JPS63251084A - 新規化合物、その製法及びそれを含む医薬組成物 - Google Patents
新規化合物、その製法及びそれを含む医薬組成物Info
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- JPS63251084A JPS63251084A JP63053424A JP5342488A JPS63251084A JP S63251084 A JPS63251084 A JP S63251084A JP 63053424 A JP63053424 A JP 63053424A JP 5342488 A JP5342488 A JP 5342488A JP S63251084 A JPS63251084 A JP S63251084A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
〔産業上の利用分野〕
本発明は新規ハイブリッド酵素、それらの生産方法、そ
れらを含む薬剤組成物、および血栓症の治療におけるそ
れらの使用に関する。 〔従来の技術〕 欧州特許第０１５５３８７号明細書は２本鎖プロテアー
ゼの一方の鎖が異なる２本鎖プロテアーゼの１つの鎖、
または同一プロテアーゼの同−鎖に連結されたものから
成る線維素溶解作用を有するハイブリッドタンパク質（
ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃａｌｌｙａｃｔｉｖｅ ｈｙ
ｂｒｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ）を開示しており、そのハ
イブリッドタンパク質の少なくとも１つの鎖は線維素溶
解活性プロテアーゼだ由来し、それによりそのハイブリ
ッドタンパク質は線維素溶解作用にとって必要不可欠な
触媒部位（任意に除去可能な遮断基で遮断されてもよい
）を有する旨記載されている。 ハイブリッドタンパク質の例には組織型プラスミノーゲ
ン活性化因子（ｔ−ＰＡ ） Ｂ鎖またはウロキナーゼ
Ｂ鎖に連結されたプラスミンＡ鎖が含まれる。 ハイブリッドタンパク質は一方のプロテアーゼの１つの
鎖と他方のプロテアーゼの１つの鎖とを。 場合により透析しながら、酸化条件下で混合することに
よシ作られる。 別法として、ハイブリッドタンパク質はそれぞれのタン
パク質の遺伝情報（ＤＮＡ配列）を取得し、それを切断
および連結してハイブリッドタンパク質をコードする新
しいＤＮＡ配列を作製し、そしてそのＤＮＡを原核細胞
または真核細胞宿主中で発現させることによシ作られる
。 プラスミノーゲン活性化因子酵素ｔ−ＰＡおよびウロキ
ナーゼを構成するアミノ酸の配列、ならびにその酵素を
コードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列は知られている
〔ペニカ（Ｐｅｎｎ１ｃａ ） ラ、１９８３ ； Ｎ
ａｔｕｒｅ、３０１，２１４および欧州特許第００９２
１８２−Ａ号明細書を参照されたい〕。 プラスミンは１本鎖前駆物質プラスミノーゲンを特定の
内部ペプチド結合で切断することによシ得られる２本鎖
セリンプロテアーゼである。ヒトプラスミノーゲンのア
ミノ酸配列は既知である〔ライマン（Ｗｌｍａｎ ）お
よびクオルターズ（Ｗａｌ−ｔｅｒｓ ）、１９７５
＊ Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、５０＊４８９〜４９
４および５８，５３９〜５４７ ；ライマン、 １９７
７ｓＥｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃ−ｈｅｒｎ、７６ ＋ １２
９〜１３７ ；ソトルプーイエンセン（５ｏｔｔｒｕｐ
−Ｊｅｎｓｅｎ ）ら、１９７８ 、線維素溶解および
血栓溶解（Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｒ
ｏｍｂｏｌｙｓｉｓ ）Ｖｏｌ、Ｌ１９１〜２０９ ｅ
ラベンプレス、ニューヨーク；ならびにソトルプーイエ
ンセンら、 １９７８ 、タンパク質配列および構造
の図表集（Ａｔ１ａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔ−ｅｌｎ ５ｅ
（ｌｕｅｎｃｅ ａｎｄ ５ｔｒｕｃｔｕｒｅ ）Ｖｏ
ｌ、５ｓＳｕｐＰ１，３ｓｐ、９１．国立生物医学研究
協会、シルバースプリング、メリーランド州を参照され
た込〕。ヒトプラスミノーゲンのアミノ酸残基２７２〜
７９０をコードする部分ヌクレオチド配列もすでに開示
されている〔マリノウスキー（ＭａｌｉｎｏｗｓｋＬＤ
、Ｐ、 ）ら、１９８４ 、 Ｂ１ｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
７，２３．４２４３〜４２５０を参照されたい〕。ヒト
プラスミノーゲンの切断部位は
れらを含む薬剤組成物、および血栓症の治療におけるそ
れらの使用に関する。 〔従来の技術〕 欧州特許第０１５５３８７号明細書は２本鎖プロテアー
ゼの一方の鎖が異なる２本鎖プロテアーゼの１つの鎖、
または同一プロテアーゼの同−鎖に連結されたものから
成る線維素溶解作用を有するハイブリッドタンパク質（
ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃａｌｌｙａｃｔｉｖｅ ｈｙ
ｂｒｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ）を開示しており、そのハ
イブリッドタンパク質の少なくとも１つの鎖は線維素溶
解活性プロテアーゼだ由来し、それによりそのハイブリ
ッドタンパク質は線維素溶解作用にとって必要不可欠な
触媒部位（任意に除去可能な遮断基で遮断されてもよい
）を有する旨記載されている。 ハイブリッドタンパク質の例には組織型プラスミノーゲ
ン活性化因子（ｔ−ＰＡ ） Ｂ鎖またはウロキナーゼ
Ｂ鎖に連結されたプラスミンＡ鎖が含まれる。 ハイブリッドタンパク質は一方のプロテアーゼの１つの
鎖と他方のプロテアーゼの１つの鎖とを。 場合により透析しながら、酸化条件下で混合することに
よシ作られる。 別法として、ハイブリッドタンパク質はそれぞれのタン
パク質の遺伝情報（ＤＮＡ配列）を取得し、それを切断
および連結してハイブリッドタンパク質をコードする新
しいＤＮＡ配列を作製し、そしてそのＤＮＡを原核細胞
または真核細胞宿主中で発現させることによシ作られる
。 プラスミノーゲン活性化因子酵素ｔ−ＰＡおよびウロキ
ナーゼを構成するアミノ酸の配列、ならびにその酵素を
コードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列は知られている
〔ペニカ（Ｐｅｎｎ１ｃａ ） ラ、１９８３ ； Ｎ
ａｔｕｒｅ、３０１，２１４および欧州特許第００９２
１８２−Ａ号明細書を参照されたい〕。 プラスミンは１本鎖前駆物質プラスミノーゲンを特定の
内部ペプチド結合で切断することによシ得られる２本鎖
セリンプロテアーゼである。ヒトプラスミノーゲンのア
ミノ酸配列は既知である〔ライマン（Ｗｌｍａｎ ）お
よびクオルターズ（Ｗａｌ−ｔｅｒｓ ）、１９７５
＊ Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、５０＊４８９〜４９
４および５８，５３９〜５４７ ；ライマン、 １９７
７ｓＥｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃ−ｈｅｒｎ、７６ ＋ １２
９〜１３７ ；ソトルプーイエンセン（５ｏｔｔｒｕｐ
−Ｊｅｎｓｅｎ ）ら、１９７８ 、線維素溶解および
血栓溶解（Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｒ
ｏｍｂｏｌｙｓｉｓ ）Ｖｏｌ、Ｌ１９１〜２０９ ｅ
ラベンプレス、ニューヨーク；ならびにソトルプーイエ
ンセンら、 １９７８ 、タンパク質配列および構造
の図表集（Ａｔ１ａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔ−ｅｌｎ ５ｅ
（ｌｕｅｎｃｅ ａｎｄ ５ｔｒｕｃｔｕｒｅ ）Ｖｏ
ｌ、５ｓＳｕｐＰ１，３ｓｐ、９１．国立生物医学研究
協会、シルバースプリング、メリーランド州を参照され
た込〕。ヒトプラスミノーゲンのアミノ酸残基２７２〜
７９０をコードする部分ヌクレオチド配列もすでに開示
されている〔マリノウスキー（ＭａｌｉｎｏｗｓｋＬＤ
、Ｐ、 ）ら、１９８４ 、 Ｂ１ｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
７，２３．４２４３〜４２５０を参照されたい〕。ヒト
プラスミノーゲンの切断部位は
【ソトルプーイエンセン
ら、１９７８ｅＡｔｌａｓ ｏｆ ＰｒｏｔｅｉｎＳｅ
ｑｕｅｎｃｅ （前掲）に記載のアミノ酸配列ナンバリ
ングに従えば〕残基ａｒｇ −５６０とＶａｌ −５６
１の間に存在する。２種類のプラスミノーゲンが同定さ
れた〔カステリノ（Ｆ、Ｊ、Ｃａ５ｔｅｌｌｉｎｏ＊Ｃ
ｈｅｍｉｃ１１本明細書において、プラスミノーゲンに
関する記述はこれらの両方の種類を包含するものである
。 最近、完全なヌクレオチド配列が開示された〔フォース
ケルン（Ｆｏｒｓｇｒｅｎ＋Ｍ、 ）ら、 １９８７
。 ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２１３．２５４〜２６０を
参照され之い〕。 そのヌクレオチド配列はＡ鎖のＮ末端付近に１以前に報
告されなかった追加のインロイシン残基が存在すること
を予告している。この発見は独立して確認された〔マク
リーン（ＭｃＬｅａｎ＊Ｊ、Ｎ、 ）ら、１９８７ 、
Ｎａｔｕｒｅ ３００．１３２〜１３７を参照された
い〕。 従って、以下のアミノ酸配列ナンバリングはすべて追加
のイソロイシンを考慮に入れである。このナンバリング
方式ではプラスミノーゲンの切断部位がａｒｇ −５６
１とｖａｌ −５６２の間に存在する。 〔発明が解決しようとする課題〕 今や、新しい種類の線維素溶解活性ハイブリットタンバ
ク質が、見出されプヒ。 本発明によれば、ｍ織型プラスミノーゲン活性化因子お
よびウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子から選ば
れるプラスミノーゲン活性化因子のＢ鎖に連結されたプ
ラスミンのＡ鎖から成る線維累溶解活性ハイブリッド酵
素であって、前記の鎖同士がプラスミノーゲンの切断部
位を含むアミノ酸配列を介してペプチド結合により連結
されることを特徴とする前記ハイブリッド酵素が提供さ
れる。 〔課題を解決するための手段〕 ９Ｂ＠１なる用語は、プラスミノーゲン活性化因子の機
能的活性中心を含むＢ鎖の少なくともその部分を意味す
ることが理解されるだろう。 本明細書で用いる組織型およびウロキナーゼプラスミノ
ーゲン活性化因子なる用語は、１９８２年７月２７日に
イタリー国ベルガモで開ｉされた「血栓症およびうつ血
症に関する国際委員会」の第Ｘ追１ミーティングにおい
て、ｔ−ＰＡまたはｕ−ＰＡについてそれぞれ定義され
た免疫学的性質を有する群のプラスミノーゲン活性化因
子を意味する。 ま７）、、 ｔ−ＰＡおよびウロキナーゼなる用語は
、例えばＷＯ８６／ ０１５３８寸たけ欧州特許第０１
９９５７４号明細８ ［Ｃ記載されるようなそれらの突
然変異タンパク質をも包含することが理解されるであろ
う。 好適な間知おいて、連結配列はプラスミノーゲンのアミ
ノ酸残基５６２−５６６ 、より好ましくは残基５６２
−５７２から成る。 他の好適な面において、プラスミノーゲン活性化因子は
ｔ−ＰＡである。 プラスミノーゲン活性化因子がｔ−ＰＡである場合、そ
の連結配列はまた任意にｔ−ＰＡの切断部位、特にｔ−
ＰＡのアミノ酸残基２７３−２７５ ’ｉ７含んでいて
もよい。 本発明の・・イブリッド酵素は例えば以下に示す既知の
プラスミノーゲン活性化因子含有複合体に類似した薬学
的に有用な複合体をもたらすよう誘導しうる： （ａ） 酵素−タンパク質複合体、ここで線維素溶解
作用に重要な働きをする酵素の触媒部位が可逆的な連結
基によってそれに結合されたヒトタンパク質により遮断
される、欧州特許出願第０１５５３８８号明細書参照； ら）酵素−タンパク質複合体、少なくとも１つの任意に
遮断され九線維素溶解酵素が線維素溶解作用に関与する
触媒部位以外の部位によって少なくとも１つのヒトタン
ノぐり質に連結される、欧州特許出願第０１５２７３６
号明細書参照；（ｅ） タンパク質−ポリマー複合体
、薬学的に有用なタンパク質が可逆的連結基によって少
なくとも１つの水浴性ポリマーに連結される、欧州特許
出願第０１８４３６３号明細書参照；または（ｄ）
酵素複合体、複数の線維素溶解酵素が除去可能な遮断基
によってそれらの活性中心を介して一緒に連結される、
欧州特許出願第０１８４３６３号明細書参照。 本発明のハイブリッド酵素は上記複合体の酵素成分′ｆ
：九は（ヒト）タンパク質成分とＬ７て天然プラスミノ
ーゲン活性化因子の代わり１ｃ使用することができる。 本発明のハイブリッド酵素またはその複合体はさらに、
線維素溶解作用にとって必要な触媒部位が除去可能な遮
断基によって遮断されるように誘導しうる。 ハイブリッド酵素の上記誘導体は、ノヘイブリツド酵素
それ自体について以後で述べる方法および組成物におい
て使用することができる。 本明細書で用いる１除去可能な遮断基”なる表現は、加
水分解の擬−次速度定数がｐＨ７，４の等張水性媒体中
３７℃で１０’／秒〜１０″２／秒の範囲であるような
速度で加水分解により除去できる基を包含する。このよ
うな遮断基は欧州特許第０００９８７９号明細書に記載
されておシ、任意に置換されたベンゾイル基または任意
に置換されたアクリロイル基のようなアシル基が含まれ
る。ベンゾイル遮断基に適した任意の置換基はハロゲン
、Ｃｍ−ａアルキル、Ｃｍ−６アルコキシ、Ｃ＋−ａア
ルカノイルオキシｓ Ｃ１□６アルカノイルアミノ、ア
ミン、ジメチルアミノまたは。ｐ−グブニジノなどであ
る。了クリロイル遮断基に適した任意置換基はＣｍ−６
アルキル、フリル、フェニルまたＶｉＣトａアル中ルフ
ルフェニルである。 別の面において１本発明はハイブリッド酵素をコードす
るＤＮＡを組換え宿主細胞中で発現させ、次すでその酵
素産物を回収することから成る本発明ハイブリッド酵素
の生産方法を提供する。 ハイブリッド酵素をコードするＤＮＡの作製は慣用の遺
伝子工学的手法を用りて実施され、そしてそのαＵ、は
原核または真核細胞宿主（好ましくは真核細胞宿主）中
で発現される。 ハイブリッド酵素をコードするヌクレオチド配列から成
るＤＮＡポリマーも本発明の一部を構成する。 本発明方法はマニアケス（Ｍａｎｌａｔｉｇ ）う、モ
レキュラークローニング： 実験ｘマニュアル、コール
ド・スプリング・ハーバ−，１９８２に記載されるよう
な慣用の組換え技術を周込て実施できる。 よシ詳細には、本方法は １）宿主細胞中で、前記ハイブリッド酵素をコードする
ヌクレオチド配列から成るＤＮＡポリマーを発現しうる
複製可能な発現ベクターを作製し；肋 該ベクターによ
り宿主細胞を形質転換し；１１１）形質転換した宿主細
胞を前記）抗ポリマーを発現させる条件下で培養して前
記ハイブリッド酵素を生産させ；そして ＋Ｖ） 前記ハイブリッド酵素を回収する諸工程から
成っている。 本発明はまた適当なモノ−、ジーまたはオリゴマー×ク
レオチド単位を縮合させることによるＤＮＡポリマーの
作製方法を提供する。 その作製方法は化学的に、酵素的に、ま九は２つの方法
の組合せにより、 ｉｎ ｖｉｔｒｏもしくは１ｎｖ
ｉｖｏで適宜に実施される。こうして、 ＤＮＡポリマ
ーはロバーツ（Ｄ、Ｍ、Ｒｏｂｅｒｔｓ ）ら、Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２４．５０９０〜５０９８．１９８
５に記載されるような慣用方法を用いて、適当なりＮＡ
、フラグメントの酵素的連結反応によシ作ることができ
る。ＤＮＡフラグメントは必要なヌクレオチド配列を含
むＤＮＡの適当々制限酵素による消化、化学的合成、酵
素的重合、またはこれらの方法の組合せにより得られる
。 制限酵素による消化は適当な緩衝液中で２０〜７゜℃の
温度において、一般には５０ ｔｔｌ以下の容量にて、
０．１〜１０瀞のＤＮＡを用いて行、われる。 ＤＮＡの酵素的重合は必要に応じてヌクレオシド三リン
酸ｄＡＴＰ 、 ｄＣＴＰ 、 ｄＧＴＰおよびｄ Ｔ
ＴＰを含む適当な緩衝液中で１σ〜３７℃の温度におい
て、一般には５０ Ａｌ以下の容量にて、良９．ポリメ
ラーゼＩ（フレノウ断片）のようなりＮＡポリメラーゼ
を用いてｉｎマｉ ｔｒｏで行われる。ＤＮＡフラグメ
ントの酵素的連結は適当な緩衝液中で４℃から周囲温度
までの温度において、一般には５０μノ以下の容量にて
、Ｔ ４ ＤＮＡリガーゼのようなりＮＡリガーゼを用
いて実施される。ＤＮＡポリマーまたはフラグメントの
化学的合成は慣用のホスホトリエステル、ホスファイト
またはホスホルアミダイト化学によシ、例えば”遺伝子
断片の化学的および酵素的合取−実験室マニ瓢アル１（
ガラセン（Ｈ，Ｇ、Ｇａ５ａｅｎ ）およびラング（Ａ
、Ｌａｎｇ ）編集、フェアラグ・ケミ−、ワインハイ
ム（１９８２） ）に記載されるような固相法を用いて
、あるいはゲイ） （Ｍ、Ｊ、Ｇａ１ｔ ）、マテス（
Ｈ，Ｗ、Ｄ、Ｍａｔｔｈｅａ ）、シンＣＭ、Ｓｉｎｇ
ｈ ）、スプロート（Ｂ、Ｓ、５Ｐｒｏａｔ ）および
チトｆｆ ’Ｘ （Ｒ，Ｃ。 Ｔｌｔｍａｓ ）、Ｎｕｃｌｅｉｅ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ
５ｅａｒｃｈ ＃ １９８２ ｅ １０６２４３
； ＊ブロードおよびバンワー’Ｘ （Ｗ、Ｂａｎｎｗ
−ａｒｔｈ ）、Ｔａｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅ
ｒｓ ｅ １９８３ ｍ ２４ ｅ５７７１ ｓ マテ
ツチ（Ｍ、Ｄ、Ｍａｔｔｅｕｃｃｆ ）およびカルサー
ズ（Ｍ、Ｈ，Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ ） ｓ Ｔｅｔｒａ
ｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ−ｅｒｓ ｔ １９８０ ｍ
２１ １７１９；ｒチッチおよびカルサーズ、Ｊｏ
ｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅ
ｍｉｃａｌＳｏｃｉｅｔｙ、１９８１，１０３，３１８
５ ；アダムス（Ｓ、Ｐ。 Ａｄａｍｓ ）らｓ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ
Ａｍｅｒｉｃａｎ ＣｈｅｍｉｃａｌＳｏｃｉｅｔｙ
ｓ １９８３ 、１０５ 、６６１ ；シンハ（Ｎ、Ｄ
、５ｉｎｈａ ）ピアナツト（Ｊ、Ｂｉｅｒｎａｔ ）
、マクマナ″Ｒ，（Ｊ、ＭｃＭａｎｎｕｓ＋ ）および
ケスター（Ｈ，Ｋｏｅｇｔｅｒ ）、Ｎｕ ｃ １−ｅ
ｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、１９８４，１２
，４５３９ ：およびマテスら、ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａ
ｌ、１９８４，３＋８０１のような他の科学文献に記載
される方法を用いて実施される。 好適な態様にお−て、プラスミンＡ鎖およびプラスミノ
ーゲンの切断部位を含むアミノ酸配列をコードするヌク
レオチド配列から成るＤＮＡ分子は、プラスミノーゲン
遺伝子を含むベクターを制限酵素ＢａｔＭで消化するこ
とにより得られる。この消化は２つのＤＮＡフラグメン
トをもたらし、これらのフラグメントは一緒になって残
基１−５７０をコードし且つ残Ｗ ５７１および５７２
を部分的にコードするフラグメント（１）を与える： ３１・・・ＧＧＴ Ｇ ｐｒｏ ｈｉｓ ｍ＠ｒ このＤＮＡフラグメント（１）はプラスミノーゲン活性
化因子Ｂ鎖をコードするＤＮＡ配列から成るＤＮＡ分子
に、その分子に適当な接着末端が存在する場合は直接連
結され、またはＢｓｔＭ接着末端を与えるように考案さ
れたオリゴヌクレオチドリンカーを介して連結される。 プラスミノーゲン活性化因子がｔ−ＰＡであるとき、ｔ
−ＰＡＢ鎖をコードするＤＮＡ分子は、ｔ−ＰＡｅＤＮ
Ａの必要な部分を含むベクター （例えば、欧州特許出
願第０２０７５８９号明細９に記載されるベクターｐＴ
ＲＥ２４ ）を制限酵素Ｄｄ＠１およびＸ１ｘｏ Ｈで
消化す、ることにより得られる。この消化はｔ−ＰＡの
残基２７４−５２７ （Ｃ末端残基）をコードし且つ残
基２７２および２７３を部分的にコードする罠フラグメ
ント（ＩＩ）をもたらす： ｄｅ １ ↓ ５’ Ｔ ＣＡＧ ＴＴＴ・・・ コード鎖３
’ Ｃん錆・・・ ↑ ｈｅ フラグメント（１）とフラグメント（ＩＩ）を連結する
ための適当なオリゴヌクレオチドリンカーは次の構造（
１）を有する： ３’ ＴＡ ＡＧＴ ＴＣＧ ＡＡＴ ＣＴＡ ＧＡＡ
ＧＴ （ＩＩＩ）フラグメント（１）を与え
るＤＮＡフラグメントと、フラグメント（ＩＩ）および
（１■）との連結は所望により逐次的にまたは同時に実
施されて、ハイブリッド酵素を発現するＤＮＡ分子をも
たらす。 フラグメント（１） 、 （ＩＮ）および（ＩＩＩ）の
連結部位のＤＮＡ配列、ならびにその結果としてのアミ
ノ酸配列は次の通りである： ・・・ＣＣＡ ＣＡＴ ＴＣＡ ＡＧＣＴＴＡ ＧＡＴ
ＣＴＴ ＣＡＧ・・・・・イ：；ＧＧＴ ＧＴＡ Ａ
ＧＴ ＴＣＧ ＡＡＴ ＣＴＡ ＧＡＡ ＧＴＣ・・・
５７０５７１５７２ ｋ ｋ ＊ １１ ２７
３ｐｒｏ Ｈｌｓ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｌｅｕ ＡｓＰ
Ｌｅｕ Ｇｌｍ−印を付けたアミノ酸はオリゴヌクレオ
チドリンカーフラグメン） （ＩＩＩ）を組み入れた結
果として存在する。アミノ酸５７０−５７２はプラスミ
ノーゲンの残基１−５７２から成るペプチド配列の末端
残基である。アミノ酸２７３はｔ−ＰＡの残基２７３−
５２７から成るペプチド配列のＮ末端残基である。従っ
て、このＤＮＡ分子により発現される／１イブリッド酵
素はプラスミノーゲンの切断部位（残基５６１と５６２
の間）とｔ−ＰＡの切断部位（残基２７５と２７６の間
）の両方を含むことが明らかであるだろう。 組換え宿主細胞によるハイブリッド酵素をコードするＤ
ＮＡ配列の発現は、この宿主細胞中でそのＤＮＡポリマ
ーを発現しうる複製可能な発現ベクターを用いて実施さ
れる。その発現ベクターは新規であり、これもまた本発
明の一部を構成する。 複製可能な発現ベクターは、宿主細胞と適合しうるベク
ターを切断して完全なレプリコンを有する線状ＤＮＡセ
グメントを得５次いでこの線状セグメントとハイブリッ
ド酵素をコードするＤＮＡ配列とを連結することによシ
、本発明に従って作製できる。線状セグメントとＤＮＡ
分子またはそのフラグメントとの連結は所望によυ同時
にまたけ逐次的に行われる。 ベクターの選択は宿主細胞（原核または真核細胞であり
うるが、真核細胞が好ましい）によって一部が決定され
るだろう。適当なベクターにはプラスミド「バクテリオ
ファージ、コスミドおよび組換えウィルスが含まれる。 複製可能な発現ベクターの作製は、例えばマニアチスら
の上記文献に記載される方法によシ、ＤＮＡの制限、重
合および連結用の適当な酵素を用いて慣例的に行われる
。制限、重合および連結は良０．ポリマーの作製につい
て上述したように実施しうる。 組換え宿主細胞は形質転換条件下に宿主細胞を本発明の
複製可能な発現ベクターで形質転換することによシ、本
発明に従って作ることができる。 適当表形質転換条件は、例えばマニアチスらの上記文献
または’ ＤＮＡクローニング１、グローバー（ＤｏＭ
、Ｇｌｏｖｅｒ ）編集、ＩＲＬプレスリミテッド、１
９８５に記載されており、慣例的である。 形質転換条件の選択は宿主細胞により決定される。こう
して大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｔ ）のような細菌宿主はＣａ
Ｃ１＊溶液で処理する〔コーエン（Ｃｏｈｅｎ ）ら、
Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｅｔ、、１９７３ ｐ
６Ｌ２１１０ を参照〕か、あるいはＲｂＣ１，Ｍｎ
Ｃ１意、酢酸カリウムおよびグＩＪ−１＝ロールの混合
物から成る溶液で処理し、その後３−（Ｎ−モルホリノ
〕プロパンースルホン酸ＲｂＣｌおよびグリセロールで
処理する。哺乳動物細胞培養物は細胞上へのベクターＤ
ＮＡのカルシウム共沈によシ形質転換される。 本発明はまた本発明の複製可能な発現ベクターで形質転
換された宿主細胞にも及ぶ。 ＤＮＡポリマーの発現条件下での形質転換宿主細胞の培
養は、例えばマニアチスらの上記文献および先に引用し
た” ＤＮＡクローニング１に記載されるように、慣例
的に行われる。従って、好ましくは細胞は栄養分を供給
して４５℃以下の温度で培倭する。 発現産物は宿主細胞に応じて慣用方法によル回収される
。従って、宿主細胞が大腸菌のような細菌である場合は
、それを物理的、化学的または酵素的に溶菌して、得ら
れた溶菌液からタンパク質産物を分離する。宿主細胞が
哺乳動物細胞である場合は、一般に栄養培地から産物を
分離する。 ＤＮＡポリマーはハイブリッド酵素を発現する安定した
形質転換哺乳動物細胞株の単離用に考案されたベクター
、例えばウシ乳頭腫ウィルスベクターまたは増幅可能な
マーカーをもつベクター、中に挿入される（ ＤＮＡク
ローニング、ｖｏｌ、Ｕ ＊ Ｄ、？’４グローバー編
集、ＩＲＬプレス、１９８５ ；カウフマン（Ｋａｕｆ
ｍａｎｓ’Ｒ１Ｊ、 ）ら、分子および細胞生物学（Ｍ
ｏ１ｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅ１ｌｕｌａｒ Ｂｉｏ
ｌｏｇ７ ）、 ５．１７５０〜１７５９．１９８５
；バブラキス（Ｐａｖｌａｋｉｓ Ｇ、Ｎ、）およびハ
マー（Ｈａｍｅｒ ＠Ｉ）、）（、）、ナショナル・サ
イエンス・アカデミ−（ＵＳＡ ）の会報、８０ 、３
９７〜４０１．１９８３；ゴーデル（ＧｏｅｄｄｅＬＤ
、Ｖ、）ら、欧州特許出願第００９３６１９号明細書、
１９８３を参照されたい〕。 本発明に従って生産されたハイブリッド蓋素は、宿主細
胞て応じて、いろいろな程度にグリコジル化されること
が理解されるであろう。特に、ボール（Ｐｏｈｌ ）ら
、Ｂｉｏｅｂｅｍｉｓｔｒ７＋ １９８４ 、２３ ｅ
３７０１〜３７０７およびカステリノ（Ｃａ５ｔｅｌ
ｌｉｎｏｔＦ、Ｊ、 ）。 Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓｔｖｏｌ、８１．ｐ
、４３Ｌ１９８１により観察されたように、天然に存在
する非修飾ｔ−ＰＡおよびプラスミノーゲンにはそれぞ
れ異なる８度のグリコジル化が見られる。本発明のノー
イブリッド酵素はこのようなグリコジル化変異型も包含
するものである。 本発明のハイブリッド酵素は適当には薬剤組成物の形体
で投与される。 従って、本発明はさらに本発明のハイブリッド酵素を製
剤上許容される担体との組合せで含有してなる薬剤組成
物を提供する。 本発明組成物はヒトへの静脈内投与に適した薬剤組成物
として常法によシ処方される。 一般に、静脈内投与用の組成物は滅菌等張水性緩衝液中
に溶解した無菌酵素の溶液である。必要に応じて、本組
成物はハイブリッド酵素を溶解状態に保持するだめの可
溶化剤、および注射個所の痛みを和らげるだめの局所麻
酔剤（例えばリグノカイン）を含有しうる。一般に、ハ
イブリッド酵素は単位剤形、例えば活性単位のタンパク
質量を示す密封容器（例えばアンプルや小袋）中の乾燥
粉末または水不含濃縮物、として供給されるであろう。 ハイブリッド酵素が除去可能な遮断基を含む場合は、遊
離タンパク質の放出される時間が表示されるだろう。こ
のタンパク質を輸液にょ）投与する場合、それは薬品級
の滅菌１注射用水１または食塩水を含む輸液ぴんと共に
分与されるだろう。タンパク質を注射により投与する場
合は、それは注射用の滅菌水または食塩水のアンプルと
共に分与される。注射用または輸液用組成物は投与圧先
立って諸成分を混合することに↓り調製しうる。投与す
る物質の量は必要とされる線維素溶解の量および速度、
血栓塞栓症の程度および商魂の位置と大きさにより左右
されるだろう。使用する正確な用量および投与方式は、
病気の性質を考慮して、諸般の情況圧応じて主治医が決
定しなければならない。しかしながら、一般に血栓症を
治療すべき患者は０．０１〜１０ｍ９／に９ｃ体重）の
−日分の用量を注射（例えば５回以下）または輸液によ
り受は取るであろう。 本発明化合物は上記の投与量３，１用で毒性の副作用を
何ら示さない。 従って、本発明のさらに別の面では、患者に無毒性有効
量の本発明ハイブリッド酵素を投与することから成る血
栓症の治療方法が提供される。 本発明はまた治療用活性物質として、特に血栓症の治療
用として、使用するための本発明のＩ・イブリッド酵素
を提供する。 以下の実施例は本発明を例示するためのものである。 実施例１および２で使用する方法 ＤＮＡ切断 一般に、約１μｇのプラスミドＤＮＡまたはＤＮＡフラ
グメントの切断は約２０μでの適当な緩衝液中で約５単
位の制限酵素（１種または２種以上）を用いて行う。 連結反応はマニアチスら、モレキュラークローニンク：
実験室マニュアル、フールド・スプリング・ハーバ−・
ラボラトリ−，１９８２に記載のごとく実施する。ＤＮ
Ａ制限フラグメントの濃度はゲル（ゲル上ではＤＮＡ標
準も泳動させる）から視覚的に概算する。 形質転換 大腸菌ＤＨ５αおよびＨＢＩＯ】細胞のプラスミドＤＮ
Ａによる形質転換はマニアチスらの上記文献に記載され
る通りである。 プラスミドＤＮＡの大規模調製およびプラスミドのミニ
製表はマニアチスらの上記文献に記載されるように実施
する。 ＤＮＡ ７ラグメントはマニアチスらの上記文献に記載
されるようにして■アガロースゲルから分離する。 合成オリゴヌクレオチドはアプライド・バイオシステム
ズ３８１ Ａ ＤＮＡ合成機で、製造元の説明書に従っ
て製造する。 合成リンカ−はマニアチスらの上記文献に記載されるよ
うにギナーゼで処理してＤＮＡに連結する。 細胞の調製：細胞はＩ−＋７ブシン処理を行って、６０
■培ｉたり１０６個の細胞をまき、そして５％ＣＯ２／
９５チ空気の雰囲気の加湿インキ】−ベーター中で３７
°Ｃにおいて増殖培地（イーグル■虎中の１０％血清、
ペニシリン／ストレプトマイシンのｌｉ液；フローラ
ボラトリーズ社製、１チグルタミン、非必須アミノ酸の
］チ原液；フローラボラトリーズ社製）に−晩装置する
。 トランスフェクション法：使用したトランスフェクショ
ン法（カルシウム共沈）ハ”ＤＮＡり０−ニング’ Ｄ
、Ｍ、グローバー編集（１５章、Ｃ、ゴーマン）に記載
されている。グリセロールショックおよび１０ｍＭブチ
レート処理を使用する。 上塗層〔オーバーレイ）：イーグルＭＥＭ（ギブコ社製
）９５１ノ中の７ガロース（インデュビオースＡ３７）
２゜４ｇをブンゼン火炎中で融点まで加熱し、その後４
８℃に保持した水浴中に置く。フイブリノーゲ：／ （
２０ｍ９／ｄ ） ５．６ ｄをイーグルＭＵＭ （追
加のＮａＣＪ ７ ｍ９ ／ ｒｒｔｔを含有する）５
．６ｄで１ ： Ｉ Ｋ希釈し、氷上に保持する。イー
グルＢ１（追加のＮａＣ／不含）３．３ｄを公地して５
０ ＮＩＨ単位／ｍｌのウシトロンビン８６μｌを含む
ビジヨー（ｂｉｊｏｕ ）（氷上に保持）中に加える。 細胞はイーグルｈｍで３回洗って血清を除く。トロンビ
ンおよびフイプリノーゲンを水浴中で３７℃に温める。 アガロース９．５−を分取して予め温めておいたユニバ
ーサル（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ）に加える。その寒天に
トロンビンを加え、続いてフィブリノーゲンを加える。 ゲルを細胞層上に注ぎ％３７℃で溶解帯域が現れ志まで
インキュベーションする。 収獲二上記の上塗層に代わるものとして、細胞を無血清
培地中でス時間インキュベーションし、培地を回収して
ザイモグラフィ−（ｚｙｍｏｇｒａｐｈ７ ）により分
析する。 ヌクレオチドのナンバリングは全体を通して（１）肩文
字１ｐ１で示されるプラスミノーゲンについてはホース
グレン（Ｆｏｒｓｇｒｅｎ ）ら、ＩＩ’ｉ−：：ＩＦ
ＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２１３ 、２５４ （１９８
７） ；（ｉｌ）肩文字ｔｔｓで示されるｔ−ＰＡＩＣ
っ論てはぺ二力（Ｐｅｎｎ１ｅａ＊Ｄ、）ら、Ｎａｔｕ
ｒｅ ３０１ ＊ ｐ、２１４に記載のものに相当する
。 実施例１ １、 プラスミノーゲン： ｔ−ＰＡハイブリッドｃＤ
ＮＡ分子の作製 プラスミノーゲンｃＤＮＡクローンはマリノウスキー（
Ｍａｌ、ｉｎｏｗｓｋｉ ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ ２３ 、 ｐ。 ４２４３（１９８４）に記載される配列のヌクレオチド
４９−６８に対応する次の配列： ５ ’ ＣＣＣＣＴ ＣＡＣＡＣＡ ＣＡＴ ＡＡＣＡ
ＧＧ ３ ’のオリゴヌクレオチドプローブを用いてス
クリーニングした後に、ヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリー
から得られた。 プラスミノーゲンおよび関連した５′および３′非翻訳
領域をコードするｃＤＮＡクローンは、ＰＴＲＥＩ！ベ
クター（欧州特許出願第０２０１１５３号明細書参照）
のＨ１ｎｄＩ１１部位とＢｇｌ Ｔｉ部位の間にサブク
ロー、ニングしてプラスミドＰＴＲＨ５（第１図参照）
を作製し念。 プラスミノーゲンｃＤＮＡは２つのＢｓｔ ＸＩ認識部
位を有し、１つは”Ａ鎖’ （１２０９ｐ） にあう
、も５１ツバ’ Ｂａ ’ （１８４０Ｐ ）１７１ル
。 ｐＴｍ５をＢａｔ）ｆｆおよびＢｇｌ Ｕで切断して３
つのフラグメントを得た： （１）ベクターおよび約１．１５Ｋｂ のプラスミノ
ーゲンＡ ＠ ＤＮＡを含む６ 、４ＫｂのＢｇＪ Ｉ
Ｉ （ｃＤＮＡの３′末端に位置する） −Ｂｓｔ Ｍ
（１２０９ｐ）、′フラグメントＡ１； （１１）プロテアーゼ切断部位を含むプラスミノーゲン
Ａ鎖ＤＮＡの残部およびプラスミノーゲンＢ鎖の一部を
保有する６３０ｂＰのＢｓｔ Ｍ （１２０９ｐ−１８
４０ｐ）、１フラグメントＢｌ； （ＩＩ） Ｂ鎖の大部分をコードする７４０ ｂＩ）の
第３番目のフラグメント（Ｂｓｔ Ｍ、 １８４０Ｐ
−Ｂｇ）ＩＩ）は捨てた。 フラグメントＡおよびＢはアガロースゲルから精製し念
。 Ｂ鎖およびＡ鎖の３個のアミノ酸をコードする８００ｂ
ｐ （１００４ｔ−１８０５ｔ）Ｏｔ−ＰＡ７；ｙ／メ
７）（Ｃ）は、プラスミドルｎ侶２４（欧州特許出願第
０２０１１５３号明細書参照）をＤｄｅ １およびＸｈ
ｏ ＩＩで消化し、次いでアガロースゲル電気泳動にか
けることによシ分離した。 Ｂｓｔ Ｍ （１８４０ｐ）末端をＤｄｅ Ｉ （１０
０４ｔ）末端を連結する九めに、次の配列の２本の合成
オリゴヌクレオチドを使用した： ３ ） ５ ’ ＴＧＡＡＧＡＴＣＴＡＡＧＣＴＴＧ
ＡＡＴ ３１４＞ ５ ’ ＡＡＧＣＴＴＡＧＡＴＣ
Ｔ ３ ’これらのオリゴヌクレオチドは組み合わされ
たとき（フラグメントＤ）、ＨｌｎｄＩ［ＩとＢｇｌ
Ｉｆのための制限部位をもたらす： ここで接着末端ＸはプラスミノーゲンｃＤＮＡのＢｓｔ
Ｍ （１８４０ｐ）末端に相補的でアシ、そして接着
末端Ｙはｔ−ＰＡ ｃＤＮＡのＤｄｅ １ （１００４
ｔ）末端に相補的である。 ７ラグメントＡ、Ｂ、ＣおよびＤは連結させて、大腸菌
ＲＩＢ １０１． Ｋ形質転換した。アンピシリン耐性
コロニーを選択した。 これらの１つから分離したノ・イブリッドプラスミド（
ＰＴＲＨ７）の構造は、以下の制限酵素を使用する消化
によシ分析した： （１） Ｂｓｔ Ｍ、プラスミノー
ゲンＡ鎖に唯一である（この酵素はまた第２のＢｓｔＸ
１部位がその構築中に破壊されるとｂう点でハイブリッ
ドの検出に役立つ） 、 （ＩＩ） Ｓｓｔ Ｉ％ｔ
−ＰＡＢ鎖に唯一である。および（ｔｆｔ） ＢｇｌＩ
ＩおよびＨｌｎｄ ＩＩＩ （Ｈｇｌ！ ＩＩ ｈよび
Ｈ１Ｔ１ｄ１！の両部位はフラグメントＤによシ導入さ
れる）（第１図参照）。ハイブリッド遺伝子の構造は第
２図に示す通〕でおると考えられ、プラスミノーゲン／
１−ＰＡ接合個所の推定上のヌクレオチド配列およびア
ミノ酸配列は次の通シである： ｐｒｏ ｈｉｓ ｓａｒ ｓｅｒ’ ｌｅｕ’ ａｓｐ
” ｌｅｕ’ ｇｉｎ←プラスミノーゲン切断部位
ｔ−ＰＡ切断部位→８個のアミノ酸
２個のアミノ酸井印を付けたアミノ酸はフラグメント
Ｄを組み入れることにより挿入された。これらの左側の
アミノ酸はプラスミノーゲンに由来し、右側のアミノ酸
はｔ−ＰＡに由来する。 実施例２ 発現 Ａ）フィブリン／寒天上塗層 トランスフェクションしたＬ９２９細胞からのＰＴＲＨ
７の発現（トランスフェクションの２４時間後）は１方
法１のところで述べたフィブリン／アガロース上塗層の
手法を用すて検出した。溶解帯域はＰＴＲＨ７から得ら
れたが、空の親ベクターｐＴＲＥ１２ （欧州特許出願
第０２０１１５３号明細書に記載される）でトランスフ
ェクションした細胞からは得られなかった。 Ｂ）ザイモグラフイー ｐＴＲＨ７の一時的発現産物はトッド（Ｄｏｄｄ ）ら
、（１９８６）、′血栓症およびうつ血症１．□（１）
。 ９４に記載されるフイブリンザイモグジフイーによシ分
析した。見掛は分子量は推定構造と一致した。 実施例３ 細胞の調Ｍ ： １ＨｅＬａ細胞はトリプシン処理を行
って、５ｔ ％ ＣＯ！／ ９５９６空気の雰囲気の加
湿インキュベーター中３７℃において１゜４Ｘ１０’細
胞／−の密度で３Ｑｍ （１７５−フラスコ当たシ）の
増殖培地〔すなわち、１０％血清（０２１−６０１０）
、ペニシリン／ストレプトマイシンの１％原液（０４３
−５０７０）２チ炭酸水素ナトリウム溶液（０４３−５
０８０）、ｈ１チグルタｚｙ原液（０４３−５０３０）
を含むＨｏｐｅｓ緩衝化ＲＰＭＩ １６４０培地（０４
１−２４００） ；ギブコ社ペイズリ−、スコツトラン
ド〕にまいた。７２時間後追加の増殖培地２５耐を加え
、２４時間後に細胞を茂トランスフェクションのために
使用した。 トランスフェクション法： ７”ｙスミ）” ＰＴＲＨ
７のトランスフェクション（イーグル■逼培地中）は’
ＤＮＡクローニング’ Ｄ、Ｍ。グローバー編集。 １肛プレス、１９８５ （第１５章、Ｃ。ゴーマン）に
記載されるカルシウム共沈を使用した。グリセロールシ
ョック（ｇｌｙｃｅｒｏｌｓｈｏｅｋ ）および５ｒｎ
Ｍブチレート処理を使用した。トランスフェクションさ
れた細胞が分泌したプラスミノーゲン活性化因子は４チ
大豆ペプトン（シグマ社）を含む上記のようなＲＰＭＩ
１６４０培地（但し血清不含）中で２４時間にわたっ
て収穫した。収穫培地２５０コはリン酸緩＠溶液（ダル
ベツコＡ）１０．１チツイーン８０（ＰＢＳ ／ ’Ｉ
Ｗ） ２５０ ｄで希釈し、ＴＲＢＭ ６細胞を由来の
ｔ−ＰＡについて述べた方法と同じ方法を用いて精製し
た〔トッドら、（１９８６） ＦＥＢＳ Ｌｅｔ、ｔ。 廻り、１３〜１７を参照〕。簡単に述べると、希釈した
収穫培地は亜鉛中レートセファロースＣＬ４Ｂのカラム
（内径３２５ｍ；高さ４３嘴）でクロマトグラフィーに
かけた。ハイブリッドプラスミノーゲン活性化因子は５
０蛎 イミダゾールを用いて溶解し、リシンセファロー
ス４Ｂのカラム（内径１５霞；高す２８瓢）に直接通し
た。精製ノ・イブリッドプラスミノーゲン活性化因子は
０．５ Ｍ Ｌ−アルギニン含有緩衝液を用いてこのカ
ラムから溶出した。 ハイブリッドプラスミノーゲン活性化因子の２つのバッ
チはプールし、そして攪拌セル限外濾過（ＹＭＩＯ膜、
アミコン社展）を使って約１．５１ＬｔｌＣ濃縮し、そ
の後セファデックスＧ２５ （ＰＤ １０．７ア一マシ
ア社製）を用いて０．０５Ｍリン酸塩／ ０．ＩＭＮａ
Ｃ！１０．０１％ツイ−７８０／ １０ ｍｌ ／ ｍ
ｌ マｙ 二） −ル／ １ ｍＭ ＥＡＣＡ（ｐＨ７
，４） （ｐｓ’ｒ７４止） （２，２ｄ ）へ緩衝液
交換した。 ＳＤＳ −ＰＡＧＥその後のフイプリンザイモグラフイ
ー（トッドら１血栓症およびうつ血症” ５５．９４〜
９７参照）による産物の分析は、欧州特許出願第０１５
５３８７号明！ａ′ＩＦＫ記載０１７ｍ？？プラ＊ミｙ
Ａ／１−ＰＡＢハイブリッドよシもかなシ大きい見掛は
分子量約１ｏｏｏｏｏをもり線維素溶解活性物質を主と
して示した。フィブリン平板検定はｔ−ＰＡの第１国原
種品（ロット番号８３１５１７ ）に関して。 この産物が４８００ＩＵを含むことを示した。セファデ
ックス（５ｅｐｈａｄｅｘ ）およびセファロース（５
ａｐｈａｒｏｓｅ ）は商標名でらる・実施例４ 性状決定 実施例３からの精製し、緩衝液交換したハイブリッドプ
ラスミノーゲン活性化因子２．２ Ｒ１（０，４４ナノ
モル）は２５℃で４１−アミノフェニル−Ｎ、Ｎ−ジメ
チル−４−アミノベンゾエート・ＨＣＪ（ＡＰ −ＤＡ
Ｂ ） （１ｍＭ ）を段階的に付加することによりそ
の活性中心を可逆的に遮断し念。最終」−ＤＡＢ濃度は
ハイブリッドプラスミノーゲン活性化因子の濃度よシも
槌倍そル過剰を示した。１０５分で、８２２８８アミド
分解活注（トッドら、曹血栓症およびうつ血症’ ５５
．９４〜９７． １９８６を参照）の９０チ阻害が検出
された。遊離ＡＰ −ＤＡＢはＰＳＴ／ＭＥ中のセファ
デックスＧ２５ （ＰＤ １０ ）による緩衝液交換を
用いて除去した。ＤＡＢハイブリッドプラスミノーゲン
活性化因子産物（３゜０ｒｒＬｔ）は−４０’Ｃで貯蔵
した。 この産生物の７リコートを等容量の０．Ｉ Ｍ ） Ｕ
＊ ／ ０．１５Ｍ ＮａＣＡ！／２０ （ｖ／ｖ ）
％グリセｏ ｙ’／ ０，０１チツイーン８０（ｐＨ
７，４）で希釈し、３７℃でインキヱベーションした。 ８２２８８活性の回復を測定することによシ脱アシル化
を監視した。実験条件下での脱アシル化速度定数は２．
ＯＸ １０−’／秒であった。
ら、１９７８ｅＡｔｌａｓ ｏｆ ＰｒｏｔｅｉｎＳｅ
ｑｕｅｎｃｅ （前掲）に記載のアミノ酸配列ナンバリ
ングに従えば〕残基ａｒｇ −５６０とＶａｌ −５６
１の間に存在する。２種類のプラスミノーゲンが同定さ
れた〔カステリノ（Ｆ、Ｊ、Ｃａ５ｔｅｌｌｉｎｏ＊Ｃ
ｈｅｍｉｃ１１本明細書において、プラスミノーゲンに
関する記述はこれらの両方の種類を包含するものである
。 最近、完全なヌクレオチド配列が開示された〔フォース
ケルン（Ｆｏｒｓｇｒｅｎ＋Ｍ、 ）ら、 １９８７
。 ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２１３．２５４〜２６０を
参照され之い〕。 そのヌクレオチド配列はＡ鎖のＮ末端付近に１以前に報
告されなかった追加のインロイシン残基が存在すること
を予告している。この発見は独立して確認された〔マク
リーン（ＭｃＬｅａｎ＊Ｊ、Ｎ、 ）ら、１９８７ 、
Ｎａｔｕｒｅ ３００．１３２〜１３７を参照された
い〕。 従って、以下のアミノ酸配列ナンバリングはすべて追加
のイソロイシンを考慮に入れである。このナンバリング
方式ではプラスミノーゲンの切断部位がａｒｇ −５６
１とｖａｌ −５６２の間に存在する。 〔発明が解決しようとする課題〕 今や、新しい種類の線維素溶解活性ハイブリットタンバ
ク質が、見出されプヒ。 本発明によれば、ｍ織型プラスミノーゲン活性化因子お
よびウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子から選ば
れるプラスミノーゲン活性化因子のＢ鎖に連結されたプ
ラスミンのＡ鎖から成る線維累溶解活性ハイブリッド酵
素であって、前記の鎖同士がプラスミノーゲンの切断部
位を含むアミノ酸配列を介してペプチド結合により連結
されることを特徴とする前記ハイブリッド酵素が提供さ
れる。 〔課題を解決するための手段〕 ９Ｂ＠１なる用語は、プラスミノーゲン活性化因子の機
能的活性中心を含むＢ鎖の少なくともその部分を意味す
ることが理解されるだろう。 本明細書で用いる組織型およびウロキナーゼプラスミノ
ーゲン活性化因子なる用語は、１９８２年７月２７日に
イタリー国ベルガモで開ｉされた「血栓症およびうつ血
症に関する国際委員会」の第Ｘ追１ミーティングにおい
て、ｔ−ＰＡまたはｕ−ＰＡについてそれぞれ定義され
た免疫学的性質を有する群のプラスミノーゲン活性化因
子を意味する。 ま７）、、 ｔ−ＰＡおよびウロキナーゼなる用語は
、例えばＷＯ８６／ ０１５３８寸たけ欧州特許第０１
９９５７４号明細８ ［Ｃ記載されるようなそれらの突
然変異タンパク質をも包含することが理解されるであろ
う。 好適な間知おいて、連結配列はプラスミノーゲンのアミ
ノ酸残基５６２−５６６ 、より好ましくは残基５６２
−５７２から成る。 他の好適な面において、プラスミノーゲン活性化因子は
ｔ−ＰＡである。 プラスミノーゲン活性化因子がｔ−ＰＡである場合、そ
の連結配列はまた任意にｔ−ＰＡの切断部位、特にｔ−
ＰＡのアミノ酸残基２７３−２７５ ’ｉ７含んでいて
もよい。 本発明の・・イブリッド酵素は例えば以下に示す既知の
プラスミノーゲン活性化因子含有複合体に類似した薬学
的に有用な複合体をもたらすよう誘導しうる： （ａ） 酵素−タンパク質複合体、ここで線維素溶解
作用に重要な働きをする酵素の触媒部位が可逆的な連結
基によってそれに結合されたヒトタンパク質により遮断
される、欧州特許出願第０１５５３８８号明細書参照； ら）酵素−タンパク質複合体、少なくとも１つの任意に
遮断され九線維素溶解酵素が線維素溶解作用に関与する
触媒部位以外の部位によって少なくとも１つのヒトタン
ノぐり質に連結される、欧州特許出願第０１５２７３６
号明細書参照；（ｅ） タンパク質−ポリマー複合体
、薬学的に有用なタンパク質が可逆的連結基によって少
なくとも１つの水浴性ポリマーに連結される、欧州特許
出願第０１８４３６３号明細書参照；または（ｄ）
酵素複合体、複数の線維素溶解酵素が除去可能な遮断基
によってそれらの活性中心を介して一緒に連結される、
欧州特許出願第０１８４３６３号明細書参照。 本発明のハイブリッド酵素は上記複合体の酵素成分′ｆ
：九は（ヒト）タンパク質成分とＬ７て天然プラスミノ
ーゲン活性化因子の代わり１ｃ使用することができる。 本発明のハイブリッド酵素またはその複合体はさらに、
線維素溶解作用にとって必要な触媒部位が除去可能な遮
断基によって遮断されるように誘導しうる。 ハイブリッド酵素の上記誘導体は、ノヘイブリツド酵素
それ自体について以後で述べる方法および組成物におい
て使用することができる。 本明細書で用いる１除去可能な遮断基”なる表現は、加
水分解の擬−次速度定数がｐＨ７，４の等張水性媒体中
３７℃で１０’／秒〜１０″２／秒の範囲であるような
速度で加水分解により除去できる基を包含する。このよ
うな遮断基は欧州特許第０００９８７９号明細書に記載
されておシ、任意に置換されたベンゾイル基または任意
に置換されたアクリロイル基のようなアシル基が含まれ
る。ベンゾイル遮断基に適した任意の置換基はハロゲン
、Ｃｍ−ａアルキル、Ｃｍ−６アルコキシ、Ｃ＋−ａア
ルカノイルオキシｓ Ｃ１□６アルカノイルアミノ、ア
ミン、ジメチルアミノまたは。ｐ−グブニジノなどであ
る。了クリロイル遮断基に適した任意置換基はＣｍ−６
アルキル、フリル、フェニルまたＶｉＣトａアル中ルフ
ルフェニルである。 別の面において１本発明はハイブリッド酵素をコードす
るＤＮＡを組換え宿主細胞中で発現させ、次すでその酵
素産物を回収することから成る本発明ハイブリッド酵素
の生産方法を提供する。 ハイブリッド酵素をコードするＤＮＡの作製は慣用の遺
伝子工学的手法を用りて実施され、そしてそのαＵ、は
原核または真核細胞宿主（好ましくは真核細胞宿主）中
で発現される。 ハイブリッド酵素をコードするヌクレオチド配列から成
るＤＮＡポリマーも本発明の一部を構成する。 本発明方法はマニアケス（Ｍａｎｌａｔｉｇ ）う、モ
レキュラークローニング： 実験ｘマニュアル、コール
ド・スプリング・ハーバ−，１９８２に記載されるよう
な慣用の組換え技術を周込て実施できる。 よシ詳細には、本方法は １）宿主細胞中で、前記ハイブリッド酵素をコードする
ヌクレオチド配列から成るＤＮＡポリマーを発現しうる
複製可能な発現ベクターを作製し；肋 該ベクターによ
り宿主細胞を形質転換し；１１１）形質転換した宿主細
胞を前記）抗ポリマーを発現させる条件下で培養して前
記ハイブリッド酵素を生産させ；そして ＋Ｖ） 前記ハイブリッド酵素を回収する諸工程から
成っている。 本発明はまた適当なモノ−、ジーまたはオリゴマー×ク
レオチド単位を縮合させることによるＤＮＡポリマーの
作製方法を提供する。 その作製方法は化学的に、酵素的に、ま九は２つの方法
の組合せにより、 ｉｎ ｖｉｔｒｏもしくは１ｎｖ
ｉｖｏで適宜に実施される。こうして、 ＤＮＡポリマ
ーはロバーツ（Ｄ、Ｍ、Ｒｏｂｅｒｔｓ ）ら、Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２４．５０９０〜５０９８．１９８
５に記載されるような慣用方法を用いて、適当なりＮＡ
、フラグメントの酵素的連結反応によシ作ることができ
る。ＤＮＡフラグメントは必要なヌクレオチド配列を含
むＤＮＡの適当々制限酵素による消化、化学的合成、酵
素的重合、またはこれらの方法の組合せにより得られる
。 制限酵素による消化は適当な緩衝液中で２０〜７゜℃の
温度において、一般には５０ ｔｔｌ以下の容量にて、
０．１〜１０瀞のＤＮＡを用いて行、われる。 ＤＮＡの酵素的重合は必要に応じてヌクレオシド三リン
酸ｄＡＴＰ 、 ｄＣＴＰ 、 ｄＧＴＰおよびｄ Ｔ
ＴＰを含む適当な緩衝液中で１σ〜３７℃の温度におい
て、一般には５０ Ａｌ以下の容量にて、良９．ポリメ
ラーゼＩ（フレノウ断片）のようなりＮＡポリメラーゼ
を用いてｉｎマｉ ｔｒｏで行われる。ＤＮＡフラグメ
ントの酵素的連結は適当な緩衝液中で４℃から周囲温度
までの温度において、一般には５０μノ以下の容量にて
、Ｔ ４ ＤＮＡリガーゼのようなりＮＡリガーゼを用
いて実施される。ＤＮＡポリマーまたはフラグメントの
化学的合成は慣用のホスホトリエステル、ホスファイト
またはホスホルアミダイト化学によシ、例えば”遺伝子
断片の化学的および酵素的合取−実験室マニ瓢アル１（
ガラセン（Ｈ，Ｇ、Ｇａ５ａｅｎ ）およびラング（Ａ
、Ｌａｎｇ ）編集、フェアラグ・ケミ−、ワインハイ
ム（１９８２） ）に記載されるような固相法を用いて
、あるいはゲイ） （Ｍ、Ｊ、Ｇａ１ｔ ）、マテス（
Ｈ，Ｗ、Ｄ、Ｍａｔｔｈｅａ ）、シンＣＭ、Ｓｉｎｇ
ｈ ）、スプロート（Ｂ、Ｓ、５Ｐｒｏａｔ ）および
チトｆｆ ’Ｘ （Ｒ，Ｃ。 Ｔｌｔｍａｓ ）、Ｎｕｃｌｅｉｅ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ
５ｅａｒｃｈ ＃ １９８２ ｅ １０６２４３
； ＊ブロードおよびバンワー’Ｘ （Ｗ、Ｂａｎｎｗ
−ａｒｔｈ ）、Ｔａｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅ
ｒｓ ｅ １９８３ ｍ ２４ ｅ５７７１ ｓ マテ
ツチ（Ｍ、Ｄ、Ｍａｔｔｅｕｃｃｆ ）およびカルサー
ズ（Ｍ、Ｈ，Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ ） ｓ Ｔｅｔｒａ
ｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ−ｅｒｓ ｔ １９８０ ｍ
２１ １７１９；ｒチッチおよびカルサーズ、Ｊｏ
ｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅ
ｍｉｃａｌＳｏｃｉｅｔｙ、１９８１，１０３，３１８
５ ；アダムス（Ｓ、Ｐ。 Ａｄａｍｓ ）らｓ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ
Ａｍｅｒｉｃａｎ ＣｈｅｍｉｃａｌＳｏｃｉｅｔｙ
ｓ １９８３ 、１０５ 、６６１ ；シンハ（Ｎ、Ｄ
、５ｉｎｈａ ）ピアナツト（Ｊ、Ｂｉｅｒｎａｔ ）
、マクマナ″Ｒ，（Ｊ、ＭｃＭａｎｎｕｓ＋ ）および
ケスター（Ｈ，Ｋｏｅｇｔｅｒ ）、Ｎｕ ｃ １−ｅ
ｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、１９８４，１２
，４５３９ ：およびマテスら、ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａ
ｌ、１９８４，３＋８０１のような他の科学文献に記載
される方法を用いて実施される。 好適な態様にお−て、プラスミンＡ鎖およびプラスミノ
ーゲンの切断部位を含むアミノ酸配列をコードするヌク
レオチド配列から成るＤＮＡ分子は、プラスミノーゲン
遺伝子を含むベクターを制限酵素ＢａｔＭで消化するこ
とにより得られる。この消化は２つのＤＮＡフラグメン
トをもたらし、これらのフラグメントは一緒になって残
基１−５７０をコードし且つ残Ｗ ５７１および５７２
を部分的にコードするフラグメント（１）を与える： ３１・・・ＧＧＴ Ｇ ｐｒｏ ｈｉｓ ｍ＠ｒ このＤＮＡフラグメント（１）はプラスミノーゲン活性
化因子Ｂ鎖をコードするＤＮＡ配列から成るＤＮＡ分子
に、その分子に適当な接着末端が存在する場合は直接連
結され、またはＢｓｔＭ接着末端を与えるように考案さ
れたオリゴヌクレオチドリンカーを介して連結される。 プラスミノーゲン活性化因子がｔ−ＰＡであるとき、ｔ
−ＰＡＢ鎖をコードするＤＮＡ分子は、ｔ−ＰＡｅＤＮ
Ａの必要な部分を含むベクター （例えば、欧州特許出
願第０２０７５８９号明細９に記載されるベクターｐＴ
ＲＥ２４ ）を制限酵素Ｄｄ＠１およびＸ１ｘｏ Ｈで
消化す、ることにより得られる。この消化はｔ−ＰＡの
残基２７４−５２７ （Ｃ末端残基）をコードし且つ残
基２７２および２７３を部分的にコードする罠フラグメ
ント（ＩＩ）をもたらす： ｄｅ １ ↓ ５’ Ｔ ＣＡＧ ＴＴＴ・・・ コード鎖３
’ Ｃん錆・・・ ↑ ｈｅ フラグメント（１）とフラグメント（ＩＩ）を連結する
ための適当なオリゴヌクレオチドリンカーは次の構造（
１）を有する： ３’ ＴＡ ＡＧＴ ＴＣＧ ＡＡＴ ＣＴＡ ＧＡＡ
ＧＴ （ＩＩＩ）フラグメント（１）を与え
るＤＮＡフラグメントと、フラグメント（ＩＩ）および
（１■）との連結は所望により逐次的にまたは同時に実
施されて、ハイブリッド酵素を発現するＤＮＡ分子をも
たらす。 フラグメント（１） 、 （ＩＮ）および（ＩＩＩ）の
連結部位のＤＮＡ配列、ならびにその結果としてのアミ
ノ酸配列は次の通りである： ・・・ＣＣＡ ＣＡＴ ＴＣＡ ＡＧＣＴＴＡ ＧＡＴ
ＣＴＴ ＣＡＧ・・・・・イ：；ＧＧＴ ＧＴＡ Ａ
ＧＴ ＴＣＧ ＡＡＴ ＣＴＡ ＧＡＡ ＧＴＣ・・・
５７０５７１５７２ ｋ ｋ ＊ １１ ２７
３ｐｒｏ Ｈｌｓ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｌｅｕ ＡｓＰ
Ｌｅｕ Ｇｌｍ−印を付けたアミノ酸はオリゴヌクレオ
チドリンカーフラグメン） （ＩＩＩ）を組み入れた結
果として存在する。アミノ酸５７０−５７２はプラスミ
ノーゲンの残基１−５７２から成るペプチド配列の末端
残基である。アミノ酸２７３はｔ−ＰＡの残基２７３−
５２７から成るペプチド配列のＮ末端残基である。従っ
て、このＤＮＡ分子により発現される／１イブリッド酵
素はプラスミノーゲンの切断部位（残基５６１と５６２
の間）とｔ−ＰＡの切断部位（残基２７５と２７６の間
）の両方を含むことが明らかであるだろう。 組換え宿主細胞によるハイブリッド酵素をコードするＤ
ＮＡ配列の発現は、この宿主細胞中でそのＤＮＡポリマ
ーを発現しうる複製可能な発現ベクターを用いて実施さ
れる。その発現ベクターは新規であり、これもまた本発
明の一部を構成する。 複製可能な発現ベクターは、宿主細胞と適合しうるベク
ターを切断して完全なレプリコンを有する線状ＤＮＡセ
グメントを得５次いでこの線状セグメントとハイブリッ
ド酵素をコードするＤＮＡ配列とを連結することによシ
、本発明に従って作製できる。線状セグメントとＤＮＡ
分子またはそのフラグメントとの連結は所望によυ同時
にまたけ逐次的に行われる。 ベクターの選択は宿主細胞（原核または真核細胞であり
うるが、真核細胞が好ましい）によって一部が決定され
るだろう。適当なベクターにはプラスミド「バクテリオ
ファージ、コスミドおよび組換えウィルスが含まれる。 複製可能な発現ベクターの作製は、例えばマニアチスら
の上記文献に記載される方法によシ、ＤＮＡの制限、重
合および連結用の適当な酵素を用いて慣例的に行われる
。制限、重合および連結は良０．ポリマーの作製につい
て上述したように実施しうる。 組換え宿主細胞は形質転換条件下に宿主細胞を本発明の
複製可能な発現ベクターで形質転換することによシ、本
発明に従って作ることができる。 適当表形質転換条件は、例えばマニアチスらの上記文献
または’ ＤＮＡクローニング１、グローバー（ＤｏＭ
、Ｇｌｏｖｅｒ ）編集、ＩＲＬプレスリミテッド、１
９８５に記載されており、慣例的である。 形質転換条件の選択は宿主細胞により決定される。こう
して大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｔ ）のような細菌宿主はＣａ
Ｃ１＊溶液で処理する〔コーエン（Ｃｏｈｅｎ ）ら、
Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｅｔ、、１９７３ ｐ
６Ｌ２１１０ を参照〕か、あるいはＲｂＣ１，Ｍｎ
Ｃ１意、酢酸カリウムおよびグＩＪ−１＝ロールの混合
物から成る溶液で処理し、その後３−（Ｎ−モルホリノ
〕プロパンースルホン酸ＲｂＣｌおよびグリセロールで
処理する。哺乳動物細胞培養物は細胞上へのベクターＤ
ＮＡのカルシウム共沈によシ形質転換される。 本発明はまた本発明の複製可能な発現ベクターで形質転
換された宿主細胞にも及ぶ。 ＤＮＡポリマーの発現条件下での形質転換宿主細胞の培
養は、例えばマニアチスらの上記文献および先に引用し
た” ＤＮＡクローニング１に記載されるように、慣例
的に行われる。従って、好ましくは細胞は栄養分を供給
して４５℃以下の温度で培倭する。 発現産物は宿主細胞に応じて慣用方法によル回収される
。従って、宿主細胞が大腸菌のような細菌である場合は
、それを物理的、化学的または酵素的に溶菌して、得ら
れた溶菌液からタンパク質産物を分離する。宿主細胞が
哺乳動物細胞である場合は、一般に栄養培地から産物を
分離する。 ＤＮＡポリマーはハイブリッド酵素を発現する安定した
形質転換哺乳動物細胞株の単離用に考案されたベクター
、例えばウシ乳頭腫ウィルスベクターまたは増幅可能な
マーカーをもつベクター、中に挿入される（ ＤＮＡク
ローニング、ｖｏｌ、Ｕ ＊ Ｄ、？’４グローバー編
集、ＩＲＬプレス、１９８５ ；カウフマン（Ｋａｕｆ
ｍａｎｓ’Ｒ１Ｊ、 ）ら、分子および細胞生物学（Ｍ
ｏ１ｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅ１ｌｕｌａｒ Ｂｉｏ
ｌｏｇ７ ）、 ５．１７５０〜１７５９．１９８５
；バブラキス（Ｐａｖｌａｋｉｓ Ｇ、Ｎ、）およびハ
マー（Ｈａｍｅｒ ＠Ｉ）、）（、）、ナショナル・サ
イエンス・アカデミ−（ＵＳＡ ）の会報、８０ 、３
９７〜４０１．１９８３；ゴーデル（ＧｏｅｄｄｅＬＤ
、Ｖ、）ら、欧州特許出願第００９３６１９号明細書、
１９８３を参照されたい〕。 本発明に従って生産されたハイブリッド蓋素は、宿主細
胞て応じて、いろいろな程度にグリコジル化されること
が理解されるであろう。特に、ボール（Ｐｏｈｌ ）ら
、Ｂｉｏｅｂｅｍｉｓｔｒ７＋ １９８４ 、２３ ｅ
３７０１〜３７０７およびカステリノ（Ｃａ５ｔｅｌ
ｌｉｎｏｔＦ、Ｊ、 ）。 Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓｔｖｏｌ、８１．ｐ
、４３Ｌ１９８１により観察されたように、天然に存在
する非修飾ｔ−ＰＡおよびプラスミノーゲンにはそれぞ
れ異なる８度のグリコジル化が見られる。本発明のノー
イブリッド酵素はこのようなグリコジル化変異型も包含
するものである。 本発明のハイブリッド酵素は適当には薬剤組成物の形体
で投与される。 従って、本発明はさらに本発明のハイブリッド酵素を製
剤上許容される担体との組合せで含有してなる薬剤組成
物を提供する。 本発明組成物はヒトへの静脈内投与に適した薬剤組成物
として常法によシ処方される。 一般に、静脈内投与用の組成物は滅菌等張水性緩衝液中
に溶解した無菌酵素の溶液である。必要に応じて、本組
成物はハイブリッド酵素を溶解状態に保持するだめの可
溶化剤、および注射個所の痛みを和らげるだめの局所麻
酔剤（例えばリグノカイン）を含有しうる。一般に、ハ
イブリッド酵素は単位剤形、例えば活性単位のタンパク
質量を示す密封容器（例えばアンプルや小袋）中の乾燥
粉末または水不含濃縮物、として供給されるであろう。 ハイブリッド酵素が除去可能な遮断基を含む場合は、遊
離タンパク質の放出される時間が表示されるだろう。こ
のタンパク質を輸液にょ）投与する場合、それは薬品級
の滅菌１注射用水１または食塩水を含む輸液ぴんと共に
分与されるだろう。タンパク質を注射により投与する場
合は、それは注射用の滅菌水または食塩水のアンプルと
共に分与される。注射用または輸液用組成物は投与圧先
立って諸成分を混合することに↓り調製しうる。投与す
る物質の量は必要とされる線維素溶解の量および速度、
血栓塞栓症の程度および商魂の位置と大きさにより左右
されるだろう。使用する正確な用量および投与方式は、
病気の性質を考慮して、諸般の情況圧応じて主治医が決
定しなければならない。しかしながら、一般に血栓症を
治療すべき患者は０．０１〜１０ｍ９／に９ｃ体重）の
−日分の用量を注射（例えば５回以下）または輸液によ
り受は取るであろう。 本発明化合物は上記の投与量３，１用で毒性の副作用を
何ら示さない。 従って、本発明のさらに別の面では、患者に無毒性有効
量の本発明ハイブリッド酵素を投与することから成る血
栓症の治療方法が提供される。 本発明はまた治療用活性物質として、特に血栓症の治療
用として、使用するための本発明のＩ・イブリッド酵素
を提供する。 以下の実施例は本発明を例示するためのものである。 実施例１および２で使用する方法 ＤＮＡ切断 一般に、約１μｇのプラスミドＤＮＡまたはＤＮＡフラ
グメントの切断は約２０μでの適当な緩衝液中で約５単
位の制限酵素（１種または２種以上）を用いて行う。 連結反応はマニアチスら、モレキュラークローニンク：
実験室マニュアル、フールド・スプリング・ハーバ−・
ラボラトリ−，１９８２に記載のごとく実施する。ＤＮ
Ａ制限フラグメントの濃度はゲル（ゲル上ではＤＮＡ標
準も泳動させる）から視覚的に概算する。 形質転換 大腸菌ＤＨ５αおよびＨＢＩＯ】細胞のプラスミドＤＮ
Ａによる形質転換はマニアチスらの上記文献に記載され
る通りである。 プラスミドＤＮＡの大規模調製およびプラスミドのミニ
製表はマニアチスらの上記文献に記載されるように実施
する。 ＤＮＡ ７ラグメントはマニアチスらの上記文献に記載
されるようにして■アガロースゲルから分離する。 合成オリゴヌクレオチドはアプライド・バイオシステム
ズ３８１ Ａ ＤＮＡ合成機で、製造元の説明書に従っ
て製造する。 合成リンカ−はマニアチスらの上記文献に記載されるよ
うにギナーゼで処理してＤＮＡに連結する。 細胞の調製：細胞はＩ−＋７ブシン処理を行って、６０
■培ｉたり１０６個の細胞をまき、そして５％ＣＯ２／
９５チ空気の雰囲気の加湿インキ】−ベーター中で３７
°Ｃにおいて増殖培地（イーグル■虎中の１０％血清、
ペニシリン／ストレプトマイシンのｌｉ液；フローラ
ボラトリーズ社製、１チグルタミン、非必須アミノ酸の
］チ原液；フローラボラトリーズ社製）に−晩装置する
。 トランスフェクション法：使用したトランスフェクショ
ン法（カルシウム共沈）ハ”ＤＮＡり０−ニング’ Ｄ
、Ｍ、グローバー編集（１５章、Ｃ、ゴーマン）に記載
されている。グリセロールショックおよび１０ｍＭブチ
レート処理を使用する。 上塗層〔オーバーレイ）：イーグルＭＥＭ（ギブコ社製
）９５１ノ中の７ガロース（インデュビオースＡ３７）
２゜４ｇをブンゼン火炎中で融点まで加熱し、その後４
８℃に保持した水浴中に置く。フイブリノーゲ：／ （
２０ｍ９／ｄ ） ５．６ ｄをイーグルＭＵＭ （追
加のＮａＣＪ ７ ｍ９ ／ ｒｒｔｔを含有する）５
．６ｄで１ ： Ｉ Ｋ希釈し、氷上に保持する。イー
グルＢ１（追加のＮａＣ／不含）３．３ｄを公地して５
０ ＮＩＨ単位／ｍｌのウシトロンビン８６μｌを含む
ビジヨー（ｂｉｊｏｕ ）（氷上に保持）中に加える。 細胞はイーグルｈｍで３回洗って血清を除く。トロンビ
ンおよびフイプリノーゲンを水浴中で３７℃に温める。 アガロース９．５−を分取して予め温めておいたユニバ
ーサル（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ）に加える。その寒天に
トロンビンを加え、続いてフィブリノーゲンを加える。 ゲルを細胞層上に注ぎ％３７℃で溶解帯域が現れ志まで
インキュベーションする。 収獲二上記の上塗層に代わるものとして、細胞を無血清
培地中でス時間インキュベーションし、培地を回収して
ザイモグラフィ−（ｚｙｍｏｇｒａｐｈ７ ）により分
析する。 ヌクレオチドのナンバリングは全体を通して（１）肩文
字１ｐ１で示されるプラスミノーゲンについてはホース
グレン（Ｆｏｒｓｇｒｅｎ ）ら、ＩＩ’ｉ−：：ＩＦ
ＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２１３ 、２５４ （１９８
７） ；（ｉｌ）肩文字ｔｔｓで示されるｔ−ＰＡＩＣ
っ論てはぺ二力（Ｐｅｎｎ１ｅａ＊Ｄ、）ら、Ｎａｔｕ
ｒｅ ３０１ ＊ ｐ、２１４に記載のものに相当する
。 実施例１ １、 プラスミノーゲン： ｔ−ＰＡハイブリッドｃＤ
ＮＡ分子の作製 プラスミノーゲンｃＤＮＡクローンはマリノウスキー（
Ｍａｌ、ｉｎｏｗｓｋｉ ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ ２３ 、 ｐ。 ４２４３（１９８４）に記載される配列のヌクレオチド
４９−６８に対応する次の配列： ５ ’ ＣＣＣＣＴ ＣＡＣＡＣＡ ＣＡＴ ＡＡＣＡ
ＧＧ ３ ’のオリゴヌクレオチドプローブを用いてス
クリーニングした後に、ヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリー
から得られた。 プラスミノーゲンおよび関連した５′および３′非翻訳
領域をコードするｃＤＮＡクローンは、ＰＴＲＥＩ！ベ
クター（欧州特許出願第０２０１１５３号明細書参照）
のＨ１ｎｄＩ１１部位とＢｇｌ Ｔｉ部位の間にサブク
ロー、ニングしてプラスミドＰＴＲＨ５（第１図参照）
を作製し念。 プラスミノーゲンｃＤＮＡは２つのＢｓｔ ＸＩ認識部
位を有し、１つは”Ａ鎖’ （１２０９ｐ） にあう
、も５１ツバ’ Ｂａ ’ （１８４０Ｐ ）１７１ル
。 ｐＴｍ５をＢａｔ）ｆｆおよびＢｇｌ Ｕで切断して３
つのフラグメントを得た： （１）ベクターおよび約１．１５Ｋｂ のプラスミノ
ーゲンＡ ＠ ＤＮＡを含む６ 、４ＫｂのＢｇＪ Ｉ
Ｉ （ｃＤＮＡの３′末端に位置する） −Ｂｓｔ Ｍ
（１２０９ｐ）、′フラグメントＡ１； （１１）プロテアーゼ切断部位を含むプラスミノーゲン
Ａ鎖ＤＮＡの残部およびプラスミノーゲンＢ鎖の一部を
保有する６３０ｂＰのＢｓｔ Ｍ （１２０９ｐ−１８
４０ｐ）、１フラグメントＢｌ； （ＩＩ） Ｂ鎖の大部分をコードする７４０ ｂＩ）の
第３番目のフラグメント（Ｂｓｔ Ｍ、 １８４０Ｐ
−Ｂｇ）ＩＩ）は捨てた。 フラグメントＡおよびＢはアガロースゲルから精製し念
。 Ｂ鎖およびＡ鎖の３個のアミノ酸をコードする８００ｂ
ｐ （１００４ｔ−１８０５ｔ）Ｏｔ−ＰＡ７；ｙ／メ
７）（Ｃ）は、プラスミドルｎ侶２４（欧州特許出願第
０２０１１５３号明細書参照）をＤｄｅ １およびＸｈ
ｏ ＩＩで消化し、次いでアガロースゲル電気泳動にか
けることによシ分離した。 Ｂｓｔ Ｍ （１８４０ｐ）末端をＤｄｅ Ｉ （１０
０４ｔ）末端を連結する九めに、次の配列の２本の合成
オリゴヌクレオチドを使用した： ３ ） ５ ’ ＴＧＡＡＧＡＴＣＴＡＡＧＣＴＴＧ
ＡＡＴ ３１４＞ ５ ’ ＡＡＧＣＴＴＡＧＡＴＣ
Ｔ ３ ’これらのオリゴヌクレオチドは組み合わされ
たとき（フラグメントＤ）、ＨｌｎｄＩ［ＩとＢｇｌ
Ｉｆのための制限部位をもたらす： ここで接着末端ＸはプラスミノーゲンｃＤＮＡのＢｓｔ
Ｍ （１８４０ｐ）末端に相補的でアシ、そして接着
末端Ｙはｔ−ＰＡ ｃＤＮＡのＤｄｅ １ （１００４
ｔ）末端に相補的である。 ７ラグメントＡ、Ｂ、ＣおよびＤは連結させて、大腸菌
ＲＩＢ １０１． Ｋ形質転換した。アンピシリン耐性
コロニーを選択した。 これらの１つから分離したノ・イブリッドプラスミド（
ＰＴＲＨ７）の構造は、以下の制限酵素を使用する消化
によシ分析した： （１） Ｂｓｔ Ｍ、プラスミノー
ゲンＡ鎖に唯一である（この酵素はまた第２のＢｓｔＸ
１部位がその構築中に破壊されるとｂう点でハイブリッ
ドの検出に役立つ） 、 （ＩＩ） Ｓｓｔ Ｉ％ｔ
−ＰＡＢ鎖に唯一である。および（ｔｆｔ） ＢｇｌＩ
ＩおよびＨｌｎｄ ＩＩＩ （Ｈｇｌ！ ＩＩ ｈよび
Ｈ１Ｔ１ｄ１！の両部位はフラグメントＤによシ導入さ
れる）（第１図参照）。ハイブリッド遺伝子の構造は第
２図に示す通〕でおると考えられ、プラスミノーゲン／
１−ＰＡ接合個所の推定上のヌクレオチド配列およびア
ミノ酸配列は次の通シである： ｐｒｏ ｈｉｓ ｓａｒ ｓｅｒ’ ｌｅｕ’ ａｓｐ
” ｌｅｕ’ ｇｉｎ←プラスミノーゲン切断部位
ｔ−ＰＡ切断部位→８個のアミノ酸
２個のアミノ酸井印を付けたアミノ酸はフラグメント
Ｄを組み入れることにより挿入された。これらの左側の
アミノ酸はプラスミノーゲンに由来し、右側のアミノ酸
はｔ−ＰＡに由来する。 実施例２ 発現 Ａ）フィブリン／寒天上塗層 トランスフェクションしたＬ９２９細胞からのＰＴＲＨ
７の発現（トランスフェクションの２４時間後）は１方
法１のところで述べたフィブリン／アガロース上塗層の
手法を用すて検出した。溶解帯域はＰＴＲＨ７から得ら
れたが、空の親ベクターｐＴＲＥ１２ （欧州特許出願
第０２０１１５３号明細書に記載される）でトランスフ
ェクションした細胞からは得られなかった。 Ｂ）ザイモグラフイー ｐＴＲＨ７の一時的発現産物はトッド（Ｄｏｄｄ ）ら
、（１９８６）、′血栓症およびうつ血症１．□（１）
。 ９４に記載されるフイブリンザイモグジフイーによシ分
析した。見掛は分子量は推定構造と一致した。 実施例３ 細胞の調Ｍ ： １ＨｅＬａ細胞はトリプシン処理を行
って、５ｔ ％ ＣＯ！／ ９５９６空気の雰囲気の加
湿インキュベーター中３７℃において１゜４Ｘ１０’細
胞／−の密度で３Ｑｍ （１７５−フラスコ当たシ）の
増殖培地〔すなわち、１０％血清（０２１−６０１０）
、ペニシリン／ストレプトマイシンの１％原液（０４３
−５０７０）２チ炭酸水素ナトリウム溶液（０４３−５
０８０）、ｈ１チグルタｚｙ原液（０４３−５０３０）
を含むＨｏｐｅｓ緩衝化ＲＰＭＩ １６４０培地（０４
１−２４００） ；ギブコ社ペイズリ−、スコツトラン
ド〕にまいた。７２時間後追加の増殖培地２５耐を加え
、２４時間後に細胞を茂トランスフェクションのために
使用した。 トランスフェクション法： ７”ｙスミ）” ＰＴＲＨ
７のトランスフェクション（イーグル■逼培地中）は’
ＤＮＡクローニング’ Ｄ、Ｍ。グローバー編集。 １肛プレス、１９８５ （第１５章、Ｃ。ゴーマン）に
記載されるカルシウム共沈を使用した。グリセロールシ
ョック（ｇｌｙｃｅｒｏｌｓｈｏｅｋ ）および５ｒｎ
Ｍブチレート処理を使用した。トランスフェクションさ
れた細胞が分泌したプラスミノーゲン活性化因子は４チ
大豆ペプトン（シグマ社）を含む上記のようなＲＰＭＩ
１６４０培地（但し血清不含）中で２４時間にわたっ
て収穫した。収穫培地２５０コはリン酸緩＠溶液（ダル
ベツコＡ）１０．１チツイーン８０（ＰＢＳ ／ ’Ｉ
Ｗ） ２５０ ｄで希釈し、ＴＲＢＭ ６細胞を由来の
ｔ−ＰＡについて述べた方法と同じ方法を用いて精製し
た〔トッドら、（１９８６） ＦＥＢＳ Ｌｅｔ、ｔ。 廻り、１３〜１７を参照〕。簡単に述べると、希釈した
収穫培地は亜鉛中レートセファロースＣＬ４Ｂのカラム
（内径３２５ｍ；高さ４３嘴）でクロマトグラフィーに
かけた。ハイブリッドプラスミノーゲン活性化因子は５
０蛎 イミダゾールを用いて溶解し、リシンセファロー
ス４Ｂのカラム（内径１５霞；高す２８瓢）に直接通し
た。精製ノ・イブリッドプラスミノーゲン活性化因子は
０．５ Ｍ Ｌ−アルギニン含有緩衝液を用いてこのカ
ラムから溶出した。 ハイブリッドプラスミノーゲン活性化因子の２つのバッ
チはプールし、そして攪拌セル限外濾過（ＹＭＩＯ膜、
アミコン社展）を使って約１．５１ＬｔｌＣ濃縮し、そ
の後セファデックスＧ２５ （ＰＤ １０．７ア一マシ
ア社製）を用いて０．０５Ｍリン酸塩／ ０．ＩＭＮａ
Ｃ！１０．０１％ツイ−７８０／ １０ ｍｌ ／ ｍ
ｌ マｙ 二） −ル／ １ ｍＭ ＥＡＣＡ（ｐＨ７
，４） （ｐｓ’ｒ７４止） （２，２ｄ ）へ緩衝液
交換した。 ＳＤＳ −ＰＡＧＥその後のフイプリンザイモグラフイ
ー（トッドら１血栓症およびうつ血症” ５５．９４〜
９７参照）による産物の分析は、欧州特許出願第０１５
５３８７号明！ａ′ＩＦＫ記載０１７ｍ？？プラ＊ミｙ
Ａ／１−ＰＡＢハイブリッドよシもかなシ大きい見掛は
分子量約１ｏｏｏｏｏをもり線維素溶解活性物質を主と
して示した。フィブリン平板検定はｔ−ＰＡの第１国原
種品（ロット番号８３１５１７ ）に関して。 この産物が４８００ＩＵを含むことを示した。セファデ
ックス（５ｅｐｈａｄｅｘ ）およびセファロース（５
ａｐｈａｒｏｓｅ ）は商標名でらる・実施例４ 性状決定 実施例３からの精製し、緩衝液交換したハイブリッドプ
ラスミノーゲン活性化因子２．２ Ｒ１（０，４４ナノ
モル）は２５℃で４１−アミノフェニル−Ｎ、Ｎ−ジメ
チル−４−アミノベンゾエート・ＨＣＪ（ＡＰ −ＤＡ
Ｂ ） （１ｍＭ ）を段階的に付加することによりそ
の活性中心を可逆的に遮断し念。最終」−ＤＡＢ濃度は
ハイブリッドプラスミノーゲン活性化因子の濃度よシも
槌倍そル過剰を示した。１０５分で、８２２８８アミド
分解活注（トッドら、曹血栓症およびうつ血症’ ５５
．９４〜９７． １９８６を参照）の９０チ阻害が検出
された。遊離ＡＰ −ＤＡＢはＰＳＴ／ＭＥ中のセファ
デックスＧ２５ （ＰＤ １０ ）による緩衝液交換を
用いて除去した。ＤＡＢハイブリッドプラスミノーゲン
活性化因子産物（３゜０ｒｒＬｔ）は−４０’Ｃで貯蔵
した。 この産生物の７リコートを等容量の０．Ｉ Ｍ ） Ｕ
＊ ／ ０．１５Ｍ ＮａＣＡ！／２０ （ｖ／ｖ ）
％グリセｏ ｙ’／ ０，０１チツイーン８０（ｐＨ
７，４）で希釈し、３７℃でインキヱベーションした。 ８２２８８活性の回復を測定することによシ脱アシル化
を監視した。実験条件下での脱アシル化速度定数は２．
ＯＸ １０−’／秒であった。
第１図はプラスミドｐＴＲＨ７の構築を示す模式一一プ
ラスミノーゲンコード配列 ローｔ−ＰＡコード配列 木−プラスミド構築中に破壊され九制限部位第２図はハ
イブリッドプラスミノーゲン活性化因子をコードするハ
イブリッド遺伝子（プラスミドｐＴＲＨ７由来）の予期
された構造を示す模式図である。 カープラスミノーゲンコード化ＤＮＡ −一フラグメントＤ ０−ｔ−ＰＡコード化ＤＮＡ 太−プラスミド構築中に破壊された制限部位代理人 弁
理士 秋 沢 政 光 他１名 自発手続補工嘗 昭和６３年グ１σ 日 特願昭／、３−で３り優４ ２、発明の名称 新規化合物、その製法及びそれを含む医薬組成物３、補
正をする者 事件との関係 出 願 人 住 所 イギリス国、ミドルセックス州、ブレンドフォ
ード、グレートウェストロード、ビーチャムハウス（番
地なし）名 称 ビーチャム・グループ・ビーエルンー
４、代理人 居 所 東京都中央区日本橋兜町１２番１号大洋ビル
。 （内容に変更なし）
ラスミノーゲンコード配列 ローｔ−ＰＡコード配列 木−プラスミド構築中に破壊され九制限部位第２図はハ
イブリッドプラスミノーゲン活性化因子をコードするハ
イブリッド遺伝子（プラスミドｐＴＲＨ７由来）の予期
された構造を示す模式図である。 カープラスミノーゲンコード化ＤＮＡ −一フラグメントＤ ０−ｔ−ＰＡコード化ＤＮＡ 太−プラスミド構築中に破壊された制限部位代理人 弁
理士 秋 沢 政 光 他１名 自発手続補工嘗 昭和６３年グ１σ 日 特願昭／、３−で３り優４ ２、発明の名称 新規化合物、その製法及びそれを含む医薬組成物３、補
正をする者 事件との関係 出 願 人 住 所 イギリス国、ミドルセックス州、ブレンドフォ
ード、グレートウェストロード、ビーチャムハウス（番
地なし）名 称 ビーチャム・グループ・ビーエルンー
４、代理人 居 所 東京都中央区日本橋兜町１２番１号大洋ビル
。 （内容に変更なし）
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、組織型プラスミノーゲン活性化因子およびウロキナ
ーゼプラスミノーゲン活性化因子から選ばれるプラスミ
ノーゲン活性化因子のＢ鎖に連結されたプラスミンのＡ
鎖から成り、前記のＡ鎖およびＢ鎖がプラスミノーゲン
の切断部位を含むアミノ酸配列を介してペプチド結合に
より連結されていることを特徴とする、線維素溶解作用
を有するハイブリッド酵素。 ２、前記のアミノ酸連結配列はプラスミノーゲンの残基
５６２−５７２から成る、請求項１記載のハイブリッド
酵素。 ３、前記プラスミノーゲン活性化因子は組織型プラスミ
ノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）である、請求項１また
は２記載のハイブリッド酵素。 ４、前記のアミノ酸連結配列はｔ−ＰＡの残基２７３−
２７５を含む、請求項３記載のハイブリッド酵素。 ５、前記請求項のいずれか一つの項に記載のハイブリッ
ド酵素の誘導体。 ６、線維素溶解作用に必要不可欠な触媒部位が除去可能
な遮断基により遮断される、請求項５記載の誘導体。 ７、請求項１記載のハイブリッド酵素またはその誘導体
を、薬学的に許容される担体と組み合わせてなる薬剤組
成物。 ８、血栓症の治療に使用するための、請求項１記載のハ
イブリッド酵素またはその誘導体。 ９、請求項１記載のハイブリッド酵素をコードするＤＮ
Ａを組換え宿主細胞中で発現させ、その酵素産生物を採
収することからなる、前記ハイブリッド酵素の産生方法
。 １０ 請求項１記載のハイブリッド酵素をコードするヌ
クレオチド配列から成るＤＮＡポリマー。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB878705377A GB8705377D0 (en) | 1987-03-07 | 1987-03-07 | Compounds |
| GB8705377 | 1987-03-07 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63251084A true JPS63251084A (ja) | 1988-10-18 |
Family
ID=10613512
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63053424A Pending JPS63251084A (ja) | 1987-03-07 | 1988-03-07 | 新規化合物、その製法及びそれを含む医薬組成物 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0290118A3 (ja) |
| JP (1) | JPS63251084A (ja) |
| GB (1) | GB8705377D0 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH03289122A (ja) * | 1990-04-06 | 1991-12-19 | Canon Inc | Ｘ線マスク構造体 |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5108909A (en) * | 1985-03-22 | 1992-04-28 | Chiron Corporation | Expression of TPA in mammalian cells |
| ES2031826T3 (es) * | 1985-12-23 | 1993-01-01 | Chiron Corporation | Procedimiento para producir nuevos peptidos activadores del plasminogeno. |
| US5262170A (en) * | 1988-09-02 | 1993-11-16 | Genentech, Inc. | Tissue plasminogen activator having zymogenic or fibrin specific properties and substituted at amino acid positions 296-299, DNA molecules encoding them, vectors, and host cells |
| US5108901A (en) * | 1988-09-02 | 1992-04-28 | Genentech, Inc. | Tissue plasminogen activator having zymogenic or fibrin specific properties |
| US5714145A (en) * | 1988-09-02 | 1998-02-03 | Genentech, Inc. | Tissue plasminogen activator having zymogenic or fibrin specific properties |
| US5258180A (en) * | 1988-09-02 | 1993-11-02 | Genetech, Inc. | Tissue plasminogen activator having fibrin specific properties and deletion of amino acids 466-970, compositions and methods of treatment |
| GB8826975D0 (en) * | 1988-11-18 | 1988-12-21 | Beecham Group Plc | Novel compounds |
| GB9019120D0 (en) * | 1990-09-01 | 1990-10-17 | Beecham Group Plc | Novel compounds |
| ATE155816T1 (de) * | 1992-06-03 | 1997-08-15 | Genentech Inc | Varianten des gewebeplasminogenaktivators mit verbesserter therapeutischer wirkung |
| US6706504B1 (en) | 1996-11-12 | 2004-03-16 | The Scripps Research Institute | Tissue type plasminogen activator (t-PA) variants: compositions and methods of use |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8334498D0 (en) * | 1983-12-24 | 1984-02-01 | Beecham Group Plc | Compounds |
| GB8609948D0 (en) * | 1986-04-23 | 1986-05-29 | Beecham Group Plc | Compounds |
| GB8400653D0 (en) * | 1984-01-11 | 1984-02-15 | Beecham Group Plc | Conjugates |
| US4916071A (en) * | 1985-08-14 | 1990-04-10 | American Home Products Corporation | Poly-kringle plasminogen activator |
| ATE90967T1 (de) * | 1986-03-28 | 1993-07-15 | Creative Biomolecules Inc | Proteinanaloge des gewebs-plasminogenaktivators. |
-
1987
- 1987-03-07 GB GB878705377A patent/GB8705377D0/en active Pending
-
1988
- 1988-03-04 EP EP88301897A patent/EP0290118A3/en not_active Withdrawn
- 1988-03-07 JP JP63053424A patent/JPS63251084A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH03289122A (ja) * | 1990-04-06 | 1991-12-19 | Canon Inc | Ｘ線マスク構造体 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| GB8705377D0 (en) | 1987-04-08 |
| EP0290118A2 (en) | 1988-11-09 |
| EP0290118A3 (en) | 1989-07-12 |
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