JPS6228678B2 - - Google Patents
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- JPS6228678B2 JPS6228678B2 JP59039652A JP3965284A JPS6228678B2 JP S6228678 B2 JPS6228678 B2 JP S6228678B2 JP 59039652 A JP59039652 A JP 59039652A JP 3965284 A JP3965284 A JP 3965284A JP S6228678 B2 JPS6228678 B2 JP S6228678B2
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/88—Lyases (4.)
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/185—Escherichia
- C12R2001/19—Escherichia coli
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- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
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- Molecular Biology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
技術分野
本発明はＮ−アシルノイラミン酸アルドラーゼ
の製造方法に関する。 背景技術 Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラーゼ（Ｎ−
acylneuraminate aldolase）は、別名シアル酸ア
ルドラーゼとも呼ばれ国際生化学連合酵素委員会
の酵素番号E.C.4.1.3.3.に分類され、系統名では
Ｎ−アシルノイラミン酸：ピルビン酸リアーゼ
（Ｎ−acylneuraminate：pyruvate lyase）と呼ば
れている酵素である。本酵素は下記の反応式に示
す如く、シアル酸（Ｎ−アシルノイラミン酸）の
分解及び合成反応を触媒する酵素である。 シアル酸
〓Ｎ−アシルマンノサミン＋ピルビン酸 本発明者らは、先にエシエリヒア属、その他の
数種の属に属する公知菌を、シアル酸の存在下に
培養する時には、上記Ｎ−アシルノイラミン酸ア
ルドラーゼが工業的規模で容易に製造できること
を見い出し、該酵素の製造技術を確立した（特公
昭56−54153号、特許第1111346号）。しかるに上
記確立された方法では、培地へのシアル酸の添加
が必須であり、このシアル酸自体その調製に煩雑
な操作等を有し且つ高価なものである不利があつ
た。しかもこのシアル酸添加を行なわない限り、
Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラーゼは生産され
ないか或は極微量生産されるのみで、到底工業的
実施はできないものであつた。即ち上記方法に利
用される微生物は、それ自体シアル酸の不存在下
ではＮ−アシルノイラミン酸生産能を実質的に発
現し得ないものであつた。 本発明者らは、上記方法の最大の欠点とするシ
アル酸利用を必須とする点を解消し、該シアル酸
を利用せずとも工業的規模で大量のＮ−アシルノ
イラミン酸アルドラーゼを製造できる方法を開発
すべく鋭意研究を重ねた。その結果上記方法に利
用された微生物のうちエシエリヒア属に属する菌
を変異処理した所、得られる変異株は、シアル酸
等の誘導物質の無添加培地においても著量の目的
酵素を生産し得るという事実、即ち上記変異処理
により顕著なＮ−アシルノイラミン酸アルドラー
ゼ生産能が付与されるという新しい事実を発見し
た。本発明はこの新しい知見に基づいて完成され
たものである。 発明の構成 即ち、本発明はエシエリヒア属に属し、誘導物
質の存在を必要とすることなくＮ−アシルノイラ
ミン酸アルドラーゼ生産能を発現するように変異
された変異株を、培養して培養物からＮ−アシル
ノイラミン酸アルドラーゼを採取することを特徴
とするＮ−アシルノイラミン酸アルドラーゼの製
造法に係る。 本発明によれば調製するのが面倒なシアル酸、
その類縁体等のＮ−アシルノイラミン酸アルドラ
ーゼの誘導物質を培地中に添加せずとも、通常の
微生物の培養に用いられる培地中で、上記変異株
が有意な量の目的酵素を産生するため、該酵素を
工業的規模で大量に且つ容易に製造することがで
きる。 本発明方法においては、エシエリヒア属に属す
る変異株を用いることが重要であり、該変異株
は、エシエリヒア属に属する公知の各種菌、例え
ばエシエリヒア コリー（E.coli）、エシエリヒ
アフロインデイー（E.freundii）、エシエリヒア
インターメデイア（E.intermedia）等を起源とし
て、之等に、一般に用いられている公知の各種変
異処理手段を適用することにより得られる。該変
異処理手段としては、例えばニトロソグアニジ
ン、マイトマイシンＣ、４−ニトロキノリン−１
−オキシド、メチルメタンスルホン酸、メチルエ
タンスルホン酸、エチルエタンスルホン酸、２−
アミノプリン、５−ブロモウラシル、亜硝酸、ヒ
ドロキシルアミン、アクリフラビン、プロフラビ
ン、アクリジンマスタード等の化学的突然変異誘
起剤処理、Ｘ線等の放射線照射、紫外線照射等を
単独で又は適宜組み合せて用いることができる。 本発明に特に好適に用いられる上記変異株の一
例としては、エシエリヒア コリー IFO3301を
親株として得られたエシエリヒア コリー
M8328を例示できる。該M8328株は、以下の変異
処理手段により得られる。即ちエシエリヒア コ
リー IFO3301を肉エキスおよび酵母エキスを含
む培地（殺菌前のPH7.0、以下Ａ培地と呼ぶ）に
一白金耳植菌し、30℃で振盪培養する。中期対数
期で集菌し、生理食塩水で洗滌後５×108細胞／
mlになるように生理食塩水に懸濁させる。この懸
濁液に最終濃度100μｇ／mlになるようにニトロ
ソグアニジンを添加し、37℃で軽く振盪処理を施
したのち、遠心分離して菌体を集め、これを生理
食塩水で洗滌後、生理食塩水に懸濁させ、その一
部をとつてＡ培地に植菌する。30℃で振盪培養し
た後、遠心分離して集菌し、生理食塩水で洗滌し
た菌体をシアル酸、リン酸二カリウム、リン酸一
カリウム、硫酸アンモニウム及び硫酸マグネシウ
ムを含む培地（殺菌前のPH6.8、以下Ｂ培地と呼
ぶ）に植菌し、37℃で３時間振盪培養後この懸濁
液に最終濃度100U／mlになるようにペニシリン
Ｇを加え、更に37℃で振盪培養を行ない、遠心分
離により菌体を集め、生理食塩水で菌体を洗滌し
た後、段階希釈してブドウ糖、リン酸二カリウ
ム、リン酸一カリウム、硫酸アンモニウム、硫酸
マグネシウム及び寒天（殺菌前のPH6.8、以下Ｃ
培地と呼ぶ）からなる固体培地に塗りつけ、これ
を37℃で培養し、生じたコロニーをＢ培地に寒天
を添加した固体培地（以下、BA培地と呼ぶ）及
びＣ培地にレプリカ法で塗りつける。37℃で培養
後、Ｃ培地で生育し、BA培地で生育しない菌を
シアル酸非資化性菌株として得る。さらに本菌株
をＡ培地に培養後、上記と同じ条件でニトロソグ
アニジン処理を行ないＡ培地に植えて振盪培養す
る。Ｃ培地にコロニーを形成させBA培地とＣ培
地とにレプリカ法により塗りつける。BA培地及
びＣ培地の両方に生育した菌株につき、常法通り
Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラーゼ活性を測定
してシアル酸を添加しない培地での培養によつて
も著量の該酵素を生産する菌株を収得する。 かくして得られるM8328株は、親株と対比して
誘導物質の存在しない培養条件下においても著量
のＮ−アシルノイラミン酸アルドラーゼ産生能を
有する点において際立つた相違が認められる以
外、その菌学的性質においては親株と同一の諸特
徴を有している。従つてこれはエシエリヒア属に
属する変異体と同定される。本菌株は通商産業省
工業技術院微生物工業技術研究所に大腸菌
（Escherichiacoli）M8328なる表示で、受託番号
微工研条寄託第832号（FERM BP−832）として
寄託されている。 本発明者らの研究によれば、上記親株（E.coli
IFO3301）に限らず、本発明者らが先に確立した
方法に利用するエシエリヒア属微生物、即ちエシ
エリヒア属に属し、シアル酸添加培地でＮ−アシ
ルノイラミン酸アルドラーゼ生産能を有する微生
物は、いずれも上記ニトロソグアニジンを用いた
処理により、シアル酸無添加培地で著量のＮ−ア
シルノイラミン酸アルドラーゼ生産能を有する所
望の変異株に誘導できることが見い出された。ま
た上記各種の微生物は、ニトロソグアニジンを用
いる処理以外の、前記した各種の変異処理手段に
よつても、同様の酵素生産能を有する変異株に誘
導できる。これらのことより、上記微生物は、Ｎ
−アシルノイラミン酸アルドラーゼ生産能を潜在
的に有しており、通常これは発現されないが、変
異処理によりこの潜在的酵素生産能が活性化され
確実に発現されるものと考えられる。 いずれにせよ、従来かかる顕著に向上された酵
素生産能を有するエシエリヒア属微生物は全く知
られておらず、勿論公知のエシエリヒア属微生物
が変異処理によりかかる酵素生産能を発現させ得
るという事実も知られていない。 本発明方法は、上記エシエリヒア属に属する変
異株を、培養することにより実施される。上記微
生物を培養するための培地としては炭素源、窒素
源、無機化合物その他の栄養素を含むものなら細
菌の培養に一般に使用されている合成培地、半合
成培地或いは天然培地のいずれをも使用すること
ができる。上記各培地に利用される炭素源として
は、例えばブドウ糖、果糖、転化糖、澱粉糖化
液、ソルビトール、グリセロール等の糖質類、ピ
ルビン酸、リンゴ酸、コハク酸等の有機酸類等
が、窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化ア
ンモニウム、硝酸アンモニウム、リン酸アンモニ
ウム、水酸化アンモニウム、酒石酸アンモニウ
ム、酢酸アンモニウム、尿素等が、炭素源にも窒
素源にもなるものとしては、ペプトン、肉エキ
ス、コーンステイープリカー等が、無機化合物と
しては、リン酸一カリ、リン酸二カリ、リン酸一
ナトリウム、リン酸二ナトリウム、硫酸マグネシ
ウム、塩化マグネシウム、塩化カリ、塩化ナトリ
ウム、硫酸第一鉄、塩化第一鉄、硫酸第二鉄、塩
化第二鉄、硫酸マンガン、塩化マンガン等が、そ
の他の栄養源としては酵母エキス、ビタミン類等
が夫々例示される。 培養は、液体培地又は固体培地のいずれでも行
ない得るが通常液体培地の方が有利であつて、特
に振盪培養又は通気撹拌培養を行なうのが量産上
有利である。培養温度は20℃乃至45℃、好ましく
は28℃乃至37℃とするのが好適である。培養中は
適当な中和剤を用いてPHを６乃至９に調整するの
が好ましい。上記培養を通常10時間乃至50時間行
なえば、Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラーゼ活
性は最高に達する。本酵素は一般に菌体内酵素で
あるので、培養物からの本酵素を採取し、精製す
るに当つては、上記培養液から遠心分離等の方法
で菌体を集め、得られた菌体を超音波処理、ガラ
スビーズを用いる摩砕処理、或いはフレンチプレ
ス処理等によつて破砕し、酵素を抽出するのが好
ましい。抽出液はこれを硫安塩析法、イオン交換
クロマトグラフイー、ゲル過法等の常法により
処理して精製Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラー
ゼとすることができる。 実施例 以下実施例を挙げて本発明を具体的に説明す
る。なお、各例におけるＮ−アシルノイラミン酸
アルドラーゼ活性は、バーネツトらの方法〔J.E.
G.Barnett，D.L.Corina，and G.Rasool，
Biochemical Journal，125，275（1971）〕に従い
測定したものであり、酵素活性の１単位は、反応
温度37℃において１分間に１マイクロモルのＮ−
アセチルノイラミン酸を分解する活性をいう。 実施例 １ ブドウ糖1.0ｇ、硫安0.2ｇ、リン酸二カリウム
0.7ｇ、リン酸一カリウム0.2ｇ、酵母エキス0.05
ｇ及び水100mlを500ml容三角フラスコに入れ、PH
6.8になる様に調整後、加熱滅菌した培養液に、
エシエリヒア コリー M8328（微工研条寄第
832号）を接種し、30℃にて24時間振盪培養を行
なつた。その後菌体を遠心分離法により集め、得
られた菌体を25mMリン酸緩衝液（PH7.5）100ml
に懸濁して超音波処理を行ない細胞を破砕し、菌
体内の酵素を抽出した。遠心分離により沈渣と上
澄とを分離した後、抽出液（上澄）のＮ−アシル
ノイラミン酸アルドラーゼ活性を測定した所、抽
出液１ml当たり1.02単位と測定された。 尚、参考のため上記培地のブドウ糖の代りにシ
アル酸（Ｎ−アセチルノイラミン酸）を1.0％添
加した培地を用いて親株（エシエリヒア コリー
IFO3301）を同様に培養して得られた酵素活性
を同様に測定した結果、抽出液１ml当たりの活性
は1.04単位であつた。 次に上記のエシエリヒア コリー M8328由来
の酵素抽出液100ml（102単位の酵素活性を有す）
を硫安で塩析し、30〜80％飽和区分（飽和度はオ
ズボーン（Osborne）法で表示）を遠心分離によ
り集め、沈澱を20mlの25mMリン酸緩衝液（PH
7.5）に溶かして同緩衝液に対して充分透析した
後、凍結乾燥した結果、Ｎ−アシルノイラミン酸
アルドラーゼの粗酵素粉末126.0mgが得られ、粉
末１mg当たりの該酵素活性は0.75単位であつた。 ここに得られた粗酵素粉末は、これをイオン交
換クロマトグラフイー、ゲル過、等の常法にに
従つて精製することにより更に純化された酵素標
品を得ることができる。 比較例 １ 実施例１において、変異株M8328に代え、親株
（エシエリヒア コリー IFO3301）を用い、同
様に培養して得られた酵素活性を同様に測定した
所、抽出液１ml当たりの酵素活性は0.001単位で
あつた。 比較例 ２〜４ 比較例１において、以下の各微生物を用い、同
様にシアル酸無添加培地で培養して得られた酵素
活性を同様に測定した所、夫々下記第１表に示す
通りであつた。 尚第１表には各微生物をシアル酸添加培地（実
施例１に示した培地のブドウ糖の代りにシアル酸
を1.0％添加した培地）で培養して、同様の酵素
活性を求めた結果を併記する。
の製造方法に関する。 背景技術 Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラーゼ（Ｎ−
acylneuraminate aldolase）は、別名シアル酸ア
ルドラーゼとも呼ばれ国際生化学連合酵素委員会
の酵素番号E.C.4.1.3.3.に分類され、系統名では
Ｎ−アシルノイラミン酸：ピルビン酸リアーゼ
（Ｎ−acylneuraminate：pyruvate lyase）と呼ば
れている酵素である。本酵素は下記の反応式に示
す如く、シアル酸（Ｎ−アシルノイラミン酸）の
分解及び合成反応を触媒する酵素である。 シアル酸
〓Ｎ−アシルマンノサミン＋ピルビン酸 本発明者らは、先にエシエリヒア属、その他の
数種の属に属する公知菌を、シアル酸の存在下に
培養する時には、上記Ｎ−アシルノイラミン酸ア
ルドラーゼが工業的規模で容易に製造できること
を見い出し、該酵素の製造技術を確立した（特公
昭56−54153号、特許第1111346号）。しかるに上
記確立された方法では、培地へのシアル酸の添加
が必須であり、このシアル酸自体その調製に煩雑
な操作等を有し且つ高価なものである不利があつ
た。しかもこのシアル酸添加を行なわない限り、
Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラーゼは生産され
ないか或は極微量生産されるのみで、到底工業的
実施はできないものであつた。即ち上記方法に利
用される微生物は、それ自体シアル酸の不存在下
ではＮ−アシルノイラミン酸生産能を実質的に発
現し得ないものであつた。 本発明者らは、上記方法の最大の欠点とするシ
アル酸利用を必須とする点を解消し、該シアル酸
を利用せずとも工業的規模で大量のＮ−アシルノ
イラミン酸アルドラーゼを製造できる方法を開発
すべく鋭意研究を重ねた。その結果上記方法に利
用された微生物のうちエシエリヒア属に属する菌
を変異処理した所、得られる変異株は、シアル酸
等の誘導物質の無添加培地においても著量の目的
酵素を生産し得るという事実、即ち上記変異処理
により顕著なＮ−アシルノイラミン酸アルドラー
ゼ生産能が付与されるという新しい事実を発見し
た。本発明はこの新しい知見に基づいて完成され
たものである。 発明の構成 即ち、本発明はエシエリヒア属に属し、誘導物
質の存在を必要とすることなくＮ−アシルノイラ
ミン酸アルドラーゼ生産能を発現するように変異
された変異株を、培養して培養物からＮ−アシル
ノイラミン酸アルドラーゼを採取することを特徴
とするＮ−アシルノイラミン酸アルドラーゼの製
造法に係る。 本発明によれば調製するのが面倒なシアル酸、
その類縁体等のＮ−アシルノイラミン酸アルドラ
ーゼの誘導物質を培地中に添加せずとも、通常の
微生物の培養に用いられる培地中で、上記変異株
が有意な量の目的酵素を産生するため、該酵素を
工業的規模で大量に且つ容易に製造することがで
きる。 本発明方法においては、エシエリヒア属に属す
る変異株を用いることが重要であり、該変異株
は、エシエリヒア属に属する公知の各種菌、例え
ばエシエリヒア コリー（E.coli）、エシエリヒ
アフロインデイー（E.freundii）、エシエリヒア
インターメデイア（E.intermedia）等を起源とし
て、之等に、一般に用いられている公知の各種変
異処理手段を適用することにより得られる。該変
異処理手段としては、例えばニトロソグアニジ
ン、マイトマイシンＣ、４−ニトロキノリン−１
−オキシド、メチルメタンスルホン酸、メチルエ
タンスルホン酸、エチルエタンスルホン酸、２−
アミノプリン、５−ブロモウラシル、亜硝酸、ヒ
ドロキシルアミン、アクリフラビン、プロフラビ
ン、アクリジンマスタード等の化学的突然変異誘
起剤処理、Ｘ線等の放射線照射、紫外線照射等を
単独で又は適宜組み合せて用いることができる。 本発明に特に好適に用いられる上記変異株の一
例としては、エシエリヒア コリー IFO3301を
親株として得られたエシエリヒア コリー
M8328を例示できる。該M8328株は、以下の変異
処理手段により得られる。即ちエシエリヒア コ
リー IFO3301を肉エキスおよび酵母エキスを含
む培地（殺菌前のPH7.0、以下Ａ培地と呼ぶ）に
一白金耳植菌し、30℃で振盪培養する。中期対数
期で集菌し、生理食塩水で洗滌後５×108細胞／
mlになるように生理食塩水に懸濁させる。この懸
濁液に最終濃度100μｇ／mlになるようにニトロ
ソグアニジンを添加し、37℃で軽く振盪処理を施
したのち、遠心分離して菌体を集め、これを生理
食塩水で洗滌後、生理食塩水に懸濁させ、その一
部をとつてＡ培地に植菌する。30℃で振盪培養し
た後、遠心分離して集菌し、生理食塩水で洗滌し
た菌体をシアル酸、リン酸二カリウム、リン酸一
カリウム、硫酸アンモニウム及び硫酸マグネシウ
ムを含む培地（殺菌前のPH6.8、以下Ｂ培地と呼
ぶ）に植菌し、37℃で３時間振盪培養後この懸濁
液に最終濃度100U／mlになるようにペニシリン
Ｇを加え、更に37℃で振盪培養を行ない、遠心分
離により菌体を集め、生理食塩水で菌体を洗滌し
た後、段階希釈してブドウ糖、リン酸二カリウ
ム、リン酸一カリウム、硫酸アンモニウム、硫酸
マグネシウム及び寒天（殺菌前のPH6.8、以下Ｃ
培地と呼ぶ）からなる固体培地に塗りつけ、これ
を37℃で培養し、生じたコロニーをＢ培地に寒天
を添加した固体培地（以下、BA培地と呼ぶ）及
びＣ培地にレプリカ法で塗りつける。37℃で培養
後、Ｃ培地で生育し、BA培地で生育しない菌を
シアル酸非資化性菌株として得る。さらに本菌株
をＡ培地に培養後、上記と同じ条件でニトロソグ
アニジン処理を行ないＡ培地に植えて振盪培養す
る。Ｃ培地にコロニーを形成させBA培地とＣ培
地とにレプリカ法により塗りつける。BA培地及
びＣ培地の両方に生育した菌株につき、常法通り
Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラーゼ活性を測定
してシアル酸を添加しない培地での培養によつて
も著量の該酵素を生産する菌株を収得する。 かくして得られるM8328株は、親株と対比して
誘導物質の存在しない培養条件下においても著量
のＮ−アシルノイラミン酸アルドラーゼ産生能を
有する点において際立つた相違が認められる以
外、その菌学的性質においては親株と同一の諸特
徴を有している。従つてこれはエシエリヒア属に
属する変異体と同定される。本菌株は通商産業省
工業技術院微生物工業技術研究所に大腸菌
（Escherichiacoli）M8328なる表示で、受託番号
微工研条寄託第832号（FERM BP−832）として
寄託されている。 本発明者らの研究によれば、上記親株（E.coli
IFO3301）に限らず、本発明者らが先に確立した
方法に利用するエシエリヒア属微生物、即ちエシ
エリヒア属に属し、シアル酸添加培地でＮ−アシ
ルノイラミン酸アルドラーゼ生産能を有する微生
物は、いずれも上記ニトロソグアニジンを用いた
処理により、シアル酸無添加培地で著量のＮ−ア
シルノイラミン酸アルドラーゼ生産能を有する所
望の変異株に誘導できることが見い出された。ま
た上記各種の微生物は、ニトロソグアニジンを用
いる処理以外の、前記した各種の変異処理手段に
よつても、同様の酵素生産能を有する変異株に誘
導できる。これらのことより、上記微生物は、Ｎ
−アシルノイラミン酸アルドラーゼ生産能を潜在
的に有しており、通常これは発現されないが、変
異処理によりこの潜在的酵素生産能が活性化され
確実に発現されるものと考えられる。 いずれにせよ、従来かかる顕著に向上された酵
素生産能を有するエシエリヒア属微生物は全く知
られておらず、勿論公知のエシエリヒア属微生物
が変異処理によりかかる酵素生産能を発現させ得
るという事実も知られていない。 本発明方法は、上記エシエリヒア属に属する変
異株を、培養することにより実施される。上記微
生物を培養するための培地としては炭素源、窒素
源、無機化合物その他の栄養素を含むものなら細
菌の培養に一般に使用されている合成培地、半合
成培地或いは天然培地のいずれをも使用すること
ができる。上記各培地に利用される炭素源として
は、例えばブドウ糖、果糖、転化糖、澱粉糖化
液、ソルビトール、グリセロール等の糖質類、ピ
ルビン酸、リンゴ酸、コハク酸等の有機酸類等
が、窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化ア
ンモニウム、硝酸アンモニウム、リン酸アンモニ
ウム、水酸化アンモニウム、酒石酸アンモニウ
ム、酢酸アンモニウム、尿素等が、炭素源にも窒
素源にもなるものとしては、ペプトン、肉エキ
ス、コーンステイープリカー等が、無機化合物と
しては、リン酸一カリ、リン酸二カリ、リン酸一
ナトリウム、リン酸二ナトリウム、硫酸マグネシ
ウム、塩化マグネシウム、塩化カリ、塩化ナトリ
ウム、硫酸第一鉄、塩化第一鉄、硫酸第二鉄、塩
化第二鉄、硫酸マンガン、塩化マンガン等が、そ
の他の栄養源としては酵母エキス、ビタミン類等
が夫々例示される。 培養は、液体培地又は固体培地のいずれでも行
ない得るが通常液体培地の方が有利であつて、特
に振盪培養又は通気撹拌培養を行なうのが量産上
有利である。培養温度は20℃乃至45℃、好ましく
は28℃乃至37℃とするのが好適である。培養中は
適当な中和剤を用いてPHを６乃至９に調整するの
が好ましい。上記培養を通常10時間乃至50時間行
なえば、Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラーゼ活
性は最高に達する。本酵素は一般に菌体内酵素で
あるので、培養物からの本酵素を採取し、精製す
るに当つては、上記培養液から遠心分離等の方法
で菌体を集め、得られた菌体を超音波処理、ガラ
スビーズを用いる摩砕処理、或いはフレンチプレ
ス処理等によつて破砕し、酵素を抽出するのが好
ましい。抽出液はこれを硫安塩析法、イオン交換
クロマトグラフイー、ゲル過法等の常法により
処理して精製Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラー
ゼとすることができる。 実施例 以下実施例を挙げて本発明を具体的に説明す
る。なお、各例におけるＮ−アシルノイラミン酸
アルドラーゼ活性は、バーネツトらの方法〔J.E.
G.Barnett，D.L.Corina，and G.Rasool，
Biochemical Journal，125，275（1971）〕に従い
測定したものであり、酵素活性の１単位は、反応
温度37℃において１分間に１マイクロモルのＮ−
アセチルノイラミン酸を分解する活性をいう。 実施例 １ ブドウ糖1.0ｇ、硫安0.2ｇ、リン酸二カリウム
0.7ｇ、リン酸一カリウム0.2ｇ、酵母エキス0.05
ｇ及び水100mlを500ml容三角フラスコに入れ、PH
6.8になる様に調整後、加熱滅菌した培養液に、
エシエリヒア コリー M8328（微工研条寄第
832号）を接種し、30℃にて24時間振盪培養を行
なつた。その後菌体を遠心分離法により集め、得
られた菌体を25mMリン酸緩衝液（PH7.5）100ml
に懸濁して超音波処理を行ない細胞を破砕し、菌
体内の酵素を抽出した。遠心分離により沈渣と上
澄とを分離した後、抽出液（上澄）のＮ−アシル
ノイラミン酸アルドラーゼ活性を測定した所、抽
出液１ml当たり1.02単位と測定された。 尚、参考のため上記培地のブドウ糖の代りにシ
アル酸（Ｎ−アセチルノイラミン酸）を1.0％添
加した培地を用いて親株（エシエリヒア コリー
IFO3301）を同様に培養して得られた酵素活性
を同様に測定した結果、抽出液１ml当たりの活性
は1.04単位であつた。 次に上記のエシエリヒア コリー M8328由来
の酵素抽出液100ml（102単位の酵素活性を有す）
を硫安で塩析し、30〜80％飽和区分（飽和度はオ
ズボーン（Osborne）法で表示）を遠心分離によ
り集め、沈澱を20mlの25mMリン酸緩衝液（PH
7.5）に溶かして同緩衝液に対して充分透析した
後、凍結乾燥した結果、Ｎ−アシルノイラミン酸
アルドラーゼの粗酵素粉末126.0mgが得られ、粉
末１mg当たりの該酵素活性は0.75単位であつた。 ここに得られた粗酵素粉末は、これをイオン交
換クロマトグラフイー、ゲル過、等の常法にに
従つて精製することにより更に純化された酵素標
品を得ることができる。 比較例 １ 実施例１において、変異株M8328に代え、親株
（エシエリヒア コリー IFO3301）を用い、同
様に培養して得られた酵素活性を同様に測定した
所、抽出液１ml当たりの酵素活性は0.001単位で
あつた。 比較例 ２〜４ 比較例１において、以下の各微生物を用い、同
様にシアル酸無添加培地で培養して得られた酵素
活性を同様に測定した所、夫々下記第１表に示す
通りであつた。 尚第１表には各微生物をシアル酸添加培地（実
施例１に示した培地のブドウ糖の代りにシアル酸
を1.0％添加した培地）で培養して、同様の酵素
活性を求めた結果を併記する。
【表】
実施例 ２
コハク酸1.0ｇ、ペプトン1.0ｇ、酵母エキス1.0
ｇ及び水100mlを500ml容三角フラスコに入れ、PH
6.5になる様に苛性ソーダでPHを調整し、加熱滅
菌した培養液に、実施例１と同じエシエリヒア
コリー M8328を接種し、30℃にて20時間振盪培
養を行なつた。以後実施例１と同様にして酵素を
抽出し、活性を測定した結果、抽出液１ml当たり
のＮ−アシルノイラミン酸アルドラーゼ活性は
1.25単位であつた。 ここに得られた抽出液100ml（125単位の酵素活
性を有す）を出発原料にして、実施例１に記した
方法と同様にして凍結乾燥標品を調製した結果、
Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラーゼの粗酵素粉
末143.1mgが得られ、粉末１mg当りの該酵素活性
は0.82単位であつた。
ｇ及び水100mlを500ml容三角フラスコに入れ、PH
6.5になる様に苛性ソーダでPHを調整し、加熱滅
菌した培養液に、実施例１と同じエシエリヒア
コリー M8328を接種し、30℃にて20時間振盪培
養を行なつた。以後実施例１と同様にして酵素を
抽出し、活性を測定した結果、抽出液１ml当たり
のＮ−アシルノイラミン酸アルドラーゼ活性は
1.25単位であつた。 ここに得られた抽出液100ml（125単位の酵素活
性を有す）を出発原料にして、実施例１に記した
方法と同様にして凍結乾燥標品を調製した結果、
Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラーゼの粗酵素粉
末143.1mgが得られ、粉末１mg当りの該酵素活性
は0.82単位であつた。
Claims (1)
- １ エシエリヒア属に属し、誘導物質の存在を必
要とすることなくＮ−アシルノイラミン酸アルド
ラーゼ生産能を発現するように変異された変異株
を、培養して培養物からＮ−アシルノイラミン酸
アルドラーゼを採取することを特徴とするＮ−ア
シルノイラミン酸アルドラーゼの製造法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59039652A JPS60184384A (ja) | 1984-02-29 | 1984-02-29 | Ν−アシルノイラミン酸アルドラ−ゼの製造法 |
| US06/758,116 US4699883A (en) | 1984-02-29 | 1985-07-23 | Process for producing N-acylneuraminate aldolase |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59039652A JPS60184384A (ja) | 1984-02-29 | 1984-02-29 | Ν−アシルノイラミン酸アルドラ−ゼの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60184384A JPS60184384A (ja) | 1985-09-19 |
| JPS6228678B2 true JPS6228678B2 (ja) | 1987-06-22 |
Family
ID=12559012
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59039652A Granted JPS60184384A (ja) | 1984-02-29 | 1984-02-29 | Ν−アシルノイラミン酸アルドラ−ゼの製造法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4699883A (ja) |
| JP (1) | JPS60184384A (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH07114695B2 (ja) * | 1986-06-16 | 1995-12-13 | 丸金醤油株式会社 | ノイラミニダ−ゼの製造法 |
| US5162513A (en) * | 1991-09-20 | 1992-11-10 | The Scripps Research Institute | L-isomeric sugars having formed stereogenic centers of R configuration: methods and compositions |
| US6353095B1 (en) * | 1991-09-20 | 2002-03-05 | The Scripps Research Institute | Ketoaldonic acids having formed stereogenic centers of R configuration: methods and compositions |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5550890A (en) * | 1978-10-09 | 1980-04-14 | Marukin Shoyu Kk | Preparation of n-acylneuraminic acid aldolase |
| US4492755A (en) * | 1982-06-30 | 1985-01-08 | Nabisco Brands, Inc. | Process for isomerizing L-mannose to L-fructose |
-
1984
- 1984-02-29 JP JP59039652A patent/JPS60184384A/ja active Granted
-
1985
- 1985-07-23 US US06/758,116 patent/US4699883A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US4699883A (en) | 1987-10-13 |
| JPS60184384A (ja) | 1985-09-19 |
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|---|---|---|---|
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