JPH0216732B2 - - Google Patents

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JPH0216732B2
JPH0216732B2 JP3634184A JP3634184A JPH0216732B2 JP H0216732 B2 JPH0216732 B2 JP H0216732B2 JP 3634184 A JP3634184 A JP 3634184A JP 3634184 A JP3634184 A JP 3634184A JP H0216732 B2 JPH0216732 B2 JP H0216732B2
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nana
cmp
acid
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Mitsukori Pietoro
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CHII ERE CHII CO DEI RISERUKA CHIMIKA SpA
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CHII ERE CHII CO DEI RISERUKA CHIMIKA SpA
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Description

【発明の詳細な説明】 この発明は、活性成分として５−アセトアミド
−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラ
クトノヌロサミン酸のシチジンモノホスフエート
を含有する、中枢神経系（CNS）及び末梢神経
系（PNS）における神経刺激の障害に関連する
病理的状態の療法において使用するための医薬組
成物に関する。 すでに知られているように、次の式（） で示される５−アセトアミド−３，５−ジデオキ
シ−５−グリセロ−Ｄ−ガラクトノヌロサミン酸
（５−acetamide−３，５−dideoxy−５−
glycero−Ｄ−galactcnonulosaminic acid；
NANA又はNeuAc）のシチジンモノホスフエー
ト（cytidine monophosphate；CMP）〔式（）
の化合物をCMP−NANA、又はCMP−NeuAc
と略す〕は、５−アセトアミド−３，５−ジデオ
キシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクトノヌロサミン
酸〔通常、Ｎ−アセチル−ニユーラミン酸（Ｎ−
acetyl−neuraminic acid）と称しNANAと略
す〕の生物学的活性形であり、そしてこの化合物
は生物体中の種々の合成過程の生成物である。 NANAは、膜に見出される分子（ガングリオ
キサイド及び糖蛋白）の生理的活性部分であり、
これは一般に、細胞が機能するために必要とされ
るすべての情報を受領しそして伝達することがで
きるように構成されている（例えば、R.W.
Teanloz等、The Biological Role of Sialic
Acid at the Surface of the Cell、in
Biological Roles of Sialic Acid、A.
Rosenberg等編、プレナムプルス、201〜227頁、
1976年参照のこと）。 次の反応式、 に従つて、生化学的方法によりCMP−NANAを
製造する方法も、例えばS.Roseman、Rroc.
Natl.Acid.Sci.US48、437−41（1962）；N.
Sharon、Complex Carbohydrates、Addison−
Wesley、出版、ロンドン−アムステルダム、150
〜153頁、1979年においてよく知られている。 B.Bendiak等、Can.J.Biochem.59、171〜180
（1981）、及びA.Preti等、J.Neurochem.35、281
〜296（1980）から、CMP−NANAは酵素シアリ
ルトランスフエラーゼの生理的基質であり、この
酵素は生物膜の前記のサブユニツト、例えばガン
グリオサイド及び糖蛋白へのCMP−NANAの導
入に寄与することもすで知られている。 前記の反応において示されるように、活性形
NANAの合成の間にCTP中の２個の高反応性結
合のエネルギーが消費される。他方、Ｎ−アセチ
ルニユーラミン酸はこの活性形においてのみ膜に
導入され得る〔例えば、A.Arce等、Arch.
Biochem.Biophys.116、52〜58（1966）参照〕。 膜中での成分の正常な代謝回転のほかに、膜の
機能はNANA残基の脱着の反復と関連している
ことは重要である。実際に、NANAが膜表面に
付与する負電荷の変化により膜の機能的活性が変
化する（例えば、R.Jbernacki等、The
Glycoconjugates Vol. part Ｂ、M.I.
Horowitz E.、アカデミツクプレス、256〜261
頁、1982；S.Ng等、The Natiral Occurence of
Sialic Acid、in Biological Roles of Sialic
Acid、A.Rosenberg等編、プレナムプレス、59
〜86頁、1976参照）。 さらに、神経不調の治療のために、ガングリオ
サイドを、天然分離源から、例えばモノ−、ジ
−、トリ−、及びテトラ−Ｎ−アセチルニユーラ
ミン酸ガングリオサイドを含有する哺乳動物の神
経組織からの抽出により得られる混合物として使
用することも提案されている（イタリア特許出願
第26323A／73号参照のこと）。 しかしながら、この療法は次のような幾つかの
欠点を有する。 (a) ガングリオサイドの混合物の組成をコントロ
ールすることは困難であり、そして複雑な装置
を必要とする。 (b) ガングリオサイドのような生物重合体の化学
的安定性は低いので医薬としての商品寿命が限
定され、このために治療上の危険、例えば種々
のコントロールできない副作用が生ずる。 (c) ガングリオサイドは高分子量（約1500）の生
物重合体であるので抗原性を有する（例えば、
J.T.Rick等、Develop.Med.Child Neurol.22、
719〜724、1980を参照のこと）。 今まで、CMP−NANAは、中枢神経系
（CNS）及び末梢神経系（PNS）における神経刺
激の障害に関連する病理的状態の療法のための医
薬組成物の形では使用されていなかつた。 今や、CMP−NANAが、中枢神経系又は末梢
神経系の障害、例えばCNS又はPNSレベルでの
神経伝達の変調；末梢神経の外傷による又は毒に
よる損傷；ハンテイントン・コレア
（Huntington′s Corea）、老人性痴呆のごとき病
的状態による記憶障害；動脈硬化性又は心臓性の
錯乱状態；眼球後部神経炎；眼球運動の麻痺；三
叉神経の神経痛；顔面神経又はベル（Bell）神経
の麻痺；ガルシン（Garcin）症候群；グイラ
ン・バレ（Guillan Barre）症候群；ラジオライ
ト（radiolites）；糖尿病性及びアルコール性多発
性神経炎；産科的麻痺；運動性神経疾患；筋萎縮
性側索硬化症；脊髄病性筋萎縮；進行性球麻痺；
激しい筋無力性；筋ジストロフイー；錯乱状態の
ような意識障害；脳しんとう；頭蓋外傷、脳血管
障害、及び血栓症の結果の治病のために非常に価
値があることが見出された。 さらに、CMP−NANAが、シチジンモノホス
フエート（CTT）とＮ−アセチルニユラミン酸
（NANA）との酵素CMP−アシルニユラミネー
トシンサーゼ〔CMP−acylnuraminate
synthase（EC2.7.7.43）〕により触媒される縮合に
基礎を置く２つの方法により得られることが見出
された。 第１の新規な方法(A)においては、CTPと
NANAとの縮合が、種々の分離源からの、無細
胞型の、溶解した、又は適当な固体に固定された
酵素CMP−アシルニユーラミネートシンサーゼ
（EC2.7.7.43）により触媒され、これは酵素の蛋
白性構造と固体担体との化学結合を可能にする
BrCN、チオカルボン酸安定剤及び／又はニトロ
イミダゾール安定剤の存在下で行われる。 第２の新規な方法(B)においては、CTPと
NANAとの縮合がＥ．コリ（Ｅ．coli）
CRC1482から分離された酵素CMP−アシルニユ
ーラミネートシンサーゼ（EC2.7.7.43）により触
媒される。 第２の方法(B)は、場合によつてはさらに、チオ
カルボン酸安定剤及び／又はニトロイミダゾール
安定剤の存在下で、そして／又は方法(A)の条件下
で行うこともできる。 従つて、この発明の対象の１つは、中枢神経系
及び末梢神経系における神経刺激の障害に関連す
る病理的状態の療法において使用するための、５
−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリ
セロ−Ｄ−ガラクトノヌロサミン酸のシチジンモ
ノホスフエートを含んでなる医薬組成物である。 この発明の他の対象は、酵素CMP−アシルニ
ユーラミネートシンサーゼ（EC2.7.7.43）により
触媒される、シチジントリホスフエート（CTP）
とＮ−アセチルニユーラミン酸（NANA）との
縮合によるCTP−NANAの製造方法であつて、
(A)該縮合をチオカルボン酸安定剤及び／又はニト
ロイミダゾール安定剤の存在下で行うことを特徴
とする方法、及び(B)該縮合をE.コリCRC1482株
から分離された酵素CMP−アシルニユーラミネ
ートシンサーゼ（EC2.7.7.43）により行うことを
特徴とする方法である。 この発明は、ガングリオサイドの治療的使用に
関する問題のほとんどを回避すると共に、次のよ
うな利点を有する。 (a) NANAの活性形、すなわちCMP−NANA
は、生物細胞代謝回転がこの分子の多量の供給
を必要とする場合、例えば神経の再生の場合
に、特にある種の病理的状態にある生物に直接
供給される。事実、NANAが導入されるガン
グリオサイド及び糖蛋白質は、すべての細胞間
認識現象、及び細胞と環境との間のいわゆる社
会的細胞挙動に関連する。 (b) CMP−NANAは化学的に良く特定された分
子であつて、生体外での酵素的合成を介して最
も高純度において手入することができる。 (c) CMP−NANAの化学的純度及び生物的活性
レベルは、簡単な化学的試験及び生体外での酵
素的方法を用いて、決定し又は制御することが
できる（例えば、R.W.Leedeen等、Chemistry
and Analysis of Sialic Acid、in Biological
Roles of Sialic Acid、A.Rosenbery等編、プ
レナムプレス、１〜48頁、1976）。 (d) CMP−NANAが生体内でガングリオサイド
及び糖蛋白質に導入されることが明確に証明さ
れている（例えば、The Glycoconjugatet
Vol. part Ｂ、M.T.Horowitz編、アカデ
ミツクプレス、1982；E.J.Mc Guire、
Anabolic Reactions involving Sialie Acids、
in Biological Roles of Sialic Acid、A.
Rosenbery等編、プレナムプレス、123〜158
頁、1976を参照のこと）。 (e) CMP−NANAは、ガングリオサイドに比べ
て実質的に小形であり、全く抗原性を有しな
い。ガングリオサイド又は関連高分子について
は抗原性が知られている。 (f) CMP−NANAは、内性分子（endogenous
molecule）であり、ヒトに対する毒性が非常
に低い。30匹ずつの２群及び対照の２群からな
る、体重20±１ｇのアルビノラツトについて発
明者等が得た結果は、腹腔内投与においては
900mg／Kg、経口投与においては2400mg／Kgの
LD50を示した。 CTPとNANAの縮合による５−アセトアミド
−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラ
クトノヌロサミン酸のシチジンモノホスフエート
を製造するための新規な方法における好ましい
CTP／NANAミリモル比は3.0〜5.0：1.0ミリモ
ルである。好ましいPHは8.5〜8.8である。好まし
くは、30℃〜40℃において１〜４時間反応を行う
のが好ましい。好ましい態様に従えば、チオカル
ボン酸及びニトロイミダゾール安定剤を、ｍMol
のCTP当たり、又は１の全容量当り0.5〜2.0ｍ
Ｍ使用する。 チオカルボン酸安定剤として非常に広範囲のチ
オカルボン酸又はメルカプトカルボン酸を使用す
ることができ、例えば式HS（CH2）oCOOH（式中
ｎは１〜５の整数である）の酸、例えばメルカプ
ト酢酸もしくはβ−チオプロピル酸、又はメチレ
ン基−CH2−がアルキル基により置換されている
前記の式の酸、例えば（＋）−β−チオ−α−メ
チルプロピオン酸、及び（＋）−β−チオ−α−
エチルプロピオン酸を使用することができる。 ニトロ−イミダゾール安定剤として、例えば、
次の式 （式中、ニトロ基は２−、４−、又は５−位にあ
り、そしてＲは水素、又は置換されている場合が
あるアルキル基、例えばヒドロキシエチルもしく
はβ−エチルチオエチル基である） で表わされる非常に広範囲のニトロイミダゾー
ル、及びニトロイミダゾール誘導体を使用するこ
とができる。典型的な、有用なニトロイミダゾー
ルは、２−ニトロ−イミダゾール、２−メチル−
５−ニトロ−１−ヒドロキシエチルイミダゾー
ル、及び２−メチル−５−ニトロ−１−β−エチ
ルチオエチルイミダゾールである。 チオカルボン酸は抗酸化剤として機能する。こ
れらは高い親水性と緩衝性を有するため、アルキ
ルチオールのごとき類似の化合物よりも好まし
い。ニトロイミダゾールは静細菌活性を有するた
め特に好ましい。 好ましくは、反応生成物（）はイオン交換ク
ロマトグラフイーによりそして／又はPH8.2〜8.6
の緩衝液、例えばトリエチルアミン／炭酸水素ナ
トリウム、もしくは0.5〜1.5ｍＭアンセニア水の
直線グラジエント溶出を用い、０℃〜６℃で行う
セフアデツクスカラムクロマトグラフイーにより
分離する。 この発明の方法においては、CMP−トランス
フエラーゼとも称する酵素CMP−アシルニユー
ラミネートシンサーゼ（EC2.7.7.43）は、無細胞
状態で、溶解した状態でもしくは適当な固体担体
に固定化して、又はエシエリヒア・コリCRC−
1482の細菌細胞中に存在する状態で使用すること
ができる。無細胞酵素は、公知の分離方法に従つ
て、例えばF.A.Troy等、J.Biol.Chem.249
（1974）156；I.K.Vijay、J.Biol.Chem.250
（1975）164；J.Haverkanp等、Hoppe−Seyler′s
Z.Physiol.Chem.360（1979）159に記載されている
ようにして、ホモジナイズした動物組織、例えば
カエル〔ラナ・エスクレンタ（Rana
Esculenta）〕の肝臓、子ウシの脳、ブタ、ヒツジ
又はウシの下顎腺から、前記のチオカルボン酸安
定剤として使用するのと同じタイプのメルカプト
カルボン酸又はチオカルボン酸、例えばβ−チオ
プロピオン酸又は（＋）−β−チオ−α−エチル
プロピオン酸の存在下で、全容量１当り0.5〜
2.0ｍＭの濃度において、PHを7.1〜7.2に保持しな
がら、０〜４℃の温度において、分離することが
でき、他方固定化酵素EC2.7.7.43を使用する場合
には、酵素を例えば適当な固体担体、例えばセフ
アロースに結合せしめることにより固定化を行
う。 好ましくは、固定化は、PH8.5〜9.0において、
適当な安定剤の存在下で行う。有用な安定剤は、
例えばブロモシアニド（CNBr）、並びに非常に
広範囲のチオカルボン酸安定剤、ニトロイミダゾ
ール、及びニトロイミダゾール誘導体であり、
CTP−NANA縮合の添加剤として前記したもの
である。ニトロイミダゾール及びその誘導体は抗
酸化安定剤として、及び殺菌剤として機能する。 なお、E.コリCRC1482は、ドイツ微生物保存
機関ゲゼルシヤフト・フユール・ビオテクノロギ
ツセ・フオルシユンクGMBH、ゲツチンゲン
（BRD）に、寄託番号No2904として1984年２月
27日に寄託された。 次に、この発明の説明のために例を記載する。 Ａ 製造方法 例 １ カエルの肝臓からの無細胞CMP−アシルニユ
ーラミネートシンサーゼにより触媒される、５
−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グ
リセロ−Ｄ−ガラクトノヌロサミン酸のシチジ
ンモノホスフエートの製造 カエル〔ラナ・エスクレンタ（Rana
Esculenta）〕の肝臓200ｇを、ウルトラトラクス
（Ultra−Turrax）ホモジナイザー中で、90秒間、
１ｍＭのβ−チオ−プロピオン酸を含有する同容
量の80ｍＭ Tris／HCl緩衝液（PH7.2）を用い
て、氷浴中で冷却しながら、ホモジナイズした。
このホモジネートを遠心分離（90000×Ｇ、30分
間）し、上清を集め、そしてさらに60分間90000
×Ｇにて遠心分離した。第２の上清液（約250ml）
を、１ｍＭのβ−チオ−プロピオン酸を含有する
80ｍＭのTris／HCl緩衝液（PH7.2）であらかじ
め平衡化したDEAE−セフアデツクスＡ−50カラ
ムに適用した。1000〜1200mlの同じ緩衝液で洗浄
した後、同じ緩衝液中０〜1.5M塩化ナトリウム
直線グラジエントを用いた。2500mlの溶出の後、
酵素を含有するすべての分画が溶出した。これら
を集め（〜600ml）、窒素のもとで限外過し、そ
して0.3〜0.6ユニツト／ml（１ユニツトの活性は
1μモルの／分を発生せしめる）の活性を有す
る最終容積（120ml）の液を得た。 酵素の20mlのアリコート（約8000ユニツトの酵
素を含有する）、CTP（４〜５ｍモル）、Ｎ−アセ
チルニウラミン酸（１ｍモル）を、２時間にわた
つて少しずつ、Tris緩衝液、Mg++、及びβ−チ
オ−プロピオン酸の溶液（200ml）に加えた。あ
との３化合物は、それぞれ0.4、0.04、及び
0.002Mの濃度で存在せしめた。混合物を36±0.2
℃で６時間インキユベートし、次に水で８倍に稀
釈し、そしてダウエツクス１×４、炭酸水素形、
50〜100メツシユ（0.6樹脂／ｍモルの化合物
）のカラムにをゆつくりと通した。まず１ｍＭ
水酸化アンモニウムで洗浄し、次に３〜４倍量の
0.02〜2.0M炭酸水素トリエチルアンモニウム
（PH7.8）を用いて溶出した。化合物（）を含有
する分画〔E.L.Kean等、Methods in Enymol.
８、208（1966）に従つて定量〕を一緒にし、そし
て凍結乾燥した。純粋な化合物（）は薄層クロ
マトグラフイー〔0.1mmセルロースシート（メル
ク）、96％エタノール／1M酢酸アンモニウム
（7.2：2.8）〕においてRf〜0.2であり、そして白色
〜淡黄色粉末は−10℃にて少なくとも１年間貯蔵
することができた。収率は、Ｎ−アセチルニユー
ラミン酸に対して85％であつた。 例 ２ ウシの下顎腺からの無細胞CMP−アシルニウ
ラミン酸シンサーゼにより触媒される化合物
（）の製造 ウシの下顎腺の凍結物から調製した薄片（0.5
Kg）を１の0.15M燐酸緩衝液（PH7.8）中で２
時間、ゆつくり振とうした。45000×Ｇにて遠心
分離した後、上清を、80ｍＭのTris／HCl緩衝液
（PH7.2）であらかじめ平衡化したDEAEセフアデ
ツクスＡ−50に適用した。カラムを同じ緩衝液で
洗浄した後、酵素を同じ緩衝液中０〜1.5M塩化
ナトリウムの直線グラジエントにより溶出した。
DEAE分画を、蛋白質当たり３〜５ｇの燐酸カル
シウムゲルを用いて処理した。０℃〜６℃におい
て0.5時間振とうした後（他のすべての操作もこ
の温度範囲において行う）、懸濁液を9500×Ｇに
て遠心分離し、沈澱を洗浄し（Tris緩衝液PH7.2
で２回、0.01M燐酸緩衝液PH7.6で２回）、そして
最後に、PH7.8の0.1M燐酸緩衝液により洗浄する
ことにより酵素をゲルから溶出した。 こうして得た酵素を用いて、例１に記載したよ
うにして化合物（）を製造した。こうして得ら
れた（収率78％）粗化合物（）を、炭酸水素型
ダウエツクス１×５クロマトグラフイーの後、
0.1ｍＭ水酸化アンモニウムを用いてセフアデツ
クスＧ−10又はＧ−25上でゲル過することによ
り最終的に精製した。カラムサイズは、0.3ミリ
モルの化合物（）の試料に対して３×120cmと
し、流速を10〜15ml／時とした。化合物（）を
含有する分画（収率60％）を一緒にし、凍結乾燥
し、そして−10℃にて貯蔵した。純粋な化合物
（）は〔α〕D＝−11.5゜（ｃ＝0.2、水）であり、
そしてE.L.Kean等、Bio 1.Chem.241、5643
（1966）に従う酸加水分解／チオバルビツル酸測
定により、98％以上の純度を有することが見出さ
れた。 例 ３ カエルの肝臓由来の、セフアロース4B上に固
定化された無細胞CMP−アシルニユーラミネ
ートシンサーゼにより触媒された、化合物
（）の製造 例１に記載した方法により純粋な酵素を調製し
た。酵素抽出物（５ml、５〜６ユニツト／mlを含
有）を100ｍＭ炭酸水素塩（PH8.2）により１：２
で稀釈し、そしてシアノゲンブロミドにより活性
化〔A.P.Corfield等、Biochem.J.177、１（1979）
に従つて〕したセフアロース4Bのスラリーと、
０℃において混合した。４℃にて12時間振とうし
た後、ゲルを過し、水、2N塩化ナトリウム、
及び水で洗浄した。ゲルを、0.6ｍＭの（±）β
−チオ−α−メチル−プロピオン酸及び殺菌剤と
しての２ｍＭの２−ニトロイミダゾールを含有す
る80ｍＭのTris／HCl中で、０℃〜６℃において
貯蔵した。こうして得られた固定化酵素（100ユ
ニツト）を用いて化合物（）の触媒的製造を行
つた。このために、1.5〜2.0の全容量中６ミリ
モルのＮ−アセチルニユーラミン酸、1.5ミリモ
ルのCTP、0.1ミリモルのTris、80ミリモルの
Mg++イオン、及び0.1ミリモルの（±）−β−チ
オ−α−メチル−プロピオン酸をPH8.2〜8.4、36
℃にて４時間インキユベートした。このインキユ
ベーシヨンはバイオゲン（Biogen）連続培養装
置（アメリカン・ステリリザー）において行い、
PHは２％水酸化ナトリウムを自動点加することに
より調整し、他方、Ｎ−アセチルニユーラミン酸
を最初の２時間に少量ずつ加えた。反応が完了し
た後、ゲルを去し、水で洗浄した。一緒にした
洗浄液を炭酸水素型のダウエツクス１×８カラム
に適用した。０〜1.5Mトリエチルアミン／
NaHCO3緩衝液（PH8.4）の直線グラジエントを
用いて流速0.6ml／分の速度で化合物（）を溶
出した（88％）。溶離液として１ｍＭアンモニア
水を用いる第２のセフアデツクＧ−25カラムクロ
マトグラフイーにより、純粋な化合物（）を不
純物CMPから分離し、凍結乾燥し、そして−10
℃にて貯蔵した。収率58％であつた。 〔α〕D＝−11.8（ｃ＝0.2、水）。試料を室温にて
10分間PH１に保持することにより、CMP及びＮ
−アセチルニユーラミン酸（1.0：1.0モル）が生
じ、これらはそれぞれ0.05及び0.5のRf値（溶剤
系及び条件は例１に記載したのと同じ）を有して
いた。 例 ４ E.コリCRC−1482株により触媒される化合物
（）の製造 培養物を反復して選択することにより、最高の
CMP−アシルニユーラミネートシンサーゼ活性
を有するE.コリ菌株を得た。培養菌は、全量１
当り15ｇの天寒、６ｇの酵母エキス、２ｇのグリ
シン、４ｇのグルコース、0.2ｇのβ−チオプロ
ピオン酸、４ｇの燐酸水素ナトリウム、２ｇの燐
酸二水素−ナトリウム、及び0.2ｇのトリメチル
ベンジルアンモニウムヒドロキシドを含有する培
地に増殖せしめた。すべての成分をあらかじめ20
〜50mlの水に溶解し、そして別々に殺菌した。
240rpmのロータリーセーカー〔ニユーブルンス
ウイツチ（new Brunswich）〕上で小試験を行つ
た。〔選択実験のために、細胞を抽出し、そして
化合物（）のバルク製造に関する次の項に記載
する方法によつて測定することにより培養物試料
（100ml）を試験した。〕 増殖細胞を10〜15倍の新鮮な培地に移植し、こ
れを反復することにより大規模製造のための移植
を行つた。最終発酵は、無菌空気を連続的に通気
しながら、20〜40容量において、36℃にて４時間
行つた。発泡を防止し又は抑制するために、この
段階で種々の消泡剤を使用し、そして５％水酸化
ナトリウムを連続的に添加することによりPHを
8.2〜8.3に保持した。培養が定常期に達したと
き、０℃にて9000×Ｇで遠心分離し、そして細胞
ペースト（約100〜150／10の発酵容器）を凍結
した。このペーストをアセトン（約1.5〜２／
100ｇのペースト）を０℃において加え、そして
生成した沈澱をフイルター上に集め、アセトンで
洗浄し、そして乾燥した。乾燥粉末をエタノー
ル／水（4.0：1.0）混合物中にスラリー化し、３
〜４時間撹拌し、90000×Ｇにて遠心分離し、そ
して同じ溶剤混合物（２×）で洗浄した。一緒に
した抽出液及び洗浄液から、例１に記載した方法
と同様にして純粋な化合物（）を得た。化合物
（）の収率は、イオン交換樹脂に吸着された合
計ヌクレオチドの15〜20％であつた。 Ｂ 療法的用途 例 １ CMP−NANAのラツトへの投与 この研究は、一定の体重を有する繁殖適齢のラ
ツト・チヤールスリバー（Charles River）16対
を用いて行つた。懐妊の３日目にこれらの動物を
無作為に４群に分けた。最初の２群には10％のカ
ゼインを含有する半合成飼料を与えた。食餌療法
を懐妊及び飼育の全期間にわたつて継続した。生
後14日目と21日目の間に、第２群及び第４群の子
動物を20mg／KgのCMP−NANAの（シグマ・チ
ミカル社）腹腔内投与により処置し、第１群及び
第３群を同量の生理的塩溶液で処置した。 21日目に、各群からの２匹ずつの雄性子動物を
穴の空いた板に固定し、そして20分間開放域実験
のもとにおいた。探索活動に関する期間を観察し
そして定量した。実験の終点において、動物を脱
血により殺し、これらの動物の脳を取り出し、そ
してガングリオサイド〔G.Tettamanti等、
Biochem.Biophys.Acta296、160〜170（1973）の
方法により抽出〕、及び糖蛋白〔B.Berra等、
Membranes in Tumor Growth、Galeotti等編、
Elsevier、81〜87頁、（1982）；F.Omodeo Sale
等、Cell Mol.Biol.27、455〜458頁、（1981）〕の
含量について試験した。 いずれの場合にもNANAの含量を測定した。 第１表は、正常蛋白飼料により飼育したラツト
の群及び低蛋白飼料により飼育したラツトの群に
おいて、CMP−NANAによる処置により、統計
的有意性をもつて、探索活動、並びに脳ガングリ
オサイド及び糖蛋白中のNANA含量が上昇した
ことが示された。 【表】 例 ２ カイニン酸により生じた障害後のラツトの脳ガ
ングリオサイドのレベル 体重180〜200ｇの雄性ラツト、チヤールスリバ
ーCDを20動物ずつから成る４群に分けた。第１
群は対照群とし、第２群は生理的塩溶液で処置
し、第３群はカイニン酸で処置し、そして第４群
はCMP−NANA（20mg／Kg／日、腹腔内）及び
カイニン酸で処置した。 CMP−NANAによる処置はカイニン酸による
処置の１週間前から始め、そして動物を殺すまで
続けた。 動物をペントバルビタール（60mg／Kgｉ・ｐ）
で麻酔し、そして次に線状体に注射することによ
りカイニン酸（1μの生理的溶液中2μｇ）で処
置した。 対照ラツトは同容量（1μ）の生理的溶液で
処置した。 ７日後、ラツトを殺し、線状体を取り出した。
５サンプルを一緒にして１回ずつの測定を行つ
た。ガングリオサイドを抽出し、そして前記の方
法により測定（NANA含量として）した。 第２表に結果を示す。CMP−NANAによる処
置により、カイニン酸により生ずる線状体中のガ
ングリオサイドレベルの低下が抑制されることを
示している。 【表】 例 ３ ラツトにおけるラベルCMP−NANAの吸着及
び分布 CMP−NANA〔９− 3H〕をNEN（ニユーイン
グランドニユークレア、6072ドライアイヒ、西
独）から入手した。 約18時間絶食せしめたラツトを、燐酸緩衝液に
溶解したCMP−NANAで、20mg／Kgｉ・ｍの投
与量（比活性1000ｍCi／mg）で処置した。30分、
１時間、２時間及び４時間後、動物を殺し、そし
てこの動物から肝臓、じん臓及び脳を摘出し、そ
して正確に重量を測定した。 前記の器官からの100μｇのサンプル及び同様
の血液サンプルをソルエン（Soluene）350（パツ
カード）に溶解し、そしてシンチレーテイング液
を加えて、液体シンチレーシヨン装置により計数
した。 測定を、キヤナル−キヤナル比法により定量化
した。第３表にすべての測定の平均結果を示す。
放射能は血中では急速に減少し、そして器官にお
いてはさらに徐々に減少した。脳は肝臓及びじん
臓以下の放射能レベルを有する。 【表】 例 ４ 培養細胞におけるCMP−NANA−誘導神経
（Neutrite）形成 ニユーロ（Neuro）−2a細胞（ATCC、ロツク
ビレ、米国）を標準的条件（104〜106細胞／100
mm皿）において接種した。12〜24時間後にCMP
−NANAを加えた。濃度は第４表に示す。出芽
の定量のためのインキユベーシヨン時間を24時間
とした。次に３％のグルタルアルデヒドを含有す
る緩衝塩溶液により細胞の固定を行つた。神経細
胞の増殖の定量的測定をザイスＤ−7082ミクレオ
−ビデオマートにより行つた。 神経細胞の分化のパラメーターとして神経出芽
を用いた。ホルマリンに固定したサンプルを、コ
ントラストを良くするために染色した。CMP−
NANAの添加量と細胞からの神経の出芽の数と
の間に密接な関係が観察された（第４表）。 【表】 第４表から、30μｇ／mlの濃度のCMP−
NANAが、培養細胞において、神経の出芽をも
との定常値の50％近く上昇せしめ、50μｇ／mlの
CMP−NANAは神経の出芽を２倍近くに上昇せ
しめることが明らかである。 例 ５ 試験管内におけるCMP−NANA性神経成熟 ニユーロ−2aニユーリン神経芽細胞腫
（ATCC−CCL−131）を、非必須アミノ酸、抗
生物質（５〜20mg％）及び炭酸水素塩（50〜100
mg％）を加えた、ウシ胎児血清（イルビンサイエ
ンテイフイツク、イルビン、カリフオルニア）を
含有する培地中で増殖せしめた。細胞を、コーニ
ングプラスチツク組織培養フラスコ上で増殖せし
めた。 測定用細胞を、コーニングプラスチツクペトリ
皿上CMP−NANAを含有する又は含有しない培
地中に入れた。試験管内神経成熟に対するCMP
−NANAの機能を試験するために、プレート時
又はプレートしてから24〜48時間後に培地中に
CMP−NANAを導入した。細胞プロセスの平均
数及び長さを、処理群当たり最低100細胞につき
反復して測定し、神経成熟の半定量的指数を得た
（第５表）。 第５表の成熟指数（Ｉ・Ｍ）はＩ・Ｍ＝Ｌ・Ｐ
×Ｎ・Ｐとして示され、ここで、 Ｌ・Ｐ・10＝約10μへのプロセスの長さ Ｎ・Ｐ＝プロセスの合計数 種々の濃度のCMP−NANAの効果を高解像力
ノマルスキー光学計で評価した。 【表】 第５表から、2μｇ／ml濃度のCMP−NANAは
Ｉ・Ｍ（前に定義した）を２倍にし、20μｇ／ml
のCMP−NANAは、標準培地について測定した
場合に比べて10倍高いＩ・Ｍ値を導く。 例 ６ 静脈投与用注射剤 活性成分 0.5mg 非発熱性マンニトール 50mg 燐酸二ナトリウム・12H2O ５mg 燐酸一カリウム １mg 注射用非発熱水 2.0mg 調製方法 活性成分、マンニトール及び無機塩を注射用無
菌水に溶解した。最終PHを6.5〜6.7とした。この
溶液に無菌窒素を通し、そしてポアーサイズ
0.45μのメンブランフイルターを通して過し、
そして２mlのガラスアンプルに充填した。 適当な凍結乾燥機中で、−58℃〜−60℃の凍結
温度を保持し、そして最後に35℃まで加熱するこ
とにより凍結乾燥を行つた。 次に、こうして得たアンプルを無菌窒素のもと
でシールした。生成物を、物理化学的性質、残留
湿度、CMP−NANA含量、再溶解性、無菌性、
発熱物質の不存在、及び非−毒性によりコントロ
ールした。 例 ７ 活性成分 1.0mg 非発熱性マンニトール 50mg 燐酸二ナトリウム・12H2O 0.5mg 燐酸一カリウム １mg 注射用非発熱水 2.0mg 例６と同様にして製剤化する。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ 次の式（） で表わされる５−アセトアミド−３，５−ジデオ
    キシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクトノヌロサミン
    酸のシチジンモノホスフエートを活性物質として
    含有することを特徴とする中枢神経系及び末梢神
    経系における神経刺激の障害に関する病理的状態
    の療法において使用するための医薬組成物。 ２ 注射可能な形である特許請求の範囲第１項記
    載の医薬組成物。 ３ 凍結乾燥された形で活性物質を含有する特許
    請求の範囲第１項又は第２項記載の医薬組成物。 ４ リポゾームとしての形で又は特異的な親脂性
    担体に導入された形で投与される特許請求の範囲
    第１項又は第２項記載の医薬組成物。 ５ 次の組成、すなわち、 活性成分 0.025〜0.5w／ｖ％ 非発熱性マンニトール 1.0〜5.0w／ｖ％ 燐酸二ナトリウム・12H2O 0.1〜0.5w／ｖ％ 燐酸−カリウム 0.02〜1.0w／ｖ％ 非発熱性注射用水 全体が２mlになる量 を含んで成ることを特徴とする特許請求の範囲第
    １項〜第３項のいずれか１項に記載の医薬組成
    物。
JP3634184A 1983-03-01 1984-02-29 ５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−ｄ−グリセロ−ｄ−ガラクトノヌロサミン酸のシチジンモノホスフエ−ト含有医薬組成物 Granted JPS606618A (ja)

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IT83341/83A IT1175061B (it) 1983-03-01 1983-03-01 Applicazione terapeutica del citidin monofosfato dell'acido 5-acetamido-3,5-dideossi-d-glicero-d-galattononulo saminico
IT83341/A/83 1983-03-01
IT83371/A/83 1983-04-20

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JP1215137A Division JPH0276894A (ja) 1983-03-01 1989-08-23 ５―アセトアミド―３，５―ジデオキシ―ｄ―グリセロ―ｄ―ガラクトノヌロサミン酸のシチジンモノホスフェートの製造方法

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JPS606618A JPS606618A (ja) 1985-01-14
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IT8383341A0 (it) 1983-03-01
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