JPH02167094A - プルマイシンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はＬ−アルギニン要求性、Ｌ−アルギニン感受性
、グルタミン酸類縁物質耐性又はβ−ラクタム抗生物質
耐性を示すバチルス属に属するプルマイシン生産菌を用
いることを特徴とするプルマイシンの製造する方法に関
するものである。本発明により製造されるプルマイシン
はキュウリ灰色かび病、インゲン菌核病、キュウリうど
んこ病、モモ灰量病などの病害に有効であることが知ら
れている。

〔従来の技術〕

従来プルマイシンの製法としてはストレプトマイセス（
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属の放線菌（Ｓ、Ｏｍｕｒ
ｓ。

Ｍ、Ｋａｔａｇｉｒｉ、　　Ｊ、Ａｗａｙａ、　　に、
八ｔｓｕｎｉ、　　Ｒ，Ｏ３ｗａ、　　Ｔ。

Ｈａｔａ、　Ｓ、ｔｌｉｇａｓｈｉｋａｗａ、　Ｋ、Ｙ
ａｓｕｉ、ｔｌ、Ｔｅｒａｄａ　ａｎｄＳ、Ｋｕｙａｍ
ａ、　Ａｇｒｉｃ、　Ｂｉｏｌ、　ｃｈｅｎ、＋　　３
７　　（１２）２８０５〜２８１２　（１９７３））、
及びバチルス（Ｂａｃ　ｉ　Ｉ　Ｉｕｓ）属の細菌（公
開特公昭５４−１５７８９６）を用いる方法が知られて
いる。これらの菌株によるプルマイシンの培地中への蓄
積量は１０００■／７！以下であり、実用面からみて満
足のいく生産性ではない。

〔発明が解決しようとする問題点と解決するための手段〕

上記したように従来のプルマイシン製造法が工業的には
生産性が低いという問題点があるため、本発明者にはよ
り効率的なプルマイシン製造法を確立すべく研究を重ね
た。その結果、バチルス属物質耐性変異株、またはβ−
ラクタム抗生物質耐性変異株を誘導することによってプ
ルマイシン産生能が向上することを見出し、本発明を完
成した。

すなわち、本発明はプルマイシン産生能を有する耐性変
異株、またはβ−ラクタム抗生物質耐性変異株を誘導し
、それらの菌株をプルマイシン生産培地に培養し、培養
物からプルマイシンを採取することを特徴とするプルマ
イシンの製造方法に関するものである。

本発明に使用する微生物はバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
）属に属し、プルマイシン産生能を有する微生物である
。例えはバチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｅｒ
ｅｕｓ）　Ａ　Ｊ１１２５２．　ＦＥＲＭ　−Ｐ４５１
２．バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂ
ｔｉｌｔｓ）Ａ　Ｊ　１３１６．　ＰＥＲＭＰ５１５４
などがある。なお本発明はバチルス属の細菌以外にプル
マイシン産生能を有する放線菌にも適用できることは容
易に推測される。例えばストレプトミセス・カガヮエン
シス（ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓＫａｇａｗａｅｎｓｉ
ｓ）　ＡＴＣＣＮａ２１８１１　（Ｓ、　Ｏｍａｒａ等
、＾ｇｒ。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｌｌ、＋　３ユ２８０５〜２８１２
．（１９７３））がある。

これらの菌株より、変異株を取得する方法は、通常の微
生物の変異方法に従って変異操作を行なえばよい。例え
ばＮＧＣＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグア
ニジン）、亜硝酸などの薬剤による処理、Ｘ線、紫外線
などの照射処理などがある。

アルギニン要求性変異株の選別方法は次のように行なう
。まず、変異処理された菌体を寒天完全培地に生育させ
てコロニーを形成させ、次に寒天最少培地とＬ−アルギ
ニン含有寒天最少培地にレプリカし、前者で生育せず、
後者で生育する菌株を選択することによってＬ−アルギ
ニン要求株を取得できる。

アルギニン感受性変異株の選別方法は次のように行なう
。上記の方法で変異処理し、レプリカし、寒天最少培地
に生育し、Ｌ−アルギニン含有寒天最少培地に生育しな
い菌株を選択することによってＬ−アルギニン要求株を
取得できる。

次にグルタミン類縁物質耐性株及びβ−ラクタム抗生ｖ
ＩＪ質耐性株を選別する方法は次の様に行なう。すなわ
ち、変異処理された菌体の比較的高濃度懸濁液を寒天完
全培地に塗布し、使用する菌の生育阻害を示す濃度のグ
ルタミン類縁物質又はβラクタム抗生物質溶液を浸み込
ませたペーパーディスクを、この寒天完全培地上に置き
、培養して生育阻止円内に出現するコロニーを釣菌する
ことによって、それぞれの耐性株を得ることができる。

グルタミン類縁物質としてはアザセリン、ＤＯＮ（６−
ジアシー５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン）、グルタミン
酸ヒドラザイド、メチオニンスルフオキシイミン等をあ
げることができる。またβ−ラクタム抗生物質としては
ペニシリン系としてベンジルペニシリン、アンピシリン
等またセファロスポリン系としてセファロスポリンＣ、
セファレキシン等、またセファマイシン系としてセフオ
キシチンをあげることができる。

本発明で付与した性質、即ち、Ｌ−アルギニン要求性、
Ｌ−アルギニン惑受性、グルタミン類縁物質耐性または
β−ラクタム抗生物質耐性のうち２以上の性質を付与し
た変異株を使用することによりプルマイシンの生産性が
向上することが予想される。

この様な変異株の取得例を次に示す。

取得例１ バチルス・ズブチリスＡ　Ｊ　１３１６　ＦＥＲＭ−Ｐ
５１５４を表１に示した完全培地（ＣＭ培地と略称する
）から寒天を除いた液体培地で１６時間好気的に培養し
、遠心分離により菌体を集めて、０．ＩＭＫ表　１　完
全培地（ｐＨ７，０） 酵母エキス　　　　　　１０　ｇ／ｌ ペプトン　　　　　　　ｌＯ〃 ＮａＣ１５” 寒天　　　　　　　　　２０　〃 リ ン酸緩衝液、ｐ１１７．０で２回洗浄後、２．０００μ
ｇ／ＩｌｌのＮＧを含む同緩衝液に懸濁後０℃で１０分
間インキュベートすることにより変異処理を行い、この
菌体を遠心で集めて同緩衝液（０℃）で２回洗浄して、
付着ＮＧを除去し、再び同緩衝液に懸濁した。この懸濁
液を適当に希釈してＣＭプレート培地に、プレート当り
５０〜１００個のコロニーが出現するようにまいた。こ
れを約２０時間２６℃でインキュベートし、出現したコ
ロニーを表２に示した最少培地（ＭＭ培地と略称と略称
する）と１００■／ｌのＬ−アルギニンを含むＭＭ培地
にレプリカした。これを２４時間２６℃でインキュベー
トして、ＭＭ培地で生育せずＭＭ＋Ｌアルギニン培地で
生育するコロニーを採取し、更に両培地を用いて要求性
の確認テストを行った。

表　２　最少培地（ｐＨ７，０） グルコース　　　　　　５　　ｇ／ｌ 硫酸アンモニウム　　　ｌ　　〃 Ｋｌｌ□ＰＯ□　　　　　　　　８．５〃クエン　酸ナ
トリウム・２ｏ、ｏ　　　　　　　、０．５　　　　〃
Ｍｇ５Ｏａ　　・７ｏｚｏ　　　　　　　　　　　　Ｏ
，２”寒　　天　　　　　　　　　２０　　〃この方法
によりＬ−アルギニン要求性変異株バチルス・ズブチリ
スＡ　Ｊ１２４０Ｂ　（ＦＥＲＭ−Ｐ１０１５５）を得
た。

し また、同条件でレプリカν、そしてインキュベニン培地
で生首したコロニーを採収し、丈に阿工首地を用いて感
受性の確認テストを行った。この方法によりＬ−アルギ
ニン感受性変異株バチルス・ズブチリスＡ　Ｊ　１２４
３１（Ｆｔ！ＲＭ會Ｐ−ｔｏりλｌ）を得た。

取得例２ バチルス・ズブチリスＡ　Ｊ　１３１６　ＦＥＲＭ　−
Ｐ５１５４を取得例１と同様にして変異処理し得られた
菌体懸濁液（菌濃度１０ｂ〜１０ａ個／ｍｊり０．１ａ
ｊ！をＣＭプレート培地にまき、このプレート上に滅菌
したペーパーディスクを置き、これに４０μｌの１０■
７ｃｍβのアザセリン溶液、または４０μｌのｌＯ■／
ｌ１ｌｌのセファロスポリンＣ溶液を浸み込ませて、２
６℃２〜４日間インキュベートした。

形成される生育阻止円内に点在して生育して来たコロニ
ーを釣菌し、これらの中から比較的プルマイシン生産性
の高い株を選択した。この方法によりそれぞれ薬剤含有
プレート培地より、バチルス・ズブチリスＡ　Ｊ　１２
４０９　（ＦＥＲＭ−Ｐ１０１５６）及びバチルス・ズ
ブチリスＡ　Ｊ　１２４１０　（ＦＥＲＭ　−Ｐ１０１
５７）を得た。

本発明で実施されるプルマイシン生産用培地としてはバ
チルス属細菌の培養に用いられている通常の栄養培地が
使用され、例えばグルコース、マルトース、シュークロ
ース、澱粉、糖蜜、グリセリン等の炭素源、大豆粉、コ
ーンスチープリカーヘフトン、酵母エキス、肉エキス、
アンモニウム塩、硝酸塩等の窒素源からなる栄養培地が
用いられる。その他必要に応じて炭酸カルシウム、塩化
ナトリウム、カリウムイオン、燐酸塩、硫酸塩、Ｍ　ｇ
２　＋　、　ｌ　ｎ２　＋　、　ｐ　ｅ　２　”等の無
機塩類及び微量栄養素も補添される。

培養方法は通常の細菌の液体培養法で良く、培養温度は
２０〜４０℃特に２７〜３３℃が望ましく、培養液の９
１１は４．０〜８．５、特にｐｎｓ、ｏ〜７．０が望ま
しい。このような条件で２〜４日間好気的に培養するこ
とによりプルマイシンは２００〜２．０００　ｍｇ／　
ｉｔ蓄積される。

プルマイシンを培養液から分離する方法は、プルマイシ
ンは水溶性塩基性物質で大部分は菌体外に蓄積されるの
で、まず培養炉液から水溶性塩基性物質の採取に用いら
れる公知の方法、例えば活性炭吸着法、イオン交換樹脂
法、ゲルが適法等を適宜組合せることによって採取する
ことができる。

特にＣＭ−セルロース、ＣＭ−セファデックス、セファ
デックスＬＨ−２０等によるカラムクロマトグラフィー
は有効である。

プルマイシンの定量方法は、通常の高速液体クロマトグ
ラフィーにより行うことができる。

以下実施例にて説明する。

実施例１ 表１に示したＣＭ培地でバチルス・ズブチリスＡ　Ｊ　
１３１６　（Ｉ’ＥＲＭ−Ｐ５１５４）、Ａ　Ｊ　１２
４０Ｂ　（ＦＥＲＭ−Ｐ１０１５５）、Ａ　Ｊ　１２４
０９　（１’ＥＲＭ−１０１５６）、Ａ　Ｊ　１２４１
０（ＦＥＲＭ　−Ｐ１０１５７）及びＡ　Ｊ１２４３１
　（ＦＥＲＭ　−Ｐｔｏｓｘｔ）を２６℃、２４時間培
養後、ｌ白金耳量の菌体を表３に示したプルマイシン生
産培地２０ａｉβを含む５００ｍｊ！の坂ロフラスコに
接種し、２６℃６４時間振盪培養（振巾５．５　Ｃｍ、
　１１７　ｒｐｍ）を行ったところ、 表 プルマイシン生産培地（ｐＨ７，０） グルコース アミノ酸混合物０ 塩化アンモニウム ＨｔＰＯ４ ＭｇＳＯａ　　・７１ｈＯ Ｃｌ Ｆｅ５Ｏａ　　・ＩＨｔＯ ＭｎＳ０４’　４ＨｚＯ 炭酸カルシウム ７０ｇ／Ｉ！。

２　　〃 ｌ　５　　〃 １　　〃 ０．４〃 １．５＃ １０■ ８ＴＩ＠ ２５ｇ（割膜） ＊デイフコ・カザミノ酸中のアミノ酸組成と同じ割合で
アミノ酸のみを混合して調製した。

表　　　４ ＡＪ１２４０８（ＦＥＲＭ−Ｐ１０１５５）バチルス・
ズブチリス　　　　　　　　　　　０．７９８　　　　
６．１８　　　　２．０４＾Ｊ１２４０９（ＦＥＩＩＭ
−Ｐ１０１５６）バチルス・ズブチリス　　　　　　　
　　　　０．８７４　　　　６．２９　　　　１．８５
ＡＪ１２４１０（ＦＥＲＭ−Ｐ１０１５７）バチルス、
ズブチリス　　　　　　　　　　　０．７２２　　　　
６．３３　　　　２．３５ＡＪ１２４３１（ＦＩＥＲＭ
−ＰＩＯｒ２／）表４に示すような結果が得られた。

実施例２ 表１に示したＣＭ培地で２４時間生育したバチルス・ズ
ブチリスＡ　Ｊ１２４０９　（ＦＥＲＭ−Ｐ１０１５６
）の１白金耳の菌体を表１の組成から寒天を除いた組成
の液体培地５０ｍｊ！を含む５００ｍＡ容の坂ロフラス
コに接種し２４時間２６℃で振慢壇養を行い、種培養液
を作った。次に表３に示したプルマイシン生産培地２０
βを３０１容のジャーファーメンタ−に入れて１１５℃
で１５分間殺菌し、放冷後前記種培養液を接種し、２６
℃で５５時間通気攪拌培養を行った（通気！４ＶＶＷ、
回転数１　、６００ｒｐｍ　）。得られた培養液を遠心
分離して菌体を除去し、上清液に活性炭４００ｇを加え
て良くかきまぜた後、濾過して活性炭を分離した。次に
、８！の８０％メタノール水溶液（ｐＨ２，０）で活性
炭より溶出し、溶出液を減圧下で濃縮後凍結乾燥してプ
ルマイシンの粗粉末６５ｇを得た。この粗粉末について
０．０１　Ｍ、　ａｌ１７．０のリン酸緩衝液で平衡化
したＣＭ−セファデックスＣ−２５（ファルマシャ社製
のイオン交換−ゲルが通用ゲル）カラム（φ２，５（３
Ｘ４０ＣＪ）を用いてイオン交換クロマトグラフィーを
行った（溶出は塩化ナトリウムの０−１．０　Ｍの濃度
勾配法で行った）。塩化ナトリウムの濃度が０．５Ｍ附
近で溶出される活性区分を集め、これをセファデックス
ＬＨ−２０（ファルマシア社製のゲルが通用ゲル）カラ
ム（２，３Ｘ４０ｃｍ）に通し、メタノールで溶出して
脱塩した。

活性区分を集め減圧下で濃縮し、これにエタノ−ルを加
えて沈澱を生成せしめ、これを分離し真空乾燥して１．
５ｇの白色粉末を得た。この白色粉末の元素分析値は以
下に示す通りである。

Ｃ：　４４．３５％、　Ｈ：　５．８０％、　Ｎ　：　
１４．５５％、Ｏ：２９．１５％またこの粉末を６Ｎ＋
１（ｌで１１０℃２４ｈｒ加水分解し、アミノ酸アナラ
イザーで分析した結果約３７％のアラニンが検出された
。これらの値はオーセンティックのプルマイシンのもの
と良く一致している。

〔発明の効果〕

本発明の変異株を用いることによりグルコースより効率
よくプルマイシンを発酵生産することができる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、バチルス属に属し、Ｌ−アルギニン要求性を有する
   プルマイシン生産菌を好気的に発育させ、その培養液か
   らプルマイシンまたはその酸付加塩の製造 ２、バチルス属に属し、グルタミン類縁物質に耐性を示
   すプルマイシン生産菌を好気的に発育させ、その培養液
   からプルマイシンまたはその酸付加塩の製造法 ３、バチルス属に属し、β−ラクタム抗生物質に耐性を
   示すプルマイシン生産菌を好気的に発育させ、その培養
   液からプルマイシンまたはその酸付加塩の製造法 ４、バチルス属に属し、Ｌ−アルギニンに感受性を示す
   プルマイシン生産菌を好気的に発育させ、その培養液か
   らプルマイシンまたはその酸付加塩の製造法