JPH02161356A - 室内塵中ダニ抗原定量方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、アレルギー性疾患に係わる小児科、耳鼻咽喉
科、皮膚科、内科領域の医療及び刺咬による皮膚炎に係
わる皮膚科領域の医療さらには、大量発生による不快感
に係わる害虫駆除分野に利用できる室内塵中ダニ抗原定
量方法に関するものである。

〔従来の技術〕

従来、室内塵性ダニ類の免疫学的検出法に関しては特開
昭６３−１９１９６１が知られている。

〔発明が解決しようとする問題点〕

室内塵性ダニのうち、ヒヨウヒダニ類は、アレルギー性
疾患の原因、ツメダニ類は、刺咬症の原因、コナダニ類
は、不快感の原因である。それぞれの領域で目的に応じ
て室内塵中からこれらのダニ類を識別して定量する必要
があるが特開昭６３−１９１９６１ではポリクローナル
抗体のため識別が不可能であった。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明は、ヒヨウヒダニ類（主にコナヒヨウヒダニとヤ
ケヒヨウヒダニ）とケナガコナダニ類及びツメダニ類の
各特異抗原に対するモノクローナル抗体を作製し、鋭意
研究を重ねた結果、酵素免疫測定法を適用することによ
り、ヒヨウヒダニ類、ケナガコナダニ類及びツメダニ類
それぞれの抗原量を極めて正確に定量できる方法を見い
だし、この知見に基づいて本発明を完成した。

本発明は、室内塵性ダニ類に対する特異モノクローナル
抗体を用いることを特徴とするｊ′Ｓ） え・５．ジ１１） 室内塵中ダニ抗原定量方法である。

本発明における免疫学的検出法は、公知の免疫法たとえ
ば凛識物として蛍光化合物（色素）を結合した抗体を反
応させる蛍光抗体法あるいは発色反応を触媒する酵素を
結合した抗体を反応させる酵素免疫測定法（Ｉｍｓ＋ｕ
ｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９７１．Ｆｅ１８．ベージ
８７１参照）などいづれの方法を用いても良いが酵素免
疫測定法が好適である。

〔発明の詳細な説明〕

ダニ抗原の作製 オリエンタル酵母社製昆虫用Ｉ粉末を飼料として、２８
℃、相対湿度７５％で飼育したコナヒヨウヒダニＤｅｒ
＋＊ａｔｏ　ｈａ　ｏｉｄｅｓ　ｆａｒｉｎａｅ。

ヤケヒヨウヒダニＤｅｒｓ＋ａＬｏ　ｈａ　ｏｉｄｅｓ
　Ｌレリ］」」−５ｓＩｆｌＩＩｓ、ケナガコナダニｎ
二線４旺ｖ１エムじ−ｅｎｔｉａｅ、それぞれの飼育培
地から飽和食塩水浮遊法を用いてダニ個体を培地と分離
し、３０００ｒｐｍ、１０分の遠心を３回繰り返して余
剰の培地成分を十分に除く、クワガタッメダニリリ１±
ｅｔｕｓ　ｍａｌａｃｃｅｎｓｉｓは、ケナガコナダニ
を餌として同様の条件で飼育し、培地を大きめの琺瑯バ
ットの中央に盛り、はい出したものを洗剤を含んだ蒸留
水にて洗い流し、少しづつろ紙上に集める。こうし−て
得られたそれぞれのダニ生体を約１ｇ相当孔バチに入れ
、約５１のＰＢＳを加える。−８０℃で凍結後、乳棒で
約５分間処理する。ついで超音波ホモジナイザー（Ｎｌ
ｌｌ０ＮＳＥＩＫＩ　ＫＡＩＳＨＡ　ＬＴＤ、製ＵＳ−
３０１で約５分間処理した後、４’ＣＩｏ、０００ｒｐ
■、６０分間遠心分離を行い、上清を分取し、孔径０．
４５μｍのフィルターで除菌しダニ抗原液とする。

（２マウスの免疫 ＢＡＬＢ／ｃマウス（４週令）の皮下にダニ抗原液（タ
ンパク量：４ｍｇ相当）と完全フロイント・アジュバン
トを等量混合して注射する。

３週間後に２ｍｇの抗原を腹腔内に注射しく追加免疫）
、３日後の肺臓ｌｌ１Ｉ胞を細胞融合に用いる。

（３）　　ハイプリドーマの作製 ハイプリドーマの作製は、「単りローン抗体Ｊ−ハイブ
リドーマとＥＬＩＳＡ−（岩崎辰夫・安東民衛・市川か
おる・保井孝太部著）に準じて行う。

上述したダニ抗原免疫マウスの牌ｖａ＃！ｌ胞５ｘＩＯ
９個に対してあらかじめ培養しておいなミエローマ細＃
１Ｐ３−χ６３−＾にトＵ！（略称Ｐ３ｔｌｌ　＞を１
．５ＸＩ０７個を混合して遠心（１，００Ｏｒｐｍ、５
分）したのち、上清を可能な限り除き、遠心管の底を１
分間叩いて沈殿物をほぐす、これを３７℃に１分間置い
た後、あらかじめ３７℃に保温したポリエチレングリコ
ール４０００溶液（Ｍｅｒｃｋ　Ｃａｔ、Ｎｏ、９７２
７　ＰＥＧ４０００ガスクロマトグラフイー用を０．５
ｇ加圧滅菌したものに対してＲＰＭ１１６４０を０．５
１加えたもの）　０．３ｍｌを徐々に静かに加えて融合
させる。その後、ＩＩＩＥＭで融合細胞を洗浄し、ポリ
エチレングリコールを除く。沈殿物に１０％、ウシ胎児
血清（Ｆｅ２）を含むＲＩ’ＭＩ培地を加え希釈し、１
１当なりの細胞個数がｌＸｌ０’個に調製する。つぎに
この溶液を９６穴マイクロプレートに０．１ｍｌ／ウェ
ルづつ分注し、３７℃のＣ０２インキユベータ中で１８
時間培養後、ＩＩＡＴ選択培地ｑ （１０Ｍヒポキサン千ン、４Ｘ１０＝Ｍアミノプテリン
、１．６Ｘ１０−ゞ　閘チミジン）を０．１１加え、培
養を継続する。

ハイブリドーマ増殖が認められたウェルの抗体活性のチ
エツクは、上述したコナヒョウクワガタツメダニリＩｌ
ユｅイヒｍａｌａｃｃｅｎｓｉｓそれぞれのダニ抗原液
を０．１Ｍ炭酸−重炭酸ｕ清液（ｐＨ９，６＞で希釈し
、超音波ホモジナイザー（ＩｉｒｌｌＯＮＳＥＩｌｌＩ
　ＫＡ［５ｌｌＡ　ＬＴＤ、製υ５−３０＞で１分間処
理したものを０．ｌｓｌ　（１０μｇ（抗原タンパク量
）／ウエルンづつ加え、４℃、−晩コーティング処理し
たＥＬＩＳＡ用の９６穴マイクロプレートを用いて、Ｅ
ＬＩＳＡ間接法にスクリーニングで抗体陽性となったウ
ェルのハイプリドーマは４週令マウスの胸腺細胞をフィ
ーダー細胞に用いて、限界希釈法によってクローニング
を行う。

４４１　　ハイブリドーマの特異性検定上述した室内塵
中の主要ダニ類−コナヒヨウヒダニＤｅｒｍａｔｏ　ｈ
ａ　ｏｉｄｅｓ　ｆａｒｉｎａｅ、ヤケヒヨウヒダニＤ
ｅｒｍａｔｏ　ｈａ　ｏｔｄｅｓ　　ｔｃｒｏｎ　５ｓ
ｉｎｏｓケナガコナダニ江阻ル■往　ａｔ　ｅｓｃｅ　
ｔｉｉｅクワガタ・ツメダニｇ」シ！ｊ（１コＬ１」Ｌ
ｌ−ｍａ　ｌ　ａ　ｃ　ｃ　ｅ　ｎ　ｓ　ｔ　ｓのドー
マ細胞の培養上清を用いてＥＬＩＳＡ間接法に従って調
べる。

＋５１　　マウス腹水の作製 成熟ＢＡＬＢ／ｃマウス（８〜ｌＯ週令）の腹腔内にプ
リスタン〈２・６・１０・１４テトラメチルペンタデカ
ン、和光純薬工業）を０．５１注射する。Ｇ４１で特異
性の高かったハイプリドーマ細胞をあらかじめ培養して
おき、１〜２週間前にプリスタン処理されたマウス１頭
当なりＩ　ＸＩＯ″１個の細胞を接種する。１〜２週間
後に高力価のモノクローナル抗体を含む腹水８０種を得
る。

（６）　　モノクローナル抗体の精製 採取したマウス腹水から硫安塩析法によりグロブリン分
画を精製した後、過剰の硫安を除くためリン酸緩衝生理
食塩水で一晩透析する。

■　パーオキシダーゼ標識モノクローナル抗体の作製 モノクローナル抗体のパーオキシダーゼ標識法に関して
は、Ｎａｋａｎｅ、Ｐ、に、ａｎｄ　ｋａｗａｏｉ、Ａ
。

（Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅｌａｂｅｌｅｄ　ａｎｔｉｂｏ
ｄｙ、Ａ　ｎｅｗ　ｍｅｔｈｏｄｏｆ　ｃｏｍｊＢａｔ
ｔｏｎ、　Ｊ、旧ｓｔｏｃｈｅｍ、　ＣｙｔｏｃｈｅＩ
ｌ、。

２２：１０♂４−１０９１．１９７４＞の方法に準じて
行う。

８　モノクローナル抗体を用いた室内塵中のダニ抗原量
系の確立 モノクローナル抗体を室内塵中のダニ抗原定量に適用す
るため、手法の簡便さと検出感度が高いことからＥＬＩ
ＳＡ法を採取する。

また、モノクローナル抗体の選択においては目標となる
ダニ種のみに反応し、それ以外のダニ（室内に生息する
主な他の種類）には反応しないもの、もしくは、僅かし
か反応しないものという基準でスクリーニングを行って
候補を絞る。特にヒヨウヒダニ類の定量系の確立は、こ
れらが、小児喘息、アトピー性皮膚炎などの主要アレル
ゲンとして注目されており、また患者をアレルゲンから
遠ざけること、が最も重要な治療法であり客観的データ
に′・、） 基づく環境改善指導が望まれていることから最優先で行
う。具体的には、コナヒヨウヒダニ、ヤケヒヨウヒダニ
両者同程度に反応するモノクローナル抗体をスクリーニ
ングによりて選択し、それらのなかでケナガコナダニに
対して反応性の最も低いものを採用する。

〔実施例〕

実施例１ 実施例としてコナヒヨウヒダニ　し■１１（■−狂り匡
旦ｆ　ａ　ｒ　ｉ　ｎ　ａ　ｅを免疫源として用い、作
製したモノクローナル抗体の一つであるＩＥ３ＣＩＨの
反応性を示した。このモノクローナル抗体は、上述した
小児喘息などの主要アレルゲンとして室内塵中に含まれ
るコナヒヨウヒダニ、ヤケヒヨウヒダニを検出定量する
ＥＬＩＳＡ系を構築する場合に最も適した特性を有して
いた。

ａ、ダニ抗原をコーティング処理した反応プレートの作
製 コナヒヨウヒダニＤｅｒｍａｔｏ　ｈａ　ｏｉｄｅｓ　
ｆａｒｉｎ−ａｅ−、ヤケヒヨウヒダニＤｃｒ醜ａｔｏ
　ｈａ　ｏｉｄｅｓ　已１阻旺ル匡巨、ケナガコナダニ
に１吐仏註Ｕ±ｒｅｓｅｅｎｔｉａｅ、クワガタツメダ
ニｕは１ユ１いＩ−吐Ｉａｅｃｅｎｓｉｓそれぞれの４
種ダニ抗原液を０．１Ｍ炭酸−重炭酸＆Ｗ衝液（ｐＨ９
，６＞で希釈し超音波ホモナイザー（ＮＩＨＯＮＳ！１
ｌＫＩ　Ｋ＾ｌ５ＨＡ　ＬＴ口、製ＵＳ−３０）で１分
間処理したものを９６穴マイクロプレート（Ｎｕｎｃ社
製イムノプレート■）に０．１ｍｌ　（ウェル当りの抗
原タンパク量として１０μｇ）づつ加え、４℃、−晩コ
ーティング処理した後、０．０５％　Ｔｖｃｅｎ２０を
含むリン酸緩衝液（以下ＰＢＳツイーン液とする）で３
回洗浄しダニ抗原処理反応プレートとした。

ｂ、室内塵中に含まれる主要な４種ダニ抗原に対するモ
ノクローナル抗体ＩＥ３ＣＩＨの反応性試験 ｂ−１，−次反応 精製したＩＥ３ＣＩＨ抗体をＢ５Ａｌ％を含むＰＢＳツ
イーン溶液で１０００倍に希釈し、ダニ抗原反応プレー
トの各ウェルに１００μＩづつ分注し、３７℃の条件で
１時間インキュベートした。（この時、同じ試験区を２
区設け、結果は、それぞれの平均をとった。）ｂ−２，
二次反応 インキュベート後のプレートをＰＢＳツイーン溶液で３
回洗浄し、Ｂ５Ａｌ％を含むＰＢＳツイーン溶液で２０
００倍に希釈したパーオキシターゼ標識ヤギ抗マウスＩ
ｇＧ（カッベル社製）溶液を１００μｌづつ各ウェルに
加え、３７℃の条件下で１時間インキュベートした。

ｂ−３，三次反応 インキュベート後のプレートをＰＢＳツイーン溶液で３
回洗浄し、続けて蒸留水で３回洗浄した６次にＯＰＤ基
質溶液（１１当たりオルトフェニレンジアミン塩酸塩を
１．８１＋ｕと過酸化水素水（３０％）を含む０．１Ｍ
フォスフエイトバッファ溶液）を各ウェル１００μｉづ
つ加え、３７℃で２分間インキューベート後、２Ｍの硫
酸溶液を各ウェル５０μｍづつ加え反応を止めた。結果
の測定は、ＥＬＩＳＡリーダー（マイクロプレート用分
光光度計）にて４９０ｎｍの吸光度で測定した。

Ｃ０結果 第１表 ※結果は、２区の平均値 ヒヨウヒダニ属に対しては、はぼ同様の反応を示したが
、ケナガコナダニ、クワガタツメダニに対しては全く反
応を示さなかった。

この結果は、ＩＥ３ＣＩＨモノクローナル抗体の特異性
の高さを示している。

実施例２ 次に上記モノクローナル抗体ＩＥ３ＣＩＨを用いたサン
ドイッチＥＬＩＳＡ系を利用して室内塵中に含まれると
考えられる物質に対する非特異反応性を調べた結果を示
す、（第２表） ａ、モノクローナル抗体ＩＥ３ＣＨをコーティング処理
した抗体処理プレートの作製 腹水から精製した（６．　　）モノクローナル抗体ＩＥ
３ＣＩＨを０．１Ｍ炭酸−重炭酸緩衝液（ｐＨ９，６＞
で１０．０００倍希釈し、９６穴マイクロプレート（Ｎ
ｕｎｃ社製イムノプレート■）に０．１ｍｌ　（ウェル
当りのタンパク量として０．５　ｓａｇ）づつ各ウェル
に分注し、４℃、−晩コーティング処理した後、内容液
を捨て、ＰＢＳツイーン液で３回洗浄し、抗体処理反応
プレートとした。

ｂ、室内塵中に含まれると考えられる物質とその前処理
法 室内血中に含まれると考えられる物質としては、髪の毛
、フケ、ビスケット（菓子類の一つ）、羊毛、ふとん綿
、土壌の６種類を用いた。これらを乳鉢で約１０分間す
りつぶしたものを２０ｍｇ計りとり、Ｂ５Ａｌ％を含む
ＰＢＳツイーン溶液を２ｍｌ加え、超音波ホモジナイザ
ー（ＮＩＨＯＮＳｌｉＩＫＩ　ＫＡＩＳＨＡ　ＬＴＤ、
製ＵＳ−３０）で１分間処理したものを３．００Ｏｒｐ
ｍ、　１０分間遠心しその上清を抽出溶液として供試し
た。

Ｃ，モノクローナル抗体ＩＥ３ＣＩＨを用いたサンドイ
ッチＥＬＩＳＡ系における室内塵中に含丈れると考えら
れる物質に対する非特異反応性試験 Ｃ−１，−次反応 上述した１７種類の物質の抽出溶液を再び超音波ホモジ
ナイザー（ＮＩＨＯＮＳＥＩＫＩに＾ｌ５Ｉ（Ａ　　Ｌ
ＴＤ、製ＵＳ−３θ）で１分間処理し直ちにａ、で作製
し一ベートした。この時、対照として実施例１で使用し
たコナヒヨウヒダニ抗原液をウェル当たり５０μｇ相当
量を１００μｍ加えた。（実施例１と同様に結果は、２
区の平均をとった。） ｃ−２，二次反応 インキューベート後のプレートをＰＢＳツイーン溶液で
３回洗浄し、Ｂ５Ａｌ％を含むＰＢＳツイーン溶液でｔ
ｏ、ｏｏｏ倍に希釈したバーオキシターゼ標識モノクロ
ーナル抗体ＩＥ３ＣＩＨ溶液を１００μｌづつ各ウェル
に加え、３７℃の条件下で１時間インキュベートした。

Ｃ−３，三次反応 インキューベート後のプレートをＰＢＳツイーン溶液で
３回洗浄し、続けて蒸留水で３回洗浄した０次にＯＰＤ
基質溶液を各ウェル１００μｍづつ加え、３７℃で１０
分間インキュベート後、２Ｍの硫酸溶液を各ウェル５０
μＩづつ加え反応を止めた。結果の測定は、ＥＬＩＳＡ
リーダー（マイクロプレート用分光光度計）にて４９０
ｎｍの吸光度で測定した。

ｄ、結果 第２表 ※結果は、２区の平均値 ６種の物質に対して全く非特異反応を示さなかった。

実施例３ 次に上記モノクローナル抗体ＩＥ３ＣＩＨを用いたサン
ドイッチＥＬＩＳＡ系のコナヒヨウヒダニ、ヤケヒヨウ
ヒダニ抗原液とコナヒヨウヒダニの生ダニ、死ダニ個体
に対する反応性を示す。

ａ、生ダニ、死ダニの抗原液の作製 オリエンタル酵母社製昆虫Ｉ粉末を飼料として、２８℃
、相対湿度７５％で飼育したコナヒヨウヒダニとヤケヒ
ヨウヒダニ生ダニをそれぞれの飼育培地から飽和食塩水
浮遊法を用いて培地と分離し、浮上した生ダニを含むペ
ーストを清潔なシャーレに移し、琺瑯バットのまん中に
放置し、はい出したダニをＰＢＳツイーンで洗って回収
し、吸引濾過によって生ダニ個体を集めた。こうして得
られた生ダニを１１のＢ５Ａｌ％を含むＰＢＳツイーン
（中試験官）に適量懸濁し、その一部を正確にとって、
実体顕微鏡下でカウントし、１１当りのダニ個体数を計
算し、記録した。この生ダニ懸濁液をすぐに一２０℃に
保存し、供試時には、解凍後、超音波ホモジナイザー（
ＮＩＨＯＮＳＩｉＩＫＩに＾ｌ５ＩＩＡ　ＬＴＤ、製Ｕ
Ｓ−３０）で１分間処理したものを３．ＯＯＯｒｐｍ、
１０分間遠心し、その上清を生ダニ抗原液としな。

死ダニの処理法に関しては、ダニ個体数を記録した生ダ
ニ懸濁液を濾過し、ろ紙片（直径ｉｏａｍ）上に集め、
−１３５℃で２時間放置し、その後２５℃の乾燥器中で
約１カ月保存したものを死ダニとし、供試時には、再度
１１のＢ５Ａｌ％を含むＰＢＳツイーン（中試験管）に
死ダニを乗せたろ紙片をそのまま入れ、超音波ホモジナ
イザーで１分間処理したものを３０００ｒｐｍ、１０分
間遠心し、その上清を死ダニ抗原液とした。

ｂ−１，−次反応 コナヒヨウヒダニ、ヤケヒヨウヒダニ抗原液は、７段階
源度（５０，１？、５．１．７．０．５．０．１？。

０．０５μｇ相当量）を設け、実施例２−ａ、で作製し
た抗体処理反応プレートの該当ウェルにそれぞれ１００
μｍづつ分注した。生ダニ、死ダニの抗原液は、四散換
算で５００．１５０．５０　。

＋５．５，１．５，０．５，０．１５匹／ウェルの８段
階を設け、上記精製抗原液と同様に分注した０反応は、
３７℃の条件下で１時間インキュベートした。〈実施例
１．２と同様に結果は、２区の平均をとった。） ｂ−２，二次反応　　実施例２　（ｂ−２＞と同様ｂ−
３，三次反応実ｍ１Ｍ２（ｂ−３）ト同ｍＣ０結果 第３表 コナヒヨウヒダニ抗原液 ヤケヒヨウヒダニ抗原液 コナヒヨウヒダニ生ダニ抗原液 コナヒヨウヒダニ死ダニ抗原液 このサンドイッチＥＬＳＩＳＡ系の検出限界は、ウェル
当たり、コナヒヨウヒダニ抗原量として０．１７μｇ、
生ダニ、死ダニ四散換算で０．５匹という結果になった
。検出可能な上限をＯＤ値から推定すると１．０００匹
、すなわち室内１１１％１ｇ当りに換算すると１００匹
から２０．０００匹まで検出できることになり十分な実
用感度であった。

実施例４ 最後に上記サンドイッチＥＬＩＳＡ系を利用してＡ宅、
Ｂ宅、Ｃ宅の室内塵中に含まれるヒヨウヒダニ成分を定
量した実地試験結果を示す。

ａ、室内塵サンプルの採集とその前処理法供試した室内
塵サンプルは、家庭用の電気掃除機（紙パツク式）に新
しい紙パツクを装着し、採集した室内塵を１６メツシユ
のフルイにかけ、通過した細塵の０．１ｇを計りとり、
Ｂ５Ａｌ％を含むＰＢＳツイーン溶液を２１加え、超音
波ホモジナイザー（Ｎｉ１（ＯｌｌＪｌｉｌＫＩに＾ｌ
５ＨＡ　ＬＴＤ、製ＵＳ−３０＞で１分間処理したもの
を３０００ｒｐｍ、１０分間遠心し、その上清を室内塵
抽出溶液として合計４７サンプルを供試した。

ｂ、モノクローナル抗体ＩＥ３ＣＩＨを用いたサンドイ
ッチＥＬＩＳＡ系における室内塵中に含まれるヒヨウヒ
ダニ成分の定量試験ｂ−１．−次反応 室内塵サンプル抽出液は、実施例２−ａ。

で作製した抗体処理反応プレートのウェルに１００μｉ
づつ分注し、３７℃の条件下で１時間インキニーベート
しな、この時、対照として実施例１で使用したコナヒヨ
ウヒダニ抗原液の濃度段階を７段階を設け、ウェル当た
り５０．１７．５，１．７，０．５．０．１？、０．０
５μｇ相当量をそれぞれ１００μｍづつ加えた。（実施
例１．２と同様に結果は、２区の平均をとった。）ｂ−
２，二次反応 実施例２　（ｂ−２）と同様。

ｂ−３，三次反応 実施例２　（ｂ−３） と同様。

Ｃ１結果 〔発明の効果〕 本発明は、室内塵中のダニ類の抗原定量にモノクローナ
ル抗体を適用することにより、従来無し得なかった特定
のダニのみを正確に定量できるだけでなく、ダニの破片
やフンなどの医療分野で重要なアレルギー因子まで定量
が可能となったことは、大きな成果であった。また、手
技手法の簡便さから検査者の技量によるデータのばらつ
きも皆無であり、これは、データの比較検討を可能にし
、将来、臨床検査データの蓄積によるより客観的な環境
改善指導の可能性をも示唆する意味において室内塵中の
ダニ類の定量法として好適である。

特許出願人　　神東塗料株式会社

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 家屋塵性ダニ類に対する特異モノクローナル抗体を用い
   ることを特徴とする室内塵中ダニ抗原定量方法。