JPS63267291A - 新規生理活性ポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （１）産業上の利用分野 本発明は新規生理活性ポリペプチド、該ポリペプチドを
コードするＤＮＡ領域を含む組換えプラスミド、該プラ
スミドによって形質転換された組換え微生物細胞及び該
微生物細胞を用いた新規生理活性ポリペプチドの製造方
法に関する。更に詳しくは、抗腫瘍活性を有する新規ポ
リペプチド（以下、新規抗腫瘍活性ポリペプチドと略す
こともある）、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ領域
を含む組換えプラスミド、該プラスミドによって形質転
換された組換え微生物細胞及び該微生物細胞を用いた新
規抗腫瘍活性ポリペプチドの製造方法に関する。

本明細書において、アミノ酸、ポリペプチドはＩＵＰＡ
Ｃ−ＩＵＢ生化学委員会（ＣＢＮ）で採用された方法に
より略記するものとし、たとえば下記の略号を用いる。

ＡＩａＬ−アラニン ＡｒＱＬ−アルギニン Ａｓｎ　　Ｌ−アスパラギン Ａｓｐ　　Ｌ−アスパラギン酸 Ｃｙｓ　　Ｌ−システィン Ｇｌｎ　　Ｌ−グルタミン ＧＩｕＬ−グルタミン酸 Ｇｌｙ　　グリシン ＨｉＳＬ−ヒスチジン １１ｅＬ−イソロイシン しｅｕ　　Ｌ−ロイシン Ｌｙｓ　　Ｌ−リジン Ｍｅｔ　Ｌ−メチオニン Ｐｈｅ　　Ｌ−フェニルアラニン ｐｒｏｌ−プロリン ３ｅｒ　　Ｌ−セリン Ｔｈｒｌ−スレオニン Ｔｒｌ）　　Ｌ−ｔ−リプトファン Ｔｙｒ　　Ｌ−チロシン Ｖａｌ　　Ｌ−バリン また、ＤＮＡの配列はそれを構成する各デオキシリボヌ
クレオチドに含まれる塩基の種類で略記するものとし、
たとえば下記の略号を用いる。

Ａ　アデニン（デオキシアデニル酸を示す。）Ｃシトシ
ン（デオキシシチジル酸を示す。）Ｇ　グアニン（デオ
キシグアニル酸を示す。）Ｔ　チミン　（デオキシチミ
ジル酸を示す。）さらに、（Ｈ２Ｎ）−及び−（ＣＯＯ
Ｈ）はそれぞれアミノ酸配列のアミノ末端側及びカルボ
キシ末端側を示すものであり、（５′）−及び（３′　
）はそれぞれＤＮＡ配列の５′末端側及び３′末端側を
示すものである。

（′２Ｊ　　発明の背景 Ｃａｒｓｗｅｌｌ　らは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　Ｃａｌ
ｍｅｔｔｅ　−Ｑｕｅｒｉｎ　　（Ｂ　ＣＧ　）などで
前もって刺激をうけたマウスにエンドトキシンを投与し
た後に採取した血清中に、移植したＭｅｔｈＡ肉腫によ
る癌を出血壊死させる物質が含まれていることを見出し
、この物質を腫瘍壊死因子（Ｔ　ｕｍｏｒ　　Ｎ　ｅｃ
ｒｏｓｉｓＦａｃｔｏｒ　、以下ＴＮＦと略記すること
もある）と名づけた［Ｅ、　Ａ、　Ｃａｒｓｗｅｌｌら
、　Ｐ　ｒｏｃ、Ｎ　ａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、Ｕ　Ｓ　Ａ　、　７２．３６６６
　（１９７５）　］　、このＴＮＦはマウス、ウサギ、
ヒト等多くの動物中に見られ、腫瘍細胞に特異的に、し
かも種を越えて働くことから、制癌剤としての利用が期
待されてきた。

最近になって、Ｐｅｎｎ１ｃａらは、ヒトＴＮＦのＣＤ
　Ｎ　Ａクローニングを行ない、ヒトＴＮＦ蛋白質の一
次構造を明らかにすると共に、大腸菌におけるヒトＴＮ
Ｆ遺伝子の発現について報告した［Ｄ、　　Ｐｅｎｎ１
ｃａら、　　Ｎａｔｕｒｅ　、　　３１２．　７２４（
１９８４）　］　。その後、自弁ら［Ｔ、　５ｈｉｒａ
ｉら。

Ｎａｔｕｒｅ　、ユ１３．　８０３（１９８５）　］　
、宗村ら［余材ら、癌と化学療法、　１２．　１６０（
１９８５）コ、Ｗａｎａら［Ａ、Ｍ、Ｗａｎｇら、　Ｓ
　ｃｉｅｎｃｅ、ユ已１４９（１９８５）　　］及びＭ
　ａｒｍｅｎｏｕｔら［Ａ　、　　Ｍ　ａｒｍｓ−ｎｏ
ｕｔら。

Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏ；ｈｅｌ、、　１５２．　５１
５（１９８５）　］が、ヒトＴＮＦ遺伝子の大腸菌にお
ける発現について相ついで報告している。

このように遺伝子操作技術を用いることによって、純粋
なヒトＴＮＦ蛋白質が多量に入手できるようになるに及
び、ＴＮＦの有する抗腫瘍活性以外の生理活性が明らか
になりつつある。たとえば、癌末期や重症感染症患者に
見られる悪液質を引き起こす原因の一つであるカケクチ
ンがＴＮＦに非常に類似しており［８，Ｂｅｕｌｔｅｒ
ら、　Ｎａｔｕｒｅ　。

３１６、　５５２　（１９８５）　］　、カケクチンが
リボプロティン・リパーゼ阻害活性を有することから、
ＴＮＦの投与により血中のトリグリセリド量が増大し、
その結果として高脂血症のような副作用を引き起こす可
能性のあることが示唆された。また、それ以外にも、血
管内皮細胞への影１［Ｊ、Ｒ。

Ｑａｍｂｌｅら、Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　、ユ６２
．２１６３（１９８５）　］　、骨吸収作用［Ｄ、　Ｒ
，Ｂｅ１ｔｏｌｉｎｉら、Ｎａｔｕｒｅ　、　　３１９
．　５１６（１９８６）　］等が報告されている。

一方、近年の遺伝子操作技術の進歩は、蛋白質中の任意
のアミノ酸を他のアミノ酸に置換したり、付加したり、
または欠失させることを可能にした。

このようにして、天然に存在する蛋白質を改変して、特
定の目的にかなった新しい蛋白質を創製する研究が、数
多く成されている。

ヒトＴＮＦ蛋白質の改変についてもいくつかの研究が成
されており、第１図記載のヒトＴＮＦ蛋白質のアミノ酸
配列において、Ｃｙｓ”及びｃｙｓ”のいずれか又は両
方の他のアミノ酸残基への置換（ＰＯＴ出願公開ＷＯ３
６／　０４６０６号、特願昭６ｌ−１０６７７２）　、
　Ｇ　Ｉｙ″ゝの他のアミノ酸残基への置換（特願昭６
１−１０６７７２号、特願昭６１−２３８０４８号）。

Ａ　Ｉ　ａ　／Ｊ’の他のアミノ酸残基への置換（特願
昭６１＝２３３３３７号）が報告されている。また、ア
ミノ末端側のアミノ酸残基の欠失についても、６アミノ
酸欠失ＴＮＦが細胞障害活性を有していること（特開昭
６１−５０９２３号）、７アミノ酸欠失ＴＮＦが細胞障
害活性を有していること（特願昭６１−９００８７号）
、１〜１０アミノ酸欠失ＴＮＦが細胞障害活性を有して
おり、その比活性は６〜８アミノ酸欠失ＴＮＦにおいて
極大になること（ＰＣＴ出願公開Ｗ　０８６／　０２３
８１号）、１０アミノ酸欠失ＴＮＦが細胞障害活性を有
していること（特願昭６１−１１４７５４号）、及び１
１アミノ酸欠失ＴＮＦが細胞障害活性を有していること
（特願昭６１−１７３８２２号）が報告されている。

そこで、本発明者らは比活性の向上、安定性の向上１反
応スペクトルの広域化、副作用の低減化等を目的として
、ヒトＴＮＦ蛋白質の改変について鋭意研究を行ない、
本発明を完成するに至った。

（３）発明の目的 本発明の目的は、新規抗腫瘍活性ポリペプチドを提供す
ることにある。

本発明の他の目的は、新規抗腫瘍活性ポリペプチドをコ
ードするＤＮＡ領域を含む組換えプラスミドを提供する
ことにある。

本発明の更に他の目的は、上記組換えプラスミドによっ
て形質転換された組換え微生物及びその組換え微生物細
胞を用いて新規抗腫瘍活性ポリペプチドを製造する方法
を提供することにある。

本発明の更に他の目的は、以下の説明から一層明らかと
なるであろう。

（４）発明の構成 本発明者らの研究によれば、前記本発明の目的は、次の
アミノ酸配列 （８２Ｎ　）　−Ｐｒｏ　−５ｅｒ−ＡＳＩ）　−Ｌ’
／５−Ｐｒｏ−Ｖａｔ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｖａ
ｌ−Ａｌａ−Ａ　ｓｎ−Ｐ　ｒｏ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ａ　
ｌａ　−Ｇ　ｌｕ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｌ　ｅ
ｕ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｔ　ｒｐ　−Ｌ　ｅｕ　−Ａ　ｓｎ
　−Ａ　ｒ（］　−Ａ　ｒｇ−Ａ　Ｉａ−Ａｓｎ−Ａ　
Ｉａ　−Ｌｅｕ　−Ｌ　ｅｕ−Ａ　１ａ−Ａｓｎ　−Ｑ
　ｌｙ−Ｖ　ａｌ　−Ｇ　Ｉｕ　−Ｌ　ｅＬｌ−Ａ　ｒ
Ｑ　−Ａ　Ｓｐ−Ａ　Ｓｎ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｌ　ｅｕ　
−Ｖａｔ　−Ｖａｌ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｓｅｒ　−Ｇ　Ｉ
ｕ　−Ｇ　＋ｙ−Ｌｅｕ−、Ｔｙｒ−Ｌｅｕ　−１１ｅ
−ｒｙｒ−Ｓｅｒ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｖａｌ　−Ｌｅｕ−
Ｐｈｅ　−Ｌｙｓ−Ｇ　ｌｙ−Ｇ　Ｉｎ　−Ｇ　Ｉｙ　
−ＣＶＳ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｓ　ｅｒ　−Ｔ　ｈｒ　−Ｈ
ｉｓ　−Ｖ　ａｔ　−１ｅｕ　−１ｅｕ　−Ｔ　ｈｒ　
−＠　ｉｓ　−Ｔｈｒ　−■ｌｅ　−Ｓｅｒ　−Ａ　ｒ
ｇ　−１１ｅ　−Ａ　ｌａ−Ｖａｌ−５ｅｒ−Ｔｙｒ−
Ｇ　ｌｎ−Ｔ　ｈｒ　−Ｌ　ｙｓ　−Ｖ　ａｌ　−Ａ　
ｓｎ　−１ｅｕ　−Ｌ　ｅｕ　−Ａ　ｌａ　−Ｉ　　ｌ
ｅ−Ｌｙｓ−３ｅｒ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ＝Ａｒｇ
−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−
Ｇｌｕ　−Ａ　Ｉａ−Ｌ　ｙｓ−Ｐ　ｒｏ−Ｔ　ｒｐ−
Ｔｙｒ−Ｇ　Ｉｕ−Ｐ　ｒｏ−Ｉ　ｌｅ−Ｔｙｒ−Ｌｅ
ｕ−Ｇ　＋ｙ−Ｇ　＋ｙ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｇ　Ｉｎ−
Ｌ　ｅｕ−Ｇ　Ｉｕ−Ｌ　ｙＳ−Ｇ　ｌｙ−Ａ　ＳＯ−
Ａ　ｒ（１−Ｌｅｕ−８ｅｒ−Ａ　１ａ−Ｇｌｕ　−１
ｌｅ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｐ　ｒｏ−Ａ　ｓｏ−ＴＶｒ−
Ｌｅｕ−Ａ　ｓｐ−Ｐｈｅ−Ａ　１ａ−Ｇ　Ｉｕ　−Ｓ
　ｅｒ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｖ　ａｌ　−Ｔ　
ｙｒ　−Ｐ　ｈｅ　−ＧＩＶ　−１ｌｅ　−１１ｅ−Ａ
ｌａ−Ｌｅｕ　−（ＣＯＯＨ）で表わされる新規抗腫瘍
活性ポリペプチドまたはそのアミノ末端にＭｅｔが結合
したポリペプチドを提供することによって達成され、ま
た上記新規抗腫瘍活性ポリペプチドをコードするＤＮＡ
領域を含む組換えプラスミドを提供することによって達
成され、更にかくして得られた組換えプラスミドによっ
て形質転換された組換え微生物細胞、その微生物細胞を
用いて目的とする新規抗腫瘍活性ポリペプチドを産生ず
る方法及びこの新規抗腫瘍活性ポリペプチドを含有する
医薬組成物を提供することによって達成されることがわ
かった。

以下本発明について更に詳細に説明する。

（Ａ）ヒトＴＮＦ遺伝子のクローン化；ヒトＴＮＦ遺伝
子は、ヒトＴＮＦ蛋白質を構成するアミノ酸［０、ｐ　
ｅｎｎｉｃａら、前出］を指定するいくつかのコドンの
中から適当なものを選び、それを化学合成することによ
って取得できる。ヒトＴＮＦ遺伝子の設計に際しては、
用いる宿主細胞に最も適したコドンを選択することが望
ましく、後にクローン化及び遺伝子改変を容易に行なえ
るように適当な位置に適当な制限酵素による切断部位を
設けることが望ましい。

また、ヒトＴＮＦ蛋白質をコードするＤＮＡ領域は、そ
の上流に読みとりフレームを一致させた形での翻訳開始
コドン（ＡＴＧ＞を有することが好ましく、その下流方
向に読みとりフレームを一致させた形での翻訳終止コド
ン（ＴＧＡ。

ＴＡＧまたはＴＡＡ）を有することが好ましい。

上記翻訳終止コドンは、発現効率の向上を目的として、
２つ以上タンデムに連結することがとりわけ好ましい。

さらに、このヒトＴＮＦ遺伝子は、その上流及び下流に
作用する制限、酵素の切断部位を用いることにより、適
当なベクターへのクローン化が可能になる。このような
ヒトＴＮＦ遺伝子の塩基配列の例を、第１図に示した。

上記のように設計したヒトＴＮＦ遺伝子の取得は、上側
の鎖、下側の鎖のそれぞれについて、たとえば第２図に
示したような何本かのオリゴヌクレオチドに分けて、そ
れらを化学合成し、各々のオリゴヌクレオチドを連結す
る方法をとるのが望ましい。各オリゴヌクレオチドの合
成法トシテハシエステル法［Ｈ，Ｇ、　Ｋｈｏｒａｎａ
。

“Ｓ　ｏｎｅ　　Ｒｅｃｅｎｔ　　Ｄ　ｅｖｅｌｏｐｍ
ｅｎｔｓ　　１ｎＣｈｅｎ＋１ｓｔｒｙ　　ｏｆ　　ｐ
　ｈｏｓｐｈａｔｅ　　Ｅ　５ｔｅｒｓ　　ｏｆＢ　１
ｏｌｏａｉｃａｌ　　　Ｉ　ｎｔｅｒｅｓｔ　”　、　
Ｊ　ｏｈｎ　　Ｗ　１ｌｅｙａｎｄ　　３ｏｎｓ　、　
　（ｎｃ、、Ｎｅｗ　　Ｙｏｒｋ　　（１９６１）　］
。

トリエステル法［Ｒ，Ｌ、　Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｊ
。

Ａｍ、Ｃｈｅｌｍ、Ｓｏｃ、、８９．４８０１（１９６
７）　］及びホスファイト法［Ｍ、　Ｄ、　Ｍａｔｔｅ
ｕｃｃｉら。

Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　　Ｌｅｔｔ、、　２１．　７
１９（１９８０）　］があるが、合成時間、収率、操作
の簡便さ等の点から、全自動ＤＮＡ合成機を用いたホス
ファイト法による合成が好ましい。合成したオリゴヌク
レオチドの精製は、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラ
フィー、ゲル電気泳動、逆相カラムによる高速液体クロ
マトグラフィー等を、適宜単独もしくは組合せて用いる
ことができる。

こうして得られた合成オリゴヌクレオチドの５′末端側
の水酸基を、たとえばＴ４−ポリヌクレオチドキナーゼ
を用いてリン酸化した後、アニーリングさせ、たとえば
Ｔ４−ＤＮＡリガーゼを用いて連結する。合成オリゴヌ
クレオチドを連結してヒトＴＮＦ遺伝子を作成する方法
としては、合成オリゴヌクレオチドをいくつかのブロッ
クに分けて連結し、たとえばｐＢＲ３２２［Ｆ　、　　
Ｂｏｌｉｖａｒら、　　Ｇｅｎｅ　、　　２．　９５（
１９７７）　］のようなベクターに一度クローン化した
後、それらの各ブロックのＤＮＡ断片を連結する方法が
好ましい。このようなヒトＴＮＦ遺伝子を構成するブロ
ックのＤＮＡ断片を含むプラスミドとして、好ましくは
ｐＴＮＦＩＢＲ。

ｐＴＮＦ２ＮまたはｐＴ　Ｎ　Ｆ　３が用いられる。

上記のようにしてクローン化したヒトＴＮＦ遺伝子を構
成する各ブロックのＤＮＡ断片を連結した後、適当なプ
ロモーター、　ＳＤ　（シャイン・ダルガーノ）配列の
下流につなぐことにより、発現型遺伝子とすることがで
きる。使用可能なプロモーターとして、トリプトファン
・オペロン・プロモーター（ｔｒｐプロモーター）。

ラクトース・オペロン・プロモーター（Ｉａｃプロモー
ター）　、　ｔａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、
　ｌｐｐプロモーター等があげられるが、とりわけｔｒ
ｐプロモーターが好適である。ｔｒｐプロモーターを有
するプラスミドとして、好ましくはｌ）Ｙ　Ｓ　３１Ｎ
　、又はｐＡ　Ａ　４１が用いられる。

さらに、発現効率向上を目的として、ヒトＴＮＦ遺伝子
下流に大腸菌で効率良く機能するターミネータ−を付与
することができる。このようなターミネータ−として、
１ｐｐターミネータ−９ｔｒｐ　Ａターミネータ−等が
あげられるが、とりわけｔｒｐ　Ａターミネータ−が好
適であり、ｔｒｐＡターミネータ−を有するプラスミド
として、好ましくはｐＡ　Ａ　４１が用いられる。この
発現型ヒトＴＮＦ遺伝子を、たとえばＩ）ＢＲ３２２由
来のベクターにクローン化することにより、発現型プラ
スミドが作成できる。ヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミ
ドとして、好ましくはｐＴＮＦ４０１ＮＮ又はｐＴＮＦ
４０１Ａが用いられる。

（Ｂ）新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子のクローン化
： こうして得られたヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミドを
適当な制限酵素で切断し、ヒトＴＮＦ遺伝子内の特定な
領域を除去した後、適当な塩基配列を有する合成オリゴ
ヌクレオチドを用いた遺伝子の修復を行なう。かかる手
法を用いることにより、ヒトＴＮＦ蛋白質中の任意のア
ミノ酸を他のアミノ酸に置換したり、付加したり、また
は欠失させた形の新規抗腫瘍活性ポリペプチドをコード
する遺伝子を含む発現型プラスミドの作成が可能になる
。このような新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型
プラスミドとして、好ましくはｆｌＴＮＦ　４１Ｂ、　
　ｐＴＮＦ４１６Ａ又はｐＴＮＦ４７８が用いられる。

（Ｃ）発現確認及び活性評価； ヒトＴＮＦＩ伝子及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝
子を発現させるための微生物宿主としては、大腸菌、枯
草菌、酵母等があげられるが、とりわけ大腸菌［エシェ
リヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ）
　］が好ましい。前記ヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミ
ド及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プラス
ミドは、たとえば公知の方法［Ｍ、　Ｖ、　Ｎｏｒａａ
ｒｄら。

Ｇｅｎｅ　、　３．　２７９（１９７８）　］を用いて
、微生物宿主、たとえばエシェリヒア・コリＣ６Ｃ６０
０ｒ−株（ＡＴＣＣ３３５２５）に導入することができ
る。

このようにして得られた組換え微生物細胞を、それ自体
は公知の方法で培養する。培地としては、たとえばグル
コースとカザミノ酸を含むＭ９培地［Ｔ、　Ｍａｎｉａ
ｔｉｓら編、　　”　Ｍ　ｏｌｅｃｕｌａｒｃ　ｌ０ｎ
ｉｎｏ”　、Ｐ　　４４０．Ｃｏ１ｄ　　　５ｐｒｉｎ
。

）−１ａｒｂｏｒ　　　１ａｂｏｒａｔｏｒｙ　　、　
　Ｎｅｗ　　Ｙｏｒｋ　　（１９８２）参照］があげら
れ、必要に応じて、たとえばアンピシリン等を添加する
のが望ましい。培養は目的の組換え微生物に適した条件
、たとえば振とうによる通気、撹拌を加えながら、３７
℃で２〜３６時間行なう。また、培養開始時または培養
中に、プロモーターを効率良く機能させる目的で、３−
β−インドールアクリル酸等の薬剤を加えることもでき
る。

培養後、たとえば遠心分離により組換え微生物細胞を集
め、たとえばリン酸バッファーに懸濁させ、たとえば超
音波処理により組換え微生物細胞を破砕し、遠心分離に
より組換え微生物細胞のライゼートを得る。得られたラ
イゼート中の蛋白質を、ラウリル硫酸ナトリウム（以下
、ＳＤＳと略すこともある）を含むポリアクリルアミド
ゲルを用いた電気泳動によって分離し、ゲル中の蛋白質
を適当な方法を用いて染色する。

発現型プラスミドを含まない微生物細胞のライゼートを
対照として泳動パターンを比較することにより、ヒトＴ
ＮＦ遺伝子または新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子の
発現を確認する。

このようにして得られたヒトＴＮＦ蛋白質及び新規抗腫
瘍活性ポリペプチドの活性の評価は、マウスに移植した
ＭｅｔｈＡ肉腫を壊死させる効果を見るｉｎ　　ｖｉｖ
ｏ活性測定法（ＣａｒｓＷｅｌ　ｌら。

前出〉、マウスＬ細胞に対する細胞障害性を見るｉｎ　
　ｖｉｔｒｏ活性測定法［Ｒｕｆｆ　、　Ｊ。

ｌ　ｍｍｕｎｏｌ、、ユ２６．　２３５　（１９８１）
コ等により行なえるが、測定時間、定量性、測定の簡便
さ等の点から、ｉｎ　　ＶｉｔｒＯ活性測定法による評
価が好ましい。

かくして本発明によれば、従来公知のヒトＴＮＦ蛋白質
とは異なる新規生理活性ポリペプチドを得ることが可能
になり、この新規抗腫瘍活性ポリペプチドを用いること
によって抗腫瘍のためのすぐれた医薬組成物を提供する
ことが可能になった。

以下、実施例を掲げて本発明について詳細に説明するが
、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

実施例１（ヒトＴＮＦ遺伝子の設計） 第１図に示した塩基配列のヒトＴＮＦ遺伝子を設計した
、設計に際しては、ｐ　ｅｎｎｉｃａら［Ｄ。

Ｐｅｎｎ１ｃａら、　　Ｎａｔｕｒ’ｅ　、　　≦１１
２．　７２４（１９８４）　　］　の報告したヒトＴＮ
Ｆ前駆体ＣＤ　Ｎ　Ａの構造遺伝子部分の塩基配列を基
盤として、適当な制限酵素による切断部位を適当な位置
に設け、５′側に翻訳開始コドン（ＡＴＧ）を、そして
３′側に２個の翻訳終止コドン（ＴＧＡ及びＴＡＡ）を
それぞれ付与した。また、５′側翻訳開始コドン上流に
は制限酵素ＣｊａＩによる切断部位を設け、ＳＤ配列と
翻訳開始コドン間を適切な状態に保った形でのプロモー
ターとの連結を可能にした。更に、３′側翻訳終止コド
ン下流には制限酵素ＨｉｎｄｌＩ［による切断部位を設
け、ベクター・プラスミドと容易に連結できるようにし
た。

実施例２（オリゴヌクレオチドの化学合成）実施例１で
設計したヒトＴＮＦ遺伝子は、第２図に示したように１
７本のオリゴヌクレオチドに分けて合成する。オリゴヌ
クレオチドの合成は全自動ＤＮＡ合成機（アプライド・
バイオシステムズ。

モデル３８０Ａ　）を用いて、ホスファイト法により行
なった。合成オリゴヌクレオチドの精製は、アプライド
・バイオシステムズ社のマニュアルに準じて行なった。

すなわち、合成オリゴヌクレオチドを含むアンモニア水
溶液を５５℃で一晩保つことにより、ＤＮＡ塩基の保護
基をはずし、セファデックスＧ−５０フアイン・ゲル（
ファルマシア）を用いたゲル濾過によって、高分子量の
合成オリゴヌクレオチド画分を分取する。ついで、７Ｍ
尿素を含むポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度
２０％）の後、紫外線シャドウィング法により泳動パタ
ーンの観察を行なう。目的とする大きさのバンド部分を
切出して、そのポリアクリルアミドゲル断片を細かく破
砕した後、２〜５ｉｄの溶出用ハラ１７−　［５００１
ＲＭ　　ＮＨ４０Ａｃ　−１ｍＭＥＤＴＡ−０，１％Ｓ
ＤＳ　（ｐＨ７，５）　］を加え、３７℃で一晩撮とう
した。遠心分離により、目的のＤＮＡを含む水相の回収
を行なった。最後に合成オリゴヌクレオチドを含む溶液
をゲル濾過カラム（セファデックスＧ−５０）にかける
ことにより、合成オリゴヌクレオチドの精製品を得た。

なお、必要に応じて、ポリアクリルアミドゲル電気泳動
を繰り返し、合成オリゴヌクレオチドの純度の向上をは
かった。

実施例３（化学合成ヒトＴＮＦ遺伝子のクローン化） 実施例２で作成した１７本の合成オリゴヌクレオチド（
ＴＮＦ−１〜ＴＮＦ−１７）を用いて、ヒトＴＮ　Ｆｉ
ｆｆ伝子を３つのブロックに分けてクローン化した。

０．１〜１．０μ９の合成オリゴヌクレオチドＴＮＦ−
２〜ＴＮＦ−６の５′末端側を、５〜１５ユニツトのＴ
４−ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｅ。

ｃｏｌｉ３タイプ、宝酒造）を用いて、それぞれ別々に
リン酸化する。リン酸化反応は１０〜２０μ磨の５０ｉ
ＭＴｒｉｓ−ＨＣｆ　（１）ｔ−１９，５）　、　１０
１Ｍ　　Ｍ−！Ｉｔ　Ｃ１２゜５　ｍＭジチオスレイト
ール、１０１Ｍ　　ＡＴＰ水溶液中で、３７℃で、　３
０分間行なった。反応終了後、すべての合成オリゴヌク
レオチド水溶液をすべて混合し、フェノール抽出、エー
テル抽出によりＴ４−ポリヌクレオチドキナーゼを失活
、除去する。

この合成オリゴヌクレオチド混合液に、新たに０．１〜
１．０μ９の合成オリゴヌクレオチドＴＮＦ−１及びＴ
ＮＦ−７を加え、９０℃で５分間加熱した後室温まで徐
冷して、アニーリングを行なう。

次に、これを減圧乾固した後に、３０μ旦の６６１ＭＴ
ｒｉｓ−Ｈ（Ｊ　（１）Ｈ７，６）　、　　６．６　ｍ
Ｍ　　ＭＣＩ　Ｃ１２゜１Ｏｎ＋Ｍジチオスレイトール
、１ａＭＡＴＰ水溶液に溶解させ、３００ユニツトのＴ
４−ＤＮＡリガーゼ（宝酒造）を加えて、１１℃で１５
時間連結反応を行なった。反応終了後、ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動（ゲル濃度５％）を行ない、エチジウ
ムブロマイド染色法により泳動パターンの観察を行なう
。目的とする大きさく約２２０ｂｐ　）のバンド部分を
切出して、実施例２の方法に従ってポリアクリルアミド
ゲルよりＤＮＡを回収する。

一方、３μりの大腸菌用プラスミド１）ＢＲ３２２（約
４．４Ｋ　ｂｐ）を３０μ旦の１０　ｍＭ　　Ｔ　ｒｉ
ｓ−ＨＣ１（ｌｌ’８７．５）　、　６０　ｍＭ　　Ｎ
ａ　Ｃ１，７ｍＭＭＱＣｆｚ水溶液に溶解させ、１０ユ
ニツトの制限酵素ＣｆａＩにューイングランド・バイオ
ラブズ）を添加して、３７℃で１時間切断反応を行なっ
た。

制限酵素Ｃ１８工による切断の後、フェノール抽出。

エーテル抽出を行ない、エタノール沈澱によりＤＮＡを
回収する。このＤＮＡを３０μ磨の５０１ＭＴｒｉｓ−
１−１（Ｊ　（ＤＨ７，４）　、　　１００１Ｍ　　Ｎ
ａ　Ｃ１，１０１Ｍ　　Ｍ＜１８０４水溶液に溶解させ
、１０ユニツトの制限酵素５ａｌＩ　（宝酒造）を添加
して、３７℃で１時間切断反応を行なった。反応終了後
、アガロースゲル電気泳動（ゲル濃度０．８％）を行な
い、エチジウムブロマイド染色法により切断パターンの
観察を行なう。プラスミド１）ＢＲ３２２の大部分を含
む約３．７Ｋ　ｂｐのＤＮＡの部分に相当するバンドを
切出し、そのアガロースゲル断片を３倍量（ｖａｔ　７
ｗｔ）の８Ｍ　　ＮａＣ１０＊水溶液に溶解させた。ｃ
　ｈｅｎらのグラスフィルター法［Ｃ，Ｗ。

Ｃｈｅｎら、　Ａｎａｌ　、３ｉｏｃｈｅａ＋、１０１
．　３３９（１９８０）　］により、約３．７Ｋｂｐの
ＤＮＡ断片＜Ｃ１ａ　Ｉ　Ｈ８ａｌＩ＞をアガロースゲ
ルより回収した。

先に得られたヒトＴＮＦ遺伝子の一部を含む約２２０ｂ
ｐのＤＮＡ断片について、前記の方法に準じて末端のリ
ン酸化反応を行なった後、プラスミド＋）ＢＲ３２２の
大部分を含む約３．７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ水溶液と混合す
る。エタノール沈澱の後、前記の方法に準じて両ＤＮＡ
断片の連結反応を行なった。

エシェリヒア・コリ（：、　６００ｒ−ｍ−株の形質転
換は、通常のＣａＣＲ２法（Ｍ、　Ｖ、　Ｎｏｒ（ｌａ
ｒｄらの方法）の改良法で行なった。すなわち、５Ｉｄ
のし培地（１％トリプトン、０．５％Ｉｎエキス、０．
５％Ｎａ　ＣＬ　　１）Ｈ７，２）にエシェリヒア−Ｄ
すＣ６Ｃ６００ｒ−株の１８時間培養基を接種し、国体
を含む培養液の６００ｒｖにおける濁度（ＯＤ、＜−）
が０．３に達するまで生育させる。菌体を冷たいマグネ
シウム・バッファー　［０，１Ｍ　　Ｎａ　Ｃ１，５１
Ｍ　　Ｍ（Ｊ　Ｃ１２゜５１Ｍ　　ＴｒｉＳ−Ｈ（Ｊ　
（１）Ｈ７，６，０℃）］中で２回洗い、２ｄの冷した
カルシウム・バッファー［１００１Ｍｃａ　Ｃ１２，２
５０１Ｍ　　ＫＣｆ、　５１ＭＭＱ　Ｃ１０，５１Ｍ　
　Ｔｒｉｓ−Ｈ（Ｊ　（１）Ｈ７，６゜０℃）］中に再
懸濁させ、０℃で２５分間放置する。

次に菌体をこの容量の１／１０にカルシウム・バッファ
ーの中で濃縮し、連結後のＤＮＡ水溶液と２＝１（ｖｏ
ｌ、　：　ｖｏｌ、）混合する。この混合物を６０分間
。

０℃で保った後、１ｄのＬＢＧ培地（１％トリプトン、
０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｊ、　　０．０８％グ
ルコース、　　ｌ）Ｈ７，２）を添加し、３７℃で１時
間撮とう培養する。培養液を、選択培地［アンピシリン
（シグマ）３０μ’ｊ／ｄを含むＬ培地プレート］に１
００μＵ／プレートの割合で接種する。プレートを３７
℃で１晩培養して、形質転換株を生育させる。得られた
アンピシリン耐性のコロニーより、公知の方法を用いて
ＤＮＡを調製し、アガロースゲル電気泳動により、目的
のプラスミドｐＴＮＦ１ＢＲ（約４．ＯＫ　ｂｐ）の取
得を確認した。第３図に、プラスミドｐＴＮＦ１ＢＲの
作成方法を示す。

以上と同様な手法により、合成オリゴヌクレオチドＴＮ
Ｆ−８〜ＴＮＦ−１３を用いてプラスミドｐＴＮＦ２Ｎ
（約３．ＩＫｂｐ）を、合成オリゴヌクレオチドＴＮＦ
−１４〜ＴＮＦ−１７を用いてプラスミドｐＴＮＦ３（
約２．４Ｋ　ｂｌ））を、それぞれ作成した。第４図及
び第５図に、プラスミドｐＴＮＦ２Ｎ及びＩ）ＴＮＦ３
の作成方法を、それぞれ示す。

こうして得られたヒトＴＮＦ遺伝子の一部を含むプラス
ミドｐＴＮＦ１ＢＲ，ｐＲＮＦ２Ｎ及びｐＴＮＦ３の、
合成オリゴヌクレオチド使用部分の塩基配列が設計通り
であることは、マキサム・ギルバート法［Ａ、Ｍ、Ｍａ
ｘａｍら、　ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ、、６５．
　４９９（１９８０）　］によって確認した。

実施例４（ヒトＴＮＦ遺伝子発現型−プラスミドの作成
） 実施例３で得られたプラスミドｐＴＮＦ１ＢＲ１０μ９
を、実施例３と同様にして制限酵素ＣｆａＩ及び５ａｌ
Ｉで切断し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃
度５％）の後、実施例２の方法に準じて、ヒトＴＮＦ遺
伝子の一部を含む約２２０ｂｌ）のＤＮＡ断片＜Ｃ１ａ
　ｌ−８ａｌＩ）をポリアクリルアミドゲルより回収し
た。

次に、実施例３で得られたプラスミドｐＴＮＦ２　１０
μ９を１００μｕの１０　ｍＭ　　Ｔ　ｒｉｓ−ＨＣｊ
（ＤＨ７，５）　、　６０ｉ　Ｍ　　Ｎａ　ＣＲ，７ｍ
ＭＭｆＪ（Ｊ２水溶液に溶解させ、４０ユニツトの制限
酵素ＰＶＩＪＩ［（宝酒造）を添加し、３７℃で１時間
切断反応を行なった。そして、実施例３の方法に準じて
制限酵素３ａｌ工による切断、ポリアクリルアミドゲル
電気泳動くゲル濃度５％）の後、実施例２の方法に準じ
て、ヒトＴＮＦｍ伝子の一部を含む約１７０ｂｐのＤＮ
Ａ断片（ＳａｌＩ”ＰＶＩＪＩＩ）をポリアクリルアミ
ドゲルより回収した。

また、実施例３で得られたプラスミドｐＴＮＦ３　１０
ｕ９も１００ｕ　ｌの１０　ｍＭ　　Ｔ　ｒｉｓ−ＨＣ
Ｒ（ｐＨ７，５）　、　６０　ｍＭ　　Ｎａ　ＣＬ　７
　ｍＭＭｇＣｊ２水溶液に溶解させ、４０ユニツトの制
限酵素ｐｖＪ及び４０ユニツトの制限酵素ＨｉｎｄＩ［
［（宝酒造）を添加し、３１℃で１時間切断反応を行な
った。そして、ポリアクリルアミドゲル電気泳動くゲル
濃度５％）の後、実施例２の方法に準じて、ヒトＴＮＦ
遺伝子の一部を含む約１１０ｂＥｌのＤＮＡ断片（ｐｖ
ＬＩＩＩ　ＭＨｉｎｄ　ｍ　）をボＩＪ　７りＩＪ　／
Ｌ、　７ミドゲルより回収した。

一方、大腸菌ｔｒｐプロモーターを有するプラスミドｐ
Ｙｓ３１Ｎ　（約ａ、ｙＫｂｐ）　５μ９を、上記と同
様に制限酵素ＣｆａＩ及びｌ−１ｉｎｄｌ［Ｉで切断し
、アガロースゲル電気泳動くゲル濃度０．８％）の後、
実施例３の方法に準じて、プラスミドｐＹｓ３１Ｎノ大
Ｂｌｌヲ含ム約４．７ＫｂｐのＤＮＡ断片（ＣオａＩ→
Ｈｉｎｄｎ［）をアガロースゲルより回収した。

こうして得られた、ヒトＴＮＦ遺伝子の一部を含む約２
２０ｂｐ、約１７０ｂｐ及び約１１０ｂｐの３つのＤＮ
Ａ！？ｌｉ片とプラスミド１）ＹＳ３１Ｎの大部分を含
む約４．７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ断片とを混合し、エタノー
ル沈澱の後、実施例３の方法に準じて、Ｔ４−ＤＮＡリ
ガーゼによる連結反応を行なった。反応終了後、実施例
３の方法に準じてエシェリヒア・コリＣ６００ｒ−１１
−株に導入し、形質転換株の中より目的のヒトＴＮＦ遺
伝子発現型プラスミドｐＴＮＦ４０１ＮＮ（約５．２Ｋ
　ｂｐ）を有するクローンを選択した。第６図に、その
プラスミド１）ＴＮＦ４０１ＮＮの作成方法を示した。

また、上記プラスミドｐＹ　Ｓ　３１Ｎ　５μびを、上
記の方法に準じて制限酵素ＰｖｕＩＩで部分分解した後
、さらに制限酵素ＨｉｎｄＩ［［で切断し、アガロース
ゲル電気泳動くゲル濃度０．８％）の後、実施例３の方
法に準じて、ｔｒｐプロモーターを含む約２．７Ｋ　ｂ
ｐのＤＮＡ断片［ＰｖｕＩＩ［２］　ＨＨｉｎｄ　Ｉ［
［］　ヲアガロースゲルより回収した。

次に第７図記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド
を、実施例２の方法に準じて、合成・精製した。得られ
た２本の合成オリゴヌクレオチドそれぞれ０．５μ９に
ついて、実施例３の方法に準じて、末端のリン酸化を行
ない、アニーリングの後、先に得られた約２．７Ｋ　ｂ
ｐのＤＮＡ断片［ｐｖｕＩＦ（２）”Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ
　］　ト混合し、Ｉｌ／−ル沈１（７）Ｉ、実施例３の
方法に準じて、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼによる連結反応を
行なった。反応終了後、実施例３の方法に準じてエシェ
リヒアφコリＣ６Ｃ６００ｒ−株に導入し、形質転換株
の中より目的のプラスミド１）ＡＡ４１（約２．７Ｋ　
ｂｐ）を有するクローンを選択した。このようなプラス
ミドは、プラスミドｐＹｓ３１Ｎからコピー数制御領域
除去し、ｔｒｐプロモーター下流に存在するクローニン
グ・サイトの下流に大腸菌ｔｒｌ）　Ａターミネータ−
を付与した形の、多コピー・高効率発現ベクターであり
、第７図にその作成方法を示した。

このプラスミドｐＡＡ４１　２μ９を、上記と同様に制
限酵素ＣｆａＩ及びＨｉｎｄｕで切断し、アガロースゲ
ル電気泳動（ゲル濃度０．８％）の後、実施例３の方法
に準じて、プラスミドｐＡ　Ａ　４１の大部分を含む約
２．７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ断片（ＣｆａＩ−ＨｉｎｄＩＩ
Ｉ）をアガロースゲルより回収した。

また、先に得られたヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミド
ｐＴＮＦ　４ｏ１ＮＮ５μ９を、上記と同様に制限酵素
ＣｊａＩ及び）ｌｉｎｄＩ［で切断し、ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動（ゲル濃度５％）の後、実施例２の方
法に準じて、ヒトＴＮＦ遺伝子全域を含む約４９０ｂｌ
）のＤＮＡ断片＜Ｃ１ａ　Ｉ”Ｈｉｎｄ　Ｉ［［）をポ
リアクリルアミドゲルより回収した。

こうして得られた、プラスミドｐＡ　Ａ　４１の大部分
を含む約２．７）（ｂｐのＤＮＡ断片とヒトＴＮＦ遺伝
子全域を含む約４９０１１１）のＤＮＡ断片とを混合し
、エタノール沈澱の後、実施例３の方法に準じて、Ｔ４
−ＤＮＡリガーゼによる連結反応を行なった。

反応終了後、実施例３の方法に準じて、エシェリヒア・
コリ６００ｒ−ｍ−株に導入し、形質転換株の中より目
的のプラスミドｐＴＮ　Ｆ　４０１Ａ　（約３．２Ｋｂ
ｐ）を有するりＯ−ンを選択した。このプラスミドは、
ヒトＴＮＦｍ転子をより効率良く発現させる能力を有し
ており、第８図にその作成方法を示した。

実施例５（新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プ
ラスミドの作成） 実施例４で得られたヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミド
ｐＴ　Ｎ　Ｆ　４ｏＩＮ　Ｎ　２０μ９を、実施例４の
方法に準じて制限酵素ＣｊａＩ及びＨｉｎｄｌｌｌで切
断し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動くゲル濃度５％
）及びアガロースゲル電気泳動（ゲル濃度０．８％）の
後、それぞれ実施例２及び３の方法に準じて、生成する
２つのＤＮＡ断片（約４９０ｂｐ及び約４，７Ｋ　ｂｐ
、両方共Ｃ１ａ　Ｉ　ＭＨｉｎｄ　［［）をゲルより回
収した。

ここで得られたヒトＴＮＦｌ転子全域を含む約４９０ｂ
ｐのＤＮＡ断片を５０μ磨の１０　ｌ１Ｍ　　Ｔｒｉｓ
−Ｉ−ｌＣｆ　（ｐ＋　７．５）　、　６０１１１Ｍ　
　Ｎａ　（Ｊ、　７　ｍＭＭＱＣＲｚ水溶液に溶解させ
、１０ユニツトの制限酵素Ａ、ｖａＩ　（宝酒造）を添
加して、３７℃で１時間切断反応を行なった。反応終了
後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度５％）
を行ない、実施例２の方法に準じて、ヒトＴＮＦ遺伝子
の大部分を含む約４６０ｂｌ）のＤＮＡ断片（Ａ　ｖａ
Ｉ　４−４８　ｉｎｄ■）をポリアクリルアミドゲルよ
り回収した。

また、第９図記載の塩基配列を有する２本鎖オリゴヌク
レオチドを、実施例２の方法に準じて、上の鎖と下の鎖
とに分けて合成、精製した。得られた２本の合成オリゴ
ヌクレオチドそれぞれ０．５μ９について、実施例３の
方法に準じて、末端のリン酸化を行なった後、アニーリ
ングさせた。

アニーリング後の２本鎖オリゴヌクレオチドを、先１．
：４１うＩｔ　ｔｃ約４．７Ｋ　ｂｐ（７）　Ｄ　Ｎ　
Ａ断片（ＣｊａＩ−１−１ｉｎｄｎ［）及びヒトＴＮＦ
遺伝子の大部分を含む約４６０ｂｐのＤＮＡ断片（Ａｖ
ａＩ＋Ｈｉｎｄ　Ｉ［［）と混合し、エタノール沈澱の
後、実施例３の方法に準じて、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼに
よる連結反応を行なった。反応終了後、実施例３の方法
に準じてエシェリヒア・コリＣ６００ｒ−ト株に導入し
、形質転換株の中より目的のプラスミド１）ＴＮＦ４１
６（約５．２Ｋ　ｂＤ）を有するクローンを選択した。

このプラスミドはＴＮＦのアミノ末端の７アミノ酸を欠
失させた形の新規抗腫瘍活性ポリペプチドをコードする
新規抗腫瘍活性ポリペブタド遺伝子発現型プラスミドで
あり、第９図にその作成方法を示した。

さらに、１）ＴＮＦ　４０１ＮＮから１）ＴＮＦ４０１
Ａを作成した場合と同様な方法により、ＴＮＦのアミノ
末端の７アミノ酸が欠失した形の新規抗腫瘍活性ポリペ
プチド遺伝子を効率良く発現させる能力を有する発現型
プラスミドｐＴＮ　Ｆ　４１６Ａ　（約３．２Ｋｂｌ）
）を作成した。第８図その作成方法を示した。

上で得られた発現型プラスミド１）ＴＮＦ４１６Ａを、
実施例３の方法に準じて制限酵素Ｈｉｎｄ［［及び５ａ
ｌＩで切断し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル
濃度５％）及びアガロースゲル電気泳動くゲル濃度０．
８％）の後、それぞれ実施例２及び３の方法に準じて、
生成する２つのＤＮＡ断片（約２７０ｂｌ）及び約２．
９Ｋ　ｂｐ、両方共３ａｌＪ＋）１ｉｎｄｎ［）をゲル
より回収した。

ここで得られた新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子の３
′側半分を含む約２７０ｂｌ）のＤＮＡ断片を５０μ文
の１０　ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ　（ｐｔ−＋　７．
４）　、　１０ＩＭ　　ＭＣＩ　８０４　、１　　ｍＭ
　　ジチオスレイトール水溶液に溶解させ、１０ユニツ
トの制限酵素５ａｕ３ＡＩ（宝酒造）を添加して、３７
℃で１時間切断反応を行なった。反応終了後、ポリアク
リルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度５％）を行ない、実
施例２の方法に準じて、新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺
伝子の３′側の部分を含む約１９０ｂｐのＤＮＡ断片（
Ｓａｕ３ＡＩ＋ＩＨｉｎｄ　ＩＩＩ）　をボｌＪ７りＩ
Ｊルアミドゲルより回収した。

また、第１０図記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオ
チドを、実施例２の方法に準じて、合成。

精製した。得られた４本の合成オリゴヌクレオチドそれ
ぞれ０．５μ９について、実施例３の方法に準じて、末
端のリン酸化を行ない、アニーリングの後、Ｔ４−ＤＮ
Ａリガーゼによる連結反応を行なった。

反応終了後、得られた２本鎖オリゴヌクレオチドを、先
に得られた約２．９Ｋ　ｂｐのＤＮＡ断片（ＳａｌＩ”
Ｈｉｎｄ　ｍ　）及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝
子の３′側の部分を含む約１９０ｂｐのＤＮＡ断片（Ｓ
ａｕ３ＡＩ”Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ）と混合し、エタノール
沈澱の後、実施例３の方法に準じて、Ｔ４−ＤＮＡリガ
ーゼによる連結反応を行なった。

反応終了後、実施例３の方法に準じてエシェリヒア・コ
リＣ６００ｒ−ｍ−株に導入し、形質転換株の中より目
的のプラスミドＩ）ＴＮＦ４７８（約３，２Ｋｂｌ））
を有するクローンを選択した。このプラスミドは、次の
アミノ酸配列 （８２Ｎ　）　−Ｐｒｏ−３ｅｒ−ＡＳＩ）　−Ｌｙｓ
　−Ｐ　ｒｏ　−Ｖ　ａｌ−Ａ　Ｉａ−Ｈｉｓ−Ｖ　ａ
ｌ−Ｖ　ａｌ−Ａ　ｌａ　−Ａ　ｓｎ　−Ｐ　ｒｏ　−
Ｇ　Ｉｎ　−Ａ　Ｉａ　−Ｇ　ｌｕ　−Ｇ　Ｉｙ　−Ｇ
　Ｉｎ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｔ　ｒｌ）　−Ｌ
　ｅｕ　−Ａ　Ｓｎ　−Ａ　ｒｌＪ−Ａ　ｒｇ−Ａ　ｌ
ａ　−Ａ　ｓｎ−Ａ　Ｉａ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｌ　ｅｕ　
−Ａ　Ｉａ　−Ａ　５ｎ−Ｇ　＋ｙ　−Ｖ　ａｌ　−Ｇ
　Ｉｕ−Ｌ　ｅｕ−Ａ　Ｉ’ｏ　−Ａ　Ｓｔ）　−Ａ　
Ｓｎ　−Ｇ　Ｉｎ　−ＬｅｔＪ　−Ｖａｌ　−ｖａｔ　
−Ｐ　ｒｏ　−Ｓｅｒ　−Ｇ　Ｉｕ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｌ
ｅｕ　−Ｔｙｒ　−Ｌｅｕ　−１１ｅ　−Ｔｙｒ　−Ｓ
ｅｒ　−Ｇ　Ｉｎ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−
Ｇ　ｌｙ　−Ｇ　Ｉｎ−Ｇ　Ｉｙ−Ｃｙｓ−Ｐ　ｒｏ−
Ｓ　ｅｒ−Ｔ　ｈｒ　−Ｈｉｓ−Ｖ　ａｌ　−Ｌ　ｅｕ
　−Ｌ　ｅｕ　−Ｔｈｒ　−Ｈｉｓ　−Ｔｈｒ　−１ｌ
ｅ　−Ｓｅｒ　−Ａ　ｒａ−Ｉ　Ｉｅ　−Ａ　Ｉａ−Ｖ
ａｌ−Ｓｅｒ　−Ｔｙｒ−Ｇ　１ｎ−Ｔｈｒ　−Ｌｙｓ
−Ｖａｌ−Ａｓｎ　−Ｌｅｕ　−Ｌｅｕ−Ａｌａ　−１
ｌｅ　−Ｌ　ｙｓ　−Ｓ　ｅｒ　−Ｐ　ｒｏ　−ＣＶＳ
　−Ｇ　Ｉｎ　−Ａ　ｒａ　−Ｇ　ｌｕ　−Ｔ　ｈｒ　
−Ｐ　ｒｏ　−Ｇ　Ｉｕ　−Ｇ　Ｉｙ　−Ａ　Ｉａ　−
Ｇ　Ｉｕ　−Ａ　ｌａ　−Ｌ　ＶＳ　−Ｐ　ｒＯ−Ｔ　
ｒｐ−Ｔ　ｙｒ　−Ｇ　Ｉｕ　−Ｐ　ｒＱ　−１１ｅ−
Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｇ
　ｌｎ−Ｌ　ｅｕ−Ｇ　ｌｕ−Ｌ　ｙｓ−Ｇ　ｌｙ−Ａ
　ｓｐ−Ａ　ｒｇ−Ｌｅｕ−８ｅｒ−Ａ　Ｉａ−Ｇ　ｌ
ｕ−１１ｅ−Ａｓｎ−Ａｒａ−Ｐ　ｒｏ　−Ａ　ｓｐ　
−Ｔ　ｙｒ　−Ｌ　ｅｕ　−Ａ　ｓｐ　−Ｐ　ｈｅ　−
Ａ　ｌａ　−Ｇ　ｌｕ　−Ｓ　ｅｒ　−Ｇ　ｍｙ　−Ｇ
　Ｉｎ　−Ｖ　ａｌ　−Ｔ　ｙｒ　−Ｐ　ｈｅ　−ｉｙ
　−１１ｅ−１１ｅ−Ａｌａ、−Ｌｅｕ　−（ＣＯＯＨ
）で表わされる新規抗腫瘍性ポリペプチドまたはそのア
ミノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドをコード
する新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プラスミ
ドであり、第１０図にその作成方法を示した。

実施例６（発現の確認） 前記実施例５で得られた、新規抗腫瘍活性ポリペプチド
遺伝子発現型プラスミドｌ］ＴＮＦ４１６゜１）ＴＮＦ
４１６Ａ又は１）ＴＮＦ４７８を有するエシェリヒア−
ＤすＣ６００ｒ−ｍ−株を、３０〜５０μｇ／ｆｄのア
ンピシリン、０．２％のグルコース及び４　ｍ９／ｍｆ
ｌのカザミノ酸を含むＭ９培地［０，６％ＮａｚＨＰ０
４　　０．３％に２　ＨＰＯ４−０，０５％ＮａＣ１−
０．１％Ｎ８４Ｃｊ水溶液（１）Ｈ７，４）をオートク
レーブ滅菌した後に、別途にオートクレーブ滅菌したＭ
（１８０４水溶液及びＣａＣｌ２水溶液をそれぞれ最１
１ｉ１ａ度２１１Ｍ及び０．１１１１Ｍになるように加
える。１　２５０ｄに接種し、ＯＤ６〃が０．７に達す
るまで、３７℃で娠とう培養を行なった。次いで、最終
濃度５０μｇ／ｒｄの３−β−インドールアクリル酸を
培養液中に添加し、さらに３７℃で１２時間振どう培養
を続けた。

遠心分離により大腸菌菌体を集めた後、ＰＢＳバッファ
ー（１５０１Ｍ　　Ｎａ　Ｃ１を含む２０１１１Ｍリン
酸バッファー、　　ＤＨ７，４＞を用いて菌体の洗浄を
行なった。洗浄後の菌体を１０−のＰＢＳバッファーに
懸濁させ、超音波発生装置（久保田、　　２００Ｍ型）
を用いて菌体を破壊した後、遠心分離により菌体残渣の
除去を行なった。

得られた大腸菌ライゼートの一部に対して、Ｔｒｉｓ−
１−１ｃｆバツフアー（１）Ｈ６，８）　、　ＳＤＳ、
　２−メルカブトエタノール、グリセロールを、それぞ
れ最終濃度６０１Ｍ、２％、４％、１０％になるように
加え、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動［鈴木
、遺伝、　３１．４３（１９７７）　］を行なった。

分離用ゲルは１２．５％とし、泳動バッファーはＳＤ３
、Ｔｒｉｓ−グリシン系［Ｕ、　Ｋ、　Ｌａｅｍｎ＋ｌ
ｉ。

Ｎａｔｕｒｅ　、ユ２７．　６８０（１９７０）　］を
用いた。電気泳動終了後、ゲル中の蛋白質をクーマシー
ブルーＲ−２５０（バイオ・ラッド）で染色し、新規抗
腫瘍活性ポリペプチド遺伝子の発現の確認を行なった。

なお、染色後のゲルをクロマト・スキャナー（高車、　
Ｃ８−９３０型）にかけて、産生された新規抗腫瘍活性
ポリペプチドの大腸菌細胞質蛋白質中にしめる割合の算
出を行った。その結果、発現型プラスミドｐＴＮＦ４１
６を有する大腸菌における新規抗腫瘍活性ポリペプチド
の産生量は、発現型プラスミドＩ）ＴＮＦ　４１６Ａの
場合の約５０％にすぎず、発現ベクター＋１Ａ　Ａ　４
１及び発現型プラスミドＩＩＴＮＦ　４１６Ａの有用性
が示された。

実施例７（活性の評価） 新規抗腫瘍活性ポリペプチドの活性測定は、前記Ｒｕｆ
ｆの方法に準じて行なった。すなわち、実施例６で得ら
れた新規抗腫瘍活性ポリペプチドを含む大腸菌ライゼー
トを順次培地で希釈した試料ｉｏｏμ文と、４　Ｘ　１
０”個／ＩＩｒＲの濃度のマウス上−９２９４Ｉ維芽細
胞（ＡＴＣＣＣＣＬ−９２９＞懸濁液１００μ文を、９
６穴の組織培養用マイクロプレート（コースタ−）内で
混合した。なおこの際に、最終濃度１μｇ／−のアクチ
ノマイシンＤ（コスメゲン、萬有製薬）を添加しておく
。培地としては、５％（ｖａｔ　／ｖｏｌ　）のウシ胎
児血清を含むイーグルのミニマム・エツセンシャル培地
（日永製薬）を用いた。上記マイクロプレートを、５％
炭酸ガスを含む空気中、３７℃で１８時間培養した後、
クリスタル・バイオレット溶液［５％（ｖｏｌ／■０１
）メタノール水溶液に、０．５％（ｗｔ／ｖｏｌ　）の
クリスタル・バイオレットを溶解させたちの］を用いて
生細胞を染色した。余分なりリスタル・バイオレットを
洗い流し乾燥した後、残ったクリスタル・バイオレット
を１００μ文の０．５％ＳＤＳ水溶液で抽出し、その５
９５ｒｖにおける吸光度をＥＬＩＳＡアナライザー（東
洋測器、ＥＴＹ−９６型）で測定する。この吸光度は、
生き残った細胞数に比例する。そこで、新規抗腫瘍活性
ポリペプチドを含む大腸菌ライゼートの希釈溶液を加え
ない対照の吸光度の５０％の値に相当する大腸菌ライゼ
ートの希釈倍率をグラフ（たとえば第１１図）によって
求め、その希釈倍率をユニットと定義する。第１１図よ
り、実施例６で得られた発現型プラスミド０ＴＮＦ４７
８にコードされるヒトＴＮＦ蛋白質を含む大腸菌ライゼ
ート　１００μ旦は５４０ユニット程度の活性を有して
いることが明らかになった。

実施例６で得られた発現型プラスミドｐＴＮＦ４７８に
コードされる新規抗腫瘍活性ポリペプチドを含む大腸菌
ライゼート中に含まれ総蛋白質量は、プロティン・アッ
セイ・キット（バイオ・ラッド）を用いて定倒し、ウシ
血清アルブミンを用いた検量線より計算した。上記で得
られた活性の値及び蛋白質定量結果より新規抗腫瘍活性
ポリペプチドを含む大腸菌ライゼートの比活性を計算し
たところ、約６８０（ユニット／ｒｒｔｇ−蛋白質）の
比活性を有していることがわかる。

【図面の簡単な説明】

第１図は設計したヒトＴＮＦ３！伝子の塩基配列を、第
２図は化学合成した合成オリゴヌクレオチドの塩基配列
を、それぞれ示したものである。第３図、第４図及び第
５図は、ヒトＴＮＦ遺伝子の一部を有するプラスミドｐ
ＴＮＦ１ＢＲ，ｐＴＮＦ２Ｎ及びｐＴＮＦ３の作成方法
を、それぞれ示したものである。第６図はヒトＴＮＦ遺
伝子発現型プラスミドｐＴＮＦ　４０１ＮＮの作成方法
を、第７図は発現ベクター１）Ａ　Ａ　４１の作成方法
を、そして第８図はヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミド
ｐＴＮＦ４０１Ａ及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝
子発現型プラスミド１）ＴＮＦ　４１６Ａの作成方法を
、それぞれ示したものである。第９図は新規抗腫瘍活性
ポリペプチド遺伝子発現型プラスミド１）ＴＮＦ４１６
の作成方法を、そして第１０図は新規抗腫瘍活性ポリペ
プチド遺伝子発現型プラスミドｐＴＮＦ４７６の作成方
法を、それぞれ示したちのである。第１１図は新規抗腫
瘍活性ポリペプチドの活性測定結果を示したものである
。 特許出願人　帝　人　株　式　会　社 〈−ΦＷ　　　　Ｑ　！　　　　Ｑ　ｋ　　　　Ｏ＃　
　　　Ｑ　ｃＩ　　　トｅ　　　　ｃ）５鳥　−４−酉 Ｐｖｕ　］Ｉ 躬ダｌ ＣＹ）Ｌｆ’） 晃９邑のＢ Ｐｙｕ’Ｊｌ（ｌン 吊＝８　口 第９図 １ｃｔα工 地ｔａｌｌり＝＝ｈＢ 用ぺ１Ｌ

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. （１）次のアミノ酸配列 【アミノ酸配列があります】 で表わされる、新規生理活性ポリペプチド。
2. （２）アミノ末端にＭｅｔが結合していることを特徴と
   する第１項記載のポリペプチド。
3. （３）次のアミノ酸配列 【アミノ酸配列があります】 で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
   ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドをコードす
   るＤＮＡ領域を含む組換えプラスミド。
4. （４）該ＤＮＡ領域が次の塩基配列 【遺伝子配列があります】 で表わされる一本鎖ＤＮＡとそれに相補的な一本鎖ＤＮ
   Ａとから成る二本鎖ＤＮＡを含むことを特徴とする第３
   項記載のプラスミド。
5. （５）該ＤＮＡ領域が次の塩基配列 【遺伝子配列があります】 で表わされる一本鎖ＤＮＡとそれに相補的な一本鎖ＤＮ
   Ａとから成る二本鎖ＤＮＡを含むことを特徴とする第３
   項記載のプラスミド。
6. （６）該プラスミドがプラスミドｐＴＮＦ４７８である
   第３項記載のプラスミド。
7. （７）次のアミノ酸配列 【アミノ酸配列があります】 で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
   ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドをコードす
   るＤＮＡ領域を含む組換えプラスミドにより形質転換さ
   れた組換え微生物細胞。
8. （８）該微生物細胞がエシェリヒア・コリ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）であることを特
   徴とする第７項記載微生物細胞。
9. （９）次のアミノ酸配列 【アミノ酸配列があります】 で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
   ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプトチドをコード
   するＤＮＡ領域を含む組換えプラスミドにより形質転換
   された組換え微生物細胞を培養し、培養物中に新規生理
   活性ポリペプチドを生成蓄積せしめ、得られた培養物か
   ら新規生理活性ポリペプチドを分離することを特徴とす
   る、新規生理活性ポリペプチドの製造方法。
10. （１０）抗腫瘍に有効な量の次のアミノ酸配列【アミノ
    酸配列があります】 で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
    ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドを含有する
    医薬組成物。