JPH02163086A - アシルポリアミンアミドヒドロラーゼおよびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は新規な特性を有するアシルポリアミンアミドヒ
ドロラーゼ、その製造法およびポリアミン定量用試薬に
関するものである。本発明のアシルポリアミンアミドヒ
ドロラーゼはアシルポリアミンのアミド結合を加水分解
し、ポリアミンを遊離する反応を触媒する酵素であり、
熱安定性に優れることを特徴とする。

プトレシン、スペルミジン、スペルミン等のポリアミン
は、広く生体中に存在し、細胞増殖に深い係わりをもつ
とされている。　１９７１年にラッセル等により癌患者
の尿中のポリアミンレベルが正常人に比べて有意に高い
ことが示されて〔キャンサージサーチ３１巻１５５５〜
１５５８（１９７１）　）以来、癌と体液中のポリアミ
ン濃度との相関性が注目されてきた。従って生体中のポ
リアミンを定量することは、癌の診断にとって有用であ
ると考えられており、その定量法として高速液体クロマ
トグラフィー酵素法等多くの方法が提案されてきた。

（従来の技術） ところで尿中のポリアミンは、多（の場合、遊離型では
なく、複合体として存在する。ポリアミン複合体の実体
は必ずしも明らかではないが、マーモードらによれば大
尿中のポリアミンはアセチル体（アシルポリアミン）と
して存在している〔ジャーナル・オブ・ファルマシュー
テイカル・サイエンス、６７巻１２号１６７１〜３　（
１９７８）　）と報告している。

従って尿中のポリアミンを定量する場合には、塩酸を用
いてアシルポリアミンを加水分解し、ポリアミンを遊離
の形にする必要がある。しかしながらこの方法は操作が
繁雑であり、ポリアミンの定量が一般化しなかった原因
の１つである。

これに対し、最近より簡便な前処理法として、ストレプ
トミセスアベラニウス（ＳｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓＡｖｅ
ｒａｎｉｕｓ）Ｒ−２０より得られ、アシルポリアミン
のアミド結合を加水分解する酵素、アシルポリアミンア
ミドヒドロラーゼ（特公昭５９−７４３５号公報）を用
いた遊離化法（特公昭６０−５０４３８号公報）や、ア
ルスロバクタ−・スピーシーズ（Ａｒｔｈｒｏｂａｃむ
ｏｒ　ＳＧ＋、）Ｎｌｌ１３−６２より得られたＮ−ア
セチルポリアミンアミドヒドロラーゼＭ（特開昭６０−
４３３８０号公報）を用いた遊離化法が報告されている
。この方法は、塩酸を用いる加水分解法に比べ、操作が
容易になったとは言え、これらの酵素は、熱安定性や、
Ｋｍ値の面で不十分であった。

例えばストレブトミセスアベランスＲ−２０のアシルポ
リアミンアミドヒドロラーゼはｐＨ７．８．１０分間処
理で３５℃まで安定であり、アルスロバクタ−・スピー
シーズＮ１１１３−６２由来のアセチルポリアミンアミ
ドヒドロラーゼＭはｐ　１１７　、０．１０分間処理で
３５℃まで安定である。そのため、尿中のポリアミンの
定量法において種々の不満足な点が存在した。

（発明が解決しようとする課題） 本発明者らは、上記の前景を踏まえ、公知のアシルポリ
アミンアミドヒドロラーゼよりも熱安定性の優れたアシ
ルポリアミンアミドヒドロラーゼを見い出そうと種々試
みた。

（問題を解決するための手段） 本発明者らは上記問題点を解決するため鋭意研究を重ね
た結果、ロイコノストック、属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓ〜ｔ
ｏｅ）　、アルカリネゲス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ
）またはリステリア属（Ｌｔｓｔｅｒｉａ）に属する微
生物から熱安定性に優れたアシルポリアミンアミドヒド
ロラーゼを見い出し、本発明を完成するに至った。

すなわち本発明は下記反応を触媒し、下記特性〔１〕お
よび〔２〕を有するアシルポリアミンアミドヒドロラー
ゼ、 アシルポリアミン十〇ｚＯ→ポリアミン十カルボン酸■
　ｐＨ７，５，１５分間処理で４０℃まで安定である。

■　至適ｐＨが７．５〜８．５である。

およびロイコノストック属、アルカリネゲス属またはリ
ステリア属に属し、上記アシルポリアミンアミドヒドロ
ラーゼの生産能を有する菌株を栄養培地にて培養し、該
培養物からアシルポリアミンアミドヒドロラーゼを採取
することを特徴とするアシルポリアミンアミドヒドロラ
ーゼの製造法および上記アシルポリアミンアミドヒドロ
ラーゼ及び遊離ポリアミンを測定する試薬を含有するポ
リアミン定量用試薬である。

本発明のアシルポリアミンアミドヒドロラーゼは下記の
特性を有する。

■　　作　　用 本酵素の作用は、下記の反応式のごとく、アシルポリア
ミンのアミド結合を加水分解し、ポリアミンを遊離させ
るものである。

アシルポリアミン＋Ｈ，０→ポリアミン＋カルボン酸■
　熱安定性 本酵素の熱に対する安定性はｐＨ７，５のリン酸緩衝液
中で１５分間処理で４０’Ｃまで安定であった（第１図
）。

■　至適ｐＨ 本酵素の至適ｐＨは７．５〜８．５にある（第２図）。

■Ｋｍ値 ｐＨ７．５の条件下、アセチルプトレシンに対する本酵
素のに＋値は７Ｘ１０−’Ｍである。

次に本酵素の活性測定法を示す。

０．２Ｍ　リン酸緩衝液ｐＨ７，５１０，５Ｉ１１０゜
２％　４−アミノアンチピリン　　　２．０ｄＯ０４％
　ＥＨ５ＰＴ　”’溶液　　　　　　　２．０ｄ９０１
／ｄ　　ペルオキシダーゼ溶液　　　２．０ｄ５００／
　ａｅ　　プレトキシオキシダーゼ溶液１．５ｄ２１．
０ｍ （傘）二Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スル
ホプロピル上記反応混液を調製した後、２．１ｔｌ！を
試験管に分取し、酵素ｉ８液０　、　８　ｍｌを添加し
、３７℃で５分間予備加温する。

次いで３０１アセチルプトレシン溶液０．１−を添加し
、ゆるやかに混和後、水を対照に、３７℃に制御された
分光光度計で５６５ｎｍにおける１分間当りの吸光変化
を求める（ΔＯＤＬｅｓｔ） 盲検はアセチルプトレシンの代りに０．２ＭＩＪン酸緩
衝液ｐＨ７．５をＱ．１ｍ１添加し、上記同様に操作を
行い、１分間当たりの吸光度変化を求める（ΔＯＤｂｌ
ａｎｋ　）。アシルポリアミンアミドヒドロラーゼ活性
は上記条件下で１分間に１μｍｏｌのポリアミンを生成
する（Ｈ．Ｏｆを生成する）酵素活性を１単位（Ｕ）と
し、次式により求められる。

４１、７６　　ｘ　％Ｘ　１．Ｏｃｍ　Ｘ　Ｏ．８ｆｆ
ｉｉ！＝（ΔＯＤｔｅｓｔ−ΔＯＤｂｌａｎｋ）　Ｘｏ
．１８Ｘ希釈倍率４１、７６：キノイミン色素のミリモ
ル分子吸光係数！４：酵素反応で生成した［０□の１分
子から形成するキノイミン色素は３分子であることによ
る係数 １、０：光路長 本発明におけるアシルポリアミンアミドヒドロラーゼは
、上記のような性質を有し、かかる性質は、アシルポリ
アミンよりのポリアミンの遊離型、さらには、尿中のポ
リアミンの定量に対し、非常に有用である。

上記のアシルポリアミンアミドヒドロラーゼは、ロイコ
ノストック属、アルカリネゲス属、またはリステリア属
に属し、アシルポリアミンアミドヒドロラーゼ生産能を
有する微生物を栄養培地に培養し、該培養物からアシル
ポリアミンアミドヒドロラーゼを採取することにより製
造することができる。

ロイコノストック属菌株としては例えばロイコノストッ
ク・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ　ｍｅ
−ｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）　ＡＴＣＣ　１４９３５な
どがあり、アルカリネゲス属苗株としてはアルカリゲネ
ス・フェカリス（Ａｌｅａｌｉｇｅｎｅｓ　ｆｅａｃａ
ｌｉｓ）　ＩＰｏ　１２６６９などがあり、リステリア
属菌株としては例えばリステリア・モノシトゲネス（Ｌ
ｉｓｔｅｒｉａ　ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）　ＩＤ
Ｄ　５７４などが挙げられる。

アシルポリアミンアミドヒドロラーゼ生産菌の培養に当
って使用する培地としては、使用菌株が資化し得る炭素
源、窒素源、無機物、その他必要な栄養素を適量含有す
るものであれば、合成培地、天然培地いずれも使用でき
る．例えば炭素源としては、グルコース、グリセロール
等が使用される。

窒素源としては、例えば、ペプトン類、肉エキス、酵母
エキス等の窒素含有天然物や、塩化アンモニウム、クエ
ン酸アンモニウム等の無機窒素含有化合物が使用される
。無機物としては、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム
、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム等が使用される．
また、アシルポリアミンアミドヒドロラーゼの生産誘導
物質として、アセチルプトレシン、ジアセチルプトレシ
ン等のアシルポリアミンを培地中に添加しておくことが
望ましい。

培地は通常振盪培養あるいは通気撹拌培養で行う．培養
温度は２０〜５０℃の範囲で、好ましくは３０〜４０℃
、培養ｐＨは５〜９の範囲で、好ましくは７〜８に制御
するのが良い．これら以外の条件下でも使用する菌株が
生育すれば実施できる．培養期間は通常１〜１０日で生
育し、菌体内にアシルポリアミンヒドロラーゼが生産蓄
積される。

本発明での酵素の精製法は一般に使用される精製法を用
いれば良い０例えば、抽出法には、超音波砕、ガラスピ
ーズを用いる機械的な破砕、フレンチプレス、界面活性
剤などいずれを用いてもよい。さらに抽出液については
、硫安や、芒硝などの塩析法、塩化マグネシウムや、塩
化カルシウムなどの金属凝集法、プロタミンや、ポリエ
チレンイミンなどの凝集法、さらには、ＤＥＡＥ　（ジ
エチルアミノエチル）−セファロース、ＣＭ　（カルボ
キシメチル）−セファロースなどのジオン交換体クロマ
ト法などにより精製することができる。またこれらの方
法で得られた粗酵素液や、精製酵素液は、例えば、スプ
レードライや凍結乾燥により、粉末化できる。さらには
、適当な担体に固定化して、固定化酵素として使用でき
る。

本発明の新規なアシルポリアミンアミドヒドロラーゼは
遊離ポリアミンを測定する試薬と組合せて使用すること
によりポリアミン定量用試薬とすることができる。

遊離ポリアミンを測定する試薬としては、ポリアミンオ
キシダーゼまたはプトレシンオキシダーゼ、これらの酵
素反応により生成した過酸化水素を測定する試薬、例え
ばペルオキシダーゼ、４アミノアンチピリンおよびフェ
ノール誘導体またはアニリン誘導体などを含む。ポリア
ミンオキシダーゼまたはプトレシンオキシダーゼの酵素
反応により生成したアミノアルキルアルデヒドを測定す
る試薬、例えばアミノアルキルアルデヒドロゲナーゼお
よびＮＡＤなどを含んでもよい。

本発明の新規なアシルポリアミンアミドヒドロラーゼが
熱安定性に優れることから、本発明のポリアミン定量用
試薬は保存安定性に優れ、ポリアミン定量時の発色感度
が高い。

（実施例） 以下実施例を挙げて本発明を具体的に示す。

実施例１ ジアセチルプトレシン０．５％、イースト・ニトロゲン
・ベース（Ｄｉｆｃｏ製）０．１％、チミン０．０１％
、ＮａＣｌ　０．５％、Ｍｇ５Ｏ，，７１１ｇ０　Ｏ，
０２％、リン酸緩衝液（ｐＨ７，５）　３０ｍＭを含む
墳地（ｐｔ１７．２）　Ｌｏｏｍを５００ｍＮ容坂ロフ
ラスコに移し、１２１℃ｌ２Ｏ分間オートクレーブを行
った０種菌として、リステリア・モノシトゲネス（Ｌｉ
ｓｔｅｒｉａ　ｍｏｎｏｓｙｔｏｇｅｎｅｓ）　１００
５７４１白金耳植菌し、３０″Ｃで２日間培養し、種培
養液とした０次に同培地３００　ｄを２１容坂ロフラス
コ１０本に移し、１２１℃ｌ２Ｏ分間オートクレーブを
行った。これに種培養液６Ｉｄを移し３０’Ｃで３日間
培養した。培養液３０００　ｍｌを遠心分離にて集菌し
、２０ＩＩＭリン酸緩衝液３００ｄに懸濁した。超音波
破砕機（久保田製）にて１５分処理し、遠心分離にてそ
の上清液３００　ｉｄを得た。得られた粗酵素液のアシ
ルポリアミンアミドヒドロラーゼ活性は１６．５ｎ＋Ｕ
／ａ！であった。粗酵素液をイオン交換クロマトグラフ
ィーにより分画し、濃縮し、３００／　ｄの酵素標品を
得た。

得られた酵素の理科学的性質は次の通りであった。

１、　熱安定性 本酵素の熱に対する安定性は、ｐ　１１７　、５のリン
酸緩衝液中で、各温度で１５分間処理で４０℃まで安定
で、５０℃では、約２０％の残存活性であった（第１図
）。

Ｚ　至適ｐＨ 本酵素の至適ρ！Ｉは７．５〜８．５にある（第２図）
。

３、１［ｍ値 ｐＨ７，５の条件下、アセチルプトレシンに対する本酵
素のＫｍ値は７ＸＩＯ−’Ｍである。

４、　化学物質の影響 本酵素は、第１表に上げた阻害剤、金属イオンにより、
２５℃１１時間後の残存活性で示すと次のような影響を
受けた。

第　　　　１　　　　表 実施例２ 実施例１で得られた酵素標品を用いて、下記の反応組成
からなる反応混液を用いて既知濃度のアセチルプトレシ
ン溶液の０．２ｄを添加し、３７℃で２０分間反応させ
００５６５におけるアセチルプトレシンに対する検量線
を作成した（第３図）。

０．２Ｍ　リン酸緩衝液ｐＨ７，５２２Ｏａｄ！０．２
％　４−アミノアンチピリン　　　　　０．２ｄＯ０４
％　ＥＨ５ＰＴ　　　　　　　　　　　　　０．２ｄ９
０Ｕ／戚　ペルオキシダーゼ　　　　　　　０．２ｄ５
００／　ｄ　　プトレシンオキシダーゼ　　　Ｏ，１ｄ
３０Ｕ／戚　　本発明のアシルポリアミン　　０．１−
アミドヒドロラーゼ 試料　　　　　　　　　　　　０．２ｄ検量線は、５６
５ｎｍの吸光度でアセチルプトレシン１２０μＭ（１ｉ
１濃度）まで直線性を示した。

実施例３ ０イコノストツク・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏ
ｓｔｏｃ　ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）ＡＴＣＣ１４
９３５を、実施例１と同様に培養し、得られたアシルポ
リアミンアミドヒドロラーゼについても同様の特性を得
た。

実施例４ アルカリゲネス・フェカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ
　ｒｅｃａｌｉｓ）ＩＦＯ１２６６９を実施例１と同様
に培養し、得られたアシルポリアミンアミドヒドロラー
ゼについても同様の特性を得た。

（発明の効果） 本発明のアシルポリアミンアミドヒドロラーゼは上記の
ような性質を有するが、ｐＨ７，５でアセチルプトレシ
ンに対するに一値が７Ｘ１０−’Ｍと小さく、至適ｐＨ
が７．５〜８．５と弱いアルカリアシルポリアミンアミ
ドヒドロラーゼはアシルポリアミンからポリアミンを遊
離させ、さらには尿中のポリアミンの定量に対し非常に
有用である。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明のアシルポリアミンアミドヒドロラーゼ
の熱安定性を示す。 第２図は本発明のアシルポリアミンアミドヒドロラーゼ
の至適ｐＨを示す。図中Ｏ−Ｏは０．２１リン酸緩衝液
、拳−・は７０ｍＭ　トリス−ＨＣｌ緩衝液を示す。 第３図はアセチルプトレシンに対する検量線を示す。 特許出願人　　東洋紡績株式会社 嬰　１　図 早　２　図 ↓、４９Ｌ　（℃ン Ｈ

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記反応を触媒し、下記特性〔１〕および〔２〕
   を有するアシルポリアミンアミドヒドロラーゼ。 アシルポリアミン＋Ｈ＿２Ｏ→ポリアミン＋カルボン酸 〔１〕ｐＨ７．５，１５分間処理で４０℃まで安定であ
   る。 〔２〕至適ｐＨが７．５〜８．５である。
2. （２）ロイコノストック属、アルカリネゲス属、または
   リステリア属に属し、特許請求の範囲第１項記載のアシ
   ルポリアミンアミドヒドロラーゼの生産能を有する菌株
   を栄養培地にて培養し、該培養物からアシルポリアミン
   アミドヒドロラーゼを採取することを特徴とするアシル
   ポリアミンアミドヒドロラーゼの製造法。
3. （３）下記反応を触媒し、下記特性〔１〕および〔２〕
   を有するアシルポリアミンアミドヒドロラーゼ及び遊離
   ポリアミンを測定する試薬を含有するポリアミン定量用
   試薬。 アシルポリアミン＋Ｈ＿２Ｏ→ポリアミン＋カルボン酸
   〔１〕ｐＨ７．５，１５分間処理で４０℃まで安定であ
   る。 〔２〕至適ｐＨが７．５〜８．５である。