JPH0276894A - ５―アセトアミド―３，５―ジデオキシ―ｄ―グリセロ―ｄ―ガラクトノヌロサミン酸のシチジンモノホスフェートの製造方法 - Google Patents

５―アセトアミド―３，５―ジデオキシ―ｄ―グリセロ―ｄ―ガラクトノヌロサミン酸のシチジンモノホスフェートの製造方法

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JPH0276894A
JPH0276894A JP1215137A JP21513789A JPH0276894A JP H0276894 A JPH0276894 A JP H0276894A JP 1215137 A JP1215137 A JP 1215137A JP 21513789 A JP21513789 A JP 21513789A JP H0276894 A JPH0276894 A JP H0276894A
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Pietro Miccoli
ピエトロ　ミッコリ
Enio Decorte
エニオ　デコルテ
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CRC Compagnie di Ricerca Chimica SpA
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 この発明は、中枢神経系（ＣＮＳ）及び末梢神経系（Ｐ
ＮＳ）における神経刺激の障害に関連する病理的状態の
療法において使用するための医薬組成物の活性成分とし
て有用な５−アセ１−アミド−３，５に関する。
すでに知られているように、次の式（Ｉ）ぺＨｚ で示される５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−５
−グリセロ−Ｄ−ガラクトノヌロサミン酸（５−ａｃｅ
ｔａｍｊｄｅ　−３、５−ｄｉｄｅｏｘｙ　−５−ｇｌ
ｙｃｅｒ。
−Ｄ　−ｇａｌａｃｔｏｎｏｎｕｌｏｓａｍｉｎｉｃ　
ａｃｉｄ　；　ＮＡＮＡ又はＮｅｕＡｃ）のシチジンモ
ノホスフェート（ｃｙｔｉｄｉｎｅ頂ｏｎｏ−ｐｈｏｓ
ｐｈａｔｅ　；　ＣＭＰ）　Ｃ式（Ｉ）の化合物をＣＭ
Ｐ−ＮＡＮＡ、又はＣＭＰ−ＮｅｕＡｃと略す〕は、５
−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−
Ｄ−ガラクトノヌロサミン酸〔通常、Ｎ−アセチル−ニ
ューラミン酸（Ｎ　−ａｃｅｔｙｌ　−ｎｅｕｒａＩＩ
Ｉｉｎｉｃ　ａｃｉｄ）と称しＮＡＮＡと略す〕の生物
学的活性形であり、そしてこの化合物は生物体中の種々
の合成過程の生成物である。
ＮＡＮＡは、膜に見出される分子（ガングリオキサイド
及び糖蛋白）の生理的活性部分であり、これは一般に、
細胞が機能するために必要とされるすべての情報を受領
しそして伝達することができるように構成されている（
例えば、ＲｏＷ、Ｔｅａｎｌｏｚ等、Ｔｈｅ　Ｂｉｏｌ
ｏｇｉｃａｌ　Ｒｏｌｅ　ｏｆ　５ｉａｌｉｃ　Ａｃ１
ｄ　ａｔ　ｔｈｅＳｕｒｆａｃｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｃｅ
１ｌ、　ｉｎ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｏｌｅｓ　ｏ
ｆＳｉａｌｉｃ　Ａｃ１ｄ、　Ａ、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ
等編、プレナムプルス、２０１〜２２７頁、１９７６年
参照のこと）。
次の反応式、 に従って、生化学的方法によりＣＭＰ−ＮＡＮＡを製造
する方法も、例えばＳ、Ｒｏｓｅｍａｎ、　Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、Ａｃ１ｄ、Ｓｃｉ。
ＵＳ　４８．４３７−４１（Ｉ９６２）　；　Ｎ、５ｈ
ａｒｏｎ、　ＣｏｍｐｌｅｘＣａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ
ｓ、＾ｄｄｉｓｏｎ−Ｗｅｓｌｅｙ　、出版、ロンドン
ーアムステルダム、１５０〜１５３頁、１９７９年にお
いてよく知られている。
Ｂ、Ｂｅｎｄｉａｋ等、Ｃａｎ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、
　５９．１７１〜１８０（Ｉ９８１）、及び＾、Ｐｒｅ
ｔｉ等、Ｊ、Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ、　３５＋　２８１〜
２９６（Ｉ９８０）から、ＣＭＰ−ＮＡＮＡは酵素シア
リルトランスフェラーゼの生理的基質であり、この酵素
は生物膜の前記のサブユニット、例えばガングリオサイ
ド及び糖蛋白へのＣＭＰ−ＮＡＮＡの導入に寄与するこ
ともすでに知られている。
前記の反応において示されるように、活性形ＮＡＮＡの
合成の間にＣＴＰ中の２個の高反応性結合のエネルギー
が消費される。他方、Ｎ−アセチルニューラミン酸はこ
の活性形においてのみ膜に導入され得る〔例えば、八、
Ａｒｃｅ等、Ａｒｃｈ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ月玉、５２〜５Ｂ（Ｉ９６６）参照〕。
膜中での成分の正常な代謝回転のほかに、膜の機能はＮ
ＡＮＡ残基の脱着の反復と関連していることは重要であ
る。実際に、ＮＡＮＡが膜表面に付与する負電荷の変化
により膜の機能的活性が変化する（例えば、ＲｏＪｂｅ
ｒｎａｃｋｉ等、Ｔｈｅ　Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔ
ｅｓＶｏｌ、ＩＶ　ｐａｒｔ　Ｂ、　Ｍ、１．Ｈｏｒｏ
ｗｉｔｚ　Ｅ、、アカデミツクプレス、２５６〜２６１
頁、１９Ｂ２　；　Ｓ、Ｎｇ等、Ｔｈｅ　Ｎａｔｕｒａ
ｌＯｃｃｕｒｅｎｃｅ　ｏｆ　５ｉａｌｔｃ　Ａｃ１ｄ
、　ｉｎ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｏｌｅｓｏｆ　５
ｉａｌｉｃ　Ａｃ１ｄ、　Ａ、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ等編
、プレナムプレス、５９〜８６頁、１９７６参照）。
さらに、神経不調の治療のために、ガングリオサイドを
、天然分離源から、例えばモノ−、ジー、トリー、及び
テトラ−Ｎ−アセチルニューラミン酸ガングリオサイド
を含有する咄乳動物の神経組織からの抽出により得られ
る混合物として使用することも提案されている（イタリ
ア特許出願第２６３２３八／７３号参照のこと）。
しかしながら、この療法は次のような幾つかの、　　欠
点を有する。
（ａ）ガングリオサイドの混合物の組成をコントロール
することは困難であり、そして複雑な装置を必要とする
。
（ｂ）ガングリオサイドのような生物重合体の化学的安
定性は低いので医薬としての商品寿命が限定され、この
ために治療上の危険、例えば種々のコントロールできな
い副作用が生ずる。
（Ｃ）ガングリオサイドは高分子量（約１５００）の生
物重合体であるので抗原性を有する（例えば、Ｊ、Ｔ、
Ｒｉｃｋ等、Ｄｅｖｅｌｏｐ、Ｍｅｄ、Ｃｈｉｌｄ　Ｎ
ｅｕｒｏｌ、２２＋　７１９〜７２４．１９８０を参照
のこと）。
今まで、ＣＭＰ−ＮＡＮＡは、中枢神経系（ＣＮＳ）及
び末梢神経系（ＰＮＳ）における神経刺激の障害に関連
する病理的状態の療法のための医薬組成物の形では使用
されていなかった。
今や、ＣＭＰ−ＮＡＮＡが、中枢神経系又は末梢神経系
の障害、例えばＣＮＳ又はＰＮＳレベルでの神経伝達の
変調；末梢神経の外傷による又は毒による損傷；ハンチ
イントン・コレア（ＩＩｕｎＬｉｎｇｔｏｎ’５Ｃｏｒ
ｅａ）、老人性痴呆のごとき病的状態による記憶障害；
動脈硬化性又は心臓性の錯乱状態；眼球後部神経炎；眼
球運動の麻痺；三叉神経の神経痛；顔面神経又はベル（
Ｂｅｌｌ）神経の麻痺；ガルシン（Ｇａｒｃｉｎ）症候
群；グイラン・バレ（Ｇｕｉｌｌａｎ　Ｂａｒｒｅ）症
候群；ラジオライト（ｒａｄｉｏｌｉｔｅｓ）　；糖尿
病性及びアルコール性多発性神経炎；産科的麻痺；運動
性神経疾患；筋萎縮性側索硬化症；を髄病性筋萎縮；進
行性球麻痺；激しい筋無力症；筋ジストロフィー；錯乱
状態のような意識障害；脳しんとう一頭蓋外傷、脳血管
障害、及び血栓症の結果の治療のために非常に価値があ
ることが見出された。
サラに、ＣＭＰ−ＮＡＮＡが、シチジントリホスフェー
ト（ＣＴＴ）とＮ−アセチルニュラミン酸（ＮＡＮＡ）
どの酵素ＣＭＰ−アシルニュラミネートシンサーゼ（Ｃ
ＭＰ−ａｃｙｌｎｕｒａｍｉｎａｔｅ　５ｙｎｔｈａｓ
ｅ（ＥＣ２，７，７，４３）　）により触媒される縮合
に基礎を置く２つの方法により得られることが見出され
た。
第１の新規な方法（Ａ）においては、ＣＴＰとＮＡＮＡ
との縮合が、種々の分離源からの、無細胞型の、溶解し
た、又は適当な固体に固定された酵素ＣＭＰ−アシルニ
ューラミネートシンサーゼ（ＥＣ２，７，７，４３）に
より触媒され、これは酵素の蛋白性構造と固体担体との
化学結合を可能にするＢｒＣＮ、チオカルボン酸安定剤
及び／又はニトロイミダゾール安定剤の存在下で行われ
る。
第２の新規な方法（Ｂ）においては、ＣＴＰとＮＡＮＡ
との縮合がＥ、　２ｉ（Ｅ、皿旦）　ＣＲＣ１４８２か
ら分離された酵素ＣＭＰ−アシルニューラミネートシン
サーゼ（ＥＣ２，７，７，４３）により触媒される。
第２の方法（Ｂ）は、場合によってはさらに、チオカル
ボン酸安定剤及び／又はニトロイミダゾール安定剤の存
在下で、そして／又は方法（Ａ）の条件下で行うことも
できる。
従って、この発明の対象の１つは、中枢神経系及び末梢
神経系における神経刺激の障害に関連する病理的状態の
療法において使用するための、５−アセトアミド−３，
５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクトノヌロサ
ミン酸のシチジンモノホスフェートを含んでなる医薬組
成物である。
この発明の他の対象は、酵素ＣＭＰ−アシルニューラミ
ネートシンサーゼ（ＥＣ２，７，７，４３）により触媒
される、シチジントリホスフェート（ＣＴＰ）とＮ−ア
セチルニューラミン酸（ＮＡＮＡ）との縮合によるＣＴ
Ｐ−ＮＡＮＡの製造方法であって、（Ａ）３ｉ縮合をチ
オカルボン酸安定剤及び／又はニトロイミダゾール安定
剤の存在下で行うことを特徴とする方法、及び（Ｂ）該
縮合を上ユ２４Ｊ−ＣＩ？ＣＩ４８２株から分離された
酵素ＣＭＰ−アシルニューラミネートシンサーゼ（ＥＣ
２，７，７，４３）により行うことを特徴とする方法で
ある。
この発明は、ガングリオシドの治療的使用に関する問題
のほとんどを回避すると共に、次のような利点を有する
。
（ａ　）　ＮＡＮＡの活性形、すなわちＣＭＰ−ＮＡＮ
Ａは、生物細胞代謝回転がこの分子の多量の供給を必要
とする場合、例えば神経の再生の場合に、特にある種の
病理的状態にある生物に直接供給される。事実、ＮＡＮ
Ａが導入されるガングリオサイド及び糖蛋白質は、すべ
ての細胞間認識現象、及び細胞と環境との間のいわゆる
社会的細胞挙動に関連する。
（ｂ　）　ＣＭＰ−ＮＡＮＡは化学的に良く特定された
分子であって、生体外での酵素的合成を介して最も高純
度において入キすることができる。
（Ｃ）　ＣＭＰ−ＮＡＮＡの化学的純度及び生物的活性
レベルは、簡単な化学的試験及び生体外での酵素的方法
を用いて、決定し又は制御することができる（例えば、
Ｒ，Ｗ、Ｌｅｅｄｅｅｎ等、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎ
ｄ　Ａｎａｌｙｓｉｓｏｆ　　５ｉａｌｉｃ　　Ａｃ１
ｄ、　　ｉｎ　　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　　Ｒｏｌｅｓ
　　ｏｆ　　５ｉａｌｉｃＡｃｉｄ、　Ａ、Ｒｏｓｅｎ
ｂｅｒｙ等編、プレナムプレス１〜４８頁、１９７６）
。
（ｄ　）　ＣＭＰ−ＮＡＮＡが生体内でガングリオサイ
ド及び糖蛋白質に導入されることが明確に証明されてい
る（例えば、Ｔｈｅ　Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｔ
　Ｖｏｌ、ＩＶ　ｐａｒｔＢ、Ｍ、Ｔ、）１ｏｒｏｗｉ
ｔｚｌｉ、アカデミンクプレス、１９８２　；Ｅ、Ｊ、
ＭｃＧｕｉｒｅ、　　八ｎａｂｏｌｉｃ　　Ｒｅａｃｔ
ｉｏｎｓ　　ｉｎｖｏｌｖｉｎｇＳｉａｌｉｃ　Ａｃ１
ｄｓ＋　ｉｎ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｏｌｅｓ　ｏ
ｒ　５ｉａｌｉｃ八ｃｉｄｓ、　Ａ、Ｒｏｓｅｎｂｅｒ
ｙ等編、ブレナムブレス〜１５８頁、１９７６を参照の
こと）。
（　ｅ　）　ＣＭＰ−ＮＡＮＡは、ガングリオシドに比
べて実質的に小形であり、全く抗原性を有しない。ガン
グリオシド又は関連高分子については抗原性が知られて
いる。
（　ｆ　）　ＣＭＰ−ＮＡＮＡは、内性分子（ｅｎｄｏ
ｇｅｎｏｕｓ　ｍｏｌｅｃｕｌｅ）であり、ヒトに対す
る毒性が非常に低い。３０匹ずつの２群及び対照の２群
からなる、体重２０±１ｇのアルピノラットについて発
明者等が得た結果は、腹腔内投与においては９００■／
ｋｇ、経口投与においては２４００■／ｋｇのＬＤ，。
を示した。
ＣＴＰとＮＡＮＡの縮合による５−アセトアミド−３、
５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクトノヌロサ
ミン酸のシチジンモノホスフェートを製造するための新
規な方法における好ましいＣＴＰ／ＮＡＮＡミリモル比
は３．０〜５．ｏ：ｔ．ｏミリモルである。好ましいｐ
＋＋は８．５〜８．８である。好ましくは、３０℃〜４
０℃において１〜４時間反応を行うのが好ましい。好ま
しい態様に従えば、チオカルボン酸及びニトロイミダゾ
ール安定剤を、ｍＭｏｌのＣＴＰ当たり、又は１ｌの全
容量当り０．５〜２．０１使用する。
チオカルボン酸安定剤として非常に広範囲のチオカルボ
ン酸又はメルカプトカルボン酸を使用することができ、
例えば式ＨＳ（ＣＨｚ）　、ｌＣＯＯＩＩ　（式中ｎは
１〜５の整数である）の酸、例えばメルカプト酢酸もし
くはβ−チオプロピオン酸、又はメチレンｉ−Ｃ１１□
−がアルキル基により置換されている前記の式の酸、例
えば（＋）−β−チオ−α−メチルプロピオン酸、及び
（＋）−βー千オーαーエチルプロピオン酸を使用する
ことができる。
ニトロ−イミダゾール安定剤として、例えば、次の式 （式中、ニトロ基は２−、４−、又は５−位にあり、そ
してＲは水素、又は置換されている場合があるアルキル
基、例えばヒドロキシエチルもしくはβ−エチルチオエ
チル基である） で表わされる非常に広範囲のニトロイミダゾール、及び
ニトロイミダゾール誘導体を使用することができる。典
型的な、有用なニトロイミダゾールは、２−ニトロ−イ
ミダゾール、２−メチル−５−二トロー１−ヒドロキシ
エチルイミダゾール、及ヒ２ーメチルー５−二トロー１
−β−エチルチオエチルイミダゾールである。
チオカルボン酸は抗酸化剤として機能する。これらは高
い親水性と緩衝性を有するため、アルキルチオールのご
とき類似の化合物よりも好ましい。
ニトロイミダゾールは静細菌活性を有するため特に好ま
しい。
好ましくは、反応生成物（Ｉ）はイオン交換クロマトグ
ラフィーによりそして／又はｐＨ８．２〜８、６の緩衝
液、例えばトリエチルアミン／炭酸水素ナトリウム、も
しくは０．　５〜１．５ｍＭアンセニア水の直線グラジ
ェント溶出を用い、０℃〜６℃で行うセファデックスカ
ラムクロマトグラフィーにより分離する。
この発明の方法においては、ＣＭＰ−４ランスフエラー
ゼとも称する酵素ＣＭＰーアシルニューラミネートシン
サーゼ（ＥＣ　２．７．７．４３）は、無細胞状態で、
溶解した状態でもしくは適当な固体担体に固定化して、
又はエシェｍ・２ｉ．ＣＩＩＣ−１４８２の細菌細胞中
に存在する状態で使用することができる。無細胞酵素は
、公知の分離方法に従って、例えばＦ、Ａ、Ｔｒｏｙ等
、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２４９（Ｉ９７４）１５
６　；１、に、Ｖｉｊａｙ、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ
、　２５０（Ｉ９７５０６４；　Ｊ。
１ａｖｅｒｋａｎｐ等、ｌ１ｏｐｐｅ−５ｅｙｌｅｒ’
ｓ　Ｚ、Ｐｈｙｓｉｏｌ、Ｃｈｅｍ。
３６０　（Ｉ９７９）　１５９に記載されているように
して、ホモジナイズした動物組織、例えばカエル〔立去
・１、、’）、９Ｌｉ７ノー（ハｎａ　Ｅｓｃｕｌｅｎ
ｔａ）　）の肝臓、子ウシの脳、ブタ、ヒツジ又はウシ
の下顎腺から、前記のチオカルボン酸安定剤として使用
するのと同じタイプのメルカプトカルボン酸又はチオカ
ルボン酸、例えばβ−チオプロピオン酸又は（＋）−β
−チオ−α−エチルプロピオン酸の存在下で、全容量１
ｌ当り０．５〜２．０ｍＭの濃度において、ｐＨを７．
１〜７．２に保持しながら、０〜４℃の温度において、
分離することができ、他方固定化酵素ＥＣ２，７，７，
４３を使用する場合には、酵素を例えば適当な固体担体
、例えばセファロースに結合せしめることにより固定化
を行う。
好ましくは、固定化は、ｐ）１８．５〜９．０において
、適当な安定剤の存在下で行う。有用な安定剤は、例え
ばブロモシアニド（ＣＮＢｒ）、並びに非常に広範囲の
チオカルボン酸安定剤、ニトロイミダゾール、及びニト
ロイミダゾール誘導体であり、ＣＴＰ−ＮＡＮ＾縮合の
添加剤として前記したものである。ニトロイミダゾール
及びその誘導体は抗酸化安定剤として、及び殺菌剤とし
て機能する。
なお、ヱユ２ｉＣＲＣ１４８２は、ドイツ微生物保存機
関ゲゼルシャフト・フユール・ビオテクノロギッセ・フ
ォルシュンクＧＩＩＩＢ１１、ゲッチンゲン（ＢＲＤ）
に、寄託番号Ｎｏ、２９０４として１９８４年２月２７
日に寄託された。
次に、この発明の説明のために例を記載する。
Ａ、製造方決 カエル〔ラナ・エスクレンタ（Ｒａｎａ　Ｅｓｃｕｌｅ
ｎｔａ）　）の肝Ｖ＆２００ｇを、ウルトラトラクス（
０１ｔｒａ−Ｔｕｒｒａｘ）ホモジナイザー中で、９０
秒間、１ｍＭのβ−チオ−プロピオン酸を含有する同容
量の８０ａ＋Ｍ　Ｔｒｉｓ／ＨＣｊ！緩衝液（ｐＨ７，
２＞を用いて、水浴中で冷却しながら、ホモジナイズし
た。このホモジネートを遠心分離（９００００ｘ　Ｇ　
、　３０分間）し、上清を集め、そしてさらに６０分間
９００００Ｘ　Ｇにて遠心分離した。第２の上清液（約
２５Ｍ）を、１ｍＭのβ−チオ−プロピオン酸を含有す
る８０ｍＭのＴｒｉｓ／ＩＩＣｊｌ！緩衝液（ｐＨ７，
２）であらかじめ平衡化したＤ［ＡＥ−セファデックス
Ａ−５０カラムに適用した。１０００〜１ｌ００ｒｎｌ
の同じ緩衝液で洗浄した後、同じ緩衝液中０〜１．５Ｍ
塩化ナトリウム直線グラジェントを用いた。
２５００ｍｆｆ１の溶出の後、酵素を含有するすべての
分画が溶出した。これらを集め（〜６００ｄ）　、窒素
のもとて限外濾過し、そして０．３〜０．６ユニツト／
ｄ（Ｉユニツトの活性は１μモルの１７分を発生せしめ
る）の活性を有する最終容積（Ｉ２０ｍｌ）の液を得た
。
酵素の２０ｍ１のアリコート（約８０００ユニツトの酵
素を含有する）、ｃ’ｒｐ　（４〜５ｍモル）、Ｎ−ア
セチルニララミン酸（Ｉｒｎモル）を、２時間にわたっ
て少しずつ、Ｔｒｉｓ緩衝液、Ｍｇ４＋、及びβ−チオ
−プロピオン酸の溶液（２００ｄ）に加えた。
あとの３化合物は、それぞれ０．４　、０．０４、及び
０．００２Ｍの濃度で存在せしめた。混合物を３６士０
．２℃で６時間インキュベートし、次に水で８倍に稀釈
し、そしてダウエックス１×４、炭酸水素形、５０〜１
００メツシユ（０，６ｆｆｉ樹脂／ｍモルの化合物■）
のカラムにゆっくりと通した。まず１ｍＭ水酸化アンモ
ニウムで洗浄し、次に３〜４倍量の０．０２〜２．０Ｍ
炭酸水素トリエチルアンモニウム（ｐＨ７，８）を用い
て溶出した。化合物（Ｉ）を含有する分画（Ｅ、Ｌ、Ｋ
ｅａｎ等、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｙｍｏｌ。
主、　２０８（Ｉ９６６）に従って定量〕を一緒にし、
そして凍結乾燥した。純粋な化合物（Ｉ）は薄層クロマ
トグラフィー（０，１ｍａ＋セルロースシート（メルク
）、９６％エタノール／ＬＭ酢酸アンモニウム（７，２
：２．８））においてＲｆ〜０．２であり、そして白色
〜淡黄色粉末は一１０℃にて少なくとも１年間貯蔵する
ことができた。収率は、Ｎ−アセチルニューラミン酸に
対して８５％であった。
ウシの下顎腺の凍結物から調製した薄片（０，５ｋｇ）
を１１の０．１５Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７，８）中で２時
間、ゆっくり振とうした。４５０００Ｘ　Ｇにて遠心分
離した後、上清を、８０ｍＭのＴｒｉｓ　／　）Ｉｃ　
ｌ　Ｑ衝液（ｐＨ７，２）であらかじめ平衡化したＤＥ
ＡＥセファデックスＡ−５０に適用した。カラムを同じ
緩衝液で洗浄した後、酵素を同じ緩衝液中０〜１．５Ｍ
塩化ナトリウムの直線グラジェントにより溶出した。
ＤＥＡＥ分画を、蛋白質当たり３〜５ｇの燐酸カルシウ
ムゲルを用いて処理した。０℃〜６℃において０．５時
間振とうした後（他のすべての操作もこの温度範囲にお
いて行う）、懸濁液を９５００ＸＧにて遠心分離し、沈
澱を洗浄しくＴｒｉｓ緩衝液ｐＨ７，２で２回、０．０
１Ｍ燐酸緩衝液ｐＨ７，６で２回）、そして最後に、ｒ
＋８７．８の０．１Ｍ燐酸緩衝液により洗浄することに
より酵素をゲルから？容゛出した。
こうして得た酵素を用いて、例１に記載したようにして
化合物（Ｉ）を製造した。こうして得られた（収率７８
％）粗化合物（Ｉ）を、炭酸水素型ダウエックス１×５
クロマトグラフイーの後、０．１ｍＭ水酸化アンモニウ
ムを用いてセファデックスＧ−１０又はＧ−２５上でゲ
ル濾過することにより最終的に精製した。カラムサイズ
は、０．３ミリモルの化合物（Ｉ）の試料に対して３Ｘ
１ｌ０ｃｍとし、流速を１０〜１５ｒＩＴ１／時とした
。化合物（Ｉ）を含有する分画（収率６０％）を−緒に
し、凍結乾燥し、そして−１０℃にて貯蔵した。純粋な
化合物（Ｉ）は〔α）　ｏ　＝１１．５°　（ｃ＝０．
２、水）であり、そしてＥ、Ｌ、Ｋｅａｎ等、旧ｏ　ｌ
、　Ｃｈｅｍ、、￥１１．．５６４３（Ｉ９６６）に従
う酸加水分解／チオバルビッル酸測定により、９８％以
上の純度を有することが見出された。
例１に記載した方法により純粋な酵素を調製した。酵素
抽出物（５戚、５〜６ユニツ）　／　ｍｌを含有）を１
００ｍＭ炭酸水素塩（ｐｕｓ、２）により１：２で稀釈
し、そしてシアノゲンプロミドにより活性化〔八、Ｐ、
Ｃｏｒｆ　１ｅｌｄ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、１７７、
　Ｈ１９７９）に従って〕したセファロース４Ｂのスラ
リーと、０℃において混合した。４℃にて１ｌ２時間振
うした後、ゲルを濾過し、水、２Ｎ塩化ナトリウム、及
び水で洗浄した。ゲルを、０．６ｍＭの（±）β−チオ
−α−メチル−プロピオン酸及び殺菌剤としての２ｍＭ
の２−ニトロイミダゾールを含有する８０ｍＭのＴｒｉ
ｓ／ｌＩＣ１！、中で、０℃〜６℃において貯蔵した。
こうして得られた固定化酵素（Ｉ００ユニツト）を用い
て化合物（Ｉ）の触媒的製造を行った。このために、１
，５〜２．０２の全容量中６ミリモルのＮ−アセチルニ
ューラミン酸、１．５ミリモル０ＣＴＰ。
０．１ミリモルのＴｒｉｓ、　８０ミリモルのＭｇ＋イ
オン、及び０．１ミリモルの（±）−β−チオ−α−メ
チル−プロピオン酸をｐＨ８，２〜８．４．３６℃にて
４時間インキュベートした。このインキュベーションは
バイオゲン（Ｂｔｏｇｅｎ）連続培養装置（アメリカン
・ステリリザー）において行い、ｐＨは２％水酸化ナト
リウムを自動点加することにより調整し、他方、Ｎ−ア
セチルニューラミン酸を最初の２時間に少量ずつ加えた
。反応が完了した後、ゲルを濾去し、水で洗浄した。−
緒にした洗浄液を炭酸水素型のダウエックス１×８カラ
ムに適用した。０〜１．５Ｍトリエチルアミン／ＮａＨ
ＣＯ３緩衝液（ｐＨ８，４）の直線グラジェントを用い
て流速０．６ｄ／分の速度で化合物（Ｉ）を溶出した（
８８％）。溶離液として１ｍＭアンモニア水を用いる第
２のセファデックスＧ−２５カラムクロマトグラフイー
により、純粋な化合物（Ｉ）を不純物ＣＭＰから分離し
、凍結乾燥し、そして−１０℃にて貯蔵した。収率５８
％であった。
〔α）ｏ＝１１．８°　（ｃ　＝　０．２、水）。試料
を室温にて１０分間ｐｉｌｌに保持することにより、Ｃ
ＭＰ及びＮ−アセチルニューラミン酸（Ｉ，０：１．０
モル）が生じ、これらはそれぞれ０．０５及び０．５の
Ｒｆ値（溶剤系及び条件は例１に記載したものと同じ）
を有していた。
合物（Ｉ）の製造 培養物を反復して選択することにより、最高のＣＭＰ−
アシルニューラミネートシンサーゼ活性を有するり、２
ｌ菌株を得た。培養菌は、全量１ｌ当り１５ｇの天窓、
６ｇの酵母エキス、２ｇのグリシン、４ｇのグルコース
、０．２ｇのβ−チオプロピオン酸、４ｇの燐酸水素ナ
トリウム、２ｇの燐酸二水素−ナトリウム、及び０．２
ｇのトリメチルベンジルアンモニウムヒドロキシドを含
有スる培地に増殖せしめた。すべての成分をあらかじめ
２０〜５０ｍ１の水に溶解し、そして別々に殺菌した。
２４０ｒｐｍのロータリーセーカー〔ニューブルンスウ
インチ（ｎｅｉｖ　Ｂｒｕｎｓ讐１ｃｈ）　）上で小試
験を行った。
〔選択実験のために、細胞を抽出し、そして化合物（Ｉ
）のバルク製造に関する次の項に記載する方法によって
測定することにより培養物試料（Ｉ００ｄ）を試験した
。〕 増殖細胞を１０〜１５倍の新鮮な培地に移植し、これを
反復することにより大規模製造のための移植を行った。
最終発酵は、無菌空気を連続的に通気しながら、２０〜
４０容量において、３６℃にて４時間行った。発泡を防
止し又は抑制するために、この段階で種々の消泡剤を使
用し、そして５％水酸化ナトリウムを連続的に添加する
ことによりｐＨを８．２〜８．３に保持した。培養が定
常期に達したとき、０℃にて９０００ＸＧで遠心分離し
、そして細胞ペースト（約１００〜１５０／１０　ｆの
発酵容器）を凍結した。このペーストにアセトン（約１
．５〜２２／１００ｇのペースト）を０℃において加え
、そして生成した沈澱をフィルター上に集め、アセトン
で洗浄し、そして乾燥した。乾燥粉末をエタノール／水
（４，０：１．０）混合物中にスラリー化し、３〜４時
間攪拌し、９００００　Ｘ　Ｇにて遠心分離し、そして
同じ溶剤混合物（２×）−で洗浄した。−緒にした抽出
液及び洗浄液から、例１に記載した方法と同様にして純
粋な化合物（Ｉ）を得た。化合物（Ｉ）の収率は、イオ
ン交換樹脂に吸着された合計ヌクレオチドの１５〜２０
％であった。
Ｂ、庶汰町朋途 肛　Ｃ門Ｐ−ＮへＮＡのう・ントへの７１　参−１１こ
の研究は、一定の体重を有する繁殖適齢のラット・千ャ
ールスリバ−（Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅｒ）　１６対
を用いて行った。懐妊の３日目にこれらの動物を無作為
に４群に分けた。最初の２群には１０％のカゼインを含
有する半合成飼料を与えた。食餌療法を懐妊及び飼育の
全期間にわたって継続した。生後１４日目と２１日目の
間に、第２群及び第４群の子動物を２０ｍｇ／ｋｇのＣ
ＭＰ−ＮＡＮＡの（シグマ・チミカル社）腹腔内投与に
より処置し、第１群及び第３群を同量の生理的塩溶液で
処置した。
２１日目に、各群からの２匹ずつの雄性子動物を穴の空
いた板に固定し、そして２０分間開放域実験のもとにお
いだ。探索活動に関する期間を観察しそして定量した。
実験の終点において、動物を脱血により殺し、これらの
動物の脳を取り出し、そしてガングリオサイド（Ｇ、Ｔ
ｅｔｔａｍａｎｔｉ等、Ｂｉｏｃｈｅ＋＋＋。
Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ　２９６．１６０〜１７０（
Ｉ９７３）の方法により抽出〕、及び糖蛋白（Ｂ、Ｂｅ
ｒｒａ等、Ｍｅｎ＋ｂｒａｎｅｓｉｎ　Ｔｕｍｏｒ　Ｇ
ｒｏｗｔｈ、　Ｇａｌｅｏｔｔｉ等編、Ｅ１ｓｅｖｊｅ
ｒ＋　８１〜８７頁、（Ｉ９Ｂ２）　；　Ｆ、Ｏｍｏｄ
ｅｏ　５ａｌｅ等、Ｃｅ１ｌ　Ｍｏｌ。
Ｂｉｏｌ、　２７．４５５〜４５Ｂ頁、（Ｉ９８１）　
）の含量について試験した。
いずれの場合にもＮＡＮＡの含量を測定した。
第１表は、正常蛋白飼料により飼育したラットの群及び
低蛋白飼料により飼育したラットの群において、ＣＭＰ
−ＮＡＮＡによる処置により、統計的有意性をもって、
探索活動、並びに脳ガングリオサイド及び糖蛋白中のＮ
ＡＮＡ含量が上昇したことが示された。
血久　　カイニン　によ　　した　　′の−・・トの体
重１８０〜２００　ｇの雄性ラット、チャールスリバー
ＣＤを２０動物ずつから成る４群に分けた。第１群は対
照群とし、第２群は生理的塩溶液で処置し、第３群はカ
イニン酸で処置し、そして第４群はＣＭＰ−ＮＡＮＡ　
（２０■／ｋｇ／日、腹腔内）及びカイニン酸で処置し
た。
ＣＭＰ−ＮＡＮＡによる処置はカイニン酸による処置の
１週間前から始め、そして動物を殺すまで続けた。
動物をベンドパルビタール（６０＋ｎｇ／ｋｇ　ｉ、ｐ
、）で麻酔し、そして次に線状体に注射することにより
力、イニン酸（ｌＩｌｌの生理的溶液中２■）で処置し
た。
対照ラットは同容１（Ｉｍ）の生理的溶液で処置した。
７日後、ラットを殺し、線状体を取り出した。
５サンプルを一緒にして１回ずつの測定を行った。
ガングリオサイドを抽出、し、そして前記の方法により
測定（ＮＡＮＡ含量として）した。
第２表に結果を示す。ＣＭＰ−ＮＡＮＡによる処置によ
り、カイニン酸により生ずる線状体中のガングリオサイ
ドレベルの低下が抑制されることを示している。
庇−」Ｌ−表 ＮＡＮＡ含量として測定されそして表示された、ラット
線状体中のガングリオサイドのレベル。値は、各５サン
プルの平均につき、対照を１００％として％で表示しで
ある。
線状体ガングリオサイド 第１群：゛対照　　　　　　　　　　　　　１００第２
群：生理的溶液を投与　　　　　　　９６第３群：カイ
ニン酸を投与　　　　　　　６６ＣＭＰ−ＮＡＮＡ　（
９−３Ｈ）をＮＥＮ　にューイングランドニュークレア
、６０７２ドライアイヒ、西独）から入手した。
約１８時間絶食せしめたラットを、燐酸緩衝液に溶解し
たＣＭＰ−ＮＡＮＡで、２０ｍｇ／ｋｇ　ｉ、ｍの投与
量（比活性１００１００Ｏ／　ｍｇ　）で処置した。３
０分、１時間、２時間及び４時間後、動物を殺し、そし
てこの動物から肝臓、じん臓及び脳を摘出し、そして正
確に重量を測定した。
前記の器官からの１００４のサンプル及び同様の血液サ
ンプルをツルエン（Ｓｏｌｕｅｎｅ）３５０　（パラカ
ード）に溶解し、そしてシンチレーティング液を加えて
、液体シンチレーション装置により計数した。
測定を、キャナル−キャナル比法により定量化した。第
３表にすべての測定の平均結果を示す。
放射能は血中では急速に減少し、そして器官においては
さらに徐々に減少した。脳は肝臓及びじん臓以下の放射
性レベルを存する。
男−」Ｌ−表 （’Ｈ）−ラベルＣＭＰ−ＮＡＮＡ　（２０ｍｇ／ｋｇ
　ｔ、ｍ、）で処置した後のラットの器官の放射性レベ
ル。４実験の平均値を投与した量の％とじて、そして１
　ｍｆｔ又は１ｇの組織について示す。
３０分間　　１時間　　２時間　　４時間血　　　　液
　　　１ｌ．２　　　　　５．７　　　　　３．２　　
　　　１．９肝　　　　臓　　　　３．９　　　　４．
７　　　　２．８　　　　０．９じ　　ん　　臓　　　
　　２．６　　　　　　５．２　　　　　　３．３　　
　　　　１．６脳　　　　　　６．２　　　　７．８　
　　　４．９　　　　２．４ニユーロ（Ｎｅｕｒｏ）　
−２ａ細胞（ＡＴＣＣ、ロックビレ、米国）を標準的条
件（Ｉ０’　〜１０６細胞／１００ａ＋＋＋＋皿）にお
いて接種した。１ｌ〜２４時間後にＣＭＰ−ＮＡＮ＾を
加えた。濃度は第４表に示す。出芽の定量のためのイン
キュベーション時間を２４時間とした。次に３％のグル
タルアルデヒドを含有する緩衝塩溶液により細胞の固定
を行った。神経細胞の増殖の定量的測定をザイスＤ−７
０８２ミクレオービデオマートにより行った。
神経細胞の分化のパラメーターとして神経出芽を用いた
。ホルマリンに固定したサンプルを、コントラストを良
くするために染色した。ＣＭＰ−ＮＡＮＡの添加量と細
胞からの神経の出芽の数との間に密接な関係が観察され
た（第４表）。
策−土一糞 ニューロ−２ａ−細胞におけるＣＭＰ−ＮＡＮＡ誘発出
芽の投与量応答関係 ＣＭＰ−ＮＡＮＡの濃度（ｕｇ　／　ｍｌ　）　　　　
出芽の程度０１００±１５ ５１１０±１５ １０　　　　　　　　　１１７±２０ ２０　　　　　　　　　１３２±２５ ３０　　　　　　　　　１４５±３０ ５０　　　　　　　　　１７８±３５ 第４表から、３０Ｉｔｇ／ｍの濃度のＣＭＰ−ＮＡＳＡ
が、培養細胞において、神経の出芽をもとの定常値の５
０％近く上昇せしめ、５０ｎ／ｍβのＣＭＰ−ＮＡＮＡ
は神経の出芽を２倍近（に上昇せしめることが明らかで
ある。
ニューロ−２ａニユーリン神経芽細胞腫（ＡＴＣＣ−ｃ
ｃｔ、−１３１）を、非必須アミノ酸、抗生物質（５〜
２０■％）及び炭酸水素塩（５０〜１００■％）を加え
た、ウシ胎児血清（イルビンサイエンティフィック、イ
ルビン、カリフォルニア）を含有する培地中で増殖せし
めた。細胞を、コーニング、プラスチック組織培養フラ
スコ上で増殖せしめた。
測定用細胞を、コーニングプラスチックペトリ皿上ＣＭ
Ｐ−ＮＡＮＡを含有する又は含有しない培地中に入れた
。試験管内神経成熟に対するＣＭＰ−ＮＡＮＡの機能を
試験するために、プレート時又はプレートしてから２４
〜４８時間後に培地中にＣＭＰ−ＮＡＮＡを導入した。
細胞プロセスの平均数及び長さを、処理群当たり最低１
００細胞につき反復して測定し、神経成熟の半定量的指
数を得た（第５表）。
第５表の成熟指数（Ｉ，Ｍ）は１．　Ｍ＝Ｌ、　　ＰＸ
Ｎ、Ｐとして示され、ここで、 Ｌ、　　Ｐ、　１０＝約１０μへのプロセスの長さＮ、
　　Ｐ　　　−プロセスの合計数 種々の濃度のＣ肝−ＮＡＮＡの効果を高解像カッマルス
キー光学計で評価した。
神経芽細胞腫細胞の形態に対するＣＭｒ’−ＮＡＮＡの
影響 標準培地（ＳＭ）　　　　　　　１０±２ＳＭ±１趨／
成　　　　　　　２０±５ＳＭ＋５ｇ／ｌｎｌ　　　　
　　　４５±５Ｓ　Ｍ　＋　１０ｉ／　ｍａｌ　　　　
　　　　６８±１０５Ｍ＋２０μｇ／ｒａｉｌ　　　　
　　　　９２±１０第５表から、２ｎ／ｍｌの濃度のＣ
ＭＰ−ＮＡＮＡはＩ、Ｍ（前に定義した）を２倍にし、
２０ｎ／ｒｌｄｌのＣＭＰ−ＮＡＮＡは、標準培地につ
いて測定した場合に比べて１０倍高いＩ、Ｍ値を導（。
Ｍ１シ　静り旧支与囲１口庄剤」」釦象例上活性成分　
　　　　　　　　　　　０．５ｍｇ非発熱性マンニトー
ル　　　　　５０　　■燐酸二ナトリウム・１ｌ１１□
０　　　　５　　ｍｇ燐酸−カリウム　　　　　　　　
　１ｍｇ注射注射用熱水　　　　　　　　２．０ｍｌ且
製立法 活性成分、マンニトール及び無機塩を注射用無菌水に溶
解した。最終ｐｌ＋を６．５〜６．７とした。この溶液
に無菌窒素を通し、そしてポアーサイズ０．４５μのメ
ンブランフィルタ−を通して濾過し、そして２成のガラ
スアンプルに充填した。
適当な凍結乾燥機中で、−５８℃〜−６０℃の凍結温度
を保持し、そして最後に３５℃まで加熱することにより
凍結乾燥を行った。
次に、こうして得たアンプルを無菌窒素のもとでシール
した。生成物を、物理化学的性質、残留湿度、ＣＭＰ−
ＮＡＮＡ含量、再溶解性、無菌性、発熱物質の不存在、
及び非−毒性によりコントロールした。
■１（参考例） 活性成分　　　　　　　　　　　１．０ｍｇ非発熱性マ
ンニトール　　　　　５０　　ｍｇ燐燐酸ナナトリウム
１ｌＨ，００，５ｍｇ燐酸−カリウム　　　　　　　　
　１　■注射用非発熱水　　　　　　　　２　、　Ｏｍ
１例６と同様にして製剤化する。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、次の式（ I ） ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） で表わされる５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−
    Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクトノヌロサミン酸のシチジン
    モノホスフェートの製造方法において、次の反応式 ▲数式、化学式、表等があります▼→ ＣＭＰ−トランスフェラーゼ→▲数式、化学式、表等が
    あります▼ に従って、ＣＭＰ−トランスフェラーゼ（ＣＭＰ−アシ
    ルニウラミネートシンサーゼ）（ＥＣ２．７．７．４３
    ）を触媒として用いて、シチジントリホスフェートとＮ
    −アセチルニューラミン酸を縮合せしめることにより５
    −アセトアミド−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−
    Ｄ−ガラクトノヌロサミン酸のシチジンモノホスフェー
    トを生成せしめ、この場合に（Ａ）該縮合をチオカルボ
    ン酸安定剤及び／又はニトロイミダゾール安定剤の存在
    下で行い、あるいは（Ｂ）該縮合を￥エセリヒア￥・￥
    コリ￥（￥Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ￥￥ｃｏｌｉ￥）Ｃ
    ＲＣ１４８２株から分離された酵素ＣＭＰ−トランスフ
    ェラーゼ（ＣＭＰ−アシルニューラミネートシンサーゼ
    ）（ＥＣ２．７．７．４３）により行うことを特徴とす
    る方法。 ２、シチジントリホスフェートとＮ−アセチルニューラ
    ミン酸を３．０〜５．０：１．０のモル比で用い、無細
    胞型、固定化型又は細胞縮合型の酵素ＥＣ２．７．７．
    ４３の存在下で、チオカルボン酸の存在下でｐＨ８．５
    〜８．８において前記の縮合を行うことを特徴とする特
    許請求の範囲第１項記載の方法。 ３、前記チオカルボン酸としてβ−チオプロピオン酸又
    は（＋）−β−チオ−α−メチルプロピオン酸を使用す
    ることを特徴とする特許請求の範囲第１項又は第２項記
    載の方法。４、シチジントリホスフェートとＮ−アセチ
    ルニューラミン酸との縮合を３０℃〜４０℃の温度にお
    いて行うことを特徴とする特許請求の範囲第１項〜第３
    項のいずれか１項に記載の方法。 ５、シチジントリホスフェートとＮ−アセチルニューラ
    ミン酸との縮合を１〜４時間行うことを特徴とする特許
    請求の範囲第１項〜第４項のいずれか１項に記載の方法
    。 ６、動物組織、例えばカエル〔￥ラナ￥・￥エスクレン
    タ￥（￥Ｒａｎａ￥￥Ｅｓｃｕｌｅｎｔａ￥）肝臓、子
    ウシ脳、又はブタ、ヒツジもしくはウシの下顎腺からの
    無細胞酵素を使用することを特徴とする特許請求の範囲
    第１項記載の方法。 ７、前記反応生成物をイオン交換クロマトグラフィーに
    より分離することを特徴とする特許請求の範囲第１項記
    載の方法。 ８、前記反応生成物を、例えば０．１５Ｍ以下のトリエ
    チルアミン／炭酸水素ナトリウムを含有するｐＨ８．２
    〜８．６の緩衝液を用いて溶出するイオン交換クロマト
    グラフィーにより、そして／又は溶出液としてアンモニ
    ア水を使用して０℃〜６℃においてセファデックス（商
    標）カラム上でイオン交換クロマトグラフィーを行うこ
    とにより、分離することを特徴とする特許請求の範囲第
    ７項記載の方法。 ９、使用する酵素ＥＣ２．７．７．４３を、全容量１ｌ
    当り０．５〜２．０ｍＭのチオカルボン酸、例えばβ−
    チオ−プロピオン酸又は（＋）−β−チオ−α−メチル
    −プロピオン酸の存在下で、０℃〜４℃において、ホモ
    ジナイズした動物組織から分離することを特徴とする特
    許請求の範囲第１項記載の方法。 １０、前記分離された酵素ＥＣ２．７．７．４３を、Ｂ
    ｒＣＮ、β−チオ−カルボン酸及び／又はニトロ−イミ
    ダゾール誘導体の存在下で、ｐＨ８．５〜９．０におい
    て適当な担体に固定化して使用することを特徴とする特
    許請求の範囲第９項記載の方法。 １１、前記固体担体としてセファロースを使用すること
    を特徴とする特許請求の範囲第１５項記載の方法。
JP1215137A 1983-03-01 1989-08-23 ５―アセトアミド―３，５―ジデオキシ―ｄ―グリセロ―ｄ―ガラクトノヌロサミン酸のシチジンモノホスフェートの製造方法 Pending JPH0276894A (ja)

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IT83341/A/83 1983-03-01
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