JPH02168163A - 疎水性物質の固定化用担体およびそれを用いた疎水性物質の固定化方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、疎水性物質の固定化用担体およびそれを用い
た疎水性物質の固定化方法に関する。さらに詳しくは１
本発明は、界面活性剤のような疎水性相互作用を弱める
ような物質の存在下においても疎水性物質を効果的に固
定しうる固定化用担体およびそれを用いた疎水性物質の
固定化方法に関する。

（従来の技術） 抗原抗体反応を利用した生理活性物質の測定を目的とし
て担体上に抗原や抗体を固定化したり。

酵素を担体上に固定化して固定化酵素を調製することが
行なれている。このような物質の固定化は。

一般に、疎水性相互作用を利用して行なわれている。例
えば、ラテックス、プラスチックビーズ。

プラスチックプレートなどの疎水性の担体に、緩衝液中
、生理食塩水中または精製水中で、固定化しようとする
物質を直接接触させることにより固定化が達成される。

しかし、上記従来の物理的な吸着による直接固定化法で
は、疎水性相互作用のみを利用しているため、吸着・固
定化時の反応系中に界面活性剤などの疎水性相互作用を
弱める物質が含まれていると固定化ができない。そのた
め。

この物理的な吸着による直接固定化法は、抽出および／
または安定化に界面活性剤を必要とする膜タンパク、脂
質などの疎水性物質の固定化には利用できない。

固定化すべき物質を共有結合により固定化すればこの問
題は解決され得る。しかし、共有結合を導入するための
反応の制御が難しいうえ、場合によっては固定化した物
質の活性を著しく損なうことがある。

特許公表公報６３−５０１９０２号には、ラテックスを
ポリカチオン性ポリアミノ酸（ポリリジンまたはポリア
ルギニン）またはメチル化血清アルブミンで処理して物
理的に吸着または化学的に結合させた後、カルシオリピ
ン（梅毒抗体と特異的に反応する抗原作用を示すリン脂
質）をイオン的に吸着させることが開示されている。こ
のようにして調製されたカルシオリビン結合ラテックス
は、梅毒の診断に用いられる。しかし、上記ポリリジン
およびポリアルギニンは親水性アミノ酸のホモポリマー
であり、親水性を示す。そのため、ポリリジンまたはポ
リアルギニンで疎水性物質であるラテックス、プラスチ
ックビーズ、プラスチ、クプレートなどを処理しても、
これらのアミノ酸ホモポリマーを効果的に導入すること
ができない。また。

リジンのε−アミノ基は１級アミノ基であり、ｐＨ１１
以上ではほとんど解離が抑えられて荷電を持たなくなる
。そのため、上記カルシオリピンのように９１１１１を
下回るｐＨ域で固定化し得る物質にはポリリジンを適用
できるが、　ｐＨ１１以上で固定化する必要のある生理
活性物質には適用できないというような制約がある。そ
のため１例えばタンパクなどその他の生理活性物質につ
いては、不適切な場合もある。さらに、上記ポリリジン
およびポリアルギニンはアミノ酸のポリマー、すなわち
ポリペプチドであり、同じくポリペプチドであるタンパ
クを吸着固定化するのには、これらの間の結合力が弱い
ため適さない。加えて、上記ポリリジンは高価であるう
え、生体に対して毒性を有するので。

取扱いに注意を要する。

このように、上記従来の物質の固定化方法では。

効率がよ（ないために固定化に多量の生理活性物質を必
要とする；単位面積当りに固定化できる生理活性物質の
量が少ない；広いρ■領領域の固定化できない；界面活
性剤存在下での固定化ができない；などの問題点があっ
た。

（発明が解決しようとする課題） 本発明は上記従来の課題を解決するものでありその目的
とするところは、界面活性剤などの疎水性相互作用を弱
める作用を有する物質の存在下においても、生理活性物
質などの疎水性物質を固定化しうる固定化用担体を提供
することにある。

本発明の他の目的は、単なる物理吸着では固定化できな
かったり、固定化できたとしても十分な量ではないよう
な疎水性物質を効果的に固定化しうる固定化用担体を提
供することにある。

本発明のさらに他の目的は、上記優れた性質を有する固
定化用担体を用いて、生理活性物質などの疎水性物質を
効率よく固定化する方法を提供することにある。

（課題を解決するための手段） 本発明の疎水性物質の固定化用担体は、カチオン性の官
能基が導入された。もしくはカチオン性の官能基を有す
る化合物を吸着した不活性担体でなり、そのことにより
上記目的が達成される。

本発明の疎水性物質の固定化方法は、上記疎水性物質の
固定化用担体に疎水性物質を接触させて該担体表面に該
疎水性物質を物理的に吸着させることを包含し、そのこ
とにより上記目的が達成される。

本発明に用いられる不活性担体としては、疎水性の表面
を有する。あるいは部分的に疎水性の表面を有する不活
性担体がいずれも利用され得る。

例えば、ラテックス、プラスチックビーズ、プラスチッ
クプレートなどの合成高分子化合物でなる材料、タンニ
ン酸で処理した赤血球などの有機材ネ１；およびシリカ
などの無機材料が挙げられる。

特に、工業的に安定した品質で大量生産しうるラテック
ス；またはプラスチックビーズ、プラスチックプレート
などのプラスチック成形品が好適に使用される。このよ
うな不活性担体に導入もしくは吸着させるカチオン性の
官能基には、１級、２級、３級または４級のアミノ基お
よびそれらの塩が挙げられる。カチオンとして作用しう
るｐＨ範囲が広い４級アミノ基およびその塩が好適に使
用される。このようなカチオン性の官能基もしくはそれ
を含む化合物は、疎水性物質の固定化を妨害しない程度
ならば、一部アニオンを含んでいてもよい。

担体に上記カチオン性の官能基を導入する方法としては
、■担体として使用するプラスチックを合成する際にカ
チオン性の官能基を含むモノマーを同時に反応させて該
基を有する担体を調製する方法；■担体を成形した後に
、その表面に化学修飾によりカチオン性の官能基を結合
させる方法；および■カチオン性の官能基を含む化合物
（例えば、アミン類またはカチオン性ポリマー）を担体
表面に物理的に吸着させる方法がある。■の方法として
は１例えば１重合時にアミノ基を有する七ツマ−を同時
に重合させる（例えば、ナイロンもしくはその誘導体を
調製する）方法が挙げられる。

■の方法としては１例えば、シリカのような無段の材料
を不活性担体として用い、該シリカのＯＨ基を化学的に
修飾する方法がある。■の方法に用いられる化合物とし
て、低分子量化合物としては。

ドデシルアミン、ヘキサデシルトリメチルアミンなどの
各種アミン類が、高分子量化合物としては疎水性部分を
含むカチオン性ポリマーが用いられる。該ポリマーの疎
水性部分は、アルキル基、アルキレン基、フェニル基な
どから成る。該アルキル基およびアルキレン基の炭素数
は、　ｌ　−１５個の範囲内にあるものが適当である。

これよりも大きな炭素数では、ポリマーが水に溶解しに
くくなり担体を処理するのが困難となる。ポリマーの分
子量は１，０００〜４００，０００が適当である。これ
よりも小さい分子量では、担体との疎水性相互作用が十
分ではなくなり、担体に効果的に吸着されない。

４００．０００を上回る分子量では、ポリマーの粘度が
高くなってしまい、担体を処理するのが困難となる。

このようなポリマーとしては、ポリアリルアミン（Ｉ級
アミノ基を有する；日東紡績σ勾製）、ポリエチレンイ
ミン（２級アミン基を有する）、ポリ塩化ジアリルジメ
チルアンモニウム、ポリアミンスルホン（４級アミノ基
を有する）、核酸などがある。例えば１次式（Ｉ）で示
される４級アミノ基を有するポリマーが好適である： こ゛こで、　Ｒ＋””Ｒ＋。は水素またはアルキル基。

ソ、およびＶｔはアルキル基またはアルキレン基であり
　Ｅｌ　ｖ、およびＹ２にはＳ、ＮまたはＯが含まれて
いてもよい。

特に１次の構造式（ｎ）で示されるポリアミンスルホン
（日東紡、　ＰＡＳ−Ａ−５，平均分子量２．０００〜
５．０００　）が好適である： （以下余白） 本発明の担体に固定化されるべき物質は、疎水性の部分
を有し、かつ固定化条件下で負の電荷を有する物質であ
る。このような物質としては、タンパクなどの生理活性
物質、脂質などが挙げられる。特に、抽出、安定化など
のために界面活性剤を必要とする物質１例えば、ウィル
ス抗原、梅毒トレポネーマなどの菌体の表面抗原、ａ＋
胞脱膜上存在する各種抗原、膜タンパク、リセプター、
酵素などは本発明の担体および方法により効果的に固定
化される。

上記菌体の表面抗原、膜タンパクなどの抽出や安定化の
ために用いられる界面活性剤としては。

非イオン性５両性およびカチオン性の界面活性剤が使用
できるが、アニオン性の界面活性剤は適当ではない。非
イオン性の界面活性剤としては１例えば、トリトンＸ、
ツイーン２０．　　ツイーン８０．オクチルグルコシド
、オクチルチオグルコシド、ヘプチルチオグルコシド、
　ＭＥＧＡ−８（オクタノイル−Ｎメチルグルカミドニ
Ｏｃｔａｎｏｙｌ−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｇｌｕｃａｍｉｄ
ｅ）　。

ＭＥＧＡ−９（ノナノイル−Ｎ−メチルグルカミド：　
Ｎｏｎ−ａｎｏｙｌ−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｇｌｕｃａｍｉ
ｄｅ　）　、　ＭＥＧＡ−１０（デカノイル−Ｎ−メチ
ルグルカミド：　Ｄｅｃａｎｏｙｌ−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ
−ｇｌｕｃａｍｉｄｅ　）などが挙げられる。両性の界
面活性剤としては２例えば、　ＣＩ（ＡＰＳ　　（３−
（（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１
−プロパンスルホネート：　３−　（（３−Ｃｈｏｌａ
ｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｄｉｍｅｔｈｙｌ−ａｍｍｏｎ
ｉｏ　）　−１−ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）
　、　ＣＩＩＡＰＳＯ（３−〔（３−コラミドプロピル
）ジメチルアンモニオ〕＝２−ヒドロキシ−１−プロパ
ンスルホネート：３（（３−Ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏ
ｐｙｌ）ｄｉｍｅｔｈｙｌａａ＋ｍｏｎｉｏ）　−２−
ｈｙｄｒｏｘｙｌ−ｐｒｏｐａｎｅ−５ｕｌｆｏｎａｔ
ｅ　）などが挙げられる。カチオン性の界面活性剤とし
ては、ドデシルアミン（Ｄｏｄｅｃｙｌ　ａｍｉｎｅ　
）　、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロマイド
（Ｈｅｘａｄｅｃｙｌ　ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎ
ｉｕｍ　ｂｒｏｍｉｄｅ）などが挙げられる。

本発明方法による上記のような疎水性物質の担体への固
定化は、緩衝液、生理食塩水または精製水に疎水性物質
を溶解した溶液を固定化用担体に接触させることにより
行われる。このことにより疎水性物質はまず、イオン的
相互作用により担体表面のカチオン性官能基に引き寄せ
られ１次いで担体との疎水性相互作用により該担体表面
に固定化される。このときに使用される緩衝液としては
。

当業者に公知のいずれの緩衝液も使用できるが。

イオン強度が０．１Ｍを下回るものが望ましい。本発明
方法は疎水性物質の固定化の最初のステップとしてイオ
ン的な相互作用を利用しているので、イオン強度が高い
と効果が得られない。緩衝液のｐｔ＋は、担体上のカチ
オンが解離しており、固定化される物質が該緩衝液中で
安定に存在し得、かつ負に荷電するようなｐＨに調整さ
れる。た、だし、担体上のカチオンとして４級アミノ基
を用いる場合には、どのｐＨにおいても担体上のカチオ
ンは解離しているので比較的広いｐＨ範囲の緩衝液が使
用され得る。

本発明の担体および方法は、特にＲＩＡ　、　ＥＩＡ　
。

ラテックス法などのための免疫診断試薬の調製に好適に
利用される。例えば、　ＨＢｓ抗原、　ＨＢｃ抗原。

ＨＢｅ抗原、梅毒抗原（トレポネーマ抗原および脂質抗
原）、ＨＩＶ抗原、　ＡＴＬＶ抗原などの抗原を適当な
担体に固定した種々の免疫診断試薬を調製するのに利用
できる。

本発明によりこのような免疫診断試薬を調製する場合に
、測定系の特異性を高めたり測定感度を上げたりするた
めに、場合によっては塩化コリンＥＤＴＡ、　糖類（多
ｔａｒ　類、デキストランなど）、ポリエチレングリコ
ールのような親水性ポリマーなどを反応系に添加するこ
ともできる。このようにして調製された免疫診断試薬は
、疾病の診断および治療のための臨床検査などの分野に
広く利用され得る。さらに、固定化酵素を調製し、これ
を用いて特定の物質を生産する方法にも利用され得る。

（実施例） 本発明を以下の実施例につき説明する。

夫施尉上 ［界面活性剤存在下における梅毒トレボネーマ抗原のプ
ラスチックプレートへの固定化］（Ａ）試薬および検体
の調製 以下の試薬および検体を調製して用いた。

リン酸緩衝液ニリン酸−ナトリウム（２水和物）。

リン酸ニナトリウム（２水和物）および塩化ナトリウム
を、リン酸および塩化ナトリウムの終４度がそれぞれ０
．０２Ｍおよび０．１５Ｍ　、　そしてｐＨが７．４と
なるように混合して調製した。

リン酸−クエン酸緩衝液：０．２Ｍリン酸二ナトリウム
と０．１Ｍクエン酸とを混合し、　ｐＨ５，５に調整し
た。

１％ポリアミンスルホン水溶液：ポリアミンスルホン（
日東紡、　ＰＡＳ−Ａ−５、平均分子量２，０００〜５
．０００　）を水に溶解して１％水溶液とした。このポ
リアミンスルホンの構造式は明細書中の（Ｕ）弐で示さ
れる。

１％ポリエチレンイミン水溶液＝３０％ポリエチレンイ
ミンＰ−７０（平均分子量７０，０００　；和光純薬社
製）を精製水で希釈して１％水溶液とした。

１ｍＭ塩酸：塩酸を精製水で希釈して１ｍＭ塩酸水ン容
液とした。

１％ＢＳＡ　　ニリン酸緩衝液に牛血′清アルブミンを
１％となるように７容解した。

１％トリトンＸ−１００ニリン酸緩衝液にトリトンＸ−
１００を１％となるようにｌ容解した。

梅毒抗原液：家兎事大中で１０〜１４日間培養したトレ
ボネーマ　パリタム［ｋ計量咀シ押」頂辿堕；ＣＤＣ（
Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｃｏｎｔｒｏ
ｌ、　Ｐｕｂｌｉｃ　ＨｅａｌｔｈＳｅｒｖｉｃｅ、　
１１．ｓ、　ＤｅｐａｒＬｍｅｒ＋Ｌ　ｏｆ　ＩＩｅａ
ｌＬｈ、　Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｎｄ　Ｗｅｌｆａｒｅ
　、　ＡＬｌａｎｔａ　、　Ｇｅｏｒｇｉａ　）より人
手したものを家兎事大に接種し、８！代培養したものを
用いた１を生理食塩水中に１０９個菌体／　ｍ　ｌとな
るように懸濁した菌体懸濁液１ｍｌを採り、リン酸緩衝
液中で遠心分離（６，０００ｒｐｍＸ　５分２３回）す
ることにより洗浄した。次いで、得られた沈澱に１％ト
リトンＸ−１００を１ｍｌ添加し、３７°Ｃにて３０分
間インキユヘートした。その後、これを超遠心分離機に
かけて（５０，０００ｒｐｎ＋　Ｘ　１時間）上清を採
取し。

１％トリトンＸ４００で１　、０００倍希釈して使用し
た。

梅毒陽性家兎血清：事大にトレボネーマ　パリダムを接
種後、４５日間飼育した家兎から血清を採取した。市販
のＴＰ）ＩＡキット（セロディアＴＰ（Ｘ士しビオ）、
およびセロクリットＴＰ（化血研））を用いてタイター
（力価）を測定したところ、いずれのキットにおいても
１０，０００タイターを示した。

この血清を１％ＢＳＡで１００倍から４００倍に希釈し
て使用した。

正常家兎血清：トレボネーマ　パリダムがｔ、ｆ　ｆｉ
ｎされていない家兎から採取した血清を用いた。上記と
同様に市販のＴ　Ｐ　ＩＩ　Ａキットを用いてタイター
を測定したところ、結果は陰性を示した。この血清を１
％ＢＳＡで１００倍から４００倍に希釈して用いた。

ペルオキシダーゼ標識抗ウサギｒｇｃ　　：ベルオキシ
ダーゼ標識抗つサギＩｇＧ　　（マイルズ・ラボラトリ
ーズ社）を１％ＢＳＡでｔ、ｏｏｏ倍に希釈して用いた
。

マイクロクイタープレート：プラスチック製の９６穴（
ウェル）マイクロタイタープレート（ヌンク社）を用い
た。

ペルオキシダーゼ基質：０−フェニレンジアミン（２塩
酸塩）および過酸化水素水を、リン酸−クエン酸緩衝液
にそれぞれ２■／　ａｌｌと０．０３％となるように溶
解した。基質の調製は使用直前に行った。

ＩＮ硫酸：濃硫酸を精製水で希釈してＩＮ硫酸水溶液と
した。

（Ｂ）マイクロタイタープレートの処理〔ポリアミン処
理〕 マイクロタイタープレートの各ウェルに、１％ポリアミ
ンスルホン水溶液または１％ポリエチレンイミン水溶液
（以下、ポリアミンスルホンおよびポリエチレンイミン
を総称してポリアミンとする）を５０μｌずつ分注し、
室温にて１時間放置した。その後、アスピレータ−を用
いてポリアミン水溶液を除去し、各ウェルを２００μ！
の精製水で３回２次いで１ｓＭ塩酸２００μｌで１回、
最後にリン酸緩衝液２００μｌで１回吸引洗浄した。

〔抗原の固定化〕

このマイクロクイタープレートのウェルに梅毒抗原液５
０μｌを添加し、室温にて１時間インキュベートした。

対照として、梅毒抗原液の代わりに１％ＢＳＡを５０μ
ｌ分注したウェルを用意した。インキュベートの後、梅
毒抗原液および１％ＢＳＡを゛吸引除去し、２００μｍ
の１％ＢＳＡで３回吸引洗浄した。次いで、２００μｍ
の１％ＢＳ＾を添加し、室温にて１時間放置してブロッ
キングを行った。その後、１％ＢＳＡを吸引除去し、直
ちにＥＬＩＳＡ分析に使用した。

（Ｃ）εＬＩＳＡ分析 第１抗体として前記の１００倍、２００倍および４００
倍希釈した梅毒陽性家兎血清１００μｍを使用した。

これを上述のように調製した梅毒抗原固定化マイクロタ
イタープレートの各ウェルに分注した。対照のウェル（
梅毒抗原の代わりに１％ＢＳＡで処理した）にも同様に
梅毒陽性家兎血清を分注した。

別に、血清中の非特異的吸着を示す物質の存在の有無を
調べるために、前記の１００倍、２００倍および４００
倍希釈した正常家兎血清を上記梅毒陽性家兎血清と同様
にウェルに分注した。これらのウェルを室温にて１時間
インキュベートした後１．液を吸引除去し、２００μｍ
の１％ＢＳＡで３回吸引洗浄した。次いで、第２抗体と
してペルオキシダーゼ標識抗ウサギｒｇＧを１００μｌ
ずつ各ウェルに分注し、室温にて１時間インキュベート
した。その後。

ウェル内の液を吸引除去し、上記と同様にウェルを２０
０μｌの１％ＢＳＡで３回吸引洗浄した後、各ウェルに
ペルオキシダーゼ基質を１００μｍ添加し。

室温にて正確に１５分間インキュベートした。基質ブラ
ンクとして、第１抗体および第２抗体のいずれも添加し
ていないウェルを用意し、同様に基質液を添加してイン
キュベートした。その後、　ＩＮ硫酸１００μｌを添加
することによって酵素反応を停止させた。反応停止後、
マイクロタイタープレートリーダー（ＭＴＰ−１００、
コロナ社）を用いて、基質ブランクを対照として４９２
ｎｍにおける吸光度を測定した。結果を表１に示す。

ル較拠土 ポリアミン処理を行わなかったマイクロタイタープレー
トを用いて、実施例１を繰り返した。結果を実施例１の
結果とともに表１に示す。

表１ 袖＝４で測定したときの平均値。

表１の結果から明らかなように、従来の単なる物理的吸
着法では界面活性剤存在下において梅毒抗原をプラスチ
ックプレートに固定化することは難しい。しかし１本発
明によれば、界面活性剤存在下においても効果的に梅毒
抗原をプラスチックプレートに固定化することができる
。

１益±又 ［界面活性剤存在下における梅毒トレポネーマ抗原のラ
テックスへの固定化］ （Ａ）試薬および検体の調製 特に指示されないかぎり、実施例１と同一名の試薬およ
び検体は実施例１と同様に調製した。

ラテックス；、０．２３μｍポリスチレンラテックス（
固形分１０％、積木化学工業■）を用いた。

（Ｂ）　ラテックスの処理 〔ポリアミンスルホン処理］ ラテックス１ｍｌと１％ポリアミンスルホン水溶液５ａ
＋ｌを混合し、室温にて１時間放置した。その後、遠心
分ＡＩ　（Ｉ５，０００ｒｐｍ　ｘ　１時間）すること
によりポリアミンスルホン水溶液を除去し、１ｍＭ塩酸
５ｍｌで３回遠心洗浄（Ｉ５，０００ｒｐｍ　Ｘ　１時
間）した。さらに、精製水５ｍｌで同様に３回遠心洗浄
した後、ラテックスの固形分が１０％となるように精製
水に懸濁し、この状態で使用するまで保存した。

〔抗原の固定化］ 上記のようにポリアミンスルホン処理したラテックス２
００　μｍと梅毒抗原液８００　μｌとを混合し室温に
て１時間撹拌した。その後、１％ＢＳＡ　５ｍｌを添加
し、　１５，０００ｒｐｎ＋にて１時間遠心分離した。

得られた沈澱にさらに１％ＢＳＡ　５ｍｌを添加し、同
様に遠心分離することにより沈澱を洗浄した。この沈澱
に１％ＢＳＡ　４ｍｌを添加し、よく分散させてラテッ
クス試薬とした。このようにして調製したラテックス試
薬は、４°Ｃにて保存した。

（Ｃ）免疫凝集法による分析 梅毒陽性家兎血清と上述のように調製したラテックス試
薬とをそれぞれ５０μｌずつガラス板上に採り、撹拌混
合して３分間反応させた。対照として、正常家兎血清に
ついても同様に反応させた。

反応後、ラテックス試薬の凝集の有無を目視観察するこ
とにより判定し、凝集が観察された場合を陽性（＋）、
そして凝集が観察されなかった場合を陰性（−）とした
。結果を表２に示す。

ル較皿Ｉ ポリアミンスルホン処理を行わなかったラテックス試薬
を用いて、実施例２を繰り返した。結果を実施例２の結
果とともに表２に示す。

表２ 表２の結果から明らかなように、従来の単なる物理的吸
着法では界面活性剤存在下において梅毒抗原をラテック
スに固定化することは難しい。これらに対して１本発明
によれば、界面活性剤存在下においても効果的に梅毒抗
原をラテックスに固定化でき、免疫診断試薬とすること
ができる。

天庭貫ユ ［界面′活性剤不在下におけるｌｌＢｓ抗原のプラスチ
ンクブレートへの固定化１ （Ａ）試薬および検体の調製 ＨＢｓ抗原液：　ＨＢｓ陽性のヒト血漿を、家兎産生抗
）ＩＢｓ抗体をセファロースＣＬ４Ｂに結合させたアフ
ィニティカラムを用いてアフィニティ精製した。

この精製ＨＢｓ抗原をリン酸緩衝液に溶解してｌｌＢｓ
抗原液とし、ａ度をローリ−法により測定した。

）ＩＢｓ抗原液は、抗原固定化に使用する直前にリン酸
緩衝液で希釈し、濃度を１〜１０μｇ／ｍｌに調整して
用いた。

抗ＨＢｓ抗血清：精製ＨＢｓ抗原をフロイントの完全ア
ジュバントとともに家兎に免疫して得られた抗ｌｌＢｓ
血清を、正常ヒト血清を結合させたＣＮＢｒ活性化セフ
ァロースＣＬ４Ｂカラム（ファルマシア社）により吸収
処理した。このカラムによる吸収処理は、製造業者の使
用説明書に従って行った。吸収処理を行った抗ＨＢｓ血
清は、実施例１と同様に１％ＢＳＡで１００倍から４０
０倍に希釈して用いた。

（Ｂ）マイクロタイタープレートの処理〔ポリアミンス
ルホン処理〕 マイクロタイタープレートの各ウェルを、実施例１に準
じてポリアミンスルホン処理した。このポリアミンスル
ホンで処理したマイクロタイタープレートに、直ちにＨ
ａｓ抗原を固定化した。

〔抗原の固定化〕

固定化の工程は、梅毒抗原液の代わりにＨＢｓ抗原液を
用いたことを除いては実施例１と同様である。このＨＢ
ｓ抗原固定化マイクロタイタープレートは、直ちにＥＬ
ＩＳ＾分析に使用した。

（Ｃ）　ＥＬＩＳＡ分析 第１抗体として梅毒陽性家兎血清の代わりに抗ＨＢｓ抗
血清を用いたことを除いては、実施例１に準じて測定を
行った。４９２ｎｍにおける吸光度を測定した結果を表
３に示す。

ル校開１ ポリアミンスルホン処理を行わなかったマイクロタイタ
ープレートを用いて、実施例３を繰り返した。結果を実
施例３の結果とともに表３に示す。

（以下余白） 表３ 村＝４で測定したときの平均値。

表３の結果から明らかなように１本発明によれば、従来
の単なる物理的吸着法よりも効果的により多量のＨＢｓ
抗原をプラスチックプレートに固定化することが可能で
ある。

次に、ポリアミンスルホンを用いてカルジオライピンを
担体上に固定化した場合（実施例４）と。

公表公報６３−５０１９０２号に記載されているように
ポリリジンを用いてカルジオライピンを担体上に固定化
した場合（比較例４）とを比較した。

丈施炭土 （Ａ）試薬および検体の調製 特に指示されない限り、実施例１〜３と同一名の試薬お
よび検体は実施例１〜３と同様に調製した。

カルジオライピン（カルシオリピン）溶液：カルジオラ
イピン、レシチンおよびコレステロールをそれぞれ０．
０３％、　０．２１％、および０．９％の割合で含有す
るエタノール溶液を調製した。

（Ｂ）　ラテックスの処理 梅毒抗原液の代わりにカルジオライピン溶液を用いたこ
と以外は実施例２（Ｂ）項と同様に操作を行なった。

（Ｃ）免疫凝集反応による分析 （Ｂ）項で得られたラテックス試薬を用い、実施例２（
Ｃ）項に準じて操作を行なった。その結果を表４に示す
。

ル較■↓ １％ポリアミンスルホン水溶液の代わりにポリＯＬ−リ
ジンの１％水溶液を用いたこと以外は実施例４と同様で
ある。その結果を表４に示す。

表４ 本十二陽性 ｍ：陰性 表４から明らかなように１本発明によれば、ポリリジン
と同等もしくはそれ以上の効率で、カルジオライピンの
固定化が可能である。ポリアミンスルホンはポリリジン
と異なり毒性を持たない点で有利である。

次に、ポリアミンスルホン（実施例５）およびポリリジ
ン（比較例５）を用いてカルジオライビンを固定化した
場合のｐＨの条件を比較した。

特に指示されない限り、実施例１〜４辺同一名の試薬お
よび検体は、実施例１〜３と同様に調製した。

ホウ酸緩衝液ニホウ酸水溶液のｐＨを水酸化ナトリウム
で調整し、　０．ＯＩＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９，２）を
ＩＡＩ製した。

Ｉ％ＢＳＡ／ホウ酸緩衝液ニホウ酸援街液に牛血清アル
ブミンを１％になるように）岩屑させた。

（Ｂ）　　ラテックスの処理 実施例２（Ｂ）項と同様にラテックスをポリアミンスル
ホンで処理し、固形分ｌＯ％になるようにホウ酸緩衝液
に懸濁した状態で保存した。この保存状態においてラテ
ックスの凝集は認められなかった。

上記のようにポリアミンスルホン処理をし、ホウ酸緩衝
液に懸濁したラテックス２００　μ２とカルジオライピ
ン溶液８００　μ！とを混合し、室温で１時間撹拌した
。これに１％ＢＳＡ／ホウ酸緩衝液を５ｄ加え、　１５
０００ｒｐｍで１時間遠心分離した。得られた沈澱に１
％ＢＳＡ　　５ｒｎ１を加え、　１５０００ｒｐｍで１
時間遠心分離することにより沈澱を洗浄した。この沈澱
に４　ｍｌの１％ＢＳＡを加え、よく分散しラテックス
試薬とした。ラテックス試薬は４℃で保存した。

（Ｃ）免疫凝集法による分析 （Ｂ）項で得られたラテックス試薬を用い、実施例２（
Ｃ）項に準して操作を行なった。その結果を表５に示す
。

止較炎】 １％ポリアミンスルホン水溶液の代わりにポリＯＬ−リ
ジンの１％水溶液を用いたこと以外は実施例５と同様で
ある。

本比較例では、ポリリジンで処理したラテックスをホウ
酸緩衝液に懸濁したときに凝集が見られたが、そのまま
実施例５と同様の操作を行なった。

その結果を表５に示す。

表５ 本土：陽性 ：陰性 実施例５ではポリアミンスルホンによるラテックスの処
理でラテックスの凝集が起こらないが。

比較例５ではラテックスの凝集が認められた。さらに実
施例５ではカルジオライビン固定化後の抗原抗体反応も
強く、亮いｐｌ＋でも、従来の１級アミンに比べて効率
よくカルジオライピンが固定化されることが確認された
。

次に、アミノ基が導入されている高分子材料を用いて１
本発明を実施する例を、高分子材料としてナイロンを例
に取り説明する。

夫施拠旦 （Ａ）試薬および検体の調製 特に指示されない限り、実施例１〜５と同一名の試薬お
よび検体は実施例１〜３と同様に調製した。

エチレンジアミン：特級試薬を用いた。

塩酸；ナイロンビーズの表面を加水分解するためにＩＮ
の塩酸を用いた。

ＥＤＣ（Ｉ−エチル−３（３−ジメチルアミノプロピル
）カルボジイミド）：エチレンジアミンのアミノ基とナ
イロンのカルボキシル基を結合させるための縮合剤（カ
ルボキシル基の活性化剤）として用いた。

ナイロンビーズ：６−ナイロンを直径６．４０の球状に
成形したもの（積木化学工業■製、ナイロンビーズ、＃
０）を用いた。

（Ｂ）梅毒抗原の固定化 ナイロンピーズ１００個を１００ｍの塩酸に浸漬し。

３７℃で１時間加水分解し、精製水により十分洗い風乾
した。これをＯ，１Ｍエチレンジアミン５０ｍ１に浸漬
し、撹拌しながら、　ＥＤＣを粉末のまま１ｇ加えた。

室温で１時間反応させた後、精製水により十分洗い風乾
した。このようにして表面処理を行なったナイロンビー
ズ２０個を５０ｔｎｆｔのビーカーに入れ、梅毒抗原液
１０ｍを加え、室温で１時間撹拌した０次に、梅毒抗原
液を吸引除去し、１％トリンＸ−１００を２５ｍ１加え
た後、吸引除去する操作を３回繰り返して洗浄した。Ｂ
ＳＡを２５ｄ加え、梅毒抗原固定化ナイロンビーズとし
た。この梅毒抗原固定化ナイロンビーズは４°Ｃで保存
した。対照として、抗原液の代わりに１％ＢＳ八を用い
て同じ操作を行なったものを調製した。

（Ｃ）　Ｅｌ＾による梅毒抗体の検出 第１抗体として、前述の１００倍、２００倍および４０
０倍に希釈した梅毒陽性家兎血清５００μβずつを分注
した。別に、血清の非特異的吸着を示す物質の存在の有
無を調べるために、前述の１００倍。

２００倍および４００倍に希釈した正常家兎血清を同様
に試験管に分注した。

各試験管に、上記梅毒抗原固定化ナイロンビーズを２個
ずつ加えた。対照として、抗原の代わりに１％ＢＳＡを
固定化した表面処理ナイロンビーズも同様に加えた。

上記試験管を室温で１時間インキュベート後。

反応液を吸引除去し、２ｍｌの１％ＢＳＡで３回吸引洗
浄した。これにペルオキシダーゼ標識抗ウサギＩｇＧを
各試験管に５００μβずつ分注し、室温で１時間インキ
ュベートした。反応液を吸引除去し。

２ｄの１％ＢＳＡで３回吸引洗浄した。

次に、各試験管に５００μｌづつ酵素基質を添加し、室
温で、１５分間インキュベートを行なった。

基質ブランクとして、空の試験管にも同様に基質を分注
し、インキュベートした。これにＩＮ硫酸を２ｄ添加し
、酵素反応を停止させた。各試験管の酵素反応時間は一
定になるように注意して行なった。反応停止後９分光光
度計（日立製作所、υＶ３２００　）により、基質ブラ
ンクを対照として４９２ｎｍの吸光度を測定した（ｎ・
２）。その結果を表６に示す。

尖脂■工 塩酸による加水分解のみを行なったナイロンビーズ（す
なわち、実施例６におけるエチレンジアミンおよびＥＤ
Ｃによる処理を行わないナイロンビーズ）を用いて、実
施例６と同様の操作を行なった。その結果を表６に示す
。

ル較拠ｌ ナイロンビーズと同じ金型で成形されたポリスチレンビ
ーズ（積木化学工業■製、ポリスチレンビーズ＃０）を
用い、実施例６と同様の１桑作を行なった。その結果を
表６に示す。

（以下余白） 表６ ｎ・２で測定したときの平均値 表６から明らかなように、カチオン性の官能基が共有結
合により導入された場合にも、高感度で梅毒抗体が検出
され、かつ非特異反応が低いことが確認された。

実施例７においては比較例６に比べ、ある程度梅毒陽性
家兎血清との反応が認められる。これは。

ナイロンビーズの加水分解により生成したアミノ基が存
在するためと考えられる。ナイロンビーズは加水分解に
よりカルボキシル基をも生じるが。

このカルボキシル基（アニオン性の官能基である）によ
る測定時の妨害は特に認められない。

（発明の効果） 本発明によれば、このように、疎水性物質が効果的に担
体上に固定化される。例えば、従来の単なる物理吸着で
は固定化できない、あるいは単位面積あたりの固定化量
が少ない生理活性物質が。

ラテックス、プラスチ・ツクプレート、無機担体赤血球
などの不活性担体に効果的に固定化される。

そのため本発明の担体および固定化方法は２例えば免疫
反応を利用した種々の物質の測定に利用される。特に疾
病の診断および治療のためのしｎ床検査などの分野に広
く利用され得る。

以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、カチオン性の官能基が導入された、もしくはカチオ
   ン性の官能基を有する化合物を吸着した不活性担体でな
   る、疎水性物質の固定化用担体。 ２、前記カチオン性の官能基が４級アミノ基を包含する
   、特許請求の範囲第１項に記載の担体。 ３、前記カチオン性の官能基を有する化合物が、下記構
   造式（ I ）を有する化合物である、特許請求の範囲第
   １項に記載の担体： ▲数式、化学式、表等があります▼・・・（ I ） ここで、Ｒ＿１〜Ｒ＿１＿０は水素またはアルキル基、
   Ｙ＿１およびＹ＿２はアルキル基またはアルキレン基で
   あり、該Ｙ＿１およびＹ＿２にはＳ、ＮまたはＯが含ま
   れていてもよい。 ４、特許請求の範囲第１項に記載の担体に疎水性物質を
   接触させて、該担体表面に該疎水性物質を物理的に吸着
   させることを包含する、疎水性物質の固定化方法。 ５、前記カチオン性の官能基が４級アミノ基を包含する
   、特許請求の範囲第４項に記載の固定化方法。 ６、前記カチオン性の官能基を有する化合物が、下記構
   造式（ I ）を有する化合物である、特許請求の範囲第
   ４項に記載の固定化方法： ▲数式、化学式、表等があります▼・・・（ I ） ここで、Ｒ＿１〜Ｒ＿１＿０は水素またはアルキル基、
   Ｙ＿１およびＹ＿２はアルキル基またはアルキレン基で
   あり、該Ｙ＿１およびＹ＿２にはＳ、ＮまたはＯが含ま
   れていてもよい。