JPH02157228A - 微生物及びその利用方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は微生物を使用する医療分野に係り、特に生体機
能の維持増進に役立つ有用物質を生体内に直接投与する
微生物及びその利用方法に関するものである。

〔従来の技術〕

有用物質を生体内に投与する場合において、従来は、当
該有用物質を天然界より抽出したり、有機化学的に、あ
るいは遺伝子工学的に人工合成した後精製し生体内に投
与してきた。しかし近年、治療対象の生体内で直接有用
物質を生産させる方法が報告された。すなわち、生ワク
チン産生において、遺伝子工学的手法を用いてワクシニ
アライスにＢ型肝炎ウィルスの抗原蛋白の遺伝子を導入
し、生体内においてフックシニアウィルスに感染した細
胞にＢ型肝炎ウィルスの抗原蛋白を生産させ、生体内に
おいて抗Ｂ型肝炎ウイルス抗体の生産を誘導する手段が
ある。詳細は文献２日本臨床。

ｖｏ　Ｉ−２５＃　Ａ　１０＋第１４２頁〜！１４ｇ頁
、１９８７年版に記載されている。本手法は治療対象生
体内において直接目的物質を生産させるという点におて
いる点で大き畷異なる。また、ウィルスの感染は半永久
的に持続するのに対し、本発明では一定期間のみその有
効性を発揮する点において大き４異なり、たとえその処
置が当該生体に有害であったにせよ一定期間内に無害化
する利点を有する。

〔発明が解決しようとする課題〕

上記従来技術は、大量生産に適した微生物に生産させた
有用物質を微生物内に蓄積あるいは培地中に分泌させそ
の微生物を破砕するなどの処理をした後、目的物質を抽
出し、微生物由来のきょう雑物質を除去していた。上記
方法は生産性と安全性確保に関して配慮がされておらず
、有用物質の精製に多大な時間と労力およびコストが必
要となり、かつ、どうしても残ってしまう有用物質の生
産微生物由来のきょう雑物による副作用等の不具合があ
った。

本発明の目的は有用物質を生体内に投与する際に、その
物質の精製操作を省略し経済性を向上するとともに、き
ょう雑物による副作用の危険性を排除できる微生物及び
その利用方法を提供することにある。

［＆１８を解決するための手段〕 上記目的は、治療対象とされる人あるいは動物。

またそれらの個体と共生関係にあるロ内菌、腸内菌など
の微生物を生体内から取り出し、それに遺伝子操作技術
によって作制された有用物質分泌型のベクターを導入し
て、菌を形質転換し、これを体内に戻すことによって有
用物質を体内で生産。

分泌させ、口内、腸管等から直接吸収させることにより
、達成される。

〔作　　用〕

治療対象生体内で共生関係にある微生物を取り出し、こ
れを目的有用物質を生産し微生物体外に分泌するベクタ
ーで形質転換した微生物（クローン）を治療対象生体内
に再投与すると、当該微生物は生体内で目的有用物質を
生産し分泌する。

万機生物が投与された生体は体内微生物系の大きな変化
をすることな（有用物質を口内あるいは腸管より吸収で
きる。それによって従来性なわれていた微生物を大量培
養し有用物質を抽出精製する過程が省略できる。

また使用する微生物は、治療対象とする生体が本来保持
している微生物であるため、それが生産する物質は生体
にとって有害ではないので治窄効果のみが発揮される。

さらに組換え体の微生物が一般的に持つ特性として、非
組換え体より増殖速度が遅いという機能があり、治療に
効果なＸＡ揮した組換え体微生物も、治療後すみやかに
生体内より排除され原状回復がなされる。

〔実　施　例〕

取し、単離培養した大腸菌を（常法により）形質転換用
菌に処理する。次に有用物質を生産し分泌釣 するベクターでｌｌＵ記大腸菌な勿質転換する。餌記：
負 ベクターは、胃〃瘍を治癒する蛋白質（ｍＥＧＦ）の合
成を指令（コード）する遺伝子と細胞外に分泌を促すβ
−ラクタマーゼあるいはアルカリ性フＪ、、７ｊターゼ
ゐるい１よブ。テアーゼＩの２グオルペブチド遺伝子が
組み込まれている。これら遺伝子が３現すると細胞外に
目的とする蛋白質が分泌される。餌記形質転換した大腸
菌が培地中に分泌した目的の蛋白質、すなわちｍＥＧＦ
をラジオレセプターアブセイ法で確認する。ラジオレセ
ブターアブセイ法とは、ラジオアイソトープで標識した
既知菫の蛋白質と測定対象蛋白質とを測定対象蛋白質の
受容体とを競合反応させ、試料中の測定対象蛋白質の定
量を行なう方法である。次にこのようにして蛋白質の分
泌を確認した大腸菌をマウス体内に戻し、目的蛋白質を
生成分泌させる。このときマウスを取扱う機会は、体内
に形質転換した大腸菌を戻すときだけで、従来のように
数回に分けて生体内（個体内）に投与する必要もない。

以下本−実施例の具体的な操作方法を説明する。

１　形質転換用大腸菌の調製 マウスの糞より一白金耳とり、それをＬＢ培地５　ｒｎ
ｌ：　（バクトドリプトン１０９／１．　　酵母エキス
７・５ ５９／ｌ、　　Ｎａｃｌ　１０９／ｌ　、　ＰＨ□　）
、　３７℃　で−晩培養する。後に一晩培養した混合液
を１７１０００゜１／１０００００．１１００００００
０００　に希釈したＬＢプレート（ＬＢ培地、寒天工５
９／ｌ）上で３７℃培養を行う。この操作を、大腸菌の
シングルコロニーができるまで行なう。次にシングルコ
ロニー化された大腸菌をＬＢ培地５ｍｌ！、３７℃で一
晩培養する。次に一晩培養した培養液１００１Ｆ＋７．
　　ＬＢ培地ＬＯｒｎｌの混合液を３７℃で２時間培養
し、該培養液を２ＷＬｌ取り出し４０００５’、４℃、
１０ｍ１ｎ　で集菌する。以下、化学的処理には、ルビ
ジウムクロライド法、カルシウムクロライド法があるが
、二コでは形質転換効率のよいルビジウムクロライド法
について記述する。集菌した大腸菌を財もって氷水中で
冷却しである溶液１ｒｎｌ　（ＩＱｒｎＭＭＯＰＳ（ｍ
ｏｒｐｈｏ　！ｊ　１ｎｏｐｒｏｐａ：ｌｅｅ　ｓｕｌ
　ｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ　）、　１０ｍＭＲｂｙｌ）を
加え懸濁する。次１．−４０００９．４℃。

１０ｍ１ｎで高速冷却遠心し上清を除（。次に餌もッテ
冷却し”ｃｓる溶液（０，１ＭＭＣＪＰＳ、５０ｍＭＣ
ａＣｌ２．１０ｍＭＲｂａｌ　）を１ｍＪ加え懸濁し氷
水中に１５分間置く。再遠心して上清を除き上記の溶液
（０，ＩＭＭＯＰＳ、　５０ｍＭ　ＣａＣｌ２．１０ｍ
ＭＲｂｏｌ　）０．２ｍｌ！を加え形質転換用菌とする
。（詳細は、文献Ｍｏ１ｅｃｖｌｏｎ　ｃｌｏｉｎｇＳ
ｅｄ　ｂｙ　Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｗｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒｌａ−第２５０頁
〜第２５３頁１９８２年版に記載されている。） ２、組み換えベクターの作製 （１）　　β−ラクタマーゼ遺伝子とｍＢＧＦ遺伝子の
融合遺伝子の場合を第１図にて説明する。

図において、β−ラクタマーゼ遺伝子中のジグｚ″ ナルペプチド相当領域（６９塩基対）はすｆに塩基配列
決定がなされている（詳細はＪ、Ｇ。

１９ｕｔｃｌｉｆｆｅ、Ｐｒｏｃ、Ｍａｔｌ　　Ａ’ａ
ｄ　　Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　　ｖｏｌ。

７５．Ａ８．第３７３７頁〜第３７４１頁　１９７８年
版に記載されている。）。一方マウスのｍＦｉＧＦ遺伝
子の構造（１６５塩基対）を決定されている（文献Ａ、
　Ｇｒａｙ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ、　ｖｏｌ
、　３０３．第７２２頁〜第７２５頁１９８３年版に記
載されている。）。

本髭明では、ｍＥＧＦのＮ末端側にβ−ラクタマーゼの
シグナルペプチドが接続した構造を有する融合型遺伝子
を何本かのオリゴヌクレオチドの断片に分けて有機化学
的に合成する。この際シグナルペプチドのＮ末端のさら
に上流側にＳＤ配列と制限酵素認識部位をまた一方ｍＥ
ＧＦのＣ末端には翻訳停止シグナルともう一つの制限酵
素認識部位とを連結してトリプトファンプロモーターお
よび遣 選択マーカーとしてアンピシリン耐性透伝子を保持する
発現ベクターに容易に組み込めるようにしたＯ 合成したオリゴＤＮＡ断片から出発し、融合遺伝子全体
を組み上げるための、末端リン酸化、アニーリング、Ｄ
ＮＡ！Ｊガーゼによる連結等の反応はすべで常法憂こ従
って行なった。

このようにして、β−ラクタマーゼのシグナルペプチド
によりｍＢＯＦの菌体外分泌が可能な組換免 え体ｘＡ鍬ベクター：　ＰＴＲＥＧＦｌを作成した。

１２）　　プロテアーゼｌシグナルペプチド遺伝子とｍ
Ｅ（３Ｆ遺伝子との融合遺伝子の場合について第２図に
より説明する。

図において、プロテアーゼｌ遺伝子中のシグナルペプチ
ド相当領域の塩基配列（６９塩基対）はすでに決定され
ている（文献Ｐ、　Ｗ、　Ｆ　１ｎｃｈ　ｅｔ　ａｌ。

Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　ｖｏ
ｌ、　１４．　Ａｌ１．第７６９５頁−＠７７０３頁　
１９８６年版に記載されている。）ので、これを有機化
学的に合成の後、（１）で説明したと同様にまず有機化
学合成したｍＥＧＦ遺伝子と連結し、次いで、発現ベク
ターに連結してプロテアーゼ■のシグナルペプチド番こ
よりｒ＋ＪＧＦの菌体外分泌が可能な組換え体発現ベク
ター：ＰＴＲｇＧＦ２を作製した。

３、形質転換 上記１で得た形質転換用人ｓｌ菌２００ｍ１！、　　上
記２で得た組み換えベクター（２０ｍ５Ｊ／ｒｌｌ　）
　１０　ｒｎｌ。

３　ｍＪ　（Ｄ　ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｏｌｆｏｘｉｄ／
を混合し氷水中に３０分間置く。次に４２℃、３０秒間
ヒートシップクを加える。次にＬＢ培地５ｍｌ！（アン
ピシリン入り、５０　＋ｌ／ｍｌ　）を加え３７°Ｃ中
で６０分間静置する。この溶液３００　ｍｌ！をＬＢプ
レート（ＬＢ培地、寒天１．５％、アンピシリン５０　
ｍ’ｉ／ＩｒＬｌ　）で−晩培養する。このようにＰＴ
ＲｇＧＦｌ、　　あるいはＰＴＲｇＧＦ２を保持する組
み換え体大腸菌を得ることができた。

３、大腸菌によるｍＥＧＦの生産について述べる。

形質転換した大腸菌の保存菌株の１白金耳を３ｒＩＬｌ
！のＭ９培地（ＮＨ４Ｃｌ　　ＩＦ、Ｎａ２ＨＰＯ４６
ｙ。

ＫＨ２ＰＯ４３ｙ、　ＮａＣｌ　　Ｏ，５り＊　Ｃａ　
ＣＩ２　”　２Ｈ２００，０１５）、ＭｇＳＯ４・７Ｈ
２００，１ｇ、　　カザミノ酸２．５ｙ、グルコース　
５ｇ、チアミン　０．ＩＬｉ、プロリン　Ｉｓ’、７：
ｚビシ’）：／　　５０ｍ＆、　水　ｔＪ、ＰＨ７，４
）に接種し、３７℃で一吃振魚培養した。次いで、本培
養液２ｍｌを上記組成の３８ｒＩＬ！！のＭ９培地に接
種し、３７℃で４時間振盪培養した。培養終了後培養液
より菌体を集菌、除去した。

ＲＲＡは次のように実施した。マウス肝ミクロゾーム分
画Ｑ、２ＷＬＪに標準ｍｇＧＦまたは検体０．１ｍ１ｆ
ｊと１３１１　ｆａｌｌ　Ｍｌ　ｍ　ｇＧＦ　０．１　
ｍ　ｐを加え攪拌後、室温で９０分間反応させＥＧＦレ
セプターに対する準ｒｒ＋ＦＪＧＦまたは検体と１３１
１標諏ｍＥＯＦとの競合的結合反応を完了させた。次い
で、４℃、６０００Ｇで５分間遠心分離し、上清を吸引
除去した後、沈澱中に含まれるレセプターと結合した１
３１工標識ｍｇＧＦの放射活性を測定し、液体中のｍｇ
ＧＦを定量した。

５、　マウス体内への投与 ｍＥＧＦ発現ベクターで形質転換したマウス由来の大腸
菌をＭ９培地で培養し対数増殖期の菌体を儂 ストレスが与えられた胃（１１［蕩マウスに数μｌ−数
ｒｎｌに分けて投与する。投与方法は経口、肛門から行
う。

なお、本発明による生体とは、哺乳類１両生類。

は虫類を含むものとし、個体とは生体の個々のもの、す
なわち特定の生体を指す場合に用いる。例えば、マウス
でありでも、１匹１匹はそれぞれ異なる生体である。こ
のような生体の個々のものを特定して個体として扱われ
る。また、本発明で用いる治療とは、疾病を予防、また
は治療すること、および健康増進を図ることを総て含ん
で使用するものである。

〔発明の効果〕

本発明によれば、従来のように目的物質を精製すること
なく、また生体内への投与においても、数回に分けて投
与する必要がなく、最初に１回投与するだけで効果を得
ることができる。また同じ物質を生成するのに、従来の
ように最初から菌の増殖、破砕、抽出、目的物質の精製
等の多段階の複雑な操作を行なう必要がな（、ただ単に
形質転換した菌の増殖を行なうだけで同等な効果が得ら
れる。さらに、多段階の複雑な操作を行なう必要がない
ため経済的にも従来法よりも優位であり、安全性の確保
が図れる等の効果がある。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の一実施例の蛋白質の分泌型発現ベクタ
ーの作製手順を示す説明図、＄２図は同じく蛋白質の分
泌型発現ベクターの他の作製手順を示す説明図である。 ｇｌ・・・・・・制限酵素１、Ｅ２・・・・・・制限酵
素２、Ａｍｐ・・・・・・アンピシリン耐性遺伝子、Ｐ
ｔｒｐ・・・・・・　トリプトファンプロモータ 代理人　弁理士　　小　川　勝　男 オＺ図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、生体と共生関係にある微生物を生体内から取り出し
   、該取り出した微生物を形質転換後、生体内に投与する
   ことを特徴とする微生物の利用方法。 ２、生体と共生関係にある微生物を生体内から取り出し
   、該取り出した微生物を遺伝子操作によって作製された
   有用物質分泌型のベクターで形質転換後、生体内に投与
   することを特徴とする微生物の利用方法。 ３、生体と共生関係にある微生物を、疾病の原因物質を
   除去したり、あるいは治療効果のある微生物に形質転換
   し、該形質転換した微生物を生体内に投与することを特
   徴とする微生物の利用方法。 ４、個体と共生関係にある微生物を個体内から取り出し
   、該取り出した微生物を遺伝子操作によって作製された
   有用物質分泌型のベクターで形質転換後、個体内に投与
   することを特徴とする微生物の利用方法。 ５、生物内で共生関係にある口内菌、腸内菌を取り出し
   、遺伝子操作によって作製された有用物質分泌型のベク
   ターで各菌を形質転換後、生体内に投与することを特徴
   とする微生物の利用方法。 ６、疾病を治癒する能力を有する物質の遺伝子、あるい
   は活性化させる能力を有する物質の遺伝子を、有用物質
   を分泌する能力を有するベクターに組込み、それを用い
   て疾病中の生体と共生関係にある微生物の形質転換を行
   ない、生体内に投与することを特徴とする微生物の利用
   方法。 ７、有用物質をコードする遺伝子が組込まれ、また該有
   用物質を産出する能力を持つベクターで形質転換を行な
   うことを特徴とする請求項第１、又は請求項第２、又は
   請求項第３、又は請求項第４、又は請求項第５、又は請
   求項第６記載の微生物の利用方法。 ８、有用物質をコードする遺伝子と、その遺伝子の上流
   にβ−ラクタマーゼ、又はアルカリ性フォスファターゼ
   、又はプロテアーゼIII等のシグナルペプチドのいずれ
   か所望のものをコードする遺伝子とが組込まれた有用物
   質を菌体外に分泌させる能力を持つベクターで形質転換
   を行なうことを特徴とする請求項第１、又は請求項第２
   、又は請求項第３、又は請求項第４、又は請求項第５、
   又は請求項第６記載の微生物の利用方法。 ９、治療対象の生体と共生関係にあって、形質転換によ
   り微生物を生成することを特徴とする微生物の生成方法
   。 １０、治療対象の生体と共生関係にあって、形質転換さ
   せたことを特徴とする微生物。 １１、治療対象の生体と共生関係にあっ手、形質転換後
   生体内に投与された微生物の増殖速度が遅いことを特徴
   とする微生物。 １２、有用物質をコードする遺伝子と、その遺伝子の上
   流にβ−ラクタマーゼ、又はアルカリ性フォスファター
   ゼ、又はプロテアーデIII等のシグナルペプチドのいず
   れか所望のものをコードする遺伝子とが組込まれた有用
   物質を菌体外に分泌させる能力を持つベクターで、治療
   対象の生体と共生関係にある微生物を形質転換させるこ
   とを特徴とする微生物。