JPH02157294A - ペプチドおよびプロテアーゼ阻害剤 - Google Patents
ペプチドおよびプロテアーゼ阻害剤Info
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- JPH02157294A JPH02157294A JP63310634A JP31063488A JPH02157294A JP H02157294 A JPH02157294 A JP H02157294A JP 63310634 A JP63310634 A JP 63310634A JP 31063488 A JP31063488 A JP 31063488A JP H02157294 A JPH02157294 A JP H02157294A
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- amino acid
- acid sequence
- protease inhibitor
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- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
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- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は、医薬、免疫グロブリン作製用のハプテン等と
して有用な新規ペプチドおよび当該ペプチドをはしめと
する後天性免疫不全症候群の病原ウィルス（ＨＩ Ｖ）
の外膜蛋白関連ペプチドを有効成分とするプロテアーゼ
阻害剤に関するものである。
して有用な新規ペプチドおよび当該ペプチドをはしめと
する後天性免疫不全症候群の病原ウィルス（ＨＩ Ｖ）
の外膜蛋白関連ペプチドを有効成分とするプロテアーゼ
阻害剤に関するものである。
（従来技術・発明が解決しようとする課題〕プロテアー
ゼ阻害剤は生体内において幅広い酵素系に影響を与え、
たとえば象、性膵炎、ションク、出血時の止血等の治療
等に使用されている。
ゼ阻害剤は生体内において幅広い酵素系に影響を与え、
たとえば象、性膵炎、ションク、出血時の止血等の治療
等に使用されている。
従って、新規かつ有用なプロテアーゼ阻害剤の出現が待
望されているのが実情である。
望されているのが実情である。
［課題を解決するための手段］
本発明者らは、ＨｔＶの外被蛋白質（ｇｐ１２０）のア
ミノ酸配列からなるペプチド等のＨＩＶの外膜蛋白関連
ペプチドについて研究を進めた結果、少な（とも後記の
式（ＩＩ）で表されるアミノ酸配列を有するペプチドが
優れたプロテアーゼ阻害作用を有することを見出した。
ミノ酸配列からなるペプチド等のＨＩＶの外膜蛋白関連
ペプチドについて研究を進めた結果、少な（とも後記の
式（ＩＩ）で表されるアミノ酸配列を有するペプチドが
優れたプロテアーゼ阻害作用を有することを見出した。
即ち、ＨＩＶに対する中和抗体誘導における抗原決定基
としてすでに公知のアミノ酸配列（Ｐｒｏｃ。
としてすでに公知のアミノ酸配列（Ｐｒｏｃ。
Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ、 ８８．
３１９８〜３２０２ （１９８８） ］の中に、タンパ
ク質性トリプシンインヒビターとして広（知られている
ダイズのトリプシンインヒビターおよびボーマン−バー
クインヒビターのそれぞれの反応部位である一Ａｒｇ−
１１ｅ−および−ＬｙｓＳｅｒ−というアミノ酸配列、
並びに哺乳頚の血′清中に存在するプロテアーゼインヒ
ビターの一種であるインター−α−トリプシンインヒビ
ターの反応部位のアミノ酸配列と高い相同性を示すアミ
ノ酸配列を有することを見出し、この部分を含む合成ペ
プチドが生理活性物質として有効ではないかと考えるに
至った。そこで、この部分を含む新規ペプチドを合成す
るとともに、当該ペプチドをはじめとしてＨＩＶの外膜
蛋白関連ペプチドのプロテアーゼ阻害効果を検討したと
ころ、少なくとも後記（ｎ）で表されるアミノ酸配列を
有するペプチドおよびその塩がプロテアーゼ、就中トリ
プシンおよびキモトリプシンの活性を極めて有為に阻害
することを見出した。
３１９８〜３２０２ （１９８８） ］の中に、タンパ
ク質性トリプシンインヒビターとして広（知られている
ダイズのトリプシンインヒビターおよびボーマン−バー
クインヒビターのそれぞれの反応部位である一Ａｒｇ−
１１ｅ−および−ＬｙｓＳｅｒ−というアミノ酸配列、
並びに哺乳頚の血′清中に存在するプロテアーゼインヒ
ビターの一種であるインター−α−トリプシンインヒビ
ターの反応部位のアミノ酸配列と高い相同性を示すアミ
ノ酸配列を有することを見出し、この部分を含む合成ペ
プチドが生理活性物質として有効ではないかと考えるに
至った。そこで、この部分を含む新規ペプチドを合成す
るとともに、当該ペプチドをはじめとしてＨＩＶの外膜
蛋白関連ペプチドのプロテアーゼ阻害効果を検討したと
ころ、少なくとも後記（ｎ）で表されるアミノ酸配列を
有するペプチドおよびその塩がプロテアーゼ、就中トリ
プシンおよびキモトリプシンの活性を極めて有為に阻害
することを見出した。
本発明はかかる新知見に基づいて完成されたものであり
、その第一番目の発明は下式（１）のアミノ酸配列を有
する新規ペプチド〔以下、ペプチド（１）という〕また
はその薬理学的に許容される塩（以下、単に塩ともいう
）である。
、その第一番目の発明は下式（１）のアミノ酸配列を有
する新規ペプチド〔以下、ペプチド（１）という〕また
はその薬理学的に許容される塩（以下、単に塩ともいう
）である。
Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ａ
ｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−ＬｙｓＳｅｒ−１１ｅ−Ａｒｇ
−１１ｅ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−
Ａｒｇ−（１）八ｌａ−Ｐｈｅ−Ｖａｔ−Ｔｈｒ−１１
ｅ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｔｉｅ−Ｇｌｙ−ＡｓｎＭｅｔ−
＾ｒｇ−Ｇｌｎ−＾１ａ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ第二番目の本
発明は、少なくとも下式（ＩＩ）のアミノ酸配列を有す
るペプチド〔以下、式（ＩＩ）で表されるアミノ酸配列
のペプチドをペプチド（ｎ）といい、ペプチド（ＴＩ）
をはじめとする式（ｎ）のアミノ酸配列を有するペプチ
ドを総称してペプチド（■）誘導体という〕またはその
塩を有効成分とするプロテアーゼ阻害剤である。
ｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−ＬｙｓＳｅｒ−１１ｅ−Ａｒｇ
−１１ｅ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−
Ａｒｇ−（１）八ｌａ−Ｐｈｅ−Ｖａｔ−Ｔｈｒ−１１
ｅ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｔｉｅ−Ｇｌｙ−ＡｓｎＭｅｔ−
＾ｒｇ−Ｇｌｎ−＾１ａ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ第二番目の本
発明は、少なくとも下式（ＩＩ）のアミノ酸配列を有す
るペプチド〔以下、式（ＩＩ）で表されるアミノ酸配列
のペプチドをペプチド（ｎ）といい、ペプチド（ＴＩ）
をはじめとする式（ｎ）のアミノ酸配列を有するペプチ
ドを総称してペプチド（■）誘導体という〕またはその
塩を有効成分とするプロテアーゼ阻害剤である。
＾ｓｎ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−５ｅｒ−１
１ｅ−Ａｒｇ−１１ｅ−ＧｌｎＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ
−Ｇｌｙ−＾ｒｇ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−
１１ｅ−（Ｕ ）Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−１１ｓ−Ｇｌｙ 本明細書において、薬理学的に許容される塩は、低毒性
であれば特に制限されるものではなく、塩酸塩、酢酸塩
、リン酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩等の有機酸塩、ア
ルカリ金属塩（ナトリウム塩、カリウム塩等）等の無機
酸塩があげられる。
１ｅ−Ａｒｇ−１１ｅ−ＧｌｎＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ
−Ｇｌｙ−＾ｒｇ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−
１１ｅ−（Ｕ ）Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−１１ｓ−Ｇｌｙ 本明細書において、薬理学的に許容される塩は、低毒性
であれば特に制限されるものではなく、塩酸塩、酢酸塩
、リン酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩等の有機酸塩、ア
ルカリ金属塩（ナトリウム塩、カリウム塩等）等の無機
酸塩があげられる。
本発明において式（ＩＩ）で表されるアミノ酸配列はＨ
ＩＶの外被蛋白質（ｇｐ１２０）における一部のアミノ
酸配列に該当するものである。しかして、ペプチド（Ｉ
Ｉ）誘導体は少なくとも上記の式（ＩＩ）で表されるア
ミノ酸配列を有するペプチドであれば特に制限はなく、
当該アミノ酸配列に付加的に１種以上のアミノ酸がペプ
チド結合したもの、その抗原性を減するためにこれらペ
プチドをポリエチレングリコールまたはその誘導体（ポ
リエチレングリコール、モノメトキシポリエチレングリ
コール等）にて修飾したペプチド等が例示され、上記ペ
プチド（Ｉ）、ペプチド（ｎ）、ＨＩＶの外膜蛋白、こ
れらの修飾化合物等のＨ［Ｖの外被蛋白質関連ペプチド
が例示される。
ＩＶの外被蛋白質（ｇｐ１２０）における一部のアミノ
酸配列に該当するものである。しかして、ペプチド（Ｉ
Ｉ）誘導体は少なくとも上記の式（ＩＩ）で表されるア
ミノ酸配列を有するペプチドであれば特に制限はなく、
当該アミノ酸配列に付加的に１種以上のアミノ酸がペプ
チド結合したもの、その抗原性を減するためにこれらペ
プチドをポリエチレングリコールまたはその誘導体（ポ
リエチレングリコール、モノメトキシポリエチレングリ
コール等）にて修飾したペプチド等が例示され、上記ペ
プチド（Ｉ）、ペプチド（ｎ）、ＨＩＶの外膜蛋白、こ
れらの修飾化合物等のＨ［Ｖの外被蛋白質関連ペプチド
が例示される。
本願発明におけるペプチド（１）、ペプチド（ＩＩ）を
はじめとするペプチド（■）誘導体はｇｐ ｌ ２０の
分解、通常のペプチド化学において使用されるペプチド
合成法、修飾法等によって製造される。
はじめとするペプチド（■）誘導体はｇｐ ｌ ２０の
分解、通常のペプチド化学において使用されるペプチド
合成法、修飾法等によって製造される。
ペプチド合成法としては、固相法、液相法のいずれでも
よい、固相法は、たとえば次のようにして行われる６即
ち、まずアミノ基が保護されたＣ末端アミノ酸をカルボ
キシル基によって不溶性担体に結合させる。不溶性担体
としては自体既知のものを使用すればよい。次にアミノ
保護基を除去した後、アミノ酸配列に従って順次アミノ
基の保護されたアミノ酸をペプチド結合させて一段ずつ
反応させ全アミノ酸配列を合成した後、不溶性担体を除
去することによって製造される。この際、反応性の官能
基はペプチド合成において既知の保護基によって保護し
ておくことが好ましい。
よい、固相法は、たとえば次のようにして行われる６即
ち、まずアミノ基が保護されたＣ末端アミノ酸をカルボ
キシル基によって不溶性担体に結合させる。不溶性担体
としては自体既知のものを使用すればよい。次にアミノ
保護基を除去した後、アミノ酸配列に従って順次アミノ
基の保護されたアミノ酸をペプチド結合させて一段ずつ
反応させ全アミノ酸配列を合成した後、不溶性担体を除
去することによって製造される。この際、反応性の官能
基はペプチド合成において既知の保護基によって保護し
ておくことが好ましい。
かくして製造されたペプチドは、たとえばイオン交換樹
脂、分配クロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー
、逆相クロマトグラフィー等のペプチド化学において通
常使用される精製方法によって任意の純度のものとして
精製することができる。
脂、分配クロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー
、逆相クロマトグラフィー等のペプチド化学において通
常使用される精製方法によって任意の純度のものとして
精製することができる。
上記のようにして製造されたペプチドは自体既知の方法
によって塩とすることができ、また塩を自体既知の方法
によって加水分解することによって遊離のペプチドが製
造される。
によって塩とすることができ、また塩を自体既知の方法
によって加水分解することによって遊離のペプチドが製
造される。
本明細書において、アミノ酸、ペプチド、保護基等に関
して略号で表示する場合、それらはＩＵＰＡＣＩＬＩＲ
Ｃｏｍｍ１ｓｓｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ
Ｎｏ＋ａｅｎｃｌａｔｕｒｅによる略号あるいは当該分
野における慣用略号に基づくものであり、その例を次に
あげる。
して略号で表示する場合、それらはＩＵＰＡＣＩＬＩＲ
Ｃｏｍｍ１ｓｓｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ
Ｎｏ＋ａｅｎｃｌａｔｕｒｅによる略号あるいは当該分
野における慣用略号に基づくものであり、その例を次に
あげる。
Ｃｙｓ ニジスティン Ｔｈｒ：スレオニンへｒ
ｇ：アルギニン Ｐｒｏ：フ゛ロリンＡｓｎ：ア
スパラギン Ｌｙｓ ：リジンＳｅｒ ：セリン
ｌｉｅ：イソロイシンＧｉｎ：グルタミン
ＧｌｙニゲリシンＡｌａ：アラニン Ｐ
ｈｅ ：フェニルアラニンＶａｌ：バリン
旧Ｓ：ヒスチジンｔ−ＢＯＣ： ｔ−ブチルオキシカル
ボニルＭＣＡ：４−メチル−クマリル−７−アミドＢｚ
：ベンヅイル ［作用・効果］ 本発明のペプチド（１）およびペプチド（Ｉｔ）をはじ
めとするペプチド（ＩＩ）Ｋ導体はヒト、イヌ、ウシ、
ウマ、マウス、ラット等の哺乳動物に対して優れたプロ
テアーゼ阻害活性、特にトリプシン阻害活性、キモトリ
プシン阻害活性を有するものであり、抗炎症剤、抗腫瘍
剤、発癌抑制剤等として、また免疫グロブリン療法用の
抗体作製のハブテン等として有用なものである。
ｇ：アルギニン Ｐｒｏ：フ゛ロリンＡｓｎ：ア
スパラギン Ｌｙｓ ：リジンＳｅｒ ：セリン
ｌｉｅ：イソロイシンＧｉｎ：グルタミン
ＧｌｙニゲリシンＡｌａ：アラニン Ｐ
ｈｅ ：フェニルアラニンＶａｌ：バリン
旧Ｓ：ヒスチジンｔ−ＢＯＣ： ｔ−ブチルオキシカル
ボニルＭＣＡ：４−メチル−クマリル−７−アミドＢｚ
：ベンヅイル ［作用・効果］ 本発明のペプチド（１）およびペプチド（Ｉｔ）をはじ
めとするペプチド（ＩＩ）Ｋ導体はヒト、イヌ、ウシ、
ウマ、マウス、ラット等の哺乳動物に対して優れたプロ
テアーゼ阻害活性、特にトリプシン阻害活性、キモトリ
プシン阻害活性を有するものであり、抗炎症剤、抗腫瘍
剤、発癌抑制剤等として、また免疫グロブリン療法用の
抗体作製のハブテン等として有用なものである。
本発明のプロテアーゼ阻害剤は、通常ペプチド（Ｉｔ）
誘導体、その塩の凍結乾燥品として製剤化されて経口的
または非経口的に投与され、その剤型は投与経路等によ
って異なる。
誘導体、その塩の凍結乾燥品として製剤化されて経口的
または非経口的に投与され、その剤型は投与経路等によ
って異なる。
本発明のプロテアーゼ阻害剤の好ましい剤型としては、
たとえば注射剤、カプセル剤、錠剤、クリーム、軟膏剤
、貼付剤、うめこみ剤等が例示され、これらは自体既知
の方法によって製造される。
たとえば注射剤、カプセル剤、錠剤、クリーム、軟膏剤
、貼付剤、うめこみ剤等が例示され、これらは自体既知
の方法によって製造される。
たとえば、ペプチド（ｎ）誘導体またはその塩を抗炎症
の治療剤として使用する場合、その投与量は、たとえば
注射剤の場合、ペプチド（ｎ ） 誘導体またはその塩
として１日０．１〜１０００ｍｇ／人が一般的であり、
これを１日１〜数回に分けて投与される。
の治療剤として使用する場合、その投与量は、たとえば
注射剤の場合、ペプチド（ｎ ） 誘導体またはその塩
として１日０．１〜１０００ｍｇ／人が一般的であり、
これを１日１〜数回に分けて投与される。
実験例１
トリプシン活性に対する本発明のプロテアーゼ阻害剤の
阻害効果を調べた。
阻害効果を調べた。
市販の精製トリプシンＩＩ）ｇ、５０ｍＭ）リス−塩酸
塩１．１街液ｐＨ８，０，０，１５Ｍ塩化ナトリウムお
よび基質である２５μＭｔ−プチルオギシカルボニルし
一フェニルアラニルーＬ−セリルーし一アルギニン４−
メチルークマリル−７−アミドからなるｌ−の反応液中
に、ペプチド（１）、ペプチド（■）、または比較とし
てペプチド（１）、（ＩＩ）とアミノ酸配列を異にする
１５個のアミノ酸配列からなるペプチド、〔即ち、Ｇｌ
ｙ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−ＡｒｇＧｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−
Ｇ １ｙ−３ｅｒ−Ａｓｐ−１１ｅ−Ａ Ｉａ−Ｇｌｙ
−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ。
塩１．１街液ｐＨ８，０，０，１５Ｍ塩化ナトリウムお
よび基質である２５μＭｔ−プチルオギシカルボニルし
一フェニルアラニルーＬ−セリルーし一アルギニン４−
メチルークマリル−７−アミドからなるｌ−の反応液中
に、ペプチド（１）、ペプチド（■）、または比較とし
てペプチド（１）、（ＩＩ）とアミノ酸配列を異にする
１５個のアミノ酸配列からなるペプチド、〔即ち、Ｇｌ
ｙ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−ＡｒｇＧｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−
Ｇ １ｙ−３ｅｒ−Ａｓｐ−１１ｅ−Ａ Ｉａ−Ｇｌｙ
−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ。
ペプチド１５という〕を添加し、蛍光セル内で３７°Ｃ
で反応させ、励起波長３８０ｎｍ、発光波長４４０ｎｍ
の蛍光強度を測定することによって酵素活性を算出した
。これをペプチドを添加しない場合の酵素活性との相対
値として第１図に示すことによってトリプシン活性阻害
値を示した。
で反応させ、励起波長３８０ｎｍ、発光波長４４０ｎｍ
の蛍光強度を測定することによって酵素活性を算出した
。これをペプチドを添加しない場合の酵素活性との相対
値として第１図に示すことによってトリプシン活性阻害
値を示した。
実験例２
α−キモトリプシン活性に対する本発明のプロテアーゼ
阻害剤の阻害効果を調べた。
阻害剤の阻害効果を調べた。
市販の精製トリプシン２０ｎｇ、５０ＩＩＭトリス塩酸
塩緩衝液ｐ＋＋ｓ、ｏ、１０ｍＭ塩化ナトリウムおよび
基質である５μＭサクシニルーＬ−アラニルし一アラニ
ルーし一プロリルーし一フェニルアラニル４−メチルー
クマリル−７−アミドからなる１ｄの反応系で実施例Ｉ
と同様に処理して蛍光強度を測定することによって酵素
活性を算出し、これをペプチドを添加しない場合の酵素
活性との相対値として第１図に示すことによってα−キ
モトリプンン活性阻害値を示した。
塩緩衝液ｐ＋＋ｓ、ｏ、１０ｍＭ塩化ナトリウムおよび
基質である５μＭサクシニルーＬ−アラニルし一アラニ
ルーし一プロリルーし一フェニルアラニル４−メチルー
クマリル−７−アミドからなる１ｄの反応系で実施例Ｉ
と同様に処理して蛍光強度を測定することによって酵素
活性を算出し、これをペプチドを添加しない場合の酵素
活性との相対値として第１図に示すことによってα−キ
モトリプンン活性阻害値を示した。
実験例３
２０μＭのペプチド（１）およびペプチド（Ｕ）の存在
下に、実験例１および２で使用したと同じ基質を使用し
、その基質濃度を変化させることによって得られたライ
ンライ−バー・パークプロットのパターンを第２図に示
した。（ラインライ−バー・パークプロットは実験例Ｉ
と同様の反応液中で基質濃度２５．３３．３．５０．１
００μＭにおける酵素活性を、１秒間に１ｋｇの酵素蛋
白質が基質と反応し７−アミノ−４−メチルクマリンを
１モル生成させる酵素単位をＩ Ｋａｔ／ｋｇとして算
出し、各々の基質濃度の逆数に対して、算出した酵素活
性の逆数をプロットすることにより得た。
下に、実験例１および２で使用したと同じ基質を使用し
、その基質濃度を変化させることによって得られたライ
ンライ−バー・パークプロットのパターンを第２図に示
した。（ラインライ−バー・パークプロットは実験例Ｉ
と同様の反応液中で基質濃度２５．３３．３．５０．１
００μＭにおける酵素活性を、１秒間に１ｋｇの酵素蛋
白質が基質と反応し７−アミノ−４−メチルクマリンを
１モル生成させる酵素単位をＩ Ｋａｔ／ｋｇとして算
出し、各々の基質濃度の逆数に対して、算出した酵素活
性の逆数をプロットすることにより得た。
この結果から本発明のプロテアーゼ阻害剤による阻害が
拮抗型であることがわかる。第２図中、・は２０μＭの
ペプチド（Ｉ）、■は２０μＭのペプチド（■）、△は
コントロールの結果である。
拮抗型であることがわかる。第２図中、・は２０μＭの
ペプチド（Ｉ）、■は２０μＭのペプチド（■）、△は
コントロールの結果である。
実験例４
実験例１および２で使用したと同じ基質を使用し、それ
ぞれ２５μＭおよび１００μＭの基質（基質としてＢＯ
Ｃ−Ｐｈｅ−３ｅｒ−＾ｒｇ−門ＣＡを使用）濃度にお
いてペプチド（＋）およびペプチド（Ｉｔ）の濃度を変
化させることによって得られたデイクソンプロットをそ
れぞれ第３図および第４図に示した。
ぞれ２５μＭおよび１００μＭの基質（基質としてＢＯ
Ｃ−Ｐｈｅ−３ｅｒ−＾ｒｇ−門ＣＡを使用）濃度にお
いてペプチド（＋）およびペプチド（Ｉｔ）の濃度を変
化させることによって得られたデイクソンプロットをそ
れぞれ第３図および第４図に示した。
デイクソンプロットは実験例１と同様の反応液中で、濃
度が０．２０．４０．６０μＭのペプチドを添加した場
合の酵素活性を算出し、各ペプチド濃度に対して酵素活
性の逆数をプロ・７トすることにより得た。第３図はペ
プチド（１）に関するものであり、第４図はペプチド（
ｎ）に関するものである。第３回および第４図中、ムは
２５μＭの基質濃度、口は０．１ｍＭ１００μＭの１８
ｔ ｆＡ ｒｘの結果である。
度が０．２０．４０．６０μＭのペプチドを添加した場
合の酵素活性を算出し、各ペプチド濃度に対して酵素活
性の逆数をプロ・７トすることにより得た。第３図はペ
プチド（１）に関するものであり、第４図はペプチド（
ｎ）に関するものである。第３回および第４図中、ムは
２５μＭの基質濃度、口は０．１ｍＭ１００μＭの１８
ｔ ｆＡ ｒｘの結果である。
かくしてペプチド（１）およびペプチド（ＩＩ）の阻害
定数は、それぞれ１２．５μＭおよび２４，２μＭであ
ることが明らかである。
定数は、それぞれ１２．５μＭおよび２４，２μＭであ
ることが明らかである。
実験例５
実験例１で用いた基質の代わりに、種々の合成基質（各
基質は第１表に示した）を用い、同様の反応液中で反応
させた場合のトリプシン活性に対するペプチド（ＩＩ）
の阻害定数（第１表）はいずれも同様の値を示している
ことから、本発明のプロテアーゼ阻害剤は幅広い基質に
おいて応用可能であることがわかる。
基質は第１表に示した）を用い、同様の反応液中で反応
させた場合のトリプシン活性に対するペプチド（ＩＩ）
の阻害定数（第１表）はいずれも同様の値を示している
ことから、本発明のプロテアーゼ阻害剤は幅広い基質に
おいて応用可能であることがわかる。
（以下、余白）
第１表
基質 阻害定数（μＭ）
ＢＯＣ−Ｐｈｅ−５ｅｒ−Ａｒｇ−ＭＣＡ
２４．８ＢＯＣ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−＾ｒｇ−ＭＣＡ
２０．８Ｂｚ−Ａｒｇ−ＭＣ＾
２９．４ＢＯＣ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−八ｒ
ｇ−ＭＣＡ ２８．５実験例６ ペプチド（１）およびペプチド（ＩＩ）のＬＤ、。
２４．８ＢＯＣ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−＾ｒｇ−ＭＣＡ
２０．８Ｂｚ−Ａｒｇ−ＭＣ＾
２９．４ＢＯＣ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−八ｒ
ｇ−ＭＣＡ ２８．５実験例６ ペプチド（１）およびペプチド（ＩＩ）のＬＤ、。
を調べたところ、いずれも１ｇ以上であった。
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが
、これらは本発明を何ら限定するものではない。
、これらは本発明を何ら限定するものではない。
なお、以下の実施例で使用されるアミノ酸は、特に言及
しない限り何れもＬ一体である。
しない限り何れもＬ一体である。
合成例１
ペプチド（ＩＩ）の合成を行なった。
ペプチド合成は、アプライド・バイオシステムズ社製ペ
プチドシンセサイザー４３ＯＡを用い、固相法により行
なった。即ち、０．５ミリモルのむＢｏｃ−Ｌ−グリシ
ン結合フェニルアセトアミドメチル樹脂（スチレン−１
％ジビニルヘンゼン共重合体）に、Ｎ末端をｔ−Ｂｏｃ
で保護した２ミリモルのｔ−Ｂｏｃアミノ酸をＮ、Ｎ−
ジメチルホルムアミド中、１ミリモルＮＮ−ジシクロへ
キンル力ルポジイミドを用いた対称アミノ酸無水物法で
縮合し、ペプチド結合を１個ずつ延長させる逐次延長法
にて行なった。ただし、ＡｓｎＧｉｎ、Ａｒｇの縮合に
ついては、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド中、１ミリモ
ルのヒドロキシヘンシトリアゾールを用いた活性エステ
ル法で２回縮合した。Ｌ−Ｂｏｃアミノ酸の側鎖の保護
基は、Ａｒｇでは２．４．６−）リメチルベンゼンスル
ホニル基、ＬｙｓではＮ”−１，−ブトキシカルボニル
−Ｎ６−２−クロロベンジルオキシカルボニル基、Ｓｅ
ｒおよびＴｈｒでは、ベンジル基をそれぞれ用いた。ペ
プチドの標準合成プログラムは、脱保護として６０％ト
リフルオロ酢酸／ジクロロメタンで１分または１５分間
、洗浄としてジクロロメタンで１分間を３回、中和とし
てｌＯ％ＮＮ−ジイソプロピルエチルアミンで１分間を
２回、洗浄としてＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミドで１分
間を６回、縮合としてＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド中
でＮ、Ｎ−ジシクロヘキシカルボジイミドを用いた対称
アミノ酸無水物法を２０分間、洗浄としてＮ、Ｎ−ジメ
チルホルムアミドで１分間を２回およびジクロロメタン
で４回行う、これらの標準合成プログラムは、各ア゛ミ
ノ酸に対して、反応温度および反応時間等が詳細にマイ
クロコンピュータにより制御されている。
プチドシンセサイザー４３ＯＡを用い、固相法により行
なった。即ち、０．５ミリモルのむＢｏｃ−Ｌ−グリシ
ン結合フェニルアセトアミドメチル樹脂（スチレン−１
％ジビニルヘンゼン共重合体）に、Ｎ末端をｔ−Ｂｏｃ
で保護した２ミリモルのｔ−Ｂｏｃアミノ酸をＮ、Ｎ−
ジメチルホルムアミド中、１ミリモルＮＮ−ジシクロへ
キンル力ルポジイミドを用いた対称アミノ酸無水物法で
縮合し、ペプチド結合を１個ずつ延長させる逐次延長法
にて行なった。ただし、ＡｓｎＧｉｎ、Ａｒｇの縮合に
ついては、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド中、１ミリモ
ルのヒドロキシヘンシトリアゾールを用いた活性エステ
ル法で２回縮合した。Ｌ−Ｂｏｃアミノ酸の側鎖の保護
基は、Ａｒｇでは２．４．６−）リメチルベンゼンスル
ホニル基、ＬｙｓではＮ”−１，−ブトキシカルボニル
−Ｎ６−２−クロロベンジルオキシカルボニル基、Ｓｅ
ｒおよびＴｈｒでは、ベンジル基をそれぞれ用いた。ペ
プチドの標準合成プログラムは、脱保護として６０％ト
リフルオロ酢酸／ジクロロメタンで１分または１５分間
、洗浄としてジクロロメタンで１分間を３回、中和とし
てｌＯ％ＮＮ−ジイソプロピルエチルアミンで１分間を
２回、洗浄としてＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミドで１分
間を６回、縮合としてＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド中
でＮ、Ｎ−ジシクロヘキシカルボジイミドを用いた対称
アミノ酸無水物法を２０分間、洗浄としてＮ、Ｎ−ジメ
チルホルムアミドで１分間を２回およびジクロロメタン
で４回行う、これらの標準合成プログラムは、各ア゛ミ
ノ酸に対して、反応温度および反応時間等が詳細にマイ
クロコンピュータにより制御されている。
ペプチド自動合成装置により得られたペプチド樹脂は、
トリフルオロメタンスルホン酸により支持体樹脂および
アミノ酸側鎖の保護基を切断した。
トリフルオロメタンスルホン酸により支持体樹脂および
アミノ酸側鎖の保護基を切断した。
即ち、合成ペプチド樹脂１ｇおよびチオアニソールｌｄ
、エタンジチオール５０μ２を室温で１０分間攪拌し、
フラスコを氷水で冷却しながらトリフルオロ酢酸を１０
戚加え、１０分間撹拌する。
、エタンジチオール５０μ２を室温で１０分間攪拌し、
フラスコを氷水で冷却しながらトリフルオロ酢酸を１０
戚加え、１０分間撹拌する。
次に１ＩＩｄｌのトリフルオロメタンスルホン酸を加え
、フラスコを氷水から取り出し室温で３０分間攪拌する
。冷ジエチルエーテルをペプチドの沈澱が出なくなるま
でフラスコに加え、１分間攪拌しテフロンフィルターで
結晶を濾過し、これをさらに少量のトリフルオロ酢酸で
溶解し、冷ジエチルエーテル中に移送し、再びテフロン
フィルターで１遇し、これを２Ｎ酢酸にて溶解し粗精製
ペプチドを得た。
、フラスコを氷水から取り出し室温で３０分間攪拌する
。冷ジエチルエーテルをペプチドの沈澱が出なくなるま
でフラスコに加え、１分間攪拌しテフロンフィルターで
結晶を濾過し、これをさらに少量のトリフルオロ酢酸で
溶解し、冷ジエチルエーテル中に移送し、再びテフロン
フィルターで１遇し、これを２Ｎ酢酸にて溶解し粗精製
ペプチドを得た。
粗精製ペプチドは、オクタデシル基を結合させたシリカ
ゲル充填剤から成る逆相カラム（直径２ｃｍ、長さ２５
１）による高速液体クロマトグラフィー（カラム：ＹＭ
ＣＲ−ＯＤＳ−５）により精製を行なった。溶出は移動
相として０．１％トリフルオロ酢酸を用い９０％アセト
ニトリルを５％〜６０％直線濃度勾配させることにより
行なった（流速５ｆＲ１／ｍｉｎ、） 、当番亥クロマ
トグラムは第５図（２２０ｎｍの紫外吸収で検出）に示
した通りである。
ゲル充填剤から成る逆相カラム（直径２ｃｍ、長さ２５
１）による高速液体クロマトグラフィー（カラム：ＹＭ
ＣＲ−ＯＤＳ−５）により精製を行なった。溶出は移動
相として０．１％トリフルオロ酢酸を用い９０％アセト
ニトリルを５％〜６０％直線濃度勾配させることにより
行なった（流速５ｆＲ１／ｍｉｎ、） 、当番亥クロマ
トグラムは第５図（２２０ｎｍの紫外吸収で検出）に示
した通りである。
精製したペプチドは、１ナノモルを気相シーケンサ−に
より分析した。その結果、分析サイクル１〜２４で検出
されたアミノ酸残基は、順に、Ａｓｎ。
より分析した。その結果、分析サイクル１〜２４で検出
されたアミノ酸残基は、順に、Ａｓｎ。
Ａｓｎ、 Ｔｈｒ、 Ａｒｇ＋ Ｌｙｓ、 Ｓｅｒ、
Ｉｌｅ、 Ａｒｇ、 Ｉｌｅ、 ＧｌｎＡｒｇ、 Ｇ
ｌｙ、 Ｐｒｏ、 Ｇｌｙ、 Ａｒｇ＋ Ａｌ
ａ、 Ｐｈｅ、 Ｖａｔ、 Ｔｈｒ目ｅ、 Ｇｌ
ｙ、 Ｌｙｓ、 Ｉｌｅ、 Ｇｌｙであり、目的とする
ペプチド（［１）が得られたことが１ｌｔｌされた。精
製後のペプチドの収量は８５ｍｇであった。
Ｉｌｅ、 Ａｒｇ、 Ｉｌｅ、 ＧｌｎＡｒｇ、 Ｇ
ｌｙ、 Ｐｒｏ、 Ｇｌｙ、 Ａｒｇ＋ Ａｌ
ａ、 Ｐｈｅ、 Ｖａｔ、 Ｔｈｒ目ｅ、 Ｇｌ
ｙ、 Ｌｙｓ、 Ｉｌｅ、 Ｇｌｙであり、目的とする
ペプチド（［１）が得られたことが１ｌｔｌされた。精
製後のペプチドの収量は８５ｍｇであった。
合成例２
ペプチド（＋）の合成を行なった。
ペプチド合成は、合成例１と同様の方法で行なった。加
えて、ｔ−Ｂｏｃアミノ酸側鎖の保護基は、Ｈｉｓでは
ジニトロフェニル基、Ｃｙｓでは４−メトキシベンジル
基を用いた。
えて、ｔ−Ｂｏｃアミノ酸側鎖の保護基は、Ｈｉｓでは
ジニトロフェニル基、Ｃｙｓでは４−メトキシベンジル
基を用いた。
合成したペプチド樹脂は、ＨｉｓおよびＭｅｔを含むの
で合成例１と同様のトリフルオロメタンスルホン酸によ
る切断を行う前に、次の前処理を行なった。ペプチド樹
脂にＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド２４ｄ、チオフェノ
ール１Ｉｎ１を加え、室温で１時間撹拌後、テフロンフ
ィルターにて吸弓濾過し、ＩＯ−ジクロロメタンで３回
洗浄および乾燥させた。さらに、この樹脂を０°Ｃに保
ちながら、ｍ−クレゾール１厩、ジメチルスルフ４ビ３
スルホン酸１ ｍｉ中で３時間反応させ、テフロンフィ
ルター上で冷ジエチルエーテルで洗浄、乾燥後、合成例
と同様の方法にて切断した。
で合成例１と同様のトリフルオロメタンスルホン酸によ
る切断を行う前に、次の前処理を行なった。ペプチド樹
脂にＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド２４ｄ、チオフェノ
ール１Ｉｎ１を加え、室温で１時間撹拌後、テフロンフ
ィルターにて吸弓濾過し、ＩＯ−ジクロロメタンで３回
洗浄および乾燥させた。さらに、この樹脂を０°Ｃに保
ちながら、ｍ−クレゾール１厩、ジメチルスルフ４ビ３
スルホン酸１ ｍｉ中で３時間反応させ、テフロンフィ
ルター上で冷ジエチルエーテルで洗浄、乾燥後、合成例
と同様の方法にて切断した。
合成例１と同様の方法で高速液体クロマトグラフィーに
よって精製した。当８亥クロマトグラムは第６図（２２
０ｎｍの紫外吸収で検出）に示した通りである。
よって精製した。当８亥クロマトグラムは第６図（２２
０ｎｍの紫外吸収で検出）に示した通りである。
合成例１と同様の方法で分析した結果分析サイクル１〜
３６で検出されたアミノ酸残基はＣｙｓＴｈｒ， Ａｒ
ｇ． Ｐｒｏ， Ａｓｎ， Ａｓｎ， Ａｓｎ， Ｔｈ
ｒ， Ａｒｇ． Ｌｙｓ。
３６で検出されたアミノ酸残基はＣｙｓＴｈｒ， Ａｒ
ｇ． Ｐｒｏ， Ａｓｎ， Ａｓｎ， Ａｓｎ， Ｔｈ
ｒ， Ａｒｇ． Ｌｙｓ。
Ｓｅｒ． 、ｌＩｅ， Ａｒｇ， ［Ｉｅ， Ｇｌｎ，
Ａｒｇ， Ｇｌｙ．Ｐｒｏ， ＧｌｙＡｒｇ， Ａｌ
ａ， Ｐｈｅ， Ｖａｌ， Ｔｈｒ， Ｉｌｅ． Ｇｌ
ｙ， Ｌｙｓ， ｌｉｅ。
Ａｒｇ， Ｇｌｙ．Ｐｒｏ， ＧｌｙＡｒｇ， Ａｌ
ａ， Ｐｈｅ， Ｖａｌ， Ｔｈｒ， Ｉｌｅ． Ｇｌ
ｙ， Ｌｙｓ， ｌｉｅ。
ｃｒｙ，八ｓｎ， Ｍｅｔ， Ａｒｇ， Ｇｌｎ， Ａ
ｌａ；旧ｓ， Ｃｙｓであり、目的とするペプチド（１
）が得られたことが確認された。
ｌａ；旧ｓ， Ｃｙｓであり、目的とするペプチド（１
）が得られたことが確認された。
製剤例１
ペプチド（ＩＩ）を精製した後、アンプルに注入し凍結
乾燥させ封入して、１００ｍ／アンプルの注射用製剤を
得た。
乾燥させ封入して、１００ｍ／アンプルの注射用製剤を
得た。
製剤例２
マクロゴール軟膏（第８改正日本薬局方）（マクロゴー
ル４０００ ５０ｇ、マクロゴール４００５０ｇを混合
したもの）に１ｇの凍結乾燥ペプチド（■）を混合よく
練り均一として１％軟膏製剤を得た。
ル４０００ ５０ｇ、マクロゴール４００５０ｇを混合
したもの）に１ｇの凍結乾燥ペプチド（■）を混合よく
練り均一として１％軟膏製剤を得た。
製剤例３
製剤例１において、ペプチド（ＩＩ）に代えてペプチド
（１）を用いて注射用製剤を得た。
（１）を用いて注射用製剤を得た。
製剤例４
製剤例２において、ペプチド（Ｉｔ）に代えてペプチド
（１）を用いて軟膏剤を得た。
（１）を用いて軟膏剤を得た。
第１図はトリプシン活性およびα−キモトリプシン活性
に対する本発明のプロテアーゼ阻害剤の阻害効果を示す
グラフである。 第２図は、ラインライ−バー・パークプロットによる、
本発明のプロテアーゼ阻害剤の基質濃度による阻害効果
を示すグラフである。 第３図は、デイクソンプロットによる、本発明のプロテ
アーゼ阻害剤〔ペプチド（Ｉ）］の基質濃度による阻害
効果を示すグラフである。 第４図は、デイクソンプロットによる、本発明のプロテ
アーゼ阻害剤［ペプチド（■）］の基質濃度による阻害
効果を示すグラフである。 第５図は、ペプチド（■）の高速液体クロマトグラフィ
ーのチャートである。 第６図は、ペプチド（１）の高速液体クロマトグラフィ
ーのチャートである。 第５図 第６図
に対する本発明のプロテアーゼ阻害剤の阻害効果を示す
グラフである。 第２図は、ラインライ−バー・パークプロットによる、
本発明のプロテアーゼ阻害剤の基質濃度による阻害効果
を示すグラフである。 第３図は、デイクソンプロットによる、本発明のプロテ
アーゼ阻害剤〔ペプチド（Ｉ）］の基質濃度による阻害
効果を示すグラフである。 第４図は、デイクソンプロットによる、本発明のプロテ
アーゼ阻害剤［ペプチド（■）］の基質濃度による阻害
効果を示すグラフである。 第５図は、ペプチド（■）の高速液体クロマトグラフィ
ーのチャートである。 第６図は、ペプチド（１）の高速液体クロマトグラフィ
ーのチャートである。 第５図 第６図
Claims (2)
- （１）下記のアミノ酸配列を有するペプチドまたはその
薬理学的に許容される塩。 【遺伝子配列があります】 - （２）少なくとも下記のアミノ酸配列を有するペプチド
またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とするプ
ロテアーゼ阻害剤。 【遺伝子配列があります】
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63310634A JPH02157294A (ja) | 1988-12-07 | 1988-12-07 | ペプチドおよびプロテアーゼ阻害剤 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63310634A JPH02157294A (ja) | 1988-12-07 | 1988-12-07 | ペプチドおよびプロテアーゼ阻害剤 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02157294A true JPH02157294A (ja) | 1990-06-18 |
Family
ID=18007616
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63310634A Pending JPH02157294A (ja) | 1988-12-07 | 1988-12-07 | ペプチドおよびプロテアーゼ阻害剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH02157294A (ja) |
-
1988
- 1988-12-07 JP JP63310634A patent/JPH02157294A/ja active Pending
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