JPH02163094A - 新規生理活性ポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （１）　　産業上の利用分野 本発明は新規生理活性ポリペプチド、該ポリペプチドを
コードするＤＮＡ領域を含む組換えプラスミド、該プラ
スミドによって形質転換された組換え微生物Ｉｎ胞及び
該微生物Ｉｎ胞を用いた新規生理活性ポリペプチドの製
造方法に関する。更に詳しくは、抗腫瘍活性を有する新
規ポリペプチド（以下、新規抗腫瘍活性ポリペプチドと
略すこともある）、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ
領域を含む組換えプラスミド、該プラスミドによって形
質転換された組換え微生物細胞及び該微生物細胞を用い
た新規抗腫瘍活性ポリペプチドの製造方法に関する。

本明細書において、アミノ酸、ポリペプチドはＩＵＰＡ
Ｃ−ＩＵＢ生化学委員会（ＣＢＮ）で採用された方法に
より略記するものとし、たとえば下記の略号を用いる。

Ａｌａｌ−−アラニン Ａｒ！ＩＩＬ−アルギニン ＡＳｎＬ−アスパラギン ＡＳＩ）Ｌ−アスパラギン酸 Ｃｙｓ　　Ｌ−システィン Ｇｌｎ　　Ｌ−グルタミン Ｇｌｕ　　Ｌ−グルタミン酸 Ｇｌｙ　　グリシン ）１ｉｓｌ−−ヒスチジン １１ｅＬ−イソロイシン ＬＣｉｔｌＬ−ロイシン ＬＶＳ　　Ｌ−リジン Ｍｅｔ　　Ｌ−メチオニン ＰｈｅＬ−フェニルアラニン Ｐｒ０Ｌ−プロリン ３ｅｒ　　Ｌ−セリン Ｔｈｒ　　Ｌ−スレオニン Ｔｒｉ）　　Ｌ−ｔ’リブトファン Ｔｙｒ　　Ｌ−チロシン Ｖａｌ　　ｌ−バリン また、ＤＮＡの配列はそれを構成する各デオキシリボヌ
クレオチドに含まれる塩基の種類で略記するものとし、
たとえば下記の略号を用いる。

Ａ　アデニン（デオキシアデニル酸を示す。）Ｃシトシ
ン（デオキシシチジル酸を示す。）Ｇ　グアニン（デオ
キシグアニル酸を示す。）Ｔ　チミン　（デオキシチミ
ジル酸を示す。）さらに、（ＨｚＮ）−及び−（ＣＯＯ
Ｈ）はそれぞれアミノ酸配列のアミノ末端側及びカルボ
キシ末端側を示すものであり、（５′　）−及び（３′
）はそれぞれＤＮＡ配列の５′末端側及び３′末端側を
示すものである。

（２発明の背景 Ｃａｒｓｗｅｌｌ　らは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　Ｃａｌ
ｍｅｔｔｅ　−Ｇｕｅｒｉｎ　　（ＢＣＧ）などで前も
って刺激をうけたマウスにエンドトキシンを投与した後
に採取した血清中に、移植したＭｅｔｈＡ肉腫による癌
を出血壊死させる物質が含まれていることを見出し、こ
の物質を腫瘍壊死因子（Ｔ　ｕｎ＋ｏｒ　　Ｎ　ｅｃｒ
ｏｓｉｓｆ−ａｃｔｏｒ　、以下ＴＮＦと略記すること
もある）と名づけだ［Ｅ、　Ａ、　Ｃａｒｓｖｅｌｌ　
ら、　Ｐ　ｒｏｃ、Ｎ　ａｔｌ。

Ａｃａｄ、ｓｃｉ、、ＵＳ　Ａ　、　７２．３６６６　
（１９７５）　］　、このＴＮＦはマウス、ウサギ、ヒ
ト等多くの動物中に見られ、腫瘍細胞に特異的に、しか
も種を越えて働くことから、制癌剤としての利用が期待
されてきた。

最近になって、ｐ　ｅｎｎｉｃａらは、ヒトＴＮＦのＣ
Ｄ　Ｎ　Ａクローニングを行ない、ヒトＴＮＦ蛋白質の
一次構造を明らかにすると共に、大腸菌におけるヒトＴ
ＮＦ遺伝子の発現について報告した［Ｄ、　　Ｐｅｎｎ
１ｃａら、　　Ｎａｔｕｒｅ　、　　３１２．　７２４
（１９８４）　］　、その後、自弁ら［Ｔ、　５ｈｉｒ
ａｉ　ら。

Ｎａｔｕｒｅ　、　　３１３．　８０３（１９８５）　
］　、宗村ら［余材ら、癌と化学療法、　１２．　１６
０（１９８５）　］　、Ｗａｎａら［Ａ、Ｍ、Ｗａｎａ
ら、　５ｃｉｅｎｃｅ、　　２２８．　１４９＜１９８
５）　］及びＭ　ａｒｌｅｎｏｔｌｔら［Ａ　、　Ｍ　
ａｒｍｅｎｏｕｔら。

Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　１５２．　５１
５（１９８５）　］が、ヒトＴＮＦ遺伝子の大腸菌にお
ける発現について相ついで報告している。

このように遺伝子操作技術を用いることによって、純粋
なヒトＴＮＦ蛋白質が多量に入手できるようになるに及
び、ＴＮＦの有する抗腫瘍活性以外の生理活性が明らか
になりつつある。たとえば、癌末期や重症感染症患者に
見られる悪液質を引き起こす原因の一つであるカケクチ
ンがＴＮＦに非常に類似しており［Ｂ　、　Ｂ　ｅｕｌ
ｔｅｒら、　Ｎａｔｕｒｅ　。

３１６、　５５２　（１９８５）　］　、カケクチンが
リボプロティン・リパーゼ阻害活性を有することから、
ＴＮＦの投与により血中のトリグリセリド量が増大し、
その結果として高脂血症のような副作用を引き起こす可
能性のあることが示唆された。また、それ以外にも、血
管内皮細胞への影響［Ｊ、Ｒ。

Ｑａｍｂｌｅら、Ｊ、　ＥＸＩｌ、　Ｍｅｄ、、　　１
６２．２１６３（１９８５）　］　、骨吸収作用［Ｄ、
　Ｒ，Ｂｅ１ｔｏｌｉｎｉら、Ｎａｔｕｒｅ　、　　３
１９．　５１６（１９８６）　］等が報告されている。

一方、近年の遺伝子操作技術の進歩は、蛋白質中の任意
のアミノ酸を他のアミノ酸に置換したり、付加したり、
または欠失させることを可能にした。

このようにして、天然に存在する蛋白質を改変して、特
定の目的にかなった新しい蛋白質を創製する研究が、数
多く成されている。

ヒトＴＮＦ蛋白質の改変についてもいくつかの研究が成
されており、第１図記載のヒトＴＮＦ蛋白質のアミノ酸
配列において、ＣｙＳ７Ｆ及びＣｙ　ｓ／Ｉ／のいずれ
か又は両方のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換
（ＰＣＴ出願公開ＷＯ３６／　０４６０６号、特願昭６
ｌ−１０６７７２）　、Ｇ　１１／”’の他のアミノ酸
残基への置換（特願昭６１−１０６７７２号、特願昭６
１−２３８０４８号）、ＡＩａ”の他のアミノ酸残基へ
の置換（特願昭６１−２３３３３７号）が報告されてい
る。また、アミノ末端側のアミノ酸残基の欠失について
も、６アミノ酸欠失ＴＮＦが細胞障害活性を有している
こと（特開昭６１−５０９２３号）、７アミノ酸欠失Ｔ
ＮＦが細胞障害活性を有していること（特願昭６１−９
００８７号）、１〜１０アミノ酸欠失ＴＮＦが細胞障害
活性を有しており、その比活性は６〜８アミノ酸欠失Ｔ
ＮＦにおいて極大になること（ＰＣＴ出願公開ＷＯ３６
／　０２３８１号）、１０アミノ酸欠失ＴＮＦが細胞障
害活性を有していること（特願昭６１１１４７５４号）
、１１アミノ酸欠失ＴＮＦが細胞障害活性を有している
こと（特願昭６１−１７３８２２号）、及び７アミノ酸
欠失ＴＮＦを基盤として、ｐ　ｒｏ８Ｓ　ｅｒ９　Ａ　
３ｐｌＯをＡ　ｒｉ）　Ｌ　ＶＳＡ　Ｐｇへ置換を行な
うと、その比活性が大きく上昇することが報告されてい
る。

そこで、本発明者らは比活性の向上、安定性の向上９反
応スペクトルの広域化、副作用の低減化等を目的として
、ヒトＴＮＦ蛋白質の改変について鋭意研究を行なった
ところ、アミン末端側の７アミノ酸を欠失させ、かツＰ
ｒ０８Ｓ　ｅｒｓ　Ａ３ｐｌＯをＡ　ｒｏ　Ｌ　ｙｓＡ
　ｒｏへ置換させた形のヒトＴＮＦ改変体を基盤として
、さらにＡ　＋ａ”、　１　ｅｕ”の他のアミノ酸残基
への置換を行なうことにより、その比活性がさらに大き
く上昇することを見出し、本発明を完成するに至った。

（３）発明の目的 本発明の目的は、新規抗腫瘍活性ポリペプチドを提供す
ることにある。

本発明の他の目的は、新規抗腫瘍活性ポリペプチドをコ
ードするＤＮＡ領域を含む組換えプラスミドを提供する
ことにある。

本発明の更に他の目的は、上記組換えプラスミドによっ
て形質転換された組換え微生物及びその組換え微生物細
胞を用いて新規抗腫瘍活性ポリペプチドを製造する方法
を提供することにある。

本発明の更に他の目的は、以下の説明から一層明らかと
なるであろう。

（４）−発明の構成 本発明者らの研究によれば、前記本発明の目的は、次の
アミノ酸配列 （Ｈ２Ｎ　）　　、Ａ、ｒｇ−Ｌｙｓ　　Ａｒ（ｌ　　
ｃｙｓＰｒｏ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｖａ
ｌ−Ａｌａ　−Ａ　ｓｎ−Ｐ　ｒｏ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ａ
　ｌａ　−Ｇ　ｌｕ−Ｇ　Ｉｙ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｌ　ｅ
ｕ−ＧＩｎ　−Ｔｒｐ　−Ｌ　ｅｕ　−Ａ　ｓｎ　−Ａ
　ｒ（］　−Ａ　ｒｆＪ　−Ａ　Ｉａ　−Ａ　ｓｎ　−
Ａ　ｌａ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｌ　ｅｕ　−Ａ　Ｉａ　−Ａ
　ｓｎ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｖ　ａｔ　−Ｇ　ｌｕ　−Ｌ　
ｅｕ　−Ａ　ｒｏ　−Ａ　ｓｐ　−Ａ　ｓｎ　−Ｇ　Ｉ
ｎ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｖ　ａｔ　−Ｖ　ａｌ　−Ｐ　ｒｏ
　−Ｓ　ｅｒ　−Ｇ　ｌｕ　−Ｇ　＋ｙ−Ｌｅｕ−Ｔｙ
ｒ−Ｌｅｕ　−１１ｅ−ＴＶｒ−５ｅｒ−Ｇ　Ｉｎ　−
Ｖ　ａｌ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｐ　ｈｅ　−Ｌ　ｙｓ　−Ｇ
　ｌｙ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｇｌｙ−ｃｙＳ−Ｐｒｏ−８ｅ
ｒ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−ＶａＬ　ｅｕ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｔ
ｈｒ　−Ｈｉｓ　−Ｔｈｒ　−Ｉ　Ｉｅ　−Ｓｅｒ　−
Ａ　ｒｇ−１１ｅ　−Ａ　ｌａ　−Ｖａｔ　−Ｓｅｒ　
−Ｔｙｒ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｔｈｒ　−Ｌ　ｙｓ−Ｖａｌ
−Ａｓｎ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｌ　ｅｕ−８ｅｒ　−Ａ　ｌ
ａ　−１ｌｅ　−１ｙｓ　−Ｓ　ｅｒ　−Ｐ　ｒｏ　−
Ｃｙｓ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ａ　ｒｇ−Ｇ　ｌｕ−Ｔ　ｈｒ
−Ｐ　ｒｏ−Ｇ　Ｉｕ−Ｇ　ｌｙ−Ａ　１ａ−Ｇ　Ｉｕ
　−Ａ　ｌａ　−Ｌ　Ｖ３−　Ｐ　ｒｏ　−Ｔ　ｒｆＪ
　−Ｔ　Ｉ／ｒ　−Ｇ　ｌｕ　−Ｐｒｏ　−Ｉ　Ｉｅ−
Ｔｙｒ　−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ　−Ｐ　ｈ
ｅ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｇ　Ｉｕ−Ｌ　Ｖｓ　
−Ｇ　Ｉｙ　−Ａ　８＋）　−Ａ　ｒｇ−Ｌ　ｅｕ−Ｓ
　ｅｒ−Ａ　ｌａ−Ｇ　ｌｕ−１ｌｅ−Ａ　ｓｎ−Ａｒ
ｇ　−Ｐ　ｒｏ　−Ａ　ｓｐ　−Ｔ　ｙｒ　−Ｌ　ｅｕ
　−Ａ　ｓｏ　−Ｐ　ｈｅ−Ａ　Ｉａ−Ｇ　ｌｕ−Ｓ　
ｅｒ−Ｇ　ｌｙ−Ｇ　Ｉｎ−Ｖ　ａｌ−Ｔ　ｙｒ−Ｐｈ
ｅ−Ｇ　ｌｙ　−１ｌｅ　−１ｌｅ　−Ｐｈｅ　−Ｌｅ
ｕ　−（ＣＯＯＨ） で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチド、また上記
新規抗腫瘍活性ポリペプチドをコードするＤＮＡ領域を
含む組換えプラスミドを提供することによって達成され
、更にかくして得られた組換えプラスミドによって形質
転換された組換え微生物細胞、その微生物細胞を用いて
目的とする新規抗腫瘍活性ポリペプチドを産生する方法
及びこの新規抗腫瘍活性ポリペプチドを含有する医薬組
成物を提供することによって達成されることがわかった
。

以下本発明について更に詳細に説明する。

（Ａ）ヒトＴＮＦ遺伝子のクローン化；ヒトＴＮＦ遺伝
子は、ヒトＴＮＦ蛋白質を構成するアミノ酸［［）　、
　ｐ　ｅｎｎｔｃａら、前出］を指定するいくつかのコ
ドンの中から適当なものを選び、それを化学合成するこ
とによって取得できる。ヒトＴＮＦ遺伝子の設計に際し
ては、用いる宿主細胞に最も適したコドンを選択するこ
とが望ましく、後にクローン化及び遺伝子改変を容易に
行なえるように適当な位置に適当な制限酵素による切断
部位を設けることが望ましい。

また、ヒトＴＮＦ蛋白質をコードするＤＮＡ領域は、そ
の上流に読みとりフレームを一致させた形での翻訳開始
コドン（ＡＴＧ）を有することが好ましく、その下流方
向に読みとりフレームを一致させた形での翻訳終止コド
ン（ＴＧＡ。

ＴＡＧまたはＴＡＡ）を有することが好ましい。

上記翻訳終止コドンは、発現効率の向上を目的として、
２つ以上タンデムに連結することがとりわけ好ましい。

さらに、このヒトＴＮＦ遺伝子は、その上流及び下流に
作用する制限酵素の切断部位を用いることにより、適当
なベクターへのクローン化が可能になる。このようなヒ
トＴＮＦ遺伝子の塩基配列の例を、第１図に示した。

上記のように設計したヒトＴＮＦ３１伝子の取得は、上
側の鎖、下側の鎖のそれぞれについて、たとえば第２図
に示したような何本かのオリゴヌクレオチドに分けて、
それらを化学合成し、各々のオリゴヌクレオチドを連結
する方法をとるのが望ましい。各オリゴヌクレオチドの
合成法としてはジエステル法［Ｈ，Ｇ、　Ｋｈｏｒａｎ
ａ。

”　３０！Ｉｌｅ　　ＲｅＣｅｎｔ　　［）　ｅｖｅｌ
ｏｐｍｅｎｔｓ　　ｉｎＣｈｅｎ＋１ｓｔｒｙ　　ｏｆ
　　Ｐ　ｈｏｓｐｈａｔｅ　　Ｅ　５ｔｅｒｓ　　ｏｆ
３　ｉｏｌｏｇｉｃａｌ　　　ｌ　ｎｔｅｒｅｓｔ　”
　、　Ｊ　ｏｈｎ　　Ｗ　１ｌｅｙａｎｄ　　３ｏｎｓ
　、　　）ｎｃ、ＪＪｅｗ　　Ｙｏｒｋ　　（１９６１
）　］。

トリエステル法［Ｒ、Ｌ　、１　ｅｔｓ＋ｎｇｅｒら、
Ｊ。

Ａｍ、　　Ｃｈｅｓ、　　Ｓｏｃ、、８９．４８０１（
１９６７）　］及びホスファイト法［Ｍ、　Ｄ、　Ｍａ
ｔｔｅｕｃｃｉら。

Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　　Ｌｅｔｔ、、　２１．　７
１９（１９８０）　］があるが、合成時間、収率、・操
作の簡便さ等の点から、全自動ＤＮＡ合成機を用いたホ
スファイト法による合成が好ましい。合成したオリゴヌ
クレオチドの精製は、ゲル濾過、イオン交換りロマトグ
ラフィー、ゲル電気泳動、逆相カラムによる高速液体ク
ロマトグラフィー等を、適宜単独もしくは組合せて用い
ることができる。

こうして得られた合成オリゴヌクレオチドの５′末端側
の水酸基を、たとえばＴ４−ポリヌクレオチドキナーゼ
を用いてリン酸化した侵、アニーリングさせ、たとえば
Ｔ４−ＤＮＡリガーゼを用いて連結する。合成オリゴヌ
クレオチドを連結してヒトＴＮ　Ｆ３ｍ１伝子を作成す
る方法としては、合成オリゴヌクレオチドをいくつかの
ブロックに分けて連結し、たとえばｐＢＲ３２２［Ｆ　
、　　Ｂ　ｏｌｉｖａｒら、　　Ｑｅｎｅ　、　　２．
　９５（１９７７）　］のようなベクターに一度クロー
ン化した後、それらの各ブロックのＤＮＡ断片を連結す
る方法が好ましい。このようなヒトＴＮＦ遺伝子を構成
するブロックのＤＮＡ断片を含むプラスミドとして、好
ましくはｐＴＮＦＩＢＲ。

ｐＴＮＦ２ＮまたはｐＴＮＦ３が用いられる。

上記のようにしてクローン化したヒトＴＮＦ遺伝子を構
成する各ブロックのＤＮＡ断片を連結した後、適当なプ
ロモーター　ＳＤ（シャイン・ダルガーノ）配列の下流
につなぐことにより、発現型遺伝子とすることができる
。゛使用可能なプロモーターとして、トリプトフアン・
オペロン・プロモーター（ｔｒｐプロモーター）。

ラクトース・オペロン・プロモーター（Ｉａｃプロモー
ター）　、　ｔａｃプロモーターＩＰＬプロモーター、
　ｌｐｐプロモーター等があげられるが、とりわけｔｒ
ｐプロモーターが好適である。ｔｒｐプロモーターを有
するプラスミドとして、好ましくはＤＹＳ３１Ｎ、又は
ｐＡ　Ａ　４１が用いられる。

さらに、発現効率向上を目的として、ヒトＴＮＦ遺伝子
下流に大腸菌で効率良く機能するターミネータ−を付与
することができる。このようなターミネータ−として、
１ｐｐターミネータ−ｔｒＤターミネータ−等があげら
れるが、とりわけｔｒｐ　Ａターミネータ−が好適であ
り、ｔｒｐ　Ａターミネータ−を有するプラスミドとし
て、好ましくはＩ）Ａ　Ａ　４１が用いられる。この発
現型ヒトＴＮＦ遺伝子を、たとえば１）ＢＲ３２２由来
のベクターにクローン化することにより、発現型プラス
ミドが作成できる。ヒトＴＮＦＩ伝子発現型プラスミド
として、好ましくはｐＴＮＦ４０１ＮＮ又はＩ）ＴＮＦ
４０１Ａが用いられる。

＜８）新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子のクローン化
： こうして得られたヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミドを
適当な制限酵素で切断し、ヒトＴＮＦ遺伝子内の特定な
領域を除去した後、適当な塩基配列を有する合成オリゴ
ヌクレオチドを用いた遺伝子の修復を行なう。かかる手
法を用いることにより、ヒトＴＮＦ蛋白質中の任意のア
ミノ酸を他のアミノ酸に置換したり、付加したり、また
は欠失させた形の新規抗腫瘍活性ポリペプチドをコード
する遺伝子を含む発現型プラスミドの作成が可能になる
。このような新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型
プラスミドとして、好ましくはｐＴＮＦ６１９が用いら
れ、る。

（Ｃ）発現確認及び活性評価： ヒトＴＮＦ遺伝子及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝
子を発現させるための微生物宿主としては、大腸菌、枯
草菌、酵母等があげられるが、とりわけ大腸菌［エシェ
リヒア・コリ（１：５ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ
）　］が好ましい。前記ヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラス
ミド及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プラ
スミドは、たとえば公知の方法［Ｍ、　Ｖ、　Ｎｏｒｇ
ａｒｄら。

Ｇｅｎｅ　、　３．　２７９（１９７８）　］を用いて
、微生物宿主、たとえばエシェリヒア・コリ（：、　６
００ｒ−ｍ−ａ　＜ＡＴＣＣ３３５２５）に導入するこ
とができる。

このようにして得られた組換え微生物細胞を、それ自体
は公知の方法で培養する。培地としては、たとえばグル
コースとカザミノ酸を含むＭ９培地［Ｔ、　Ｍａｎｉａ
ｔｉｓら編、“Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒＣＩｏｎｉｎｇ”、
　Ｐ　４４０．　Ｃｏ１ｄ　　５ｔ）ｒｉｎ（ＩＨａｒ
ｂｏｒ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　、　Ｎｅｗ　　Ｙｏ
ｒｋ　　（１９８２）参照〕があげられ、必要に応じて
、たとえばアンピシリン等を添加するのが望ましい。培
養は目的の組換え微生物に適した条件、たとえば振とう
による通気、撹拌を加えながら、３７℃で２〜３６時間
行なう。また、培養開始時または培養中に、プロモータ
ーを効率良く機能させる目的で、３−β−インドールア
クリル酸等の薬剤を加えることもできる。

培養後、たとえば遠心分離により組換え微生物細胞を集
め、たとえばリン酸バッファーに懸濁させ、たとえば超
音波処理により組換え微生物細胞を破砕し、遠心分離に
より組換え微生物細胞のライゼートを得る。得られたラ
イゼート中の蛋白質を、ラウリル硫酸ナトリウム（以下
、ＳＯ８と略すこともある）を含むポリアクリルアミド
ゲルを用いた電気泳動によって分離し、ゲル中の蛋白質
を適当な方法を用いて染色する。

発現型プラスミドを含まない微生物細胞のライゼートを
対照として泳動パターンを比較することにより、ヒトＴ
ＮＦ遺伝子または新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子の
発現を確認する。

このようにして得られたヒトＴＮＦ蛋白質及び新規抗腫
瘍活性ポリペプチドの抗癌活性の評価は、マウスに移植
したＭｅｔｈＡ肉腫を壊死させる効果を見る１ｎｖｉｖ
ｏ活性測定法（Ｃａｒｓｗｅｌｌら、前出）、マウスし
細胞に対する細胞障害性を児るｉｎ　　ｖｉｔｒｏ活性
測定法［Ｒｕｆｆ　、　Ｊ、　　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　
１２６．　２３５（１９８１）　］等により行なえる。

ヒトＴＮＦ蛋白質及び新規抗腫瘍活性ポリペプチドの大
腸菌ライゼートからの分離・精製は、公知の通常知られ
ている蛋白質の分離・精製法に従えばよいが、ヒトＴＮ
Ｆ蛋白質等に対する抗体を用いたアフィニティー・カラ
ム・クロマトグラフィーが有利である。なかでも、ヒト
ＴＮＦ蛋白質等に対するマウス・モノクローナル抗体を
用いたアフィニティー・カラム・クロマトグラフィーが
とりわけ好適である。こうして得られたヒトＴＮＦ蛋白
質及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド精製品を用いること
により、ｉｎ　ｖｉｖ□抗癌活性（前出〉及び副作用に
関する検討が可能となる。

ヒトＴＮＦ蛋白質及び新規抗腫瘍活性ポリペプチドの副
作用の評価は、カケクチン活性測定に代表されるｉｎ　
ｖｉｔｒｏ法、マウス等の実験動物に投与してその致死
量や血圧の降下程度等を測定するｉｎ　ｖｉｖｏ法等に
より行なうことができる。

かくして本発明によれば、従来公知のヒトＴＮＦ蛋白質
とは異なる新規生理活性ポリペプチドを得ることが可能
になり、この新規抗腫瘍活性ポリペプチドを用いること
によって抗腫瘍のためのすぐれた医薬組成物を提供する
ことが可能になった。

以下、実施例を掲げて本発明について詳細に説明するが
、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

実施例１（ヒトＴＮＦ遺伝子の設計） 第１図に示した塩基配列のヒトＴＮＦ遺伝子を設計した
。設計に際しては、Ｐ　ｅｎｎｉｃａら［Ｄ。

ｐｅｎｎｉＣａら、　　Ｎａｔｕｒｅ　、　　３１２．
　７２４　（１９８４）　　］　の報告したヒトＴＮＦ
前駆体ＣＤ　Ｎ　Ａの構造遺伝子部分の塩基配列を基盤
として、適当な制限酵素による切断部位を適当な位置に
設け、５′側に翻訳開始コドン（ＡＴＧ）を、そして３
′側に２個の翻訳終止コドン（ＴＧＡ及びＴＡＡ）をそ
れぞれ付与した。また、５′側翻訳開始コドン上流には
制限酵素ＣｆａＩによる切断部位を設け、ＳＤ配列と翻
訳開始コドン間を適切な状態に保った形でのプロモータ
ーとの連結を可能にした。更に、３′側翻訳終止コドン
下流には制限酵素１（ｉｎｄ■による切断部位を設け、
ベクター・プラスミドと容易に連結できるように゛した
。

実施例２（オリゴヌクレオチドの化学合成）実施例１で
設計したヒトＴＮＦ遺伝子は、第２図に示したように１
７本のオリゴヌクレオチドに分けて合成する。オリゴヌ
クレオチドの合成は全自動ＤＮＡ合成！！１（アプライ
ド・バイオシステムズ。

モデル３８０Ａ　）を用いて、ホスファイト法により行
なった。合成オリゴヌクレオチドの精製は、アプライド
・バイオシステムズ社のマニュアルに準じて行なった。

すなわち、合成オリゴヌクレオチドを含むアンモニア水
溶液を５５℃で一部保つことにより、ＤＮＡ塩基の保護
基をはずし、セファデックスＧ−５０フアイン・ゲル（
ファルマシア）を用いたゲル濾過によって、高分子量の
合成オリゴヌクレオチド画分を分取する。ついで、７Ｍ
尿素を含むポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度
２０％）の模、紫外線シャドウィング法により泳動パタ
ーンの観察を行なう。目的とする大きざのバンド部分を
切出して、そのポリアクリルアミドゲル断片を細かく破
砕した模、２〜５ｄの溶出用バッファ　−［５００ｉＭ
　　ＮＨ４０ＡＣ−１信ＭＥＤＴＡ−０，１％ＳＤＳ　
（ｐ）−１７，５＞　］を加え、３７℃で一部振とうし
た。遠心分離により、目的のＤＮＡを含む水相の回収を
行なった。最後に合成オリゴヌクレオチドを含む溶液を
ゲル濾過カラム（セファデックスＧ−５０）にかけるこ
とにより、合成オリゴヌクレオチドの精製品を得た。な
お、必要に応じて、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を
繰り返し、合成オリゴヌクレオチドの純度の向上をはか
った。

実施例３（化学合成ヒトＴＮＦ遺伝子のクローン化） 実施例２で作成した１７本の合成オリゴヌクレオチド（
ＴＮＦ−１〜ＴＮＦ−１７）を用いて、ヒトＴＮＦ遺伝
子を３つのブロックに分けてクローン化した。

０．１〜１．０μ９の合成オリゴヌクレオチドＴＮＦ−
２〜ＴＮＦ−６の５′末端側を、５〜１５ユニツトのＴ
４−ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｅ。

ｃｏｌｉＢタイプ、宝酒造）を用いて、それぞれ別々に
リン酸化する。リン酸化反応は１０〜２０μ旦の５０ｉ
ＭＴｒｉｓ−ＨＣｊ　（ＤＨ９，５＞　、　１０１１Ｍ
　　ＭＣＩ　Ｃ１ｚ　。

５−Ｍジチオスレイトール、１ＱＩＭ　　ＡＴＰ水溶液
中で、３７℃で、３０分間行なった。反応終了後、すべ
ての合成オリゴヌクレオチド水溶液をすべて混合し、フ
ェノール抽出、エーテル抽出によりＴ４−ポリヌクレオ
チドキナーゼを失活、除去する。

この合成オリゴヌクレオチド混合液に、新たに０．１〜
１．０μりの合成オリゴヌクレオチドＴＮＦ−１及びＴ
ＮＦ−７を加え、９０℃で５分間加熱した後至温まで徐
冷して、アニーリングを行なう。

次に、これを減圧乾固した後に、３０μ磨の６６１ＭＴ
ｒｉｓ−Ｈｃｆ　（ｐＨ７，６）　、　　６，８１１Ｍ
　　ＭｌｌＩ　Ｃ’１２゜１０１Ｍジチオスレイトール
、１　１ＭＡＴＰ水溶液に溶解させ、３００ユニツトの
Ｔ４−ＤＮＡリガーゼ（宝酒造）を加えて、１１℃で１
５時間連結反応を行なった。反応終了後、ポリアクリル
アミドゲル電気泳動（ゲル濃度５％）を行ない、エチジ
ウムブロマイド染色法により泳動パターンの観察を行な
う。目的とする大きさ（約２２０ｂｐ　）のバンド部分
を切出して、実施例２の方法に従ってポリアクリルアミ
ドゲルよりＤＮＡを回収する。

一方、３μ９の大腸菌用プラスミド１）ＢＲ３２２（約
４．４Ｋｂｐ）を３０μ旦の１０　ｍＭ　　Ｔ　ｒｉｓ
−ＨＣ１（ｐＨ７，５）　、　６０　ｍＭ　　Ｎａ　Ｃ
１，７ｍＭＭＱＣ１２水溶液に溶解させ、１０ユニツト
の制限酵素ＣｆａＩにューイングランド・パイオラブズ
）を添加して、３７℃で１時間切断反応を行なった。

制限酵素ＣｊａＩによる切断の後、フェノール抽出。

エーテル抽出を行ない、エタノール沈澱によりＤＮＡを
回収する。このＤＮＡを３０μ立の５０１１ＭＴｒｉｓ
−Ｈ（Ｊ　（ＤＨ７，４）　、　　１００　ｍＭ　　Ｎ
ａ　Ｃ１，１０ＭＭ　　ｆｖＮｌｓＯ４水溶液に溶解さ
せ、１０ユニツトの制限酵素５ａｌＩ　（宝酒造）を添
加して、３１℃で１時間切断反応を行なった。反応終了
後、アガロースゲル電気泳動（ゲル濃度０．８％）を行
ない、エチジウムブロマイド染色法により切断パターン
の観察を行なう。プラスミド１）ＢＲ３２２の大部分を
含む約３，７Ｋ　ｂｐのＤＮＡの部分に相当するバンド
を切出し、そのアガロースゲル断片を３倍量（ｖｏｌ　
７ｗｔ）の８Ｍ　　ＮａＣ１０＊水溶液に溶解させた。

Ｑ　ｈｅｎらのグラスフィルター法［Ｃ，Ｗ。

Ｃｈｅｎら、　Ａｎａｌ　、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、１０１
．　３３９（１９８０）　］により、約３．７Ｋ　ｂｐ
のＤＮＡ断片（Ｃｆａ　Ｉ”５ａｌＩ）をアガロースゲ
ルより回収した。

先に得られたヒトＴＮＦ遺伝子の一部を含む約２２０ｂ
ｐのＤＮＡ断片について、前記の方法に準じて末端のリ
ン酸化反応を行なった摸、プラスミドｐＢＲ３２２の大
部分を含む約３．７Ｋｂｌ）のＤＮＡ水溶液と混合する
。エタノール沈澱の後、萌記の方法に準じて両ＤＮＡ断
片の連結反応を行なった。

エシェリヒア・コリＣ６００ｒ−ｎ＋−株の形質転換は
、通常のＣａＣｆｚ法（Ｍ、　Ｖ、　Ｎｏｒｇａｒｄら
の方法）の改良法で行なった。すなわち、５ｄのＬ培地
（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％Ｎａ
Ｃ１，ｐＨ７，２）にエシェリヒア・コリＣ６００ｒ−
１−株の１８時間培養基を接種し、菌体を含む培養液の
ｅｏｏｎｍにおける濁度（ＯＤ　６，０）が０．３に達
するまで生育させる。菌体を冷たいマグネシウム・バッ
ファー　［０，ＩＭ　　Ｎａ　Ｃ１，５ｍＭ　　ＭｇＣ
１ｚ　。

５　ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−Ｈ（Ｊ　（１）Ｈ７，６，０℃
）］中で２回洗い、２ｄの冷したカルシウム・バッフ？
−［１００１ＭＣａ　Ｃ１ｚ　、　２５０　１Ｍ　　Ｋ
Ｃｊ、　５　ＩＢＭＭ（ｌ　Ｃｆ２．５１Ｍ　　Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｆ　（１）Ｈ７，６゜０℃）］中に再懸濁させ
、０℃で２５分間放置する。

次に菌体をこの容量の１／１０にカルシウム・バッファ
ーの中で濃縮し、連結後のＤＮＡ水溶液と２：１　（ｖ
ｏｌ、　：　ｖｏｌ、）混合する。この混合物を６０分
間。

０℃で保った後、１ｄのＬＢＧ培地（１％トリプトン、
０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｊ、　　０．０８％グ
ルコース、　　ｐＨ７，２）を添加し、３７℃で１時間
振とう培養する。培養液を、選択培地［アンピシリン（
シグマ）３０μｇ／ｆＲ１を含むし培地プレート］に１
００μ交／プレートの割合で接種する。プレートを３１
℃で１晩培養して、形質転換株を生育させる。得られた
アンピシリン耐性のコロニーより、公知の方法を用いて
ＤＮＡを１１製し、アガロースゲル電気泳動により、目
的のプラスミドｐＴＮＦＩＢＲ（約４．ＯＫ　ｂｐ）の
取得を確認した。第３図に、プラスミドｐＴＮＦ１ＢＲ
の作成方法を示す。

以上と同様な手法により、合成オリゴヌクレオチドＴＮ
Ｆ−８〜ＴＮＦ−１３を用いてプラスミドｐＴＮＦ２Ｎ
＜約３．ＩＫｂｌ））を、合成オリゴヌクレオチドＴＮ
Ｆ−１４〜ＴＮＦ−１７を用いてプラスミド１）ＴＮＦ
３（約２，４Ｋ　ｂｐ）を、それぞれ作成した。第４図
及び第５図に、プラスミドｐＴＮＦ２Ｎ及びρＴＮＦ３
の作成方法を、それぞれ示す。

こうして得られたヒトＴＮＦ遺伝子の一部を含むプラス
ミドｐＴＮＦＩＢＲ，ｐＲＮＦ２Ｎ及び１）ＴＮＦ３の
、合成オリゴヌクレオチド使用部分の塩基配列が設計通
りであることは、マキサム・ギルバート法［Ａ、Ｍ、Ｍ
ａｘａｍら、　Ｍ　ｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ、、６
５．　４９９（１９８０）　］によって確認した。

実施例４（ヒトＴＮＦ３１伝子発現型プラスミドの作成
） 実施例３で得られたプラスミドｐＴＮＦ１ＢＲ１０μ９
を、実施例３と同様にして制限酵素（ＪａＩ及び５ａｌ
Ｉで切断し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動くゲル濃
度５％）の後、実施例２の方法に準じて、ヒトＴＮＦ遺
伝子の一部を含む約２２０ｂｐのＤＮＡ断片＜Ｃ１ａ　
ｌ−３ａｌＩ）をポリアクリルアミドゲルより回収した
。

次に、実施例３で得られたプラスミドｐＴＮＦ２　１０
μｓｒをｉｏｏμｕの１０　ｍＭ　　Ｔ　ｒｉｓ−ＨＣ
２（１）Ｈ７，５＞　　、　　６０　１Ｍ　　　Ｎａ　
　Ｃ１，７１１ＭＭ０Ｃｆｚ水溶液に溶解させ、４０ユ
ニツトの制限酵素ＰＶｕ［（宝酒造）を添加し、３７℃
で１時間切断反応を行なった。そして、実施例３の方法
に準じて制限酵素３ａｌ■による切断、ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動くゲル濃度５％）の後、実施例２の方
法に準じて、ヒトＴＮＦＩ伝子の一部を含む約１７０ｂ
ｐのＤＮＡ断片（ＳａｌＩＨＰｖｕｌＩ）をポリアクリ
ルアミドゲルより回収した。

また、実施例３で得られたプラスミド１）ＴＮＦ３　１
０μグも１０（Ｉ　ｕの１０　！ＩＩＭ　　Ｔ　ｒｉｓ
−ＨＣ１（１）Ｈ７，５）　、　６０１Ｍ　　Ｎａ　Ｃ
１，７ｍＭＭ（ＩＣｆｚ水溶液に溶解させ、４０ユニツ
トの制限酵素ｐｖＪ及び４０に／トの制限酵素Ｈｉｎｄ
Ｉ［［（宝酒造）を添加し、３７℃で１時間切断反応を
行なった。そして、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（
ゲル濃度５％）の後、実施例２の方法に準じて、ヒトＴ
ＮＦ遺伝子の一部を含む約１１０ｂｐのＤＮＡ断片（Ｐ
ｖｕ■→ＨｉｎｄＩＩＩ）をポリアクリルアミドゲルよ
り回収した。

一方、大腸菌ｔｒｐプロモーターを有するプラスミドｐ
Ｙｓ３１Ｎ（約４．７Ｋｂｐ）　５μグを、上記と同様
に制限酵素ＣｊａＩ及び）ｌｉｎｄｌｌ［で切断し、ア
ガロースゲル電気泳動くゲル濃度０．８％）の後、実施
例３の方法に準じて、プラスミドｌ］Ｙｓ３１Ｎの大部
分を含む約４，７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ断片（（Ｊａ工”−
’Ｈｉｎｄｕ）をアガロースゲルより回収した。

こうして得られた、ヒトＴＮＦ遺伝子の一部を含む約２
２０ｂｐ、約１７０ｂｌ）及び約１１０ｂｐの３つのＤ
ＮＡ断片とプラスミドｐＹ　Ｓ　３１Ｎの大部分を含む
約４．７Ｋｌ）ｐのＤＮＡ断片とを混合し、エタノール
沈澱の後、実施例３の方法に準じて、Ｔ４−ＤＮＡリガ
ーゼによる連結反応を行なった。反応終了後、実施例３
の方法に準じてエシェリヒア・コリＣ６００ｒ−１１−
株に導入し、形質転換株の中より目的のヒトＴＮＦ遺伝
子発現型プラスミドｐＴＮＦ４０１ＮＮ（約５．２Ｋ　
ｂｐ）を有するクローンを選択した。第６図に、そのプ
ラスミドＤＴＮＦ４０１ＮＮの作成方法を示した。

また、上記プラスミドｐＹｓ３１Ｎ５μ３を、上記の方
法に準じて制限酵素ＰＶＬＩＩＩで部分分解した侵、さ
らに制限酵素１−１ｉｎｄＩ［Ｉで切断し、アガロース
ゲル電気泳動（ゲル濃度０．８％）の後、実施例３の方
法に準じて、ｔｒｐプロモーターを含む約２．７Ｋ　ｂ
ｐのＤＮＡ断片［ＰｖｕＩＩ（２）”Ｈｉｎｄ　Ｉ［［
］をアガロースゲルより回収した。

次に第７図記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド
を、実施例２の方法に準じて、合成・精製した。得られ
た２本の合成オリゴヌクレオリドそれぞれ０．５μ９に
ついて、実施例３の方法に準じて、末端のリン酸化を行
ない、アニーリングの後、先に得られた約２．７Ｋ　ｂ
ｐのＤＮＡ断片［ｐｖｕＩＩ（２）ＨＨｔｎｄ　ＩＩＩ
　］と混合し、エタノール沈澱の後、実施例３の方法に
準じて、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼによる連結反応を行なっ
た。反応終了後、実施例３の方法に準じてエシェリヒア
・コリＣ６００ｒ−ｍ株に導入し、形質転換株の中より
目的のプラスミドｐＡＡ４１（約２．７Ｋ　ｂｐ）を有
するクローンを選択した。このようなプラスミドは、プ
ラスミド１）Ｙ　Ｓ　３１Ｎからコピー数制御領域を除
去し、ｔｒｐプロモーター下流に存在するクローニング
・サイトの下流に大腸菌ｔｒｐ　Ａターミネータ−を付
与した形の、多コピー・高効率発現ベクターであり、第
７図にその作成方法を示した。

このプラスミド１）ＡＡ４１　２μ９を、上記と同様に
制限酵素Ｃ１ａｌ及びＨｉｎｄｌ［［で切断し、アガロ
ースゲル電気泳動（ゲル濃度０．８％）の後、実流例３
の方法に準じて、プラスミドｐＡ　Ａ　４１の大部分を
含む約２．７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ断片（Ｃオａ■←Ｉ」１
ｎｄｌ＞をアガロースゲルより回収した。

また、先に得られたヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミド
ｐＴ　Ｎ　Ｆ　４０１Ｎ　Ｎ　５μ９を、上記と同様に
制限酵素Ｃ１ａ工及びＨｉｎｄＤＩで切断し、ポリアク
リルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度５％）の後、実施例
２の方法に準じて、ヒトＴＮＦ遺伝子全域を含む約４９
０ｂｐのＤＮＡ断片＜Ｃ１ａ　ｌ−Ｈｌｎｄ　ＩＩＩ）
をポリアクリルアミドゲルより回収した。

こうして得られた、プラスミドｌ）Ａ　Ａ　４１の大部
分を含む約２．７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ断片とヒトＴＮＦ遺
伝子全域を含む約４９０ｂｌ）のＤＮＡ断片とを混合し
、エタノール沈澱の後、実施例３の方法に準じて、Ｔ４
−ＤＮＡリガーゼによる連結反応を行なった。

反応終了後、実施例３の方法に準じて、エシェリヒア・
コリ６００ｒ−ｍ−株に導入し、形質転換株の中より目
的のプラスミドｐＴ　Ｎ　Ｆ　４０１Ａ　（約３．２Ｋ
ｂｐ＞を有するクローンを選択した。このプラスミドは
、ヒトＴＮＦＩ仏子をより効率良く発現させる能力を有
しており、第８図にその作成方法を示した。

実施例５（新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プ
ラスミドの作成） 実施例４で得られたヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミド
Ｉ）ＴＮＦ　４０１Ａ２０μ９を、実施例４の方法に準
じて制限酵素Ｃ１ａＩ及びｌ−１ｉｎｄｌｌｌで切断し
、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度５％）及
びアガロースゲル電気泳動（ゲル＠ｆｉｌ　Ｏ，８％）
の後、それぞれ実施例２及び３の方法に準じて、生成す
る２つのＤＮＡ断片（約４９０ｂｐ及び約２．７Ｋｂｐ
、両方共Ｃｊａ　Ｉ　”Ｈｉｎｄ　＠　）をゲルより回
収した。

ここで得られたヒトＴＮＦ遺伝子全域を含む約４９０ｂ
ｐのＤＮＡ断片を５０μ磨の１０１１１Ｍ　　Ｔｒ＋５
Ｈ（Ｊ（ｐｔ−＋　７．４）、　１０ｍＭ　　ＭＣ１ｓ
Ｏ４、１ＲＩＭジチオスレイトール水溶液に溶解させ、
１０ユニツトの制限酵素ＨａｐＩＩ（宝酒造）を添加し
て、３７℃で１時間切断反応を行なった。反応終了後、
ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度５％）を行
ない、実施例２の方法に準じて、ヒトＴＮＦ遺伝子の大
部分を含む約３９０ｂｐのＤＮＡ断片（Ｈａｔ）■←Ｈ
ｉｎｄｍ）をポリアクリルアミドゲルより回収した。

また、第９図記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチ
ドを、実施例２の方法に準じて、合成。

ＩＩした。得られた４本の合成オリゴヌクレオチドそれ
ぞれ０．５μシについて、実施例３の方法に準じて、末
端のリン酸化を行ない、アニーリングの後、Ｔ４−ＤＮ
Ａリガーゼによる連結反応を行なった。

反応終了後、得られた２本鎖オリゴヌクレオチドを、先
に得られた約２．７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ断片Ｂｌａ　Ｉ”
Ｈｉｎｄ　ｍ　）及びヒトＴＮＦ遺伝子の大部分を含む
約３９０ｂｐのＤＮＡ断片（ＨａｐｌＩ　−Ｈｌｎｄｌ
ｌ）と混合し、エタノール沈澱の後、実施例３の方法に
準じて、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼによる連結反応を行なっ
た。反応終了後、実施例３の方法に準じてエシェリヒア
・コリＣ６００ｒ−ｍ−株に導入し、形質転換株の中よ
り目的のプラスミド１）ＴＮＦ４７１（約３．２Ｋｂｌ
））を有するクローンを選択した。このプラスミドは、
次のアミノ酸配列（Ｈ２Ｎ　）　−Ａｒ＋ｌＩ−ＬＶＳ
−Ａｒ（Ｊ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｈｉｓ
−Ｖａｔ−Ｖａｔ−Ａｌａ−Ａ　Ｓｎ　−Ｐ　ｒｏ　−
Ｇ　Ｉｎ　−Ａ　ｌａ　−Ｇ　Ｉｕ　−Ｇ　＋ｙ　−Ｇ
　Ｉｎ　−Ｌ　ｅｕ−Ｇ　Ｉｎ−Ｔ　ｒｐ−Ｌ　ｅｕ−
Ａ　ｓｎ−Ａ　ｒａ−Ａ　ｒｏ　−Ａ　Ｉａ　−Ａ　ｓ
ｎ　−Ａ　ｔａ−１，ｅｕ　−Ｌ　ｅｕ　−Ａ　ｌａ　
−Ａ　ｓｎ　−Ｇ　＋ｙ−Ｖ　ａｌ−Ｇ　Ｉｕ−Ｌ　ｅ
ｕ−Ａ　ｒｌ）−Ａ　５ｌ）−Ａ　５ｎ−Ｇｌｎ　−Ｌ
ｅｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−３ｅｒ−Ｇｌｕ　−Ｇ
ｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ　−１１ｅ−Ｔｙｒ−８
ｅｒ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｖ　ａｔ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｐ　ｈ
ｅ　−Ｌ　ｙｓ−Ｇ　Ｉｙ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｇ　Ｉｙ−
Ｃｙｓ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｓ　ｅｒ　−Ｔ　ｈｒ−Ｈｉｓ
　−Ｖ　ａｌ−Ｌ　ｅｕ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｔｈｒ　−Ｈ
ｉｓ　−Ｔｈｒ　−１１ｅ　−Ｓｅｒ　−Ａ　ｒａ　−
１１ｅ　−Ａ　Ｉａ　−Ｖａｔ　−Ｓｅｒ　−Ｔｙｒ　
−Ｇ　Ｉｎ　−Ｔ　ｈｒ　−Ｌ　ｙｓ　−Ｖ　ａｔ　−
Ａ　ｓｎ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｓ　ｅｒ　−Ａ
　Ｉａ　−Ｉ　ｌｅ　−Ｌ　ｙｓ　−Ｓ　ｅｒ　−Ｐ　
ｒｏ　−Ｃｙｓ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ａ　ｒｇ−Ｇ　Ｉｕ−
Ｔ　ｈｒ−Ｐ　ｒｏ−Ｇ　ｌｕ−Ｇ　Ｉｙ−Ａ　１ａ−
Ｇ　Ｉｕ−Ａ　Ｉａ−Ｌｙｓ−Ｐ　ｒｏ−Ｔ　ｒｐ−Ｔ
ｙｒ−Ｇ　１ｕ−Ｐｒｏ−１１ｅ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇ
ｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐ　ｈｅ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｌ　
ｅｕ　−Ｇ　ｌｕ　−Ｌ　ｙｓ　−Ｇ　ｌｙ　−Ａ　ｓ
ｏ　−Ａｒａ−Ｌｅｕ−８ｅｒ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−１１
ｅ−Ａｓｎ−Ａ　ｒａ−Ｐ　ｒｏ−Ａ　ｓｐ−Ｔｙｒ−
Ｌｅｕ−Ａ　ｓｐ−Ｐｈｅ−Ａ　ｌａ−Ｇ　ｌｕ−５ｅ
ｒ−Ｇ　ｌｙ−Ｇ　Ｉｎ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇ
ｔｙ−１１ｅ−１１ｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−（ＣＯＯＨ） で表わされる抗腫瘍性ポリペプチドまたはそのアミノ末
端にＭｅｔが結合しているポリペプチドをコードする発
現型プラスミドであり、第９図にその作成方法を示した
。

一方、上記で得られたヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミ
ドＥＩＴＮＦ　４７１　２０μグを、実施例４の方法に
準じて制限酵素ＨｉｎｄＩ［［で切断した後、５０１Ｍ
　　　Ｔｒｉｓ　　−ＨＣｊ　　（１）８　７．４）　
　、　　１００　　ｍ　　ＭＮａ　Ｃ１，１０１Ｍ　　
ＭＱ　ＳＯ４水溶液中で制限酵素ＮｃｏＩ（宝酒造）に
よる切断反応を３７℃で１時間行なう。反応終了後、ア
ガロースゲル電気泳動（ゲル濃度０．７％）及びポリア
クリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度５％）を行ない、
実施例２の方法に準じて、ヒトＴＮＦ遺伝子の一部を含
む約１４０ｂｐのＤＮＡ断片（ＮｃｏＩ＋Ｈｉｎｄ　Ｉ
ＩＩ）をポリアクリルアミドゲルより、そして実施例３
の方法に準じて、１）ＴＮＦ４７１の大部分を含む約３
．０ＫｂｐのＤＮＡ断片（ＮｃｏＩ４−４Ｈｉｎｄ　ｍ
　）をアカロースゲルより、それぞれ回収した。

さらに、上で得られた約１４０ｂｐのＤＮＡ断片（Ｎｃ
ｏＩ”Ｈｉｎｄ　ｌ）を５０μ文の１０ｍＭ　　Ｔｒｙ
ｓ−ＨＣＩ　（ＤＨ７，４）　、　１０１Ｍ　　Ｍｇ３
０４　、１１１Ｍジチオスレイトール水溶液に溶解させ
、１０ユニツトの制限酵素ＡＣＣＩ（宝酒造）を添加し
て、３１℃で１時間切断反応を行なった。反応終了後、
ポリアクリルアミドゲル電気泳動くゲル濃度８％）を行
ない、実施例２の方法に準じて、ヒトＴＮＦ遺伝子の一
部を含む約１１０ｂｐのＤＮＡ断片（Ｎ　Ｃ０Ｉ４−４
ＡＣＣＩ）をポリアクリルアミドゲルより回収した。

また、第１０図記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオ
チドを、実施例２の方法に準じて、合成。

精製した。得られた２本の合成オリゴヌクレオチドそれ
ぞれ０．５μグについて、実施例３の方法に準じて、末
端のリン酸化を行ない、アニーリングを行なった。

アニーリングの後、得られた２本鎖オリゴヌクレオチド
を、先に得られた約３．０Ｋ　ｂｐのＤＮＡ断片（Ｎｃ
ｏＩ４−ＩＨｉｎｄ　ｍ　）及びヒトＴＮＦ遺伝子の一
部含む約１１０ｂｌ）のＤＮＡ断片（ＮｃｏＩ→Ａｃｃ
Ｉ＞と混合し、エタノール沈殿の後、実施例３の方法に
準じて、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼによる連結反応を行なっ
た。反応終了後、実施例３の方法に準じてエシェリヒア
・コリＣ６００ｒ−ト株に導入し、形質転換株の中より
目的のプラスミドＤＴＮＦ６１９（約３．２Ｋ　ｂｐ）
を有するクローンを選択した。このプラスミドは、次の
アミノ酸配列 （Ｈ２Ｎ　）　−Ａｒ（ｌ　　Ｌｙｓ−ＡｒｌＪ　−Ｌ
ｙｓ　−ｐｒｏ−Ｖａｔ−△ｌａ　−Ｈｉｓ　−Ｖａｌ
−Ｖａｌ　−Ａ　Ｉａ　−Ａ　ｓｎ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｇ
　Ｉｎ　−Ａ　Ｉａ　−Ｇ　Ｉｕ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｇ　
Ｉｎ　−Ｌ　ｅｕ−Ｇ　Ｉｎ　−Ｔｒｐ　−Ｌ　ｅｕ　
−Ａ　ｓｎ　−Ａ　ｒｇ　−Ａ　ｒｇ　−Ａ　ｌａ　−
Ａ　ｓｎ　−Ａ　ｌａ　−Ｌ　ｅｕ−Ｌ　ｅｕ　−Ａ　
ｌａ　−Ａ　ｓｎ　−Ｇ　ＩＶ−Ｖ　ａｌ−Ｇ　ｌｕ−
Ｌ　ｅｌＪ−Ａ　ｒｌＪ−Ａ　Ｓｐ−Ａ　５ｎ−Ｇ　Ｉ
ｎ　−Ｌ　ｅｕ−Ｖ　ａｌ　−Ｖ　ａｌ−Ｐ　ｒｏ　−
Ｓ　ｅｒ　−Ｇ　ｌｕ　−Ｇ　Ｉｙ　−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ
　−Ｌｅｕ　−Ｉ　ｌｅ　−Ｔｙｒ　−５ｅｒ−Ｇ　Ｉ
ｎ　−Ｖ　ａｌ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｐ　ｈｅ　−Ｌ　ｙｓ
　−Ｇ　ｌｙ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｇ　ＩＶ　−ＣＶｓ　−
Ｐ　ｒｏ　−Ｓ　ｅｒ−Ｔ　ｈｒ−Ｈｉｓ−Ｖ　ａｔ　
−Ｌ　ｅｕ　−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｈ１ｓ−Ｔｈｒ　−Ｔ
　１ｅ−８ｅｒ　−Ａ　ｒｏ−１１ｅ−Ａ　Ｉａ　−Ｖ
ａｌ　−Ｓｅｒ　−Ｔｙｒ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｔ　ｈｒ　
−Ｌ　ｙｓ　−Ｖａｌ　−、Ａ　５ｎ−１ｅｕ　−Ｌ　
ｅｕ　−３ｅｒ　−Ａ　ｌａ−１１ｅ　−Ｌｙｓ　−Ｓ
ｅｒ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｃｙｓ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ａ　ｒ（
Ｊ−Ｇ　Ｉｕ　−Ｔ　ｈｒ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｇ　Ｉｕ−
Ｇ　ＩＶ　−Ａ　Ｉａ　−Ｇ　Ｉｕ　−Ａ　ｌａ　−Ｌ
　ｙＳ−Ｐ　ｒｏ　−Ｔ　ｒｐ　−Ｔ　ｙｒ　−Ｇ　ｌ
ｕ　−Ｐｒｏ　−１１ｅ−Ｔｙｒ　−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−
Ｇｌｙ−ｖａｌ　−Ｐ　ｈｅ　−Ｇ　ｌｎ−Ｌ　ｅｕ−
Ｇ　Ｉｕ　−Ｌ　”／Ｓ−Ｇ　１１／　−Ａ　Ｓ＋１−
Ａｒ（＋　−Ｌｅｕ−８ｅｒ−Ａ　１ａ−Ｇｌｕ　−１
１ｅ−Ａｓｎ　−Ａ　ｒｏ　−Ｐ　ｒｏ　−Ａ　ｓｐ　
−Ｔ　ｙｒ　−Ｌ　ｃｕ　−Ａ　３ｐ−Ｐ　ｈｅ　−Ａ
　ｌａ−Ｇ　Ｉｕ−Ｓ　ｅｒ−Ｇ　ｌｙ−Ｇ　Ｉｎ−Ｖ
　ａｌ　−Ｔ　ｙｒ　−ＰＭ−Ｇ　ＩＶ−Ｉ　Ｉｅ−１
１８−Ｐｈｅ−１−ｅｕ−（ＣＯＯＨ） で表わされる新規抗腫瘍性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドをコードす
る新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プラスミド
であり、第１０図にその作成方法を示した。

実施例６（発現の確認） 前記実施例４で得られたヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラス
ミドｐＴＮＦ　４０１Ａ、実施例５で得られた発現型プ
ラスミドＩ）ＴＮＦ４７１又は新規抗腫瘍活性ポリペプ
チド遺伝子発現型プラスミドｐＴＮＦ６１９を有するエ
シェリヒア・コリ（：、　６００ｒ−＋ｅ−株を、３０
〜５０μｇ／ｊｌｅノアンビシリン、０．２％のグルコ
ース及び４１１９／ａｌｌのカザミノ酸を含むＭ９培地
［０，６％Ｎａ　２　ＨＰＯ４−０，３％に２ＨＰＯ４
０，０５％ＮａＣ！−０．１％Ｎ８４Ｃオ水溶液（ｐＨ
７，４）をオートクレーブ滅菌した後に、別途にオート
クレーブ滅菌したＭｇ８０４水溶液及びＣａＣｌ２水溶
液をそれぞれ最終部１２５Ｍ及び０．１　ｇ＋Ｍになる
ように加える。］　　２５０ｄに接種し、ＯＤ６．Ｄが
０．７に達するまで、３７℃で振どう培養を行なった。

次いで、最終濃度５０μｇ／ｄの３−β−インドールア
クリル酸を培養液中に添加し、さらに３７℃で１２時間
振とう培養を続けた。

遠心分離により大腸菌菌体を集めた後、ＰＢＳバッフ：
Ｆ　−（１５０ｍＭ　　Ｎａ　Ｃ１を含む２０１Ｍリン
酸バッファー、　　ｌ）Ｈ７，４）を用いて菌体の洗浄
を行なった。洗浄後の菌体をＩＱａｄ！のＰＢＳバッフ
ァーに懸濁させ、超音波発生装置（久保田、　　２００
Ｍ型）を用いて菌体を破壊した後、遠心分離により菌体
残漬の除去を行なった。

得られた大腸菌ライゼートの一部に対して、Ｔｒｉｓ−
）−１（Ｊバッファ　−（１）Ｈ６，８）　、　ＳＤＳ
、　２−メルカブトエタノール、グリセロールを、それ
ぞれ最終濃度６０１Ｍ、２％、４％、１０％になるよう
に加え、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動［枠
木、遺伝、虹、　４３（１９７７）　］を行なった。

分離用ゲルは１５％とし、泳動バッファーはＳＯ３゜Ｔ
　ｒｉｓ−グリシン系［Ｌｌ、　Ｋ、　Ｌａｅｍｍｌｉ
。

Ｎａｔｕｒｅ　、ユ２７．　６８０（１９７０）　１を
用いた。電気泳動終了後、ゲル中の蛋白質をクーマシー
ブル−Ｒ−２５０（バイオ・ラッド）で染色し、ヒトＴ
ＮＦ遺伝子及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子の発
現の確認を行なった。結果の一部を複写して、第１１図
に示した。

なお、染色後のゲルをクロマト・スキャナー（島津、Ｃ
８−９３０型）にかけて、産生された抗腫瘍活性ポリペ
プチドの大腸菌細胞質蛋白質中にしめる割合の算出を行
なった。その結果、ヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミド
１）ＴＮＦ４０１Ａを有する大腸菌においては全細胞質
蛋白質の約１６．３％の発現型プラスミド１）ＴＮＦ４
７１を有する大腸菌においては全細胞質蛋白質の約１８
．３％の新規抗腫瘍活性ポリフペブチド遺伝子発現型プ
ラスミドｐＴＮＦ６１９を有する大腸菌においては同じ
く約２０．３％の抗腫瘍活性ポリペプチドの産生が、そ
れぞれ認められた。

実施例７（活性の評価） 新規抗腫瘍活性ポリペプチドのｉｎ　ｖｉｔｒｏ抗癌活
性測定は、前記Ｒｕｆｆの方法に準じて行なった。

すなわち、実施例６で得られた新規抗腫瘍活性ポリペプ
チドを含む大腸菌ライゼートを順次培地で希釈した試料
１００μ文と、４Ｘ１０６個／Ｉｒｄｌの濃度のマウス
ｌ−９２９Ｉｌ維芽細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ９２９）懸濁
液１００μ文を、９６穴の組織培養用マイクロプレート
（コースタ−）内で混合した。なおこの際に、最終濃度
１μｇ／ＩＩ！ｉ！のアクチノマイシンＤ（コスメゲン
、萬有製薬）を添加しておく。

培地としては、５％（ｖｏｌ　／ｖｏｌ　）のウシ胎児
血清を含むイーグルのミニマム・エツセンシャル培地（
日本製薬）を用いた。上記マイクロプレートを、５％炭
酸ガスを含む空気中、３７℃で１８〜２０時間培養した
後、クリスタル・バイオレット溶液［５％（ｖｏｌ／ｖ
ｏｌ　）メタノール水溶液に、０．５％（ｗｔ／ＶＯＩ
　）のクリスタル・バイオレットを溶解させたちの］を
用いて生細胞を染色した。余分なりリスタル・バイオレ
ットを洗い流し乾燥した後、残ったクリスタル・バイオ
レットを１００μ文の０．５％ＳＤＳ水溶液で抽出し、
その５９５μｍにおける吸光度をＥＬＩＳＡアナライザ
ー（東洋側器。

ＥＴＹ−９６型）で測定する。この吸光度は、生き残っ
た細胞数に比例する。そこで、抗腫瘍活性ポリペプチド
等を含む大腸菌ライゼートの希釈溶液を加えない対照の
吸光度の５０％の値に相当する大腸菌ライゼートの希釈
倍率をグラフ（たとえば第１２図）によって求め、その
希釈倍率をユニットと定義する。第１２図より、発現型
プラスミドｐＴＮＦ　４０１ＡにコードされるヒトＴＮ
Ｆ蛋白質を含む大腸菌ライゼート　１００μ文は５，３
Ｘ　１０６ユニツト程度の活性を、発現型プラスミドＩ
）ＴＮＦ４７１にコードされる抗腫瘍活性ポリペプチド
を含む大腸菌ライゼート　１００μ旦は約５．８Ｘ　１
０’ユニット程度の活性を、そして発現型プラスミドｐ
ＴＮＦ６１９にコードされる新規抗腫瘍活性ポリペプチ
ドを含む大腸菌ライゼート　１００μ磨は約１．３Ｘ　
１０８ユニツト程度の活性を、それぞれ有していること
が明らかになった。

実施例６で得られた各種大腸菌ライゼート中に含まれ総
蛋白質量は、プロティン・アッセイ・キット（バイオ・
ラッド）を用いて定量し、ウシ血清アルブミンを用いた
検量線より計算した。上記で得られた発現量、活性の値
及び蛋白質定量結果より抗腫瘍活性ポリペプチド等の比
活性を計算したところ、表１のような値が得られた。表
１より、１）ＴＮＦ６１９にコードされる新規抗腫瘍活
性ポリペプチドはヒトＴＮＦ蛋白質の約１８倍の比活性
を、そしてｐＴＮＦ４７１にコードされる抗腫瘍活性ポ
リペプチドの約２倍の比活性を有していることがわかる
。

【図面の簡単な説明】

第１図は設計したヒトＴＮＦ３！Ｉ伝子の塩基配列を、
第２図は化学合成した合成オリゴヌクレオチドの塩基配
列を、それぞれ示したものである。第３図、第４図及び
第５図は、ヒトＴＮＦ遺伝子の部を有するプラスミドｐ
ＴＮＦＩＢＲ，ｐＴＮＦ２Ｎ及びｐＴＮＦ３の作成方法
を、それぞれ示したものである。第６図はヒトＴＮＦ遺
伝子発現型プラスミドｐＴＮＦ　４０１ＮＮの作成方法
を、第７図は発現ベクター１）Ａ　Ａ　４１の作成方法
を、そして第８図はヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミド
１）ＴＮＦ４０１Ａの作成方法を、それぞれ示したもの
である。第９図は抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型
プラスミドＩ）ＴＮＦ４７１の作成方法を示したもので
ある。第１０図は新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発
現型プラスミドＩ）ＴＮＦ６１９の作成方法を示したも
のである。第１１図はヒトＴＮＦ遺伝子及び新規抗腫瘍
活性ポリペプチド遺伝子の発現確認結果を示したもので
ある。第１２図はヒトＴＮＦ蛋白質及び新規抗腫瘍活性
ポリペプチドのｔｒｏ抗癌活性測定結果を示したもので
ある。

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. （１）次のアミノ酸配列 【アミノ酸配列があります】 で表わされる、新規生理活性ポリペプチド。
2. （２）アミノ末端にＭｅｔが結合していることを特徴と
   する請求項１記載のポリペプチド。
3. （３）次のアミノ酸配列 【アミノ酸配列があります】 【アミノ酸配列があります】 で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
   ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドをコードす
   るＤＮＡ領域を含む組換えプラスミド。
4. （４）該ＤＮＡ領域が次の塩基配列 【塩基配列があります】 で表わされる一本鎖ＤＮＡとそれに相補的な一本鎖ＤＮ
   Ａとから成る一本鎖ＤＮＡを含むことを特徴とする請求
   項３記載のプラスミド。
5. （５）該ＤＮＡ領域が次の塩基配列 【塩基配列があります】 で表わされる一本鎖ＤＮＡとそれに相補的な一本鎖ＤＮ
   Ａとから成る一本鎖ＤＮＡを含むことを特徴とする請求
   項３記載のプラスミド。
6. （６）該プラスミドがプラスミドｐＴＮＦ６１９である
   請求項３記載のプラスミド。
7. （７）次のアミノ酸配列 【アミノ酸配列があります】 で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
   ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドをコードす
   るＤＮＡ領域を含む組換えプラスミドにより形質転換さ
   れた組換え微生物細胞。
8. （８）該微生物細胞がエシエリヒア・コリ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）であることを特
   徴とする請求項７記載の微生物細胞。
9. （９）次のアミノ酸配列 【アミノ酸配列があります】 で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
   ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプトチドをコード
   するＤＮＡ領域を含む組換えプラスミドにより形質転換
   された組換え微生物細胞を培養し、培養物中に新規生理
   活性ポリペプチドを生成蓄積せしめ、得られた培養物か
   ら新規生理活性ポリペプチドを分離することを特徴とす
   る、新規生理活性ポリペプチドの製造方法。
10. （１０）抗腫瘍に有効な量の次のアミノ酸配列【アミノ
    酸配列があります】 【アミノ酸配列があります】 で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
    ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドを含有する
    医薬組成物。