる塩基に対応
するバンドは同じ強度を有し、高々２０％互いに異なる
。
において実施する場合、下記のトリブレットにおける下
線を施した塩基は、これらのトリブレットが現れる場合
はいつでも隣接する塩基より２〜５倍強い二ＴＣ工、Ａ
Ａ旦、ＧＣΔ、ＣＣＴ。しかし、頂度挙げた例で、頂度
示した全てのトリブレットにおけるあらゆる塩基に対応
するバンドは同じ強度を有し、高々２０％互いに異なる
。
本例では、たった１つの容器を用いて配列決定反応を行
い、ＤＮＡテンプレートにおける２つのタイプの塩基（
すなわち、Ｃ及びＧ）の配列を決定した。工程は下記の
通りであったニ アニーリング反応では、下記の溶液を調製した： ５Ｘ ５ｅｑＢｕｆ
４プライマー（ＡＢＩ ｆａｍ プラ
イマー、０．４ｐｍ／μ ｌ） ２Ｈａ０
５．
４２０ μ４ この溶液を６５℃で２分加熱し、ゆっくり冷却して室温
にした。ｆａｍプライマーを、ＡＢＩモデル３７０Ａ
ＤＮＡシークエンシングシステムを用いて、配列決定
用ゲルを通過するにつれて検出することができる蛍光標
識で標識する。
い、ＤＮＡテンプレートにおける２つのタイプの塩基（
すなわち、Ｃ及びＧ）の配列を決定した。工程は下記の
通りであったニ アニーリング反応では、下記の溶液を調製した： ５Ｘ ５ｅｑＢｕｆ
４プライマー（ＡＢＩ ｆａｍ プラ
イマー、０．４ｐｍ／μ ｌ） ２Ｈａ０
５．
４２０ μ４ この溶液を６５℃で２分加熱し、ゆっくり冷却して室温
にした。ｆａｍプライマーを、ＡＢＩモデル３７０Ａ
ＤＮＡシークエンシングシステムを用いて、配列決定
用ゲルを通過するにつれて検出することができる蛍光標
識で標識する。
伸長反応では、下記の溶液を調製したニアニーリング反
応混合物 ２０μ℃ジチオトレイトールＯ，
ｌ Ｍ １４ ｄＮＴＰ ３ ｍＭ
３ｄｄＧＴＰ ３０μＭ３ ｄｄＣＴＰ ３０μＭ１．５ ２８．５μ℃ この溶液を３７℃で２分間インキュベートし、遺伝的に
改質したＴ７ＤＮＡポリメラーゼ（△２８）（１単位／
μｆｉ）１．５μ℃を加え、溶液を３７℃で１０分間イ
ンキュベートした。
応混合物 ２０μ℃ジチオトレイトールＯ，
ｌ Ｍ １４ ｄＮＴＰ ３ ｍＭ
３ｄｄＧＴＰ ３０μＭ３ ｄｄＣＴＰ ３０μＭ１．５ ２８．５μ℃ この溶液を３７℃で２分間インキュベートし、遺伝的に
改質したＴ７ＤＮＡポリメラーゼ（△２８）（１単位／
μｆｉ）１．５μ℃を加え、溶液を３７℃で１０分間イ
ンキュベートした。
１００ｍＭ ＥＤＴＡ （ｐＨ８，０）５μｆ２を加
えて反応を停止した。
えて反応を停止した。
生成した断片を下記の通りにして沈殿させた：３Ｍ酢酸
ナトリウム３．５μ℃及び１００％エタノール１００Ｌ
ＬＩ２を加えた。混合物を氷上で１０分間インキュベー
トした後に、ミクロ遠心分離機で４℃において３０分間
遠心分離した。ペレットを７０％エタノール５００μ℃
で洗浄し、再び５分間遠心分離した。上澄液をデカント
し、ベレットを減圧下で数分間遠心分離して乾燥した。
ナトリウム３．５μ℃及び１００％エタノール１００Ｌ
ＬＩ２を加えた。混合物を氷上で１０分間インキュベー
トした後に、ミクロ遠心分離機で４℃において３０分間
遠心分離した。ペレットを７０％エタノール５００μ℃
で洗浄し、再び５分間遠心分離した。上澄液をデカント
し、ベレットを減圧下で数分間遠心分離して乾燥した。
次いで、サンプルを９０％ホルムアミド５μ℃、５０ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ （ｐＨ８，０）中に再懸濁し、７５°
Ｃで２分間加熱し、ＡＢＩモデル３７０ＡＤＮＡシーク
エンシングシステムに加えた。モデル３７０Ａインスト
ールメントについてのユーザーズマニュアル（ブリリミ
ナリーバージョン、１９８７年３月、セクション３．４
及び５）に記載する通りにして、インストルーメントを
動かして未加工の（生の）データを集めた。ｆａｍプラ
イマーのみについての未加工の（生の）アウトプットを
示す。
Ｍ ＥＤＴＡ （ｐＨ８，０）中に再懸濁し、７５°
Ｃで２分間加熱し、ＡＢＩモデル３７０ＡＤＮＡシーク
エンシングシステムに加えた。モデル３７０Ａインスト
ールメントについてのユーザーズマニュアル（ブリリミ
ナリーバージョン、１９８７年３月、セクション３．４
及び５）に記載する通りにして、インストルーメントを
動かして未加工の（生の）データを集めた。ｆａｍプラ
イマーのみについての未加工の（生の）アウトプットを
示す。
この反応からのアウトプットを第４図に示す。
各々のＧは高いピークによって表わされ、各々のＣは短
いピークによって表わされる。これより、Ｄ Ｎ Ａに
おけるＧ及びＣの配列はピークの高さから求めることが
できる。こうして、１つの配列決定反応から、全てのＤ
ＮＡ生成物について１つだけの標識を用いて、Ｇ及びＣ
のＤＮＡ配列を決定することができる。分子量の大きい
生成物程、存在する世が少なくなるので、ピークの高さ
はゲルの長さに沿って小さくなる。しかし、近接するＧ
及びＣの間の差異はゲルに沿って約２倍のままであり、
一方、一対の近接するＧ或は一対の近接するＣの差はほ
ぼ均一であり（約１．１〜１．４倍変わる）、配列に沿
った各々の追加の位置についての強度の低下を修正する
０例えば、第４図において、シグナルは所定のシリーズ
のバンドについておよそ６０塩基の期間にわたって２倍
減小する。
いピークによって表わされる。これより、Ｄ Ｎ Ａに
おけるＧ及びＣの配列はピークの高さから求めることが
できる。こうして、１つの配列決定反応から、全てのＤ
ＮＡ生成物について１つだけの標識を用いて、Ｇ及びＣ
のＤＮＡ配列を決定することができる。分子量の大きい
生成物程、存在する世が少なくなるので、ピークの高さ
はゲルの長さに沿って小さくなる。しかし、近接するＧ
及びＣの間の差異はゲルに沿って約２倍のままであり、
一方、一対の近接するＧ或は一対の近接するＣの差はほ
ぼ均一であり（約１．１〜１．４倍変わる）、配列に沿
った各々の追加の位置についての強度の低下を修正する
０例えば、第４図において、シグナルは所定のシリーズ
のバンドについておよそ６０塩基の期間にわたって２倍
減小する。
これより、本例では、テンプレートに沿った各々の追加
の位置において１．１６％の減小が固有である（カイロ
０＝２の場合、カイは１．０１１６であるので）。
の位置において１．１６％の減小が固有である（カイロ
０＝２の場合、カイは１．０１１６であるので）。
強度の異なるバンドを、近接バンド及び電気泳動する間
に一緒に移行する２つ又はそれ以上のバンド内の異なる
鎖停止効率によって区別することが重要である。後者の
事象はコンプレッションと呼ばれ、ゲル電気泳動のアー
ヂファクトであってＤＮＡ配列決定それ自体でなく、マ
ンガンを用いることによって排除されない、このような
コンプレッションの一例を第４図に星印（＊）でマーク
する。第４図に示されるようなコンプレッションが２つ
のＤＮＡ生成物の共移行（ｃｏ−ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）
を表わしていることを知るならば、そのバンドは２Ｘ強
度のバンドの正確なマーカーである。
に一緒に移行する２つ又はそれ以上のバンド内の異なる
鎖停止効率によって区別することが重要である。後者の
事象はコンプレッションと呼ばれ、ゲル電気泳動のアー
ヂファクトであってＤＮＡ配列決定それ自体でなく、マ
ンガンを用いることによって排除されない、このような
コンプレッションの一例を第４図に星印（＊）でマーク
する。第４図に示されるようなコンプレッションが２つ
のＤＮＡ生成物の共移行（ｃｏ−ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）
を表わしていることを知るならば、そのバンドは２Ｘ強
度のバンドの正確なマーカーである。
コンプレッションの領域における正確な配列を決定する
ことはできない、この配列を決定するためには、１）配
列を逆配向に決定する、２）配列決定ゲルを一層強い変
性条件、すなわち−屡高い温度下で、或はホルムアミド
５０％を加えることによって運転する、或は３）ｄＧＴ
Ｐに代えてヌクレオチド類似体、例えばｄＩＴＰ或はｄ
ｅａｚａＧＴＰを用いることが必要である。コンプレッ
ションはゲル電気泳動の条件下でＤＮＡ中に安定なヘア
ピンが形成することにより、これらのヌクレオチド類似
体を加入することはこれらのヘアピンのほとんどを変動
させる。
ことはできない、この配列を決定するためには、１）配
列を逆配向に決定する、２）配列決定ゲルを一層強い変
性条件、すなわち−屡高い温度下で、或はホルムアミド
５０％を加えることによって運転する、或は３）ｄＧＴ
Ｐに代えてヌクレオチド類似体、例えばｄＩＴＰ或はｄ
ｅａｚａＧＴＰを用いることが必要である。コンプレッ
ションはゲル電気泳動の条件下でＤＮＡ中に安定なヘア
ピンが形成することにより、これらのヌクレオチド類似
体を加入することはこれらのヘアピンのほとんどを変動
させる。
ヘアピン構造によるコンプレッションはヘアピンの程度
及び長さに応じて、事実上任意の長さになることができ
る。こうして、Ｍｎにより、全ての近接するバンドは同
じ分子量のＤＮＡ生成物をほぼ等しい数で有しコンプレ
ッションにより同様のバンド強度を必ずしも持たない。
及び長さに応じて、事実上任意の長さになることができ
る。こうして、Ｍｎにより、全ての近接するバンドは同
じ分子量のＤＮＡ生成物をほぼ等しい数で有しコンプレ
ッションにより同様のバンド強度を必ずしも持たない。
第２図を参照すれば、マンガンの存在において頂度ｄｄ
ＧＰＴを１ｍＭの最終濃度にして、上記の方法を用いた
。生成するゲル上の各々のバンドは第２図にピークとし
て表われる。バンドの強度は各々のピークの高さによっ
て反映される。マンガンによって、近接するバンド強度
、こうしてピーク高さはゲルに沿って均一であり、近接
するバンド間で５或は１０％未満で異なる。
ＧＰＴを１ｍＭの最終濃度にして、上記の方法を用いた
。生成するゲル上の各々のバンドは第２図にピークとし
て表われる。バンドの強度は各々のピークの高さによっ
て反映される。マンガンによって、近接するバンド強度
、こうしてピーク高さはゲルに沿って均一であり、近接
するバンド間で５或は１０％未満で異なる。
対照して、第３図に示すアウトプットはマンガンに代え
てマグネシウムの存在において行った同じ実験を表わす
、ここで、近接するバンド強度、こうしてピーク高さは
１０倍程大きく変わる。
てマグネシウムの存在において行った同じ実験を表わす
、ここで、近接するバンド強度、こうしてピーク高さは
１０倍程大きく変わる。
第５図を参照すれば、マンガンの存在における配列決定
反応で４つ全てのジデオキシヌクレオチドを等しい濃度
（例２のように、各々のｄｄＮＴＰについて０．７５μ
Ｍの最終濃度）にして、近接するバンド及び対応するピ
ークはほぼ均一であり、変わるのは１．５倍にすぎず、
再び分子量の一層大きいＤＮＡ生成物についての絶対強
度が減小する。対照して、第６図に示す通りに、マグネ
シウム及び４つ全てが等しい濃度のジデオキシヌクレオ
チドの存在において、近接するバンド強度は大きく変わ
る。
反応で４つ全てのジデオキシヌクレオチドを等しい濃度
（例２のように、各々のｄｄＮＴＰについて０．７５μ
Ｍの最終濃度）にして、近接するバンド及び対応するピ
ークはほぼ均一であり、変わるのは１．５倍にすぎず、
再び分子量の一層大きいＤＮＡ生成物についての絶対強
度が減小する。対照して、第６図に示す通りに、マグネ
シウム及び４つ全てが等しい濃度のジデオキシヌクレオ
チドの存在において、近接するバンド強度は大きく変わ
る。
配列決定反応において各々のｄｄＮＴＰの濃度を変える
ことによって、ＤＮＡ鎖の完全なヌクレオチド配列を決
定することができる。このような手順の例を第７図に示
し、ここで各々のｄｄＮＴＰの濃度は３０％の間隔だけ
異なる：ｄｄＧＴＰ（４，５ｕＭ、２．２ｘ） 、ｄｄ
ＡＴＰ （３，ＯｕＭ。
ことによって、ＤＮＡ鎖の完全なヌクレオチド配列を決
定することができる。このような手順の例を第７図に示
し、ここで各々のｄｄＮＴＰの濃度は３０％の間隔だけ
異なる：ｄｄＧＴＰ（４，５ｕＭ、２．２ｘ） 、ｄｄ
ＡＴＰ （３，ＯｕＭ。
１．７ｘ） 、ｄｄＴＴＰ （２ｕＭ、１．３ｘ）及び
ｄｄＣＴＰ （１，４ｕＭ、１．０ｘ）、このグラフか
ら求めたＤＮＡ配列を図の第二の線の下に示す。実際の
ＤＮＡ配列に比べてたった６つの誤り（「■」で示す）
がなされただけであった。これらの誤りは各々のｄｄＮ
ＴＰ （例えば、１ｘｄｄＣＴＰ、２ｘｄｄＴＴＰ、４
ｘｄｄＡＴＰ及び８ｘ ｄ ｄ Ｇ Ｔ Ｐ ）の比を
大きくして用いることによって排除することができる。
ｄｄＣＴＰ （１，４ｕＭ、１．０ｘ）、このグラフか
ら求めたＤＮＡ配列を図の第二の線の下に示す。実際の
ＤＮＡ配列に比べてたった６つの誤り（「■」で示す）
がなされただけであった。これらの誤りは各々のｄｄＮ
ＴＰ （例えば、１ｘｄｄＣＴＰ、２ｘｄｄＴＴＰ、４
ｘｄｄＡＴＰ及び８ｘ ｄ ｄ Ｇ Ｔ Ｐ ）の比を
大きくして用いることによって排除することができる。
同様に、ピーク高さよりむしろピーク面積を測定するこ
とによって、結果は一層正確になる。既存のＤＮＡ配列
決定装置について、このようなピーク面積を測定するコ
ンピュータープログラムを書くのは容易である。
とによって、結果は一層正確になる。既存のＤＮＡ配列
決定装置について、このようなピーク面積を測定するコ
ンピュータープログラムを書くのは容易である。
第８図を参照すれば、シトレート或はイソシトレート等
のキレート剤の不存在において、マグネシウムの場合２
０ｍＭであるのに比べて、配列決定反応におけるマンガ
ンの最適濃度は１ｍＭである。４０ｍＭのイソシトレー
トが反応において存在する場合、マンガンの存在におけ
るポリメラーゼ活性は４倍刺激され、最適のマンガン濃
度は５〜２０ｍＭになる。第９図を参照すれば、１０ｍ
Ｍのマンガン濃度において、最適のイソシトレート濃度
は４０ｍＭであり、ポリメラーゼ活性を４倍刺激するに
至る。１０ｍＭのマグネシウム濃度で、イソシトレート
は任意の量でポリメラーゼに対し抑制作用を有する。こ
れらの結果は、ポリメラーゼ反応を下記に説明する通り
にして種々のキレート剤及びイオン濃度の存在において
行って得た。詳細には、反応（２ｏＯμβ）は４０ｍＭ
トリス−ＨＣＡ （ｐＨ７，５） 、５ｍＭジチオトレ
イトール、０．５ ｍ Ｍ変性中胸腺ＤＮＡ、０．３ｍ
ＭｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ及び［’Ｈ］ｄＴＴＰ
（２０ｃｐｍ／ｐｍ）、５０μｇ／ｍＩ２’ＢｓＡ及
び示した濃度のＭｇＣβｚ、ＭｎＣβ２或はナトリウム
イソシトレートを含有した。遺伝的に改質したＴ７ＤＮ
Ａポリメラーゼ（△Ｌｙｓｌ１８−Ａｒｇ１４５）を０
．１単位加えて反応を開始した。インキュベーションは
３７℃において３０分間であった。ｌＮＨｃＩ２３ｍ℃
及び０．１ Ｍナトリウムピロホスフェートを加えて反
応を停止させ、酸不溶性放射能を測定した。ＤＮＡポリ
メラーゼ１単位は全ヌクレオチドＩｏｎモルを酸不溶性
形態にアセイの条件下３０分で加入するのを触媒する。
のキレート剤の不存在において、マグネシウムの場合２
０ｍＭであるのに比べて、配列決定反応におけるマンガ
ンの最適濃度は１ｍＭである。４０ｍＭのイソシトレー
トが反応において存在する場合、マンガンの存在におけ
るポリメラーゼ活性は４倍刺激され、最適のマンガン濃
度は５〜２０ｍＭになる。第９図を参照すれば、１０ｍ
Ｍのマンガン濃度において、最適のイソシトレート濃度
は４０ｍＭであり、ポリメラーゼ活性を４倍刺激するに
至る。１０ｍＭのマグネシウム濃度で、イソシトレート
は任意の量でポリメラーゼに対し抑制作用を有する。こ
れらの結果は、ポリメラーゼ反応を下記に説明する通り
にして種々のキレート剤及びイオン濃度の存在において
行って得た。詳細には、反応（２ｏＯμβ）は４０ｍＭ
トリス−ＨＣＡ （ｐＨ７，５） 、５ｍＭジチオトレ
イトール、０．５ ｍ Ｍ変性中胸腺ＤＮＡ、０．３ｍ
ＭｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ及び［’Ｈ］ｄＴＴＰ
（２０ｃｐｍ／ｐｍ）、５０μｇ／ｍＩ２’ＢｓＡ及
び示した濃度のＭｇＣβｚ、ＭｎＣβ２或はナトリウム
イソシトレートを含有した。遺伝的に改質したＴ７ＤＮ
Ａポリメラーゼ（△Ｌｙｓｌ１８−Ａｒｇ１４５）を０
．１単位加えて反応を開始した。インキュベーションは
３７℃において３０分間であった。ｌＮＨｃＩ２３ｍ℃
及び０．１ Ｍナトリウムピロホスフェートを加えて反
応を停止させ、酸不溶性放射能を測定した。ＤＮＡポリ
メラーゼ１単位は全ヌクレオチドＩｏｎモルを酸不溶性
形態にアセイの条件下３０分で加入するのを触媒する。
（ティパー等、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、 ２６２巻、
１６２１２頁、（１９８７年））。
１６２１２頁、（１９８７年））。
ビロホスフ ターゼ
化学的に改質したＴ７ＤＮＡポリメラーゼなりＮＡ配列
決定用に用いた場合に、長くインキュベートした際に特
異の断片が消える（ティパー及びリチャードソン（Ｒ１
ｃｈａｒｄｓｏｎ） 、 Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ、 Ａｃ
ａｄ。
決定用に用いた場合に、長くインキュベートした際に特
異の断片が消える（ティパー及びリチャードソン（Ｒ１
ｃｈａｒｄｓｏｎ） 、 Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ、 Ａｃ
ａｄ。
Ｓｃｉ、ＵＳＡ ８４巻：４７６７頁、１９８７年）０
本発明者等は、このプロセスが配列決定ゲルにおいてス
ペースを生じるので、これが生じる部位を「ホール」と
呼ぶ。ホールは、ｄＧＴＰに代えてｄＩＴＰを用いる場
合に、−層頻繁に生じる。
本発明者等は、このプロセスが配列決定ゲルにおいてス
ペースを生じるので、これが生じる部位を「ホール」と
呼ぶ。ホールは、ｄＧＴＰに代えてｄＩＴＰを用いる場
合に、−層頻繁に生じる。
特異の断片が減成するのは、ＤＮＡ配列決定ゲルを読み
取る際に問題となるのは明らかである。
取る際に問題となるのは明らかである。
断片が存在しないことは、配列を読み取る際に完全に見
落されて決定した配列に欠失を生じるか、或はその位置
において単に未知の塩基と解釈され得るホールを観測す
る。
落されて決定した配列に欠失を生じるか、或はその位置
において単に未知の塩基と解釈され得るホールを観測す
る。
この問題の現行の解決法は反応時間を短く保つことであ
る。これは２つの理由で満足すべきものではない、第１
に、反応を開始した後すぐに反応を停止させるために極
めて迅速に作業することが予儀なくされるので、反応を
行うことを技術的に一層困難にさせる。−層重要なこと
は、いくつかのバンドはこの減成に極めて感応性であり
、非常に短い反応時間の後でさえ消える。
る。これは２つの理由で満足すべきものではない、第１
に、反応を開始した後すぐに反応を停止させるために極
めて迅速に作業することが予儀なくされるので、反応を
行うことを技術的に一層困難にさせる。−層重要なこと
は、いくつかのバンドはこの減成に極めて感応性であり
、非常に短い反応時間の後でさえ消える。
本発明者等は検出し得るレベルのエキソヌクレアーゼ活
性を持たない（野生型酵素のレベルの１ｏ−７より低い
、或は化学的に改質したＴ７ＤＮＡポリメラーゼより１
０，０００倍以上低い）遺伝的に変更した形の７７ＤＮ
Ａポリメラーゼ（上述した△２８）を構築した。本発明
等は、ホールが長いインキュベーションによって現われ
ることから、ホールはおそらくエキソヌクレアーゼ活性
によるものと考えられ、これよりこの遺伝的に改質した
形のＴ７ＤＮＡポリメラーゼを用いた場合に生じないで
あろうと予想した。しかし、上述した放射性断片は、化
学的にか或は遺伝的のいずれかに改質したＴ７ポリメラ
ーゼを用いる場合に依然同じ割合で消失する。
性を持たない（野生型酵素のレベルの１ｏ−７より低い
、或は化学的に改質したＴ７ＤＮＡポリメラーゼより１
０，０００倍以上低い）遺伝的に変更した形の７７ＤＮ
Ａポリメラーゼ（上述した△２８）を構築した。本発明
等は、ホールが長いインキュベーションによって現われ
ることから、ホールはおそらくエキソヌクレアーゼ活性
によるものと考えられ、これよりこの遺伝的に改質した
形のＴ７ＤＮＡポリメラーゼを用いた場合に生じないで
あろうと予想した。しかし、上述した放射性断片は、化
学的にか或は遺伝的のいずれかに改質したＴ７ポリメラ
ーゼを用いる場合に依然同じ割合で消失する。
本発明者等はこの特異なバンドの損失がポリメラーゼの
ビロホスホリシス活性によるものと決めた。この活性は
ＰＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性によるも
のでなく、むしろポリメラーゼ活性の逆転による。ピロ
ホスフェート（ＰＰｉ）の存在において、ポリメラーゼ
はＰＰｉを鎖の３′末端に置かれた末端ヌクレオチドに
加え、この場合、ジデオキシヌクレオシド５′−トリホ
スフェートを開放する。全般をトイチャー （Ｄｅｕｔ
ｓｃｈｅｒ）等、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、 ２４４巻
＝３０１９頁、１９６９年及びフリーマンアンドカンパ
ニー ＳＦ、出版のコーンベルブ（Ｋｏｍｂｅｒｇ）、
ＤＮＡリブリケーションコン２５−１２６頁参照。この
反応は３′末端におけるブロックを取り去り、合成をテ
ンプレートに沿って更に伸長させろ効果を有する。ＰＰ
ｉは重合反応の生成物であるので、通常ＤＮＡ合成反応
混合物中に蓄積する。ビロホスホロリシスの部位はＤＮ
Ａ配列依存性であり、これより、上述したホールは特異
の部位においてのみ作られる。
ビロホスホリシス活性によるものと決めた。この活性は
ＰＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性によるも
のでなく、むしろポリメラーゼ活性の逆転による。ピロ
ホスフェート（ＰＰｉ）の存在において、ポリメラーゼ
はＰＰｉを鎖の３′末端に置かれた末端ヌクレオチドに
加え、この場合、ジデオキシヌクレオシド５′−トリホ
スフェートを開放する。全般をトイチャー （Ｄｅｕｔ
ｓｃｈｅｒ）等、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、 ２４４巻
＝３０１９頁、１９６９年及びフリーマンアンドカンパ
ニー ＳＦ、出版のコーンベルブ（Ｋｏｍｂｅｒｇ）、
ＤＮＡリブリケーションコン２５−１２６頁参照。この
反応は３′末端におけるブロックを取り去り、合成をテ
ンプレートに沿って更に伸長させろ効果を有する。ＰＰ
ｉは重合反応の生成物であるので、通常ＤＮＡ合成反応
混合物中に蓄積する。ビロホスホロリシスの部位はＤＮ
Ａ配列依存性であり、これより、上述したホールは特異
の部位においてのみ作られる。
この問題を克服するには、ビロホスホロリシス反応を抑
制しなければならない。ビロホスホロリシスを抑制する
１つの方法は、ポリメラーゼ反応においてピロホスフェ
ートが発生されるにつれて、酵素ピロホスファターゼを
加えてピロホスフェートを分解することである。他の解
決法は他の酵素反応によってピロホスフェートを変える
か、或はＤＮＡポリメラーゼのこの活性を抑制する類似
体を加えてビロホスホロリシス反応を防止することを含
む。本発明者等はこの酵素を微量でさえ（ＤＮＡポリメ
ラージ分子の十分の−のモル比）配列決定反応に加える
と特定のクラスの断片を完全に安定にしかつホールの生
成を排除することを見出した。遺伝的に変えた形のＴ７
ポリメラーゼ（△２８）及びピロホスファターゼの両方
の存在において、全てのバンドは長く（２時間まで）イ
ンキュベートした場合でさえ安定である。
制しなければならない。ビロホスホロリシスを抑制する
１つの方法は、ポリメラーゼ反応においてピロホスフェ
ートが発生されるにつれて、酵素ピロホスファターゼを
加えてピロホスフェートを分解することである。他の解
決法は他の酵素反応によってピロホスフェートを変える
か、或はＤＮＡポリメラーゼのこの活性を抑制する類似
体を加えてビロホスホロリシス反応を防止することを含
む。本発明者等はこの酵素を微量でさえ（ＤＮＡポリメ
ラージ分子の十分の−のモル比）配列決定反応に加える
と特定のクラスの断片を完全に安定にしかつホールの生
成を排除することを見出した。遺伝的に変えた形のＴ７
ポリメラーゼ（△２８）及びピロホスファターゼの両方
の存在において、全てのバンドは長く（２時間まで）イ
ンキュベートした場合でさえ安定である。
バンド強度差を用いる自動化配列決定の場合、あらゆる
バンドの強度をｄｄＮＴＰ対ｄＮＴＰの比によって完全
に決定することが重要である。いくつかのバンドの強度
を減小させることによって、ビロホスホロリシスがアン
ビギュイテイを生じることになる。このように、ピロホ
スファターゼを加えることは本配列決定手順において特
に有用である。
バンドの強度をｄｄＮＴＰ対ｄＮＴＰの比によって完全
に決定することが重要である。いくつかのバンドの強度
を減小させることによって、ビロホスホロリシスがアン
ビギュイテイを生じることになる。このように、ピロホ
スファターゼを加えることは本配列決定手順において特
に有用である。
化学的に或は遺伝的に改質したＴ７ＤＮＡポリメラーゼ
或はその他のポリメラーゼを配列決定用に用いる場合は
いつでも、ピロホスファターゼを、ＰＰｉの蓄積をビロ
ホスホロリシスに至るレベルに止める速度で形成される
ＰＰｉの加水分解を触媒する程の量より多くして加える
べきである。これは、ｄＧＴＰに代えてｄＩＴＰを用い
る場合に特に当てはまり、この場合、ビロホスホロリシ
ス反応によるホールの出現が一層大きい程度に起きる。
或はその他のポリメラーゼを配列決定用に用いる場合は
いつでも、ピロホスファターゼを、ＰＰｉの蓄積をビロ
ホスホロリシスに至るレベルに止める速度で形成される
ＰＰｉの加水分解を触媒する程の量より多くして加える
べきである。これは、ｄＧＴＰに代えてｄＩＴＰを用い
る場合に特に当てはまり、この場合、ビロホスホロリシ
ス反応によるホールの出現が一層大きい程度に起きる。
本例では、通常の配列決定手順を用いた。酵母無機ピロ
ホスファターゼを用いたのが唯一の変更であった。ピロ
ホスファターゼの出所は重要でないが、本例では、シグ
マ酵母無機ピロホスファターゼカタログ番号ｌ−４５０
３を更に精製しないで、或はＥＰＬＣモノＱカラムで更
に精製して及びワーシントン（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ
）酵母無機ビロホスファターゼを更に精製しないで用い
た。ピロホスファターゼを改質Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ
に加えた後にポリメラーゼを標識反応に加えた。代表的
には、配列決定反応セット当り、２単位（０，２５μｇ
）のポリメラーゼ及び０．００１単位の酵母無機ピロホ
スファターゼ（４ｎｇ）を用いた。広範囲のピロホスフ
ァターゼ活性が作用して良い結果を得る：配列決定及応
当り０．０１ｎｇ〜１μｇの酵母ピロホスファターゼを
試験して良好な結果を得た。
ホスファターゼを用いたのが唯一の変更であった。ピロ
ホスファターゼの出所は重要でないが、本例では、シグ
マ酵母無機ピロホスファターゼカタログ番号ｌ−４５０
３を更に精製しないで、或はＥＰＬＣモノＱカラムで更
に精製して及びワーシントン（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ
）酵母無機ビロホスファターゼを更に精製しないで用い
た。ピロホスファターゼを改質Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ
に加えた後にポリメラーゼを標識反応に加えた。代表的
には、配列決定反応セット当り、２単位（０，２５μｇ
）のポリメラーゼ及び０．００１単位の酵母無機ピロホ
スファターゼ（４ｎｇ）を用いた。広範囲のピロホスフ
ァターゼ活性が作用して良い結果を得る：配列決定及応
当り０．０１ｎｇ〜１μｇの酵母ピロホスファターゼを
試験して良好な結果を得た。
例えば、アニーリング反応では、下記の溶液を調製した
； ５Ｘ ５ｅｑＢｕｆ １Ｏμ℃ この溶液を６５℃において２分加熱し、ゆっくり冷却し
て室温にした。
； ５Ｘ ５ｅｑＢｕｆ １Ｏμ℃ この溶液を６５℃において２分加熱し、ゆっくり冷却し
て室温にした。
標識反応では、下記の溶液を調製したニアニーリング反
応ン昆合物 ｌＯμＣ ジチオトレイトール ０．１Ｍ ”Ｓ ｄＡＴＰ、ニューイングランドニュークリアＮ
ＥＧ−０３４８酵素混合物（下記参照） １６μ４ 酵素混合物： 遺伝的に改質したＴ７ＤＮＡポリメラーセ、△Ｌｙｓ１
１８−Ａｒｇ１４５ １単位／μ℃２０ｍ
ＭトリスーＨＣｊ２（ｐＨ７，５）、１０ｍＭβ−メル
カプトエタノール、 ５０μｇ ／ ｍ Ｉ２牛血清ア・ル・ブミン中の酵母
無機ピロホスファターゼ ０．０１単位μ℃ この溶液を室温で５分インキュベートした。
応ン昆合物 ｌＯμＣ ジチオトレイトール ０．１Ｍ ”Ｓ ｄＡＴＰ、ニューイングランドニュークリアＮ
ＥＧ−０３４８酵素混合物（下記参照） １６μ４ 酵素混合物： 遺伝的に改質したＴ７ＤＮＡポリメラーセ、△Ｌｙｓ１
１８−Ａｒｇ１４５ １単位／μ℃２０ｍ
ＭトリスーＨＣｊ２（ｐＨ７，５）、１０ｍＭβ−メル
カプトエタノール、 ５０μｇ ／ ｍ Ｉ２牛血清ア・ル・ブミン中の酵母
無機ピロホスファターゼ ０．０１単位μ℃ この溶液を室温で５分インキュベートした。
終結反応では、下記の４つの反応混合物を調製した。
＋１２０ １．９ １．９ １
．９ １．９ μβｄｄＧＴＰＯ，０３ｍＭ
０．２ｕ １２ｄｄＡＴＰ０．２ｍＭ
Ｏ，２μｍ２ｄｄＴＴＰ０．２ｍＭ
Ｏ，２１ｔ ＡｄｄｅＴＰｏ、
２ｍＭ
Ｏ，２ｎ１３ ３ ３ ３ μ
℃これらの終結混合物を３７℃において２分間インキュ
ベートし、標識反応の３μβアリコートを各々の終結混
合物に加えた。生成した溶液を３７℃で６０分間インキ
ュベートした。
．９ １．９ μβｄｄＧＴＰＯ，０３ｍＭ
０．２ｕ １２ｄｄＡＴＰ０．２ｍＭ
Ｏ，２μｍ２ｄｄＴＴＰ０．２ｍＭ
Ｏ，２１ｔ ＡｄｄｅＴＰｏ、
２ｍＭ
Ｏ，２ｎ１３ ３ ３ ３ μ
℃これらの終結混合物を３７℃において２分間インキュ
ベートし、標識反応の３μβアリコートを各々の終結混
合物に加えた。生成した溶液を３７℃で６０分間インキ
ュベートした。
各々の終結反応を９０％ホルムアミド５μ℃、２０ｍＭ
ＥＤＴＡ、０．２％ブロモフェノール−ブルー、キ
シレン−シアツール、ｐ Ｈ８，０で停止した。
ＥＤＴＡ、０．２％ブロモフェノール−ブルー、キ
シレン−シアツール、ｐ Ｈ８，０で停止した。
生成したサンプルを７５℃で２分間加熱し、７Ｍ尿素、
１００ｍＭトリス−ボレート、ｐＨ８，９中のポリアク
リルアミドゲル（ポリアクリルアミド８％、ビスアクリ
ルアミド０．３％）に添加し、２０００ボルトで２時間
電気泳動した。ゲルをメタノール５０％、酢酸１０％中
で３０分間固定し、乾燥し、オートラジオグラフィーに
よってフィルムを暴露するのに用いた。
１００ｍＭトリス−ボレート、ｐＨ８，９中のポリアク
リルアミドゲル（ポリアクリルアミド８％、ビスアクリ
ルアミド０．３％）に添加し、２０００ボルトで２時間
電気泳動した。ゲルをメタノール５０％、酢酸１０％中
で３０分間固定し、乾燥し、オートラジオグラフィーに
よってフィルムを暴露するのに用いた。
■
第１１図を参照すれば、自動化ＤＮＡ配列決定に適した
装置１００は、反応装置１０２を含み、該反応装置に上
述した試薬１０４、例えばＤＮＡポリメラーゼ、マンガ
ン或は鉄イオン、キレート剤、ピロホスファターゼが入
っている。装置にまたＤＮＡ生成物を分子量に従って分
離するためのゲルボックス１０６及びＤＮＡ生成物がゲ
ルの中を通る（点線の矢印１０７で示す）につれてＤＮ
Ａ生成物を検出する読取り装置１０８を装備する。更に
、計算手段１１０を装備してＤＮＡ生成物のバンドの強
度及びバンドの互いに対する位置を計算する。ＤＮＡ生
成物を１つのレーンに流すならば、コンピューター手段
はバンドの強度及び位置からＤＮＡ配列を計算すること
ができる。この機能を行うのに標準のコンピュータープ
ログラムを使用する。
装置１００は、反応装置１０２を含み、該反応装置に上
述した試薬１０４、例えばＤＮＡポリメラーゼ、マンガ
ン或は鉄イオン、キレート剤、ピロホスファターゼが入
っている。装置にまたＤＮＡ生成物を分子量に従って分
離するためのゲルボックス１０６及びＤＮＡ生成物がゲ
ルの中を通る（点線の矢印１０７で示す）につれてＤＮ
Ａ生成物を検出する読取り装置１０８を装備する。更に
、計算手段１１０を装備してＤＮＡ生成物のバンドの強
度及びバンドの互いに対する位置を計算する。ＤＮＡ生
成物を１つのレーンに流すならば、コンピューター手段
はバンドの強度及び位置からＤＮＡ配列を計算すること
ができる。この機能を行うのに標準のコンピュータープ
ログラムを使用する。
４、図１の簡単な言口
第１図はサンガー等の方法によるＤＮＡ配列決定の略図
である。
である。
第２−７図はアブライドバイオシステムズモデル３７０
Ａ ＤＮＡシークエンシングシステムによって走査し
た６つの異なる配列決定ゲルの相対バンド強度を図示す
るものであり、各々は遺伝的に改質したＴ７ＤＮＡポリ
メラーゼをマンガン或はマグネシウムと種々のジデオキ
シヌクレオシドとの種々の混合物の存在において用いる
ことから生じる配列決定反応混合物を含有する単一のゲ
ルレーンからのものである。
Ａ ＤＮＡシークエンシングシステムによって走査し
た６つの異なる配列決定ゲルの相対バンド強度を図示す
るものであり、各々は遺伝的に改質したＴ７ＤＮＡポリ
メラーゼをマンガン或はマグネシウムと種々のジデオキ
シヌクレオシドとの種々の混合物の存在において用いる
ことから生じる配列決定反応混合物を含有する単一のゲ
ルレーンからのものである。
これらの図の各々において、配列決定したＤＮＡはｍＧ
Ｐ １−２ （Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼをエンコードす
る、ティパー等、Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ、 Ａｃａｄ、
Ｓｃｉ。
Ｐ １−２ （Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼをエンコードす
る、ティパー等、Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ、 Ａｃａｄ、
Ｓｃｉ。
ＵＳＡ、８４巻； ４７６７頁、１９８７年）であり、
プライマーはアプライドバイオシステムズのｆａｍプラ
イマーであった。各々の場合において、ｆａｍプライマ
ーについての未加工の（生の）アウトプットを示す。各
々のアウトプットの開始と終りを示す。加えて、配列の
位置を野生型Ｔ７ＤＮＡにおけるそれらの対応する位置
に関して示す（ダン（Ｄｕｎｎ）等、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉ
ｏｌ、 ８巻：４５２頁、１９８３年）。各々のグラフ
上に星印をマークした点はコンプレッションの領域を表
わし、そこでは、分子量の異なる少なくとも２つのＤＮ
Ａ生成物がゲルの同じ位置に移行する。コンプレッショ
ンはティパー等がＰｒｏｃ、 Ｎａｔ、 Ａｃａｄ、
Ｓｃｉ 。
プライマーはアプライドバイオシステムズのｆａｍプラ
イマーであった。各々の場合において、ｆａｍプライマ
ーについての未加工の（生の）アウトプットを示す。各
々のアウトプットの開始と終りを示す。加えて、配列の
位置を野生型Ｔ７ＤＮＡにおけるそれらの対応する位置
に関して示す（ダン（Ｄｕｎｎ）等、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉ
ｏｌ、 ８巻：４５２頁、１９８３年）。各々のグラフ
上に星印をマークした点はコンプレッションの領域を表
わし、そこでは、分子量の異なる少なくとも２つのＤＮ
Ａ生成物がゲルの同じ位置に移行する。コンプレッショ
ンはティパー等がＰｒｏｃ、 Ｎａｔ、 Ａｃａｄ、
Ｓｃｉ 。
ＵＳＡ、８４巻： ４７６７頁、１９８７年に一般的に
記載している。
記載している。
第８図は４．０ ｍ Ｍのインシトレートの存在及び不
存在において遺伝的に改質したＴ７ＤＮＡポリメラーゼ
の場合のＤＮＡポリメラーゼについてのマグネシウム及
びマンガンの最適濃度を示すグラフである。
存在において遺伝的に改質したＴ７ＤＮＡポリメラーゼ
の場合のＤＮＡポリメラーゼについてのマグネシウム及
びマンガンの最適濃度を示すグラフである。
第９図は１０ｍＭのマグネシウム収はマンガンの存在に
おける種々の濃度のイソシトレートが遺伝的に改質した
Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼについてのＤＮＡポリメラーゼ
活性に与える作用を示すグラフである。
おける種々の濃度のイソシトレートが遺伝的に改質した
Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼについてのＤＮＡポリメラーゼ
活性に与える作用を示すグラフである。
第１０図はエキソヌクレアーゼ活性のない、Ｌｙｓ １
１８−Ａｒｇ１４５のアミノ酸を欠いた遺伝的に改質し
たＴ７ＤＮＡポリメラーゼについてエンコードするプラ
スミドであるｐＧＰ５−８の路地図である。
１８−Ａｒｇ１４５のアミノ酸を欠いた遺伝的に改質し
たＴ７ＤＮＡポリメラーゼについてエンコードするプラ
スミドであるｐＧＰ５−８の路地図である。
第１１図は本発明の自動配列決定装置を図示する。
１０２：反応装置 １０４：試薬
１０６：ゲルボックス １０８：読取手段１１ｏ：計算
手段 テンブレー ト３’ ＧＡＣＴＡＣＣＴＡＧＧＡ
Ｔ−５’プライマー５゛−一→３″ ■ αμポリメラーゼ ＋鎖停止剤 プライマー伸長 Ｇｅｌ電気体動 ■ ＦＩＧ、 １ ムー ムー ポリメラーゼ活性、単位／ｍ９ Ｕ− ポリメラーゼ活性、単位／〜 ＦＩＧ、 Ｉ Ｉ
手段 テンブレー ト３’ ＧＡＣＴＡＣＣＴＡＧＧＡ
Ｔ−５’プライマー５゛−一→３″ ■ αμポリメラーゼ ＋鎖停止剤 プライマー伸長 Ｇｅｌ電気体動 ■ ＦＩＧ、 １ ムー ムー ポリメラーゼ活性、単位／ｍ９ Ｕ− ポリメラーゼ活性、単位／〜 ＦＩＧ、 Ｉ Ｉ
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、ＤＮＡの鎖を準備し、該鎖を該鎖にハイブリダイズ
することができるプライマーと共にアニールしてアニー
ルド混合物とし、該アニールド混合物をデオキシリボヌ
クレオシドトリホスフェート、ＤＮＡポリメラーゼ及び
第１鎖停止剤と共にインキュベートする工程を含むＤＮ
Ａ鎖を配列決定する方法において、インキュベーション
を、ポリメラーゼがプライマーを伸長させて伸長したプ
ライマーの長さの異なる第１シリーズの第１ＤＮＡ生成
物を形成し、各々の該第１ＤＮＡ生成物はその伸長端に
該鎖停止剤を有し、各々の該第１ＤＮＡ生成物の量は長
さが１〜２０塩基異なる実質的に全てのＤＮＡ生成物に
ついてほぼ同じであることを特徴とするＤＮＡ鎖の配列
決定方法。 ２、更に、前記第１ＤＮＡ生成物をゲルパーミエーショ
ンにより分子量に従って分離して第１シリーズのバンド
を形成し、各々の該第１シリーズバンドは特定の分子量
の前記第１ＤＮＡ生成物を表わし、各々の近接する第１
シリーズバンドの強度は実質的に全ての該第１シリーズ
バンドについてほぼ同じであり、及び各々の該第１シリ
ーズバンドの位置を決定する工程を含む特許請求の範囲
第１項記載の方法。 ３、更に、前記アニールド混合物に１〜３の追加の異な
る鎖停止剤をもたらすことを特徴とし、各々はあらゆる
他の鎖停止剤の濃度と異なる濃度であり、前記ＤＮＡポ
リメラーゼは１〜３の追加のシリーズの追加のＤＮＡ生
成物の産生を引き起こし、各々の追加のシリーズの各々
の生成物はその伸長端に該追加の鎖停止剤の内の１つを
有し、同じ鎖停止剤を有する該追加のＤＮＡ生成物の各
々の量は２０塩基の範囲内の全ての長さについてほぼ同
じであり、異なる鎖停止剤を有し、異なるシリーズにあ
るがほぼ同じ分子量を有する全てのＤＮＡ生成物の量と
明瞭に異なる特許請求の範囲第１項記載の方法。 ４、更に、前記ＤＮＡ生成物を全て分子量に従うゲルパ
ーミエーションによって分離して合計２〜４シリーズの
バンドをそれぞれ形成し、シリーズの各々の前記バンド
は該シリーズにおけるあらゆる他のバンドと同じ鎖停止
剤を有しかく特定の分子量であるＤＮＡ生成物を表わし
、同じシリーズ内の各々の近接するバンドの強度はほぼ
同じであり、かつ異なるシリーズの各々の近接するバン
ドの強度と明瞭に異なり、各々のシリーズの各々のバン
ドの位置及び強度を決定する工程を含む特許請求の範囲
第３項記載の方法。 ５、更に、前記アニールド混合物にマンガン或は鉄イオ
ンを付与し、該イオンはポリメラーゼを鎖停止剤につい
て非区別性にさせることを特徴とする先の特許請求の範
囲のいずれかに記載の方法。 ６、更に、前記ＤＮＡポリメラーゼをＴ７−タイプＤＮ
Ａポリメラーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼ I
の大断片及びＴａｑポリメラーゼから選ぶことを特徴と
する先の特許請求の範囲のいずれかに記載の方法。 ７、更に、前記鎖停止剤がジデオキシヌクレオシドトリ
ホスフェートであることを特徴とする先の特許請求の範
囲のいずれかに記載の方法。 ８、更に、前記アニールド混合物にキレート剤を付与す
ることを特徴とする先の特許請求の範囲のいずれかに記
載の方法。 ９、マンガン或は鉄イオンを含有することを特徴とする
、ＤＮＡポリメラーゼ及び鎖停止剤の供給材料を含むＤ
ＮＡを配列決定するのに用いるキット。 １０、前記ポリメラーゼがＴ７−タイプＤＮＡポリメラ
ーゼ、クレノー或はＴａｑポリメラーゼであり、前記鎖
停止剤がジデオキシヌクレオシドトリホスフェートであ
ることを特徴とする特許請求の範囲第９項記載のキット
。 １１、ピロホスファターゼを含有することを特徴とする
特許請求の範囲第９項記載のキット。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US218103 | 1988-07-12 | ||
| US07/218,103 US4962020A (en) | 1988-07-12 | 1988-07-12 | DNA sequencing |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02154699A true JPH02154699A (ja) | 1990-06-14 |
| JP2870696B2 JP2870696B2 (ja) | 1999-03-17 |
Family
ID=22813763
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1175763A Expired - Lifetime JP2870696B2 (ja) | 1988-07-12 | 1989-07-10 | Ｄｎａ配列決定 |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| US (4) | US4962020A (ja) |
| EP (1) | EP0351138B1 (ja) |
| JP (1) | JP2870696B2 (ja) |
| KR (1) | KR900001860A (ja) |
| CN (1) | CN1039845A (ja) |
| AT (1) | ATE119579T1 (ja) |
| AU (1) | AU614245B2 (ja) |
| CA (1) | CA1340851C (ja) |
| DD (1) | DD284052A5 (ja) |
| DE (2) | DE68921515T2 (ja) |
| DK (1) | DK342289A (ja) |
| ES (1) | ES2015853A4 (ja) |
| GR (1) | GR900300159T1 (ja) |
| HU (1) | HUT52543A (ja) |
| IL (1) | IL90850A0 (ja) |
| LT (1) | LTIP1515A (ja) |
| NO (1) | NO892825L (ja) |
Families Citing this family (171)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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