JPH0284178A - Ｎ−アセチルヘキソサミンデヒドロゲナーゼ、その製造法及び該酵素を用いるｎ−アセチルグルコサミン又はｎ−アセチルガラクトサミンの定量法及びその定量用キット - Google Patents
Ｎ−アセチルヘキソサミンデヒドロゲナーゼ、その製造法及び該酵素を用いるｎ−アセチルグルコサミン又はｎ−アセチルガラクトサミンの定量法及びその定量用キットInfo
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- JPH0284178A JPH0284178A JP63234746A JP23474688A JPH0284178A JP H0284178 A JPH0284178 A JP H0284178A JP 63234746 A JP63234746 A JP 63234746A JP 23474688 A JP23474688 A JP 23474688A JP H0284178 A JPH0284178 A JP H0284178A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〈産業上の利用分野〉
本発明は、Ｎ−７セチルグルコサミン又はＮ −アセチ
ルガラクトサミンに作用して、Ｎ−７セチルグルコサミ
ノラクトン又はＮ−アセチルガラクトサミノラクトンに
すると共に、酸化型ニコチンアミド・アデニン・ジヌク
レオチド（ＮＡＤ ）を還元型 ニコチンアミド・アデ
ニン・ジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）に還元する、新規な
Ｎ−アセチルヘキソサミンデヒドロゲナーゼ（以下Ｎ
−ＡＨＤＨという）とその製造法及びＮ −ＡＨＤＨを
用いるＮ−７セチルグルコサミン又はＮ−アセチルガラ
クトサミンの酵素的定量方法、及びその定量用キットに
関するものである。
ルガラクトサミンに作用して、Ｎ−７セチルグルコサミ
ノラクトン又はＮ−アセチルガラクトサミノラクトンに
すると共に、酸化型ニコチンアミド・アデニン・ジヌク
レオチド（ＮＡＤ ）を還元型 ニコチンアミド・アデ
ニン・ジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）に還元する、新規な
Ｎ−アセチルヘキソサミンデヒドロゲナーゼ（以下Ｎ
−ＡＨＤＨという）とその製造法及びＮ −ＡＨＤＨを
用いるＮ−７セチルグルコサミン又はＮ−アセチルガラ
クトサミンの酵素的定量方法、及びその定量用キットに
関するものである。
〈従来の技術〉
細胞表層や体液中の蛋白質等に結合して存在する複合糖
質が生体制御の情報を担っていることが知られて以来、
複合糖質の研究は急速な発展を見せている。その結果、
生体制御の異常と複合糖質の構造異常との関係も少しづ
つ判明してきている。
質が生体制御の情報を担っていることが知られて以来、
複合糖質の研究は急速な発展を見せている。その結果、
生体制御の異常と複合糖質の構造異常との関係も少しづ
つ判明してきている。
又、一連のムコ多糖や複合糖質の代謝異常にょリムコ多
糖類が尿中に多量に排出されたり、組織に蓄積されたり
する場合があり、その原因を特定するためにも、それら
の糖類の構造研究は重要である。
糖類が尿中に多量に排出されたり、組織に蓄積されたり
する場合があり、その原因を特定するためにも、それら
の糖類の構造研究は重要である。
又、臨床検査の上においては、腎障害の程度や障害部位
を特定するため、β−Ｎ−７セチルグルコサミニダーゼ
やリゾチーム等、Ｎ−７セチルグルコサミン代謝系の酵
素活性が盛んに測定されている。
を特定するため、β−Ｎ−７セチルグルコサミニダーゼ
やリゾチーム等、Ｎ−７セチルグルコサミン代謝系の酵
素活性が盛んに測定されている。
これらの研究や酵素活性の測定は、Ｎ−アセチルグルコ
サミンの定量が重要な部位を占めており、その優れた測
定法が当業者から要望されていた。
サミンの定量が重要な部位を占めており、その優れた測
定法が当業者から要望されていた。
Ｎ−７セチルグルコサミンの定量は、−船釣には化学的
な方法（例えば、モーガンーエルフン法など）で測定さ
れているが、酵素を用いた方法が精度と簡便性において
優れている。その例としては、Ｎ−７セチルヘキソサミ
ン酸化酵素を用いる特開昭５９−１５６２９９号がある
。これはＮ−７セチルヘキソサミンにＮ−７セチルヘキ
ソサミン酸化酵素を作用させて生成された過酸化水素等
の産物を測定するか、又は反応に伴って吸収された酸素
を測定することによって、Ｎ−７セチルヘキソサ。
な方法（例えば、モーガンーエルフン法など）で測定さ
れているが、酵素を用いた方法が精度と簡便性において
優れている。その例としては、Ｎ−７セチルヘキソサミ
ン酸化酵素を用いる特開昭５９−１５６２９９号がある
。これはＮ−７セチルヘキソサミンにＮ−７セチルヘキ
ソサミン酸化酵素を作用させて生成された過酸化水素等
の産物を測定するか、又は反応に伴って吸収された酸素
を測定することによって、Ｎ−７セチルヘキソサ。
ミンを定量するものである。
〈発明が解決しようとする問題点〉
しかし、該Ｎ−７セチルヘキソサミン酸化酵素は基質特
異性が比較的広いため、Ｎ、Ｎ’−ジアセチルキトビオ
ース等にも作用を示すことが分っている。この糖はβ−
Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの１回の作用で２分子
のＮ−アセチルグルコサミンを生成するため、酵素活性
の高感度測定を行なうのに優れた基質であるが、前述の
理由のために、例えば、尿中のβ−Ｎ−アセチルグルコ
サミニダーゼを測定する場合の基質として用いることは
出来なかった。
異性が比較的広いため、Ｎ、Ｎ’−ジアセチルキトビオ
ース等にも作用を示すことが分っている。この糖はβ−
Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの１回の作用で２分子
のＮ−アセチルグルコサミンを生成するため、酵素活性
の高感度測定を行なうのに優れた基質であるが、前述の
理由のために、例えば、尿中のβ−Ｎ−アセチルグルコ
サミニダーゼを測定する場合の基質として用いることは
出来なかった。
又、尿中に存在する還元性物質は過酸化水素の定量系に
対して影響を与えることが知られており、そのため測定
精度が多少低下する場合があった。しかしＮＡＤＨ定量
系の場合には、その様な物質の影響は殆どないことが解
かっている。このため測定試料の前処理や測定系の工夫
を最小限に留めることが可能であり、より精度の高い定
量を行なうことが出来る。
対して影響を与えることが知られており、そのため測定
精度が多少低下する場合があった。しかしＮＡＤＨ定量
系の場合には、その様な物質の影響は殆どないことが解
かっている。このため測定試料の前処理や測定系の工夫
を最小限に留めることが可能であり、より精度の高い定
量を行なうことが出来る。
本発明者等は、この点に着目して改良されたＮ−７セチ
ルヘキソサミンの酵素的測定法の開発を目的として、Ｎ
−７セチルグルコサミン定量用酵素を検索した。その結
果、土壌から分離したシェードモナス属に属する１細菌
にＮ−７セチルグルコサミン又はＮ−アセチルガラクト
サミンに作用して、それぞれＮ−７セチルグルコサミノ
ラクトン又はＮ−アセチルガラクトサミノラクトンにす
ると共に、共存するＮＡＤ をＮＡＤＨに還元する新規
な酵素Ｎ −ＡＨＤＨが含まれていることを発見した。
ルヘキソサミンの酵素的測定法の開発を目的として、Ｎ
−７セチルグルコサミン定量用酵素を検索した。その結
果、土壌から分離したシェードモナス属に属する１細菌
にＮ−７セチルグルコサミン又はＮ−アセチルガラクト
サミンに作用して、それぞれＮ−７セチルグルコサミノ
ラクトン又はＮ−アセチルガラクトサミノラクトンにす
ると共に、共存するＮＡＤ をＮＡＤＨに還元する新規
な酵素Ｎ −ＡＨＤＨが含まれていることを発見した。
そして、その酵素が７セチルキトビオースには作用しな
いことを確認し、新規なＮ−アセチルグルコサミン又は
Ｎ−アセチルガラクトサミンの酵素的定量に応用出来る
ことを見出して、本発明を完成させた。
いことを確認し、新規なＮ−アセチルグルコサミン又は
Ｎ−アセチルガラクトサミンの酵素的定量に応用出来る
ことを見出して、本発明を完成させた。
すなわち本発明はＮ−アセチルグルコサミンとＮ−アセ
チルガラクトサミンに作用して、それぞれＮ−７セチル
グルコサミノラクトンとＮ−アセチルガラクトサミノラ
クトンにすると共に、ＮＡＤをＮＡＤＨに還元する新規
な酵素Ｎ −Ａ）［）Ｈであり、又、本発明はシュード
モナス属に属し、Ｎ−ＡＨＴ）Ｈ生産能を有する菌株を
培地に培養し、培養物よりＮ −ＡＨＤＨを採取するこ
とを特徴とするＮ −ＡＨＤＨの製造法である。
チルガラクトサミンに作用して、それぞれＮ−７セチル
グルコサミノラクトンとＮ−アセチルガラクトサミノラ
クトンにすると共に、ＮＡＤをＮＡＤＨに還元する新規
な酵素Ｎ −Ａ）［）Ｈであり、又、本発明はシュード
モナス属に属し、Ｎ−ＡＨＴ）Ｈ生産能を有する菌株を
培地に培養し、培養物よりＮ −ＡＨＤＨを採取するこ
とを特徴とするＮ −ＡＨＤＨの製造法である。
モして又、本発明はＮ−アセチルグルコサミン又はＮ〜
ルアセチルガラクトサミン有試料にＮ−ＡＨＤＨを作用
させ、生成するＮＡＤＨを測定するＮ−アセチルグルコ
サミン又はＮ−アセチルガラクトサミンの定量方法であ
り、又、少なくともＮ−ＡＩＩＤＨ、ＮＡＤ 及び緩衝
液を含む定量用キットである。
ルアセチルガラクトサミン有試料にＮ−ＡＨＤＨを作用
させ、生成するＮＡＤＨを測定するＮ−アセチルグルコ
サミン又はＮ−アセチルガラクトサミンの定量方法であ
り、又、少なくともＮ−ＡＩＩＤＨ、ＮＡＤ 及び緩衝
液を含む定量用キットである。
く問題点を解決するための手段〉
以下本発明を具体的に説明する。
本発明における新規酵素Ｎ −ＡＨＤＨの理化学的性質
は下記の通りである。
は下記の通りである。
（１１作用及び基質特異性
次の反応式に示されるごとく、Ｎ−アセチルグルコサミ
ン又はＮ−アセチルガラクトサミンをＮＡＤトの共存下
でＮ−アセチルグルフサミノラクトン又はＮ−アセチル
ガラクトサミノラクトンに酸化すると共に、ＮＡＤをＮ
ＡＤＨに還元する。
ン又はＮ−アセチルガラクトサミンをＮＡＤトの共存下
でＮ−アセチルグルフサミノラクトン又はＮ−アセチル
ガラクトサミノラクトンに酸化すると共に、ＮＡＤをＮ
ＡＤＨに還元する。
Ｎ−７セチルグルコサミン ＋ ＮＡＤ −→（
Ｎ−アセチルガラクトサミン〉 Ｎ−７セチルグルコサミノラクトン十 ＮＡＤＨ＋
Ｈ＋（Ｎ−アセチルガラクトサミノラクトン）Ｎ−アセ
チルマンノサミンに極めて僅かに作用する他は、Ｎ、Ｎ
’−ジアセチルキトビオースやヘキソサミン、中性糖に
対しては全く、もしくは殆ど作用しな（・。
Ｎ−アセチルガラクトサミン〉 Ｎ−７セチルグルコサミノラクトン十 ＮＡＤＨ＋
Ｈ＋（Ｎ−アセチルガラクトサミノラクトン）Ｎ−アセ
チルマンノサミンに極めて僅かに作用する他は、Ｎ、Ｎ
’−ジアセチルキトビオースやヘキソサミン、中性糖に
対しては全く、もしくは殆ど作用しな（・。
（２）至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲
リン酸緩ｉｔ液、トリス−塩酸緩衝液、グリシン−苛性
ソーダ緩衝液を用いて酵素活性を測定した結果は第１図
に示すとおりで、至適ｐＨは８．０〜１０．５である。
ソーダ緩衝液を用いて酵素活性を測定した結果は第１図
に示すとおりで、至適ｐＨは８．０〜１０．５である。
安定ｐＨ範囲は第２図に示すごと＜８，０〜１１．５で
ある。
ある。
使用緩衝液はリン酸カリウム緩衝液、トリス−塩酸緩衝
液、グリシン−苛性ソーダ緩衝液である。
液、グリシン−苛性ソーダ緩衝液である。
（３）作用適温の範囲
第３図に示すごと＜ ３０〜６０’Ｃである。
（４１ｐＨ、温度等による失活の条件
第４図に示すごと＜ 、０．１ Ｍ グリシン−苛性ソ
ーダ緩衝液（ｐＨ９，５）の中では、１０分間の熱処理
では５５°Ｃまで安定であり、６５“Ｃ以上では急速に
失活する。４５°Ｃ１１０分間の熱処理ではｐＨ８，０
〜１１．５で安定であるが、ｐＨ６，０以下では特に不
安定である。
ーダ緩衝液（ｐＨ９，５）の中では、１０分間の熱処理
では５５°Ｃまで安定であり、６５“Ｃ以上では急速に
失活する。４５°Ｃ１１０分間の熱処理ではｐＨ８，０
〜１１．５で安定であるが、ｐＨ６，０以下では特に不
安定である。
（５）阻害剤の影響及び安定化
上表は各種金属イオン及び阻害剤を２ ｍＭの濃度で含
有する反応液中での酵素活性を測定したものである。活
性化及び安定化のために特別に寄与する物質は知られて
いない。
有する反応液中での酵素活性を測定したものである。活
性化及び安定化のために特別に寄与する物質は知られて
いない。
（６）精製方法
本酵素の単離・精製は常法に従って行なうことができ、
例えばＤＥＡＥ −セルロースを用いたカラムクロマト
グラフィー、硫安沈殿、ＤＥＡＥ −セファデックス
を用いたカラムクロマトグラフィー、セファデックスＧ
−２００にヨルケル濾過等の精製手段を単独もしくは適
宜組合わせて使用する。
例えばＤＥＡＥ −セルロースを用いたカラムクロマト
グラフィー、硫安沈殿、ＤＥＡＥ −セファデックス
を用いたカラムクロマトグラフィー、セファデックスＧ
−２００にヨルケル濾過等の精製手段を単独もしくは適
宜組合わせて使用する。
（７）分子量
０．０５Ｍ）リス−塩酸緩衝液（０，１Ｍ ＮａＣ１含
有） ヲ用いてセファデックスＧ−２００のカラムによ
るゲル濾過法により測定した値は約１２万〜１３万であ
る。
有） ヲ用いてセファデックスＧ−２００のカラムによ
るゲル濾過法により測定した値は約１２万〜１３万であ
る。
（８）ポリアクリルアミドゲル電気泳動７．５％ポリア
クリルアミドゲルを用いて常法によってアクリルアミド
ディスク電気泳動を行なった結果、第５図に示すごとく
、はぼ単一のバンドが認められた。７．５％ポリアクリ
ルアミドゲルでブロムフェノールブルーを指標とした時
、相対移動度は０．４１である。
クリルアミドゲルを用いて常法によってアクリルアミド
ディスク電気泳動を行なった結果、第５図に示すごとく
、はぼ単一のバンドが認められた。７．５％ポリアクリ
ルアミドゲルでブロムフェノールブルーを指標とした時
、相対移動度は０．４１である。
（９）等電点
アクリルアミドゲル焦点電気泳動により測定した値は４
．７である。
．７である。
（１１活性の測定法
０．１Ｍグリシン−苛性ソーダ緩衝液（ｐＨ９，５）１
．８ｍ／に６０ ｍＭ ＮＡＤ 溶液０．１ｍ／を加え
る。３７°Ｃに１０分間保った後、酵素液ｌＯμｌを加
え、続いて０．３ＭＮ−７セチルグルフサミン溶液０．
ＩＭｔを加え混合して、反応を始める。直ちに３７°Ｃ
に保った吸光度測定用セル（１ｃ＋＋＋光路）に移し、
３４０ ｎｍ の波長で１分ごとに５分または必要で
あればそれ以上の時間にわたって吸光度を測定する。１
単位は１分間に１μモルのＮＡＤＨを生成させる酵素量
である。
．８ｍ／に６０ ｍＭ ＮＡＤ 溶液０．１ｍ／を加え
る。３７°Ｃに１０分間保った後、酵素液ｌＯμｌを加
え、続いて０．３ＭＮ−７セチルグルフサミン溶液０．
ＩＭｔを加え混合して、反応を始める。直ちに３７°Ｃ
に保った吸光度測定用セル（１ｃ＋＋＋光路）に移し、
３４０ ｎｍ の波長で１分ごとに５分または必要で
あればそれ以上の時間にわたって吸光度を測定する。１
単位は１分間に１μモルのＮＡＤＨを生成させる酵素量
である。
以上のように本酵素はその作用及び基質特異性において
従来全く知られていない新規な酵素である。
従来全く知られていない新規な酵素である。
次に本発明による新規な酵素Ｎ−ＡＨＤＨの製造法につ
いて説明する。使用される微生物はンエードモナス属に
属し、Ｎ−Ａ［）Ｈ生産能を有する菌株であって、その
具体例としては、シュードモナスｓｐ、Ｎ＆５３が挙げ
られ、原菌の変種もしくは変異株も用いられる。シュー
ドモナスｓｐ、Ｆｋ５３は本発明者等が土壌中より分離
した菌株であり、その菌学的性質は下記の通りである。
いて説明する。使用される微生物はンエードモナス属に
属し、Ｎ−Ａ［）Ｈ生産能を有する菌株であって、その
具体例としては、シュードモナスｓｐ、Ｎ＆５３が挙げ
られ、原菌の変種もしくは変異株も用いられる。シュー
ドモナスｓｐ、Ｆｋ５３は本発明者等が土壌中より分離
した菌株であり、その菌学的性質は下記の通りである。
（ａ）形態
顕微鏡的観察（０，４％酵母エキスを加えた加糖ブイヨ
ン培地に３０″Ｃ１１８時間培養した）■細胞の大きさ
：１．Ｏ〜１．Ｉ Ｘ １．４〜２．６ミクロンの桿菌 ■細胞の多形性：球状に近いものから比較的長い桿状の
ものまである。末端で つながった２連鎖状のものは見ら れるが、それ以上の連鎖は見られ ない。
ン培地に３０″Ｃ１１８時間培養した）■細胞の大きさ
：１．Ｏ〜１．Ｉ Ｘ １．４〜２．６ミクロンの桿菌 ■細胞の多形性：球状に近いものから比較的長い桿状の
ものまである。末端で つながった２連鎖状のものは見ら れるが、それ以上の連鎖は見られ ない。
■運動性：直線状の早い運動をする。（極鞭毛）
■胞子の有無：形成せず。
■ ダラム染色性：陰性
■抗酸性：陰性
（ｂ） 各培地における生育状態
■肉汁寒天平板培養＝３０°Ｃ，３日間の培養で直径１
．５龍の白茶色の金縁、コン ベックスの半透明なコロニーを作 る。色素の生成は見られない。
．５龍の白茶色の金縁、コン ベックスの半透明なコロニーを作 る。色素の生成は見られない。
■酵母エキス添加（０，４％）加糖肉汁寒天平板培養：
３０°Ｃ，３日間で直径２．１朋白茶色の金縁、コンベ
ックスの半透明な コロニーを作る。
３０°Ｃ，３日間で直径２．１朋白茶色の金縁、コンベ
ックスの半透明な コロニーを作る。
■酵母エキス添加（０，４％）加糖肉汁寒天斜面培養：
３０°Ｃ１２４時間の培養で良好に生育する。表面平滑
で脂肪光沢があ り、半透明である。
３０°Ｃ１２４時間の培養で良好に生育する。表面平滑
で脂肪光沢があ り、半透明である。
■酵母エキス添加（０，４％）加糖肉汁液体培地：静置
培養では極めて生育が悪く、３゜°Ｃ１２日間で、僅か
に表面に菌膜 らしいものが生じ、時間がたつと 沈殿する。振盪培養を行なうと、 ３０°Ｃ１２４時間で均一によく生育 する。
培養では極めて生育が悪く、３゜°Ｃ１２日間で、僅か
に表面に菌膜 らしいものが生じ、時間がたつと 沈殿する。振盪培養を行なうと、 ３０°Ｃ１２４時間で均一によく生育 する。
■肉汁ゼラチン穿刺培養：２４°Ｃ，３日間で僅かに生
育するがゼラチンの液化は しない。
育するがゼラチンの液化は しない。
■ リドマスミルク＝３０°Ｃ，５日間で僅かに酸性反
応を示し、弱く凝固し、上゛に 透明液を分離した。
応を示し、弱く凝固し、上゛に 透明液を分離した。
生理的性質
硝酸塩の還元二陰性
脱窒反応：陰性
ＭＲテスト：陰性
ＶＰテスト：陰性
インドールの生成：陰性
硫化水素の生成：陽性（酢酸鉛試験紙）デンプンの加水
分解：陰性 クエン酸の利用：陰性 無機窒素源の利用：陰性 色素の生成：陰性 ウレアーゼ：陰性 オキシダーゼ：陽性 カタラーゼ：陽性 ０生育の範囲＝１３°Ｃ〜３６°Ｃ（至適温度２９°Ｃ
）ｐＨ４，６〜８．５（至適ｐＨ、中性付近）■酸素に
対する態度：極めて好気的 ＠Ｏ−Ｆテスト二酸化的 ■糖類から酸及びガスの生成： Ｌ−７ラビノース Ｄ−キシロース Ｄ−グルコース Ｄ−マンノース Ｄ−フラクトース Ｄ−ガラクトース 麦 芽 糖 庶 糖 乳 糖 トレハロース Ｄ−ソルビット Ｄ−マンニット イノジット グリセリン デンプン （ｄ） その他の性質 ■ポリーβ−ハイドロキシブチル酸エステルを蓄積しな
い。
分解：陰性 クエン酸の利用：陰性 無機窒素源の利用：陰性 色素の生成：陰性 ウレアーゼ：陰性 オキシダーゼ：陽性 カタラーゼ：陽性 ０生育の範囲＝１３°Ｃ〜３６°Ｃ（至適温度２９°Ｃ
）ｐＨ４，６〜８．５（至適ｐＨ、中性付近）■酸素に
対する態度：極めて好気的 ＠Ｏ−Ｆテスト二酸化的 ■糖類から酸及びガスの生成： Ｌ−７ラビノース Ｄ−キシロース Ｄ−グルコース Ｄ−マンノース Ｄ−フラクトース Ｄ−ガラクトース 麦 芽 糖 庶 糖 乳 糖 トレハロース Ｄ−ソルビット Ｄ−マンニット イノジット グリセリン デンプン （ｄ） その他の性質 ■ポリーβ−ハイドロキシブチル酸エステルを蓄積しな
い。
■蛍光性色素を生成しない。
０４０°Ｃで生育しない。
■Ｈ２をエネルギー源として利用しない。
■アルギニンシバイド−ラーゼを生産しない。
以上の新規なＮ −ＡＨＤＨ生産能を有する本菌の分類
学的諸性質を「パージエイズ・マニュアル・オブ・シス
テマチック・バクテリオロジー」（１９８４年）第１巻
の分類と対比すると、本菌はダラム染色性が陰性、好気
性の無胞子桿菌で極鞭毛を持つ、カタラーゼ陽性菌であ
ることから、シェードモナス属に属すると思われる。菌
体内にポリ−β−ハイドロキシブチレートを蓄積せず、
黄色色素や蛍光性物質も生産せず、生育にグルコースを
利用する、４０°Ｃで生育しない等の性質から、’／ニ
ードモナス スツツセリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓ
ｔｕｔｚｅｒｉ ）に近縁であると思われる。しかしな
がら、脱窒反応１．デンプン分解反応、トレハロースの
利用などの点で異なっており、従来知られていない新規
な菌株と思われる。
学的諸性質を「パージエイズ・マニュアル・オブ・シス
テマチック・バクテリオロジー」（１９８４年）第１巻
の分類と対比すると、本菌はダラム染色性が陰性、好気
性の無胞子桿菌で極鞭毛を持つ、カタラーゼ陽性菌であ
ることから、シェードモナス属に属すると思われる。菌
体内にポリ−β−ハイドロキシブチレートを蓄積せず、
黄色色素や蛍光性物質も生産せず、生育にグルコースを
利用する、４０°Ｃで生育しない等の性質から、’／ニ
ードモナス スツツセリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓ
ｔｕｔｚｅｒｉ ）に近縁であると思われる。しかしな
がら、脱窒反応１．デンプン分解反応、トレハロースの
利用などの点で異なっており、従来知られていない新規
な菌株と思われる。
以上の理由により本菌をシェードモナスｓｐ、 Ｎｈ５
３と命名した。なお、シェードモナスｓｐ、ＮＬＬ５３
は通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所に微工研
条寄第２０５７号（ＦＥＲＭ ＢＰ−２０５７）として
寄託されている。
３と命名した。なお、シェードモナスｓｐ、ＮＬＬ５３
は通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所に微工研
条寄第２０５７号（ＦＥＲＭ ＢＰ−２０５７）として
寄託されている。
次に本発明で使用する培地としては、炭素源、窒素源、
無機物、その他の栄養素を適宜含有する培地ならば、合
成培地又は天然培地のいずれでも使用可能である。炭素
源としてはグルコース、ガラクトース、フラクトース等
を用いることができる。窒素源としてはペプトン、カゼ
イン消化物、グルタミン酸、酵母エキス等の窒素性有機
物が好適に使用できる。無機物としては、ナ） ＩＪウ
ム、カリウム、マグネシウム、マンガン、カルシウム、
鉄等の塩類が使用できる。
無機物、その他の栄養素を適宜含有する培地ならば、合
成培地又は天然培地のいずれでも使用可能である。炭素
源としてはグルコース、ガラクトース、フラクトース等
を用いることができる。窒素源としてはペプトン、カゼ
イン消化物、グルタミン酸、酵母エキス等の窒素性有機
物が好適に使用できる。無機物としては、ナ） ＩＪウ
ム、カリウム、マグネシウム、マンガン、カルシウム、
鉄等の塩類が使用できる。
本発明においては、Ｎ −ＡＨＤＨ生産能を有する菌株
をＮ−７セチルグルコサミン又はＮ−アセチルガラクト
サミンを含有する培地で培養したときにＮ −ＡＨＤＨ
が収量よく得られる。該培養培地の好適な例としては、
Ｎ−７セチルグルコサミン０．５％、酵母エキス０．５
％、ポリペプトン０．３％、リン酸−カリウム０．２％
、硫酸マグネシウム０．０５％、塩化カルシウム０．０
１％、硫酸第一鉄０．０１％（ｐＨ７，０）の培地例が
挙げられる。そして該培地で３０°Ｃｌ２Ｏ時間、通気
撹拌培養した場合には、Ｎ−７セチルグルコサミンをＮ
−アセチルガラクトサミン以外の他の糖に置き換えた場
合の１０〜１００倍の生産力価を得ることができる。
をＮ−７セチルグルコサミン又はＮ−アセチルガラクト
サミンを含有する培地で培養したときにＮ −ＡＨＤＨ
が収量よく得られる。該培養培地の好適な例としては、
Ｎ−７セチルグルコサミン０．５％、酵母エキス０．５
％、ポリペプトン０．３％、リン酸−カリウム０．２％
、硫酸マグネシウム０．０５％、塩化カルシウム０．０
１％、硫酸第一鉄０．０１％（ｐＨ７，０）の培地例が
挙げられる。そして該培地で３０°Ｃｌ２Ｏ時間、通気
撹拌培養した場合には、Ｎ−７セチルグルコサミンをＮ
−アセチルガラクトサミン以外の他の糖に置き換えた場
合の１０〜１００倍の生産力価を得ることができる。
培養温度は通常２０〜３５°Ｃの範囲で好適には３０゛
Ｃの近辺で行なわれる。培養開始のｐＨは通常６〜８の
範囲、好適には７近辺である。この様な条件下で２０〜
３０時間振盪又は深部撹拌培養を行なえば、該培養物中
にＮ −ＡＨＤＨが生成蓄積する。
Ｃの近辺で行なわれる。培養開始のｐＨは通常６〜８の
範囲、好適には７近辺である。この様な条件下で２０〜
３０時間振盪又は深部撹拌培養を行なえば、該培養物中
にＮ −ＡＨＤＨが生成蓄積する。
Ｎ −ＡＨＤＨは通常は菌体中に存在するので培養物を
遠心分離、あるいは濾過によって菌体だけを分離するの
が好ましい。これを適量の緩衝液中で破壊して酵素を可
溶化することによって溶液中に放出させる。
遠心分離、あるいは濾過によって菌体だけを分離するの
が好ましい。これを適量の緩衝液中で破壊して酵素を可
溶化することによって溶液中に放出させる。
菌体の破壊方法はダイノミル、フレンチプレス、超音波
等の物理的なものや、トリトンＸ−１００、ラウリル硫
酸ソーダ、ＥＤＴＡ等の化学的方法、リゾチーム等の酵
素的方法を単独または併用して用いることができる。こ
の様にして得られた菌体破壊液から核酸を常法によって
除去し、濾過または遠心分離によって不溶物を除きＮ
−ＡＨＤＨを得る。
等の物理的なものや、トリトンＸ−１００、ラウリル硫
酸ソーダ、ＥＤＴＡ等の化学的方法、リゾチーム等の酵
素的方法を単独または併用して用いることができる。こ
の様にして得られた菌体破壊液から核酸を常法によって
除去し、濾過または遠心分離によって不溶物を除きＮ
−ＡＨＤＨを得る。
更にＮ −ＡＨＤＨは必要により酵素の単離精製の常法
に従って、例えば（！ｌ ＤＥＡＥ−セルシース塔ニよ
るカラムクロマトグラフィー、（２）硫安による分画沈
殿、（３）ＤＥＡＥ−セファデックス塔にょるカラムク
ロマトグラフィー、（４） セファデックスによるゲル
濾過等の方法、又はその他の方法を必要に応じて組合わ
せて用いることにより、精製されたＮ −ＡＨＤＨを得
ることができる。
に従って、例えば（！ｌ ＤＥＡＥ−セルシース塔ニよ
るカラムクロマトグラフィー、（２）硫安による分画沈
殿、（３）ＤＥＡＥ−セファデックス塔にょるカラムク
ロマトグラフィー、（４） セファデックスによるゲル
濾過等の方法、又はその他の方法を必要に応じて組合わ
せて用いることにより、精製されたＮ −ＡＨＤＨを得
ることができる。
次に本発明によるＮ−７セチルグルプサミン又はＮ−ア
セチルガラクトサミンの定量法及びその定量用キットに
ついて具体的に説明する。
セチルガラクトサミンの定量法及びその定量用キットに
ついて具体的に説明する。
本発明の測定原理は下記に示す通りである〇Ｎ −ＡＨ
ＤＨ Ｎ−７セチルグルコサミン ＋ ＮＡＤ（Ｎ−アセ
チルガラクトサミン） Ｎ−７セチルグルフサミノラクトン十 ＮＡＤＨ＋
Ｈ”（Ｎ−アセチルガラクトサミノラクトン）すなわち
試料中のＮ−７セチルグルコサミン又はＮ−アセチルガ
ラクトサミンにＮ −ＡＨＤＨヲ作用させ、この生成さ
れたＮＡＤＨを公知の測定方法、例えば紫外部３４０
ｎｍ の吸光度を測定する方法等によって測定するこ
とができる。
ＤＨ Ｎ−７セチルグルコサミン ＋ ＮＡＤ（Ｎ−アセ
チルガラクトサミン） Ｎ−７セチルグルフサミノラクトン十 ＮＡＤＨ＋
Ｈ”（Ｎ−アセチルガラクトサミノラクトン）すなわち
試料中のＮ−７セチルグルコサミン又はＮ−アセチルガ
ラクトサミンにＮ −ＡＨＤＨヲ作用させ、この生成さ
れたＮＡＤＨを公知の測定方法、例えば紫外部３４０
ｎｍ の吸光度を測定する方法等によって測定するこ
とができる。
またＮ −ＡＨＤＨを固体に保持させて試料と接触させ
ることにより、生成したＮＡＤＨを同様に測定すること
もできる。また共存するラクテートデヒドロゲナーゼ（
ＬＤＨ）の影響を防ぐために必要であればオキサミド酸
や蓚酸等の阻害剤を適量添加することもできる。
ることにより、生成したＮＡＤＨを同様に測定すること
もできる。また共存するラクテートデヒドロゲナーゼ（
ＬＤＨ）の影響を防ぐために必要であればオキサミド酸
や蓚酸等の阻害剤を適量添加することもできる。
本発明に用いるＮ −ＡＨＤＨはいかなる起源のもので
も使用出来るが、例えばシー−トモナス属に属する細菌
から選ばれた菌を培養して得られるＮ−ＡＨＤＨを用い
ることが好ましい。
も使用出来るが、例えばシー−トモナス属に属する細菌
から選ばれた菌を培養して得られるＮ−ＡＨＤＨを用い
ることが好ましい。
シェードモナス属に属する上記酵素生産菌としては、例
えばシュードモナスｓｐ、 ＮＬ５３ （ＦＥＲＭＢ
Ｐ−２０５７）等が挙げられる。
えばシュードモナスｓｐ、 ＮＬ５３ （ＦＥＲＭＢ
Ｐ−２０５７）等が挙げられる。
試料中のＮ−７セチルグルコサミン又はＮ−アセチルガ
ラクトサミンに上記Ｎ−ＡＨＤＨヲｆｌｆｌ サせる場
合には、ｐＨ７〜１１及び温度６０°Ｃ以下、好ましく
はｐＨ８〜１Ｏ０５及び温度３０〜５５°Ｃの条件で、
通常は１〜２０分間程分間窓させる。ｐＨの調整には前
記ｐＨ範囲を維持することができ、かつ酵素反応を阻害
しない任意の緩衝液が用いられ、例えばリン酸カリウム
緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、グリシン−苛性ソーダ緩
衝液等が好適に使用できる。
ラクトサミンに上記Ｎ−ＡＨＤＨヲｆｌｆｌ サせる場
合には、ｐＨ７〜１１及び温度６０°Ｃ以下、好ましく
はｐＨ８〜１Ｏ０５及び温度３０〜５５°Ｃの条件で、
通常は１〜２０分間程分間窓させる。ｐＨの調整には前
記ｐＨ範囲を維持することができ、かつ酵素反応を阻害
しない任意の緩衝液が用いられ、例えばリン酸カリウム
緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、グリシン−苛性ソーダ緩
衝液等が好適に使用できる。
Ｎ −ＡＨＤＨの作用により生成されるＮＡＤＨの定量
はいかなる方法を用いても良いが、最も一般的に用いら
れている方法は、紫外部３４０ ｎｍ における吸光
度を測定する方法である。可視部に吸収を持つ色素に転
換して定量する方法は、フェナジンメトサルフェートと
ニトロブルーテトラゾリウムと共に反応させて生成した
ダイホルマザンの５７０ｎｍ における吸光度を測定
するものや、ＮＡＤＨ酸化酵素Ｈ，Ｂｉｏｃｈｅｍ ９
８１４３３ （１９８５））やフェナジンメトサルフェ
ート又はそれに類する作用をする電子伝達体、又は金属
イオンと反応させて生成した過酸化水素をパーオキシダ
ーゼと各種色原体と共に発色させて、それぞれの好適な
波長での吸光度を測定するものがある。過酸化水素に導
かれたものはル・ミノールと共に発光させて検出するこ
ともできる。また適当に選択した複数の酸化還元指示薬
と電子伝達体を共存させて、その色調の特徴から半定量
的に検出することも可能である。これらの検出方法はそ
の特徴によって使いわければ良い。
はいかなる方法を用いても良いが、最も一般的に用いら
れている方法は、紫外部３４０ ｎｍ における吸光
度を測定する方法である。可視部に吸収を持つ色素に転
換して定量する方法は、フェナジンメトサルフェートと
ニトロブルーテトラゾリウムと共に反応させて生成した
ダイホルマザンの５７０ｎｍ における吸光度を測定
するものや、ＮＡＤＨ酸化酵素Ｈ，Ｂｉｏｃｈｅｍ ９
８１４３３ （１９８５））やフェナジンメトサルフェ
ート又はそれに類する作用をする電子伝達体、又は金属
イオンと反応させて生成した過酸化水素をパーオキシダ
ーゼと各種色原体と共に発色させて、それぞれの好適な
波長での吸光度を測定するものがある。過酸化水素に導
かれたものはル・ミノールと共に発光させて検出するこ
ともできる。また適当に選択した複数の酸化還元指示薬
と電子伝達体を共存させて、その色調の特徴から半定量
的に検出することも可能である。これらの検出方法はそ
の特徴によって使いわければ良い。
本発明のＮ−アセチルグルコサミン又はＮ−アセチルガ
ラクトサミン定量用キツトは、Ｎ−Ａ）［）Ｈ、ＮＡＤ
と生成されるＮＡＤＨを定量するための酵素や試薬
類、及びこれらの反応を円滑に進めるための緩衝用試薬
からなっている。この試薬類、酵素類は液剤、固形剤も
しくは凍結乾燥された製剤とし、必要に応じて使用前に
緩衝液に溶解混合して測定用試薬とする。
ラクトサミン定量用キツトは、Ｎ−Ａ）［）Ｈ、ＮＡＤ
と生成されるＮＡＤＨを定量するための酵素や試薬
類、及びこれらの反応を円滑に進めるための緩衝用試薬
からなっている。この試薬類、酵素類は液剤、固形剤も
しくは凍結乾燥された製剤とし、必要に応じて使用前に
緩衝液に溶解混合して測定用試薬とする。
測定方法はＮ−アセチルグルコサミン又はＮ −アセチ
ルガラクトサミン含有試料に直接作用させることによっ
てＮＡＤＨを生成させる。そしてこれをそのまま、ある
いはＮＡＤＨ定量用試薬を加えることによってＮＡＤＨ
を測定する。これらの測定方法は１試薬系でも２試薬系
でも良く、さらに何試薬系で測定しても良い。
ルガラクトサミン含有試料に直接作用させることによっ
てＮＡＤＨを生成させる。そしてこれをそのまま、ある
いはＮＡＤＨ定量用試薬を加えることによってＮＡＤＨ
を測定する。これらの測定方法は１試薬系でも２試薬系
でも良く、さらに何試薬系で測定しても良い。
〈発明の効果〉
本発明によれば新規なＮ −ＡＥ［）Ｈを用いるとＮ−
アセチルグルコサミン又はＮ−アセチルガラクトサミン
の定量を精度良く行なうことが出来、こｈに基づいてβ
−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの活性等を知ること
が出来る。その結果、複合糖質の構造解析や腎臓障害の
病態診断を効率良く行なうことが出来、当業者にとって
極めて有意義である。
アセチルグルコサミン又はＮ−アセチルガラクトサミン
の定量を精度良く行なうことが出来、こｈに基づいてβ
−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの活性等を知ること
が出来る。その結果、複合糖質の構造解析や腎臓障害の
病態診断を効率良く行なうことが出来、当業者にとって
極めて有意義である。
次に本発明を実施例により説明する。
〈実施例〉
実施例１
ハードモナスｓｐ、 ｋ５３ （微工研条寄第２０５
７号、ＦＥＲＭ ＢＰ−２０５７）をＮ−アセチルグル
コサミン０．５％、酵母エキス０．５％、ポリペプトン
０．３％、リン酸−カリウム０．２％、硫酸マグネシウ
ム０．０５％、塩化カルシウム０．０１％、硫酸第一鉄
０．０１％を含有した種培地（ｐＨ７，２） ２０ゴが
入った１５０ ａｔ容三角フラスコに接種した。３０°
Ｃで２４時間、振盪培養した後、同じ培地２７！が入っ
たジャーファーメンタ−（株式会社いわしや生物科学部
）に植菌し、３０°Ｃで１８時間、通気（２１／分）撹
拌（５００ｒ、ｐ、ｍ、 ）培養した。生産されたＮ
−Ａ）［）Ｈは、菌体に蓄積していた０実施例２ 実施例１と同様にして得た０、９６ ｋｇの生菌体に０
．０２Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，０） （以下
、これを標準緩衝液と呼ぶ）５７Ｉを加え、更に０．５
％トリトンＸ −１００、ＥＤＴＡ １０ ｍＭになる
様に各々加えた。低温室（５°Ｃ）内で一晩撹拌を行な
い、均一な懸濁液を得た。これをダイノミル（スイス、
ウィーリー・Ａ・パッコーヘン社製）によって破砕（３
０００ｒ、ｐ、ｍ、 ） した。８０００ｒ、ｐ、ｍ、
で２０分間、遠心分離することによって上澄液５．
１７１を得た。
７号、ＦＥＲＭ ＢＰ−２０５７）をＮ−アセチルグル
コサミン０．５％、酵母エキス０．５％、ポリペプトン
０．３％、リン酸−カリウム０．２％、硫酸マグネシウ
ム０．０５％、塩化カルシウム０．０１％、硫酸第一鉄
０．０１％を含有した種培地（ｐＨ７，２） ２０ゴが
入った１５０ ａｔ容三角フラスコに接種した。３０°
Ｃで２４時間、振盪培養した後、同じ培地２７！が入っ
たジャーファーメンタ−（株式会社いわしや生物科学部
）に植菌し、３０°Ｃで１８時間、通気（２１／分）撹
拌（５００ｒ、ｐ、ｍ、 ）培養した。生産されたＮ
−Ａ）［）Ｈは、菌体に蓄積していた０実施例２ 実施例１と同様にして得た０、９６ ｋｇの生菌体に０
．０２Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，０） （以下
、これを標準緩衝液と呼ぶ）５７Ｉを加え、更に０．５
％トリトンＸ −１００、ＥＤＴＡ １０ ｍＭになる
様に各々加えた。低温室（５°Ｃ）内で一晩撹拌を行な
い、均一な懸濁液を得た。これをダイノミル（スイス、
ウィーリー・Ａ・パッコーヘン社製）によって破砕（３
０００ｒ、ｐ、ｍ、 ） した。８０００ｒ、ｐ、ｍ、
で２０分間、遠心分離することによって上澄液５．
１７１を得た。
これに湿潤状態のＤＥＡＥ−セルロース３．５ｋｇを投
入し、ｐＨ８，０に調整した後、３０分間、撹拌を行な
い、該酵素を吸着させた。プフナー漏斗に移して濾過し
た後、標準緩衝液１０１で洗浄し、更に０．３Ｍの食塩
を含有した標準緩衝液７１で洗浄して、この部位を集め
た。これをホローファイバー限外濾過装置（旭化成工業
株式会社製）によって、１．４１まで濃縮した。１１２
ｇの粉末硫安を加えて溶かし、良く撹拌した。
入し、ｐＨ８，０に調整した後、３０分間、撹拌を行な
い、該酵素を吸着させた。プフナー漏斗に移して濾過し
た後、標準緩衝液１０１で洗浄し、更に０．３Ｍの食塩
を含有した標準緩衝液７１で洗浄して、この部位を集め
た。これをホローファイバー限外濾過装置（旭化成工業
株式会社製）によって、１．４１まで濃縮した。１１２
ｇの粉末硫安を加えて溶かし、良く撹拌した。
２時間放置した後、９０００ ｒ、ｐ、ｍ、 で２０分
間、遠心分離して上澄液１．４ｅを得た。これに更に粉
末硫安３６４ｇを加え、良く溶かして一晩低温室に放置
した。
間、遠心分離して上澄液１．４ｅを得た。これに更に粉
末硫安３６４ｇを加え、良く溶かして一晩低温室に放置
した。
生じた沈殿を１２００Ｏｒ、ｐ、ｍ、で２０分間、遠心
分離して集め、４％硫安を含有した標準緩衝液１．４ｇ
に溶解した。これを予め硫安６％を含有した標準緩衝液
で平衡化したフェニルセファロースＣＬ−４Ｂ（スウェ
ーデン、ファルマシア社製）のカラム（直径９Ｃ肩×高
さ４０ｃｍ）に通して酵素全吸着させ、エチレングリコ
ールの濃度勾配（０→３０％）と硫安の逆濃度勾配（４
→０％）を合わせもった標準緩衝液２０ ｇで溶出した
。
分離して集め、４％硫安を含有した標準緩衝液１．４ｇ
に溶解した。これを予め硫安６％を含有した標準緩衝液
で平衡化したフェニルセファロースＣＬ−４Ｂ（スウェ
ーデン、ファルマシア社製）のカラム（直径９Ｃ肩×高
さ４０ｃｍ）に通して酵素全吸着させ、エチレングリコ
ールの濃度勾配（０→３０％）と硫安の逆濃度勾配（４
→０％）を合わせもった標準緩衝液２０ ｇで溶出した
。
活性部位を集めて限外濾過装置で０．５Ｅまで濃縮し、
更に０．１Ｍ食塩を含有した標準緩衝液３１を用いて、
酵素液の濾過透析を行なった。これを予め０．１Ｍ食塩
含有した標準緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ −セファデ
ックス Ａ−５０のカラム（直径９α×高さ３０α）に
通して吸着させ、０、ＩＭから０．３Ｍの食塩濃度勾配
をもった標準緩衝液２０１で溶出した。
更に０．１Ｍ食塩を含有した標準緩衝液３１を用いて、
酵素液の濾過透析を行なった。これを予め０．１Ｍ食塩
含有した標準緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ −セファデ
ックス Ａ−５０のカラム（直径９α×高さ３０α）に
通して吸着させ、０、ＩＭから０．３Ｍの食塩濃度勾配
をもった標準緩衝液２０１で溶出した。
活性部を限外濾過装置で５０ ｍｌまで濃縮し、うち５
履ｌをポリアクリルアミドディスク電気泳動法に基づい
て、蛋白質を分離回収する調整用電気泳動装置（株式会
社富士理研製）にかけた。
履ｌをポリアクリルアミドディスク電気泳動法に基づい
て、蛋白質を分離回収する調整用電気泳動装置（株式会
社富士理研製）にかけた。
この際に使用したポリアクリルアミドゲルは７．５％、
電流は１０ ｍＡ Ｎ回収用の緩衝液は６．０１２Ｍ
トリス−０，１Ｍ グリシン緩衝液（ｐＨ８，３）で
あった０ 分離回収した活性部を限外濾過装置で濃縮し、更にコロ
ジオンパック濃縮装置で１ ｍｌまで濃縮した。これを
０．１Ｍ食塩を含有したセファデックスＧ−２０００カ
ラム（直径２．５Ｃ肩×高さ９５α）を用いてゲル濾過
を行なった０ すべての粗酵素溶液を同様に処理して酵素を精製した。
電流は１０ ｍＡ Ｎ回収用の緩衝液は６．０１２Ｍ
トリス−０，１Ｍ グリシン緩衝液（ｐＨ８，３）で
あった０ 分離回収した活性部を限外濾過装置で濃縮し、更にコロ
ジオンパック濃縮装置で１ ｍｌまで濃縮した。これを
０．１Ｍ食塩を含有したセファデックスＧ−２０００カ
ラム（直径２．５Ｃ肩×高さ９５α）を用いてゲル濾過
を行なった０ すべての粗酵素溶液を同様に処理して酵素を精製した。
得られた活性部を集めて濃縮し、精製酵素１９８０単位
を得た。これは第５図に示す通り、ディスク電気泳動に
よって、殆ど単一バンドを示す酵素標品であった。
を得た。これは第５図に示す通り、ディスク電気泳動に
よって、殆ど単一バンドを示す酵素標品であった。
実施例３
溶液中のＮ−７セチルグルコサミンの濃度を下記試薬を
用いて下記方法により定量した０１、試薬 ０．１Ｍ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，４）１．
７ 履１ ＮＡＤ （６０ｍＭ） ０．１
ｍ１Ｎ−ＡＨＤＨ（２５０単位／ＩＩ／） ０
．１＊１試料溶液 ０．１ｍ１
２、定量方法 各試薬をそれぞれ所定量試験管にとり、３７°Ｃで１０
分間反応させ３４０ ｎｍ で吸光度を測定し、同様
にして試料溶液のかわりに水を同量加えて反応させた場
合の吸光度を差しひいて試料溶液の吸光度とした。別に
既知濃度のＮ−７セチルグルコサミン溶液を同様にして
得た検量線から、試料中のＮ−７セチルグルコサミンの
濃度を求めた。第６図に検量線を示す。
用いて下記方法により定量した０１、試薬 ０．１Ｍ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，４）１．
７ 履１ ＮＡＤ （６０ｍＭ） ０．１
ｍ１Ｎ−ＡＨＤＨ（２５０単位／ＩＩ／） ０
．１＊１試料溶液 ０．１ｍ１
２、定量方法 各試薬をそれぞれ所定量試験管にとり、３７°Ｃで１０
分間反応させ３４０ ｎｍ で吸光度を測定し、同様
にして試料溶液のかわりに水を同量加えて反応させた場
合の吸光度を差しひいて試料溶液の吸光度とした。別に
既知濃度のＮ−７セチルグルコサミン溶液を同様にして
得た検量線から、試料中のＮ−７セチルグルコサミンの
濃度を求めた。第６図に検量線を示す。
実施例４
溶液中のＮ−アセチルガラクトサミンの濃度全下記試薬
を用いて下記方法により定量した。
を用いて下記方法により定量した。
■、試薬
０．１Ｍ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８，０）（０，
３％トリトンｘ −ｔｏｏ含有）１１５ μｌ フェナジンメトサルフェート（１ｍ９／ａｔ）５μｌ とトロブルーテトラゾリウム（１０ｍｙ ／ ｍｅ ）
５μｅ ＮＡＤ （６０ｍＭ） １０
ｐ ＩＮ−ＡＨＤＨ（１５５単位／屑１）１５μｌ試
料溶液 ５０μＥ２、定量
方法 上記試薬を各々所定量試験管にとり、３７°Ｃで１５分
間反応させた。その後０．３規定塩酸２．０＋＊／を添
加して良く撹拌した。生成した色素を５７０ ｎｍで
吸光度を測定した。試料溶液のかわりに水を同量添加し
て同様に反応処理したものの吸光度をブランクとして差
しひき、試料の吸光度とした。別に既知濃度のＮ−アセ
チルガラクトサミン溶液ヲ同様にして得た検量線から試
料溶液中のＮ−アセチルガラクトサミンの濃度を求めた
。
３％トリトンｘ −ｔｏｏ含有）１１５ μｌ フェナジンメトサルフェート（１ｍ９／ａｔ）５μｌ とトロブルーテトラゾリウム（１０ｍｙ ／ ｍｅ ）
５μｅ ＮＡＤ （６０ｍＭ） １０
ｐ ＩＮ−ＡＨＤＨ（１５５単位／屑１）１５μｌ試
料溶液 ５０μＥ２、定量
方法 上記試薬を各々所定量試験管にとり、３７°Ｃで１５分
間反応させた。その後０．３規定塩酸２．０＋＊／を添
加して良く撹拌した。生成した色素を５７０ ｎｍで
吸光度を測定した。試料溶液のかわりに水を同量添加し
て同様に反応処理したものの吸光度をブランクとして差
しひき、試料の吸光度とした。別に既知濃度のＮ−アセ
チルガラクトサミン溶液ヲ同様にして得た検量線から試
料溶液中のＮ−アセチルガラクトサミンの濃度を求めた
。
実施例５
牛腎臓から抽出したβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダー
ゼの活性を下記試薬を用い、下記方法によって定量した
。
ゼの活性を下記試薬を用い、下記方法によって定量した
。
１、試薬
Ａ、０．１Ｍ クエン酸ソーダ緩衝液（ｐＨ４，４）
０．３ｔｓｌ Ｎ、Ｎ’−ジアセチルキトビオース （５０ｍＭ ） ０．１ ｍｌ
試料溶液 ０．１屑ｔＢ、０．２
Ｍ グリノン−苛性ソーダ緩衝液（ｐＨ１０，０）
１．３屑１ＮＡＤ （６０ｍＭ）
０．１ ｄＮ −Ａ）［）Ｈ（２５
０単位／ゴ）０．１肩１２、定量方法 試薬Ａを各々所定量試験管にとり、３７°Ｃで１５分間
反応させた。これに試薬Ｂを各々所定量混合したものを
加えて、再び３７°Ｃで１０分間反応させた。これを３
４０ ｎｍ で吸光度を測定し、試料溶液のかわりに
水を同量用いて反応させた場合の吸光度を差しひいて、
試料の吸光度とした。試料溶液中の酵素活性は次の式か
ら算出した。
０．３ｔｓｌ Ｎ、Ｎ’−ジアセチルキトビオース （５０ｍＭ ） ０．１ ｍｌ
試料溶液 ０．１屑ｔＢ、０．２
Ｍ グリノン−苛性ソーダ緩衝液（ｐＨ１０，０）
１．３屑１ＮＡＤ （６０ｍＭ）
０．１ ｄＮ −Ａ）［）Ｈ（２５
０単位／ゴ）０．１肩１２、定量方法 試薬Ａを各々所定量試験管にとり、３７°Ｃで１５分間
反応させた。これに試薬Ｂを各々所定量混合したものを
加えて、再び３７°Ｃで１０分間反応させた。これを３
４０ ｎｍ で吸光度を測定し、試料溶液のかわりに
水を同量用いて反応させた場合の吸光度を差しひいて、
試料の吸光度とした。試料溶液中の酵素活性は次の式か
ら算出した。
第１図は本酵素の至適ｐＨを示すグラフであり、第２図
は安定ｐＨを示すグラフである。第３図は本酵素の作用
適温の範囲を示すグラフであり、第４図は本酵素の熱安
定性を示すグラフである。第５図は電気泳動によるバン
ドを示す図である。第６図は実施例３における検量線で
ある。なお、第１図及び第２図における使用緩衝液はそ
れぞれリン酸カリウム緩衝液（○−○）、トリス塩酸緩
衝液（Δ−△）及びグリシン−苛性ソーダ緩衝液（・−
・）である。 特許出願人 財団法人 野田産業科学研究所溝Ｌ （’
Ｃ’：’
は安定ｐＨを示すグラフである。第３図は本酵素の作用
適温の範囲を示すグラフであり、第４図は本酵素の熱安
定性を示すグラフである。第５図は電気泳動によるバン
ドを示す図である。第６図は実施例３における検量線で
ある。なお、第１図及び第２図における使用緩衝液はそ
れぞれリン酸カリウム緩衝液（○−○）、トリス塩酸緩
衝液（Δ−△）及びグリシン−苛性ソーダ緩衝液（・−
・）である。 特許出願人 財団法人 野田産業科学研究所溝Ｌ （’
Ｃ’：’
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、Ｎ−アセチルグルコサミン又はＮ−アセチルガラク
トサミンから水素を奪って、Ｎ−アセチルグルコサミノ
ラクトン又はＮ−アセチルガラクトサミノラクトンにす
ると共に、補酵素ＮＡＤをＮＡＤＨに還元するＮ−アセ
チルヘキソサミンデヒドロゲナーゼ。 ２、下記（１）〜（３）の理化学的性質を有するＮ−ア
セチルヘキソサミンデヒドロゲナーゼ。 （１）作用及び基質特異性 Ｎ−アセチルグルコサミン又はＮ−アセチルガラクトサ
ミンから水素を奪って、Ｎ−アセチルグルコサミノラク
トン又はＮ−アセチルガラクトサミノラクトンにすると
共に、補酵素ＮＡＤをＮＡＤＨに還元する。 （２）至適ｐＨ：８．０〜１０．５ （３）安定ｐＨ：８．０〜１１．０ ３、シュードモナス属に属し、Ｎ−アセチルヘキソサミ
ンデヒドロゲナーゼ生産能を有する菌株を培地に培養し
、培養物よりＮ−アセチルヘキソサミンデヒドロゲナー
ゼを採取することを特徴とするＮ−アセチルヘキソサミ
ンデヒドロゲナーゼの製造法。 ４、Ｎ−アセチルグルコサミン又はＮ−アセチルガラク
トサミン含有試料にＮ−アセチルヘキソサミンデヒドロ
ゲナーゼを作用させ、生成するＮＡＤＨを測定すること
を特徴とするＮ−アセチルグルコサミン又はＮ−アセチ
ルガラクトサミンの定量方法。 ５、Ｎ−アセチルヘキソサミンデヒドロゲナーゼ、ＮＡ
Ｄ及び緩衝液を含む、Ｎ−アセチルグルコサミン又はＮ
−アセチルガラクトサミンの定量用キット。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63234746A JPH0667317B2 (ja) | 1988-09-21 | 1988-09-21 | Ｎ−アセチルヘキソサミンデヒドロゲナーゼ、その製造法及び該酵素を用いるｎ−アセチルグルコサミン又はｎ−アセチルガラクトサミンの定量法及びその定量用キット |
| US07/407,150 US5068190A (en) | 1988-09-21 | 1989-09-14 | N-acetylhexosamine-dehydrogenase, process for producing same, method for the quantitative analysis of N-acetylglucosamine or N-acetylgalactosamine using same and kit for use in the quantitative analysis |
| DE3931399A DE3931399A1 (de) | 1988-09-21 | 1989-09-20 | N-acetylhexosamin-dehydrogenase, verfahren zu deren herstellung, verfahren zur quantitativen analyse von n-acetylglucosamin oder n-acetylgalactosamin unter verwendung derselben, sowie kit fuer die quantitative analyse |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63234746A JPH0667317B2 (ja) | 1988-09-21 | 1988-09-21 | Ｎ−アセチルヘキソサミンデヒドロゲナーゼ、その製造法及び該酵素を用いるｎ−アセチルグルコサミン又はｎ−アセチルガラクトサミンの定量法及びその定量用キット |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0284178A true JPH0284178A (ja) | 1990-03-26 |
| JPH0667317B2 JPH0667317B2 (ja) | 1994-08-31 |
Family
ID=16975708
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63234746A Expired - Lifetime JPH0667317B2 (ja) | 1988-09-21 | 1988-09-21 | Ｎ−アセチルヘキソサミンデヒドロゲナーゼ、その製造法及び該酵素を用いるｎ−アセチルグルコサミン又はｎ−アセチルガラクトサミンの定量法及びその定量用キット |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5068190A (ja) |
| JP (1) | JPH0667317B2 (ja) |
| DE (1) | DE3931399A1 (ja) |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3118573B1 (ja) * | 1999-10-27 | 2000-12-18 | 工業技術院長 | キチナーゼ及びその製造法 |
| EP2528002B1 (en) * | 2007-04-16 | 2015-11-04 | Momenta Pharmaceuticals, Inc. | Defined glycoprotein products and related methods |
| BR112012025645A2 (pt) | 2010-04-07 | 2017-12-12 | Momenta Pharmaceuticals Inc | glicanos de alta manose. |
| US9170249B2 (en) | 2011-03-12 | 2015-10-27 | Momenta Pharmaceuticals, Inc. | N-acetylhexosamine-containing N-glycans in glycoprotein products |
| US9695244B2 (en) | 2012-06-01 | 2017-07-04 | Momenta Pharmaceuticals, Inc. | Methods related to denosumab |
| US20150210753A1 (en) | 2012-07-26 | 2015-07-30 | Momenta Pharmaceuticals, Inc. | Glycoproteins with anti-inflammatory properties |
| US10450361B2 (en) | 2013-03-15 | 2019-10-22 | Momenta Pharmaceuticals, Inc. | Methods related to CTLA4-Fc fusion proteins |
| WO2014186310A1 (en) | 2013-05-13 | 2014-11-20 | Momenta Pharmaceuticals, Inc. | Methods for the treatment of neurodegeneration |
| EP3058084A4 (en) | 2013-10-16 | 2017-07-05 | Momenta Pharmaceuticals, Inc. | Sialylated glycoproteins |
| CN113155804B (zh) * | 2021-05-27 | 2022-11-15 | 江南大学 | 一种快速检测氨基葡萄糖的方法 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS59156299A (ja) * | 1983-02-28 | 1984-09-05 | Noda Sangyo Kagaku Kenkyusho | Ｎ−アセチルヘキソサミンの定量法及びその定量用試薬 |
| US4960701A (en) * | 1986-12-04 | 1990-10-02 | Noda Institute For Scientific Research | N-acetylmannosamine dehydrogenase, process for its production, method for quantitatively analyzing N-acetylmannosamine or sialic acid, and kit for the quantitative analysis |
-
1988
- 1988-09-21 JP JP63234746A patent/JPH0667317B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1989
- 1989-09-14 US US07/407,150 patent/US5068190A/en not_active Expired - Fee Related
- 1989-09-20 DE DE3931399A patent/DE3931399A1/de not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE3931399A1 (de) | 1990-03-29 |
| US5068190A (en) | 1991-11-26 |
| JPH0667317B2 (ja) | 1994-08-31 |
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