JPH0212062A - 誘導化したガラス表面を使用した生物特異的検定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は一般に検定法に関する。より詳細には、本発明
は、誘導化した固体担体を使用した、ヘルペスウィルス
（ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓｅｓ）　（すなわちヘルペス
ウィルス科）を検出するための生物特異的検定に関する
。

〔従来の技術及び発明が解決しようとする課題〕これま
で、生物学的流体中のヘルペスウィルスの、簡単、高速
かつ効果的な迅速検出方法はなかった。単純ヘルペスウ
ィルス（ｌ（ＳＶ）のようなウィルスを生物学的検体か
ら単離し、固定するには、通常数日から数週間を要する
。また通常の方法は、臨床検査室では大抵容易に行い得
るものではなく、従って検体の付加的な取り扱いが必要
となる。一般に、診断の大半は遡及的試験（たとえば、
急性領域と回復期領域の血清学的検査）に依拠している
。これよりは迅速な診断が、イムノアセイ（ｉｍｍｕｎ
ｏａｓｓａｙｓ＞　、たとえば已ＬＩＳＡまたは免疫蛍
光顕鏡法といった方法によって可能であるものの、これ
らの技法は感度が悪く、培養で確認する必要がある。も
っと重篤な感染においては、ウィルスの迅速かつ正確な
検出が決定的であり、それによって生命が救われること
も稀ではない。

現在、特定の種類の微生物を検出するには数種の検定法
が利用可能である。ブフチャー（Ｂｕｃｈｅｒ）の米国
特許第４，５８８，６８０号（ＰＣＴ、１９８１年７月
３１日）には、インフルエンザウィルス検出用のイムノ
アッセイが開示されている。ナイセリア・ゴノロエ−（
Ｎｅｌｓｓｅｒｉａ　　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｃ）検出
用のイムノアッセイがアブラム（Ａｂｒａｍ）の米国特
許第４，４９７，９００号（１９８３年３月２８日）に
開示されている。アームストロング・（Ａｒｍｓｔｒｏ
ｎｇ）の米国特許第４，４９７．８９９号（１９８３年
３月２８日）には、クラミジア菌検出用のイムノアッセ
イが開示されている０以上の各イムノアッセイでは固体
担体として未処理ポリスチレンを使用している。ロバー
トソン（ＲｏｂｅｒＬｓｏｎ）のＰＣＴＷＯ−Ｅ１６１
０２７３３号（１９８５年ＩＯ月３１日）には、眼科疾
患に伴うウィルス抗原検出用のサンドインチ検定法が開
示されている。

ライ−トール（ＷｅｅＬａｌｌ）の「アファニティクロ
マトグラフィー用の多孔質ガラス（Ｐ。

ｒｏｕｓ　　Ｇｌａｓｓ　　Ｆｏｒ　　Ａ［ｒｉｎｉＬ
ｙ　　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）」、メソッド・
イン・エンザイモロジー（ＭｅＬｈｏｄｓｉｎ　　Ｅｎ
ｚｙｍｏｌｏｇｙ）、３土：５９−７２　（１９７４）
には、アフィニティクロマトグラフィーに有用なシラン
化多孔質ガラスが開示されている。ライ−トールに開示
されたような制御された孔のガラスのシラン化は、本発
明で開示するようにウィルス抗原を固定ｔＵ体に結合す
るのではなく、化学基をガラスカラムに結合させ、蛋白
質のガラスカラムへの特異的吸着を阻止するためのもの
である。

ヘルペスウィルスなどを検出する現在可能な検出法は概
して高価で、往々にして不正値で、時間および手間がか
かる。従って、効率的で迅速がっ経済的で、特異性が高
く、それ以上の確認を行わなくてもすむヘルペスウィル
スの検出方法が必要とされている。

〔課題を解決するための手段〕

本発明は、シランで誘導化した固体担体を使用したヘル
ペスウィルス用の生物特異的検定法を提供する。ウィル
ス抗原と、これと相補的な結合物質との間の特異的な結
合反応を検出する高感度の方法を、シラン化剤で処理し
た固体担体を使用して、ウィルス抗原の合計吸着量を増
加させることによって達成した。より詳細には、本発明
はサンプル中のヘルペスウィルスの以下の検出方法、即
ち、サンプル中のヘルペスウィルス破壊し；破壊したヘ
ルペスウィルスをシランでＭＲ化した固体担体に固定化
し；固定化したヘルペスウィルスを、破壊したウィルス
粒子に特異的な一次抗体と接触させて免疫複合体を形成
し；免疫複合体を、標識をイｆｉ１着させた二次抗体と
接触させて標識免疫複合体を形成し；そして標識免疫複
合体を検出する工程よりなる方法に関する。

驚くべきことに、シラン化による固体（■体の誘導化が
、ヘルペスウィルス抗原、特に単純ヘルペス抗原の固体
担体への吸着を増大させることを見出した。この吸着の
際の親和性は、これを従来の捕）足用抗原のかわりに用
いるのに十分である。固体担体は、シラン化による誘導
化を可能とする固体担体表面上の表面ヒドロキシル基の
利用可能性に応じて選択する。

本発明は広範な生物特異的検定に適用することができる
０本発明は、ラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノ
アッセイ、蛍光イムノアッセイ、およびＤＮＡプローブ
アッセイで使用されるどちらかといえば伝統的な標識と
も、近年の蛍光イムノアッセイとも有用に用いることが
できる。

本発明のもたらす多くの利点としては、この検出方法の
容易さ、正確さ、および費用の低廉さが挙げられる０本
発明の他の利点、観点および実施態様は、以下の説明か
ら明らかとなるであろう。

以下の説明および実施例は、具体的には単純ヘルペスウ
ィルス（ＨＳＶ）に関するものであるが、本発明は本明
細書に記載するすべてのヘルペスウィルスに使用できる
と理解されたい、これらのウィルスの例としては、水痘
帯状ヘルペスウィルス、単純ヘルペスウィルスＩおよび
■型、サイトメガロウィルス、およびエプスタイン・バ
ールウィルスがある。これらのウィルスのうち、単純ヘ
ルペスウィルスＩおよび１１型が好ましい。

本発明の新規な方法では、ＨＳＶに感染したサンプルは
、通常の医学的、および微生物学的技法を用いて得る。

こうして得られたサンプルは、測定する抗原を含有して
いる。検定の感度を上げるには、ＨＳ　Ｖを破壊してＩ
（Ｓ　Ｖ表面にエピトープを露出させることによって、
ＨＳＶ抗体が結合することのできる抗原部位の数を増加
させるのが好適である。ウィルスを破壊するのに用いる
ことのできる通常の技法としては、可溶化剤、好ましく
はカオトロピック剤、特に好ましくは洗浄剤、たとえば
非イオン性洗浄剤によって処理することが挙げられる。

更に、検出感度を最大とするために、目的とする抗原を
捕捉する固体表面をシラン化剤を用いて誘導化すること
によって、固相への非免疫的結合を可能とする。抗原上
の反応性部位の数を増加させ、なおかつこれらの破壊し
たウィルス粒子の固体担体への吸着を増大させることに
よって、ＨＳＶの新規な検出方法が創出される。

シラン化剤、たとえばアミノアルキルトリアルコキシシ
ラン、またはハロトリアルキルシランを使用したガラス
１！Ｌ体の誘導化は、以下に説明する方法によって行う
ことができる。アミノアルキルトリアルコキシシランと
しては、３−アミノプロピルトリエトキシシランが好ま
しく　（「３−アミノプロピル」）、ｒ−（ｐ−アミノ
フェノキシ）プロピルトリエトキシシランが更に好まし
い（［ｐ−アミノフェニル」）、ハロトリアルキルシラ
ンとしては、クロロジメチルイソプロピルシラン（「ク
ロロジメチル」）が好ましい。

そこで、ジクロロメタンへの３−アミノプロピルトリエ
トキシシランの０．１％（Ｖ　／　Ｖ　）　溶？＆ヲ、
ソーダ石灰ガラス製ビーズ（シグマ）と、ピーズ１ｇ当
たりシラン溶液１．０−の比で組み合わせる。

ビーズを室温で約２時間かき混ぜる。シラン溶液をデカ
ントした後、ビーズを１容積のメタノール（シラン溶液
と等容積）中で５分間がきまぜ、溶液をデカントする。

もう−度量容積のメタノールを＋ａ用してビーズを洗い
、デカントする０次にビーズを減圧デシケータ中で約１
時間乾燥する。

ソーダ石灰ガラス製ビーズのかわりに、３−アミノプロ
ピルシラン化硼珪酸ガラス製試験官、またはシラン化ガ
ラス繊維フィルターを用いても、ＨＳ　Ｖについて同様
の結果が得られた。具体的には、１２Ｘ７５ａｇの硼珪
酸ガラス製試験官を、３−アミノプロピルトリエトキシ
シランのＣＨ，Ｃｌアへの０．１％（Ｖ／Ｖ）溶液を各
試験官に加えることによってシラン化した。試験管を垂
直方向で２時間回転さ−Ｕ、シラン溶液をデカントした
。各試験管にメ・タノールを１ｄずつ分注した後、チュ
ーブを５分間回転させ、デカントした。もう−度量容積
のメタノールを使用して、試験管を洗浄した。

試験管をデカン［・シ、約２時間「風燥」した。

硼珪酸ガラス製試験管をそれぞれ独立に、クロロジメチ
ルイソプロピルシランおよびγ−（ｐ−アミノフェノキ
シ）プロピル１−リエトキシンランでシラン化しても、
同じようにＩＩ　Ｓ　Ｖの優れた検出率を得るとかでき
た。これらの結果を得るのに使用した方法は、３−アミ
ノプロピルソラン化硼珪酸ガラス製試験管について先に
説明したのと、使用した特定のシラン化剤のみが異なる
以外は、実質的に同一である。

更に、ソーダ石灰ガラス製試験管をそれぞれ独立に、３
−アミノプロピルトリエトキシシラン、クロロジメチル
イソプロピルシラン、およびγ−（ｐ−アミノフェノキ
シ）プロピルトリエトキシシランでシラン化した場合に
も、ｔｉｓｖについて同様の結果が得られた。これらの
結果を得るのに使用した方法は、この場合も、固体担体
材料としてソーダ石灰ガラス製試験管を使用し、特定の
シラン化剤を使用した以外は、３−アミノプロピルソラ
ン化硼珪酸ガラス製試験管について先に説明したのと実
質的に同一である。

四級アミンガラス表面上での検定も、本発明で有用なこ
とを見出した。四級アミンガラス表面は、たとえば、３
−アミノプロピルガラスを１％ヨウ化メタン（ｃＨ，り
溶液中で温間することによって製造することができる。

本発明の好適実施態様では、Ｉ（Ｓ　Ｖは検定にとペッ
トで加える前に、蛋白質培地に加えておく。

蛋白質培地は抗原輸送培地として作用するのである。適
当な蛋白質培地としては、たとえば、２％ウシ胎児血清
を含有する最小必須培地（ＭＥＭ）、または０．５％ゼ
ラチンを含有するハンクス平衡塩類液がある。蛋白質培
地としては、２％ウシ胎児血清を含有するＭＥＭ　（ギ
ブコ＝Ｃ；１ｂｃｏ）を用いるのが好ましい。

本発明では、抗原の固体爪体への固定化の目的で、サン
プルを溶解条件に置いて、ウィルスを溶解（すなわら「
破壊Ｊ）ＬＨ３Ｖ抗原を暴露する。

溶解条件は、ウィルスを溶解させることが知られている
任意の通常の条件を用いることができる。

好適なのは、可溶化剤を使用する方法である。ウィルス
の破壊に有用な好適な可溶化剤の例どしては、非イオン
性洗浄剤、双性イオン性洗浄剤、およびカオトロピック
剤、たとえば尿素、チオシアン酸カリウム、およびグア
ニジンＨＣＩがある。

本発明で有用な非イオン性洗浄剤の例としては、オクチ
ルフェノールーエヂレンオキシド１ｉｖｉｉ（ノニデ・
）ｌニーＮｏｎ１ｄｅＬ　　Ｐ−４０■（ＮＰ−４０）
）　、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレ−１・
（トウィーン＝’ｒｗｅｅｎ　　２０■）、オクチルフ
ェノキシポリエトキシエタノール（１−リドン＝Ｔｒｉ
Ｌｏｎ　　Ｘ−１００＠）、およびＮ−オクチル−β−
Ｄ−グリコピラノシドがある。これらの非イオン性洗浄
剤のうち、ＮＰ−４００が好適である。双性イオン性洗
浄剤としては、たとえば、Ｎ−テトラデシル−Ｎ、　Ｎ
〜ジメチル−３−アンモニオ−■−ブロバンスルホネー
１・（ツヴインタージェンｌ−＝Ｚｗｉｔｆ、ｅｒ（Ｈ
ｅｎｔ３−１４＠）、および３−（（３−コラミドプロ
ピル）ジメチルアンモニオ）−１−ブロンパンスルボネ
ート（チャラプス−Ｃ１１Ａ　Ｐ　Ｓ　）がある、これ
らの可溶化剤の任意のものを蛋白質培地に加えることに
よって、本発明の方法を用いることで得られる結果にみ
られる優れた感度および感受性が達成されるのである。

本発明では、検定するＨ　Ｓ　Ｖ抗原を含有する輸送培
地を、シラン化したガラス固体担体と接触させる。測定
する■Ｉ　Ｓ　Ｖ抗原と、シラン化したガラス固体担体
」二に見つかることのあるいかなる物質との間にも、免
疫学的結合は存在しない、ＨＳＶ抗原を含有する輸送培
地と固体ｉ［１体とを十分な時間にわたって培養して、
Ｉ（Ｓ　Ｖ抗原を固体担体に吸着させる。

点画期間をおいた後、ＨＳ　Ｖ抗原で被覆した固体！■
体を、０．１％トウイーン２０＠を含有するリン酸緩衝
液（ＰＢＳＴ）で洗浄し、吸着されなかったウィルスお
よびｕｕｓｔ＋の破片を除去する。１−１ｓ■抗体を被
ＩＷＬ、た固体Ｉｕ体を、抗単純ヘルペスウィルス七ツ
ク１」−ナル抗体、好ましくは抗単純ヘルペスウィルス
マウスモノクローナル抗体、または抗単純へルベスウィ
ルスボリクローナル抗体、好ましくは抗単純ヘルペスウ
ィルスウサギボリクｌ」−ナル抗体と接触させる。得ら
れた混合物を十分な期間にわたって温間して、固体ｍ体
上で免疫複合体を形成させる。こうして形成された複合
体をＰ１３ＳＴで洗浄して、複合しなかった抗体を除去
する。

次に固体ｌｕ体」二の免疫複合体を、酵素標識を結合し
た抗グロブリンで処理する。得られた混合物を十分な期
間にわたって温間して、固体担体上で、抗体：抗ＨＳ　
Ｖ抗体：酵素標識抗グロブリン複合体を形成させる。こ
うして形成した？Ｍ合体をＰＢＳＴで洗浄して、結合し
なかった抗グロブリン結合体を除去する。抗グロブリン
に結合された特定の酵素標識によって触媒される基質を
、抗原：抗ＩＩ　Ｓ　Ｖ抗体；酵素標識抗グロブリン複
合体と接触させて酵素活性を誘導することによって、標
識効果を生じさせる。基質および上記複合体を温間し、
酵素反応を適当な停止剤で停止させる。・次に、反応し
た基質を、たとえば分光光度計を使用することによって
読みとる。

「誘導化固体担体」という用語は、抗体に対して吸着性
の表面アミノまたはアルキル基を有する不溶性材料をさ
す、誘導化を行うことのできる公知の材料には、ガラス
、硼珪酸、ソーダ石灰、シリカ、セルロース、祇などが
ある。固体担体は、構造式： を有するアミノトリアルコキシシランを用いて誘導化す
ることができ、ここでＲ１、Ｒ”およびＲ３はそれぞれ
独立に、それぞれ１〜１０個の炭素原子を含むアルキル
２ｋ、そしてＸは１〜１０個の炭素原子を含むアルキル
、アリール、またはアリーロキシアルキル基である。

これらのアミノトリアルコキシシランのうち、式中のＲ
１、Ｒ１およびＲ３がそれぞれ独立に、それぞれ１〜４
個の炭素原子を含むアルキル基で、Ｘが１〜４個の炭素
原子を含むアルキル基、フェニル基、またはアルキル基
が１〜４個の炭素原子を含むフェノキシアルキル基であ
るシランが好ましい、特に好適なのは３−アミノプロピ
ルトリエト−１−ジシランで、更に好適なのがｒ−（ｐ
−アミノフェノキシ）トリエトキソシランである。

また、固体（ｕ体を構造式 Ｒ２−人じＸ 占・ を有するハロトリアルキルシランで３Ｍ　ｉ化すること
もでき、ここでＲ１、Ｒ１およびＲ３はそれぞれ独立に
、それぞれ１〜ＩＯ個の炭素原子を含むアルキル法、そ
してＸはハロゲン原子である。これらのハロトリアルキ
ルシランのうち、式中のＲ、Ｒ″′及びＲ３がそれぞれ
独立に、それぞれ１〜４個の炭素原子を含むアルキル基
であるシランが好ましい、特に好適なのはクロロジメチ
ルイソプロピルシランである。

さらにまた、アミン誘導化表面を各種の反応物質、たと
えばヨウ化メチルを用いて四級化することもできる。

固体担体は、ビーズ、管、ストリップ、ディスク、微量
滴定プレート、ガラス繊維フィルターなどの形状とする
ことができ、ガラスピーズとするのが好ましく、ガラス
管とするのが更に好ましい。

「−次抗体」という用語は、一種以上の系統のヘルペス
ウィルスの抗原と、「免疫反応性」であるモノクローナ
ルまたはポリクローナル抗体のことをさし、これはヒト
またはヒト以外の種、たとえばウサギ、ヤギなどから得
られる。−次抗体、即ち、抗単純ヘルペス抗体は、好ま
しくは、抗１■ＳＶマウスモノクローナル抗体、更に好
ましくは抗ＨＳ　Ｖウサギポリクローナル抗体で、これ
は市販されている（ダコーＤ　ａ　ｋ　ｏ　）　ｅ［二
次抗体」という用語は、抗単純ヘルペス抗体が由来する
種に特異的な抗グＣｌプリンをさし、これはヒト以外の
種、たとえばヤギ、ウサギなどから得られる。

「−次抗体」は通常の蛍光染料１．酵素、または放射能
標識で直接標識して、固体担体上に結合してｔｌ　Ｓ　
Ｖ抗原を測定することができる。また、「二次抗体」を
通常の方法で蛍光染料、酵素、または放射能標識で標識
することもできる。酵素で標識した「二次抗体」を用い
ることが好ましい。

酵素の例としては、酸化酵素、加水分解酵素、溶解酵素
、脱炭酸酵素などがある。酵素としてはホースラデイツ
シュベルオキシダーゼが好ましい。

標識複合体を形成した後、酵素の基質を標識複合体と反
応させ、酵素の測定を通常の比色分析、蛍光測定、また
は分光分析技術によって行う、好適な酵素と相補的であ
り、したがって、好適であるのは、３，３°、５．５’
　−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）である。

〔実施例〕

当業者が本発明をよりよ（理解できるように、以下の具
体的実施例を挙げるが、本発明はこれらによって限定さ
れるものではない。

実施例１ この実施例は、本発明のシラン化ガラスピーズの製造を
例示する。この検定で用いたガラスピーズは、３−アミ
ノプロピルトリエトキシシランでシラン化したソーダ石
灰ガラスで、本発明ではこれを「３−アミノプロピルガ
ラス」と称する。以下にこの°９工程の製造方法を説明
する。

第１工程ニジラン化したガラスとシラン化していないガ
ラスを比較するために、約１００１１ｇの７０〜１５０
μのガラスピーズ（シラン化したもの、及びシラン化し
ていないもの）を、プラスチック製ミニカラムの底部に
挿入した多孔質ガラス上に置いた。Ｉ（ＳＶａ検定の間
にビーズが移動しないように、第二ディスクをビーズ上
にしっかり挿入した。これらのカラムでは、通常重力流
のみを使用してＨＳＶの検定を行うが、流速を増大させ
るために加圧または減圧を適用しても良い、このカラム
の空隙率は０．２−以下であった。すべての反応物につ
いて過剰量（３００μｌ）を使用して、それ以前に加え
た反応物質をカラムから確実に除去した。

第２工程：ＡＴＣＣ番号がＶＲ−７３４であるＨ　Ｓ　
ＶをＡＴＣＣ番号がＣＣＬ２３であるｔｌ　Ｅｐ−２細
胞中で成長させることにより、ＨＳ　Ｖ抗原を！Ｊｉｌ
製した。陰性対照としてＨＳＶに感染させていないｌ（
Ｂ　ｐ　−２細胞を使用して、検定のバックグラウンド
信号を測定した＊３００１ｔ１．のサンプル（ＩＩＳＶ
に感染させたＨ　Ｅ　ｐ　−２及び感染させていないＨ
Ｕ！、ｐ−２）を２％のウシ胎児血清と１％のＮＰ−４
０＠洗浄剤（ｐ　Ｈ７，５）を含有する最少必須培地（
ＭＩＦ、Ｍ）（ギブコ−Ｇｉｈｃｏ）に希釈し、これを
カラムにピペットで加えた。希釈サンプルは、ＭＥＭ希
釈剤への１：ｉｏｏ及び１：５００の２種の濃度のもの
を調製した。

第３工程：　ＨＳＶサンプルをカラム上で室温にて１分
間温室し、０．１％のトゥイーン２０（Ｔｈｅθロ　２
０＠）を含イ１するリン酸緩ｉ）Ｉ液（１’１３ＳＴ）
２ｍｌで洗浄した。

第４工程１００μ！＋７）つ（ツギ−ＨＳ　Ｖ抗体（ダ
コーＤａｋｏ、９０％のウシ胎児血清／リン酸緩衝液に
１　：　１０００で希釈）をカラムにピペットで加え、
室温で１０分間温置した。

第５工程二カラムを５４のＰＢＳＴで洗浄し、３００μ
ｅのヤギ抗ウサギ抗体−ホースラディッシュベルオキシ
ダーゼ結合体（バイオラッド−旧ｏ−ＲＩ］ｄ　、　２
０％のウシ胎児血清／リン酸ＩＡ衡液でｉ：３ｏｏｏに
希釈）をカラムにピペットで加えた。

第６エ程二結合体をカラム中で室温で１０分間温置し、
過剰分を５ｄのＰＢＳＴ′７！洗浄した。

第７エ程＝３０μ２のＴＭＢ　（３，：Ｉ　、５５゛　
−テトラメチルベンジジン）＆’Ｊｌｔを各カラムにピ
ペットで加えた。３−アミノプロピルガラス製ビーズの
入ったミニカラムに基質のみを流すことによって、基質
ブランクを製造した。

第８工程二基質を室温で２分間温置した。温間後、ガラ
ス製採取管に入れ、３００ＯＮの２　Ｎ　ＨＣ＋をカラ
ムにピペットで加えて反応を停止させた。

第９工程：各採取管からの２００μｌの反応済基質をマ
イクロタイター（＠量滴定）プレートのウェルにピペッ
トで加え、プレートを分光光度計で４５０ｎｍにて読み
とった。結果を第１表に示す。

第１Ａ表及び第１Ｂ表には、３−アミノプロピルガラス
製ビーズではｔｌｌ　純ヘルペスウィルスの検出率が増
大することを示すデータ８挙げである。

表中に示したデータは各組の反復試験の平均である。第
１Ａ表は、非誘導化ガラス上で１１　Ｓ　Ｖを検出した
際のデータを示す、第１８表は、３−アミノプロピルガ
ラス上でＩＩ　Ｓ　Ｖを検出した際のデータを示す、各
カラムについての以下の説明は両方の表についてのもの
である。第１列は、各サンプルの希釈度を示す、このカ
ラムに示した陰性対照は、非感染Ｈ已ｐ−２細胞である
。第２列は、各サンプルについての４５０ｎｍでの光学
濃度（ＯｌＤ、　）の読取値を示す、第３列は、［Ｉ　
Ｓ　Ｖサンプルと陰性対照サンプルとの光学濃度の差を
示す。

第４列は、ＨＳ　Ｖサンプル対陰性コントロールの光学
濃度の比を示す、＋（ＳＶ抗原を３−・アミノプロピル
ガラスに固定化すると検出信号が実質的に増大すること
が明らかである。この種の信号の増大は、本発明によっ
て１ｔ！、度が上昇していることを示す一つの兆候であ
る。

ガラスピーズによ４錠の結果 ＜４５Ｏｎ謡での光学濃度の各読取イ直からは基質ブラ
ンク分を減算済）第１Ａ表 ３は唱胴ヒカ゛ラス ５Ｖ （１：　１００） ０．５２［＋ 第１Ｂ表 ０．２８１１ ２．２ ３−アミノブ口ピルガラス 実施例２ この実施例は、本発明のシラン化ガラス管の型造につい
てのものである。このガラス管は実施例１と同じシラン
化剤を用いてシラン化した硼珪酸ガラスである。試験方
法は以下の通りとした。

第１工程：実施例１と同様にして、ＨＳ　Ｖ感染及び非
感染ＨＥｐ２サンプルを、２％のウシ胎児血清及び１％
ＮＰ−４０８を含有するＭＥＭに、１　：　１２５．１
；２５０およびｌ：５００で希釈した。

第２工程：３ＯＯμ２のサンプルを、１２Ｘ７５の３−
アミノプロピルガラス管にピペットで加えた。ガラス管
を室温で２０分間垂直方向で回転させた（　１８０　ｒ
ｐｍ）。

第３工程ニガラス管を１ｄのＰｒ３ＳＴで２回洗浄した
。

第４工程；９０％ウシ胎児／リン酸緩衝液に１　：１０
００で希釈したウサギ抗ＨＳ　Ｖ抗体５００　ｇ　Ｎを
ガラス管に加えた。ガラス管を室温にて２０分間回転さ
せた（　１　Ｂ　Ｏｒｐｍ）。

第５工程二次にガラス管をＩ　ｍＨのＰ　Ｂ　Ｓ　Ｔで
３回洗浄した。

第６エ程；２０％のウシ胎児血清／リン酸緩衡液に１：
３０００で希釈したヤギ抗ウサギ抗体−ＩＩ　ＲＰ結合
体３００μ２をガラス管にピペットで加えた。ガラス管
を室温で２０分間回転させた（　１　Ｂ　Ｏｒｐｍ）。

第７エ程ニガラス管をｌ　ｍＱのＰＢＳＴで３回洗浄し
た。

第８工程：１０攬ｇの０−フェニレンジアミンジヒドロ
クロリドの１０ｄのリン酸クエン酸緩衝液（ＰＨ５，２
）への溶液、及び０．０３％の過酸化水素からなるＯＰ
Ｄ基質３００μ２をガラス管に加えた。シラン化ガラス
管に基質のみを加えることによって、基質ブランクを製
造した。室温で１０分間温直間た後、１００１ｊｆｆｉ
の２Ｎ硫酸（Ｈ、５０４）で反応をクエンチ（ｑｕｅｎ
ｃｈ）　した６第９工程：反応したｉ’１２００μｌを
マイクロタイタープレートのウェルにピペットで加え、
プレートを分光光度針で４９２ｎｍにて読み取った。

結果を第１表に示す。

第ＤＡ表及び第ｎ［３表には、土間の第１Ａ表及第１Ｂ
表で示したずべ°このデータを示す０本実施例のデータ
は、使用した担体の種類がガラス製試験管であるという
点が異なっている。

第１１Ａ表 Ｊμ唱町ヒカ゛ラス 第１１Ｂ表 ３−アミノブ口ピルガラス 実施例３ この実施例は、３−アミノプロピルシラン化硼珪酸ガラ
ス製試験管についての別の例である。この実施例も実施
例１と同じく、以下の９工程を含む。

第１工程：実施例１と同様にして、Ｈ３Ｖ感染及び非感
染ＩＩ　Ｅ　ｐ　−２サンプルを、２％のウシ胎児血／
／１及び１％のＮＰ−４０を含有するＭＥＭに、ｘ：ｔ
ｏｏで希釈した。

第２工程：３００ｕｌのサンプルを、１２×７５の３−
アミノプロピル硼珪酸ガラス管にピペットで加えた。ガ
ラス管を室温で２０分間垂直方向で回転させた（　ｉ　
８０　ｒｐｍ）、。

第３工程ニガラス管を２ｄのＰＢＳＴで１回洗浄した。

第４工程：９０％のウシ胎児血清／リン酸緩衝液に１：
１０００で希釈したウサギ抗ＨＳ　Ｖ抗体３００μｉを
ガラス管に加えた。ガラス管を室温にて２０分間回転さ
せた（　１　Ｂ　Ｏｒｐｍ）。

第５王程：次にガラス管を２１ｄの１）　Ｂ　Ｓ　Ｔで
１回洗浄した。

第６エ程：２０％のウシ胎児血清／リン酸緩ｉ負ｉ液に
１：３０００で希釈したヤギ抗ウサギ抗体−Ｉｔ　Ｒｌ
）結合体３００　／／　ｌをガラス管にピペットで加え
た。ガラス管を室温で２０分間回転させた（１１１０ｒ
ρ−）。

第７エ程ニガラス管を２ｍｌのＰＢＳＴで２回洗浄した
。

第８工稈：３００μ２のＴＭＢ　（３，３°、５５゛　
−テトラメチルヘンジジン）を試験管に加えた。シラン
化ガラス管に＆’ｆｆのみを加えることによって、基質
ブランクを製造した。室温で２分間温置した後、１００
μｌの２Ｎ塩酸（ＨＣＩ）で反応をクエンチした。

第９工程：反応した基質３００μ！をマイクロタイター
プレートのウェルにピペットで加え、プレートを分光光
度８１で４５０ｎｒｎにて読みとった。

実施例４ シラン化剤としてクロロジメチルイソプロピルシランを
使用した以外は、実施例３の手順を本質的な点について
はすべて繰り返した。

実施例５ シラン化剤としてｒ−（ｐ−アミノフェノキシ）プロピ
ルトリエトキシシランを使用した以外は、実施例３の手
順を本質的な点についてはすべて繰り返した。

第■表には、実施例３．４及び５の結果を示す。

１！　Ｓ　Ｖ抗原を、クロロジメチルイソプロピル／硼
珪酸ガラス及びｐ−アミノフェニル／硼珪酸ガラスのい
ずれに固定化しても、検出信号が有意に増大することが
明らかである。３−アミノプロピル／硼珪酸ガラス管の
データが以上の実施と比較すると、変動しているのは、
シラン化方法及び硼珪酸ガラスは不規則であったためで
ある。

第ｍ表 実施例に の実施例には、３−アミノプロピル／ソーダ石灰ガラス
製試験管の例を示す、試験方法は以下の通りである。

第１工程：実施例１と同様にして、Ｉｌ、ＳＶ惑感染び
非感染ＩＩ　Ｕ　ｐ　−２サンプルを、２％のウシ胎児
血清及び１％ＮＰ−４０を含有するＭＥＭに、１　：　
１００で希釈した。

第２工程：３００ｕｆｆｉのサンプルを、１２×７５の
３−アミノプロピルソーダ石灰ガラス製の試験管にピペ
ットで加えた。ガラス管を室温で２０分間垂直方向で回
転させた（１ＢＯｒｐｍ）。

第３工程ニガラス管を２ｄのＰＢＳＴで１回洗浄した。

第４工程：９０％のウシ胎児血清／リン酸緩衡液に１　
：　１０００で希釈したウサギ抗ＨＳ　Ｖ抗体３００μ
２をガラス管に加えた。ガラス管を室温にて２０分間回
転させた（　１　Ｂ　Ｏｒｐｍ）。

第７エ程ニガラス管を２ｄのＰＢＳＴで２回洗浄した。

第８工程：３００μ２のＴＭＢ　（３，３°、５゜５゛
　−テトラメチルベンジジン）基質をガラス管に加えた
。シラン化ガラス管にＷ！のみを加えることによって、
基質ブランクを製造した。室温で２分間温間した後、１
００６　ｌの２Ｎ塩酸（Ｉ　Ｃりで反応をクエンチした
。

第９工程；反応した基質３００μｌをマイクロタイター
プレートのウェルにピペットで加え、プレートを分光光
度計で４５０　ｎｍで読みとった。

結果を第■表に示す。

実施例７ シラン化剤としてクロロジメチルイソプロピルシランを
使用した以外は、実施例６の手順を木質的な点について
はすべて繰り返した。

実施例８ シラン化剤としてγ−（ｐ−アミノフェノキシ）プロピ
ルトリエトキシシランを使用した以外は、実施例６０手
順を本質的な点についてはすべて繰り返した。

第■表には、実施例６．７及び８の結果を示す。

第■表 実施例９ この実施例は、実際の患者からのサンプルに３−アミノ
プロピル硼珪酸ガラス製試験管を使用した例を示す。

陽性及び陰性のサンプルは臨床検査室から入手したもの
で、当業者に公知の培養技術を用いて予め試験しである
。陰性サンプルは、サンプルチューブ中の輸送培地に埋
没させた病変部のスワブとともに受領した。チ二−ブを
かきまぜ、スワブをチューブ中で発現させた。陽性のサ
ンプルはスワブなしで届けられた。いずれのサンプルも
そのままで、３μ２のＮＰ−４０８を含有する検定用試
験管にピペットで加えた。試験方法は以下の通りであっ
た。

第１工程：実施例１と同様にしてＨＳ　Ｖ感染ＨＥｐ−
２サンプル及びＨＳ　Ｖ非感染ＨＥ　ｐ　−２対照サン
プルを、２％のウシ胎児血清及び１％のＮＰ−４０８を
含有するＩＩＥＭに、１　：３００で希釈した。

第２工程：３００μ２のサンプルを、１２×７５の３−
アミノプロピルガラス製試験管にピペットで加えた。ガ
ラス管を室温で２０分間垂直方向で回転させた（　１８
０　ｒｐｍ）。

第３工程ニガラス管を２　ｒｘｌのＰＢＳＴで２回洗浄
した。

第４工程：５０％のウシ胎児血清／リン酸１７１　加液
にｌ　：　ｔｏｏｏの希釈度（ダコ）または１：１４２
９の希釈度（バイオラッド）で希釈したウサギ抗ＩＩ　
Ｓ　Ｖ抗体３００μｌをガラス管に加えた。

ガラス管を室温にて２０分間回転させた（１８０ｒｐｅ
Ａ）。

第５工程−次にガラス管を２ｄのＰＢＳＴで３回洗浄し
た。

第６エ程：２０％のウシ胎児血清／リン酸緩加液にｔ：
３ｏｏｏで希釈したヤギ抗ウサギ抗体−ＩＩ　ＲＰ結合
体３００ｕｆｆｉをガラス管にピペットで加えた。ガラ
ス管を室温で２０分間回転させた（　１８０　ｒｐｍ）
。

第７エ程ニガラス管を２Ｍ１のＰＢＳＴで３回洗浄した
。

第８工程＝】０ＩＲ１の０−フエニし・ンジアミンジヒ
ドロクロリドの１０　ｍｌのリン酸クエンＮｉ１ｄ衡液
（ｐｌ＋５．２）への溶液、及び０．０３％の過酸化水
素からなるＯＰＤ、ｌ￥ｔ３００μ２をガラス管に加え
た。シラン化ガラス管に基質のみを加えることによって
、基質ブランクを製造した。室温で１０分間；！！　’
ＩＩ　した後、ｌ　００　／７　Ｎの２Ｎ硫酸（Ｈ、５
０４）で反応をクエンチした。

第９工程；反応したｖＭ質２００μｌをマイクロタイタ
ープレートのウェルにピペットで加え、プレートを分光
光度計で４５０　ｎｍにて読みとった。

結果を第Ｖ表に示す、表中に示した結果は単一サンプル
のみについてのものである。一番人側の列には、患者か
らの各供試サンプルを、さらに陽性、陰性、及び対照サ
ンプルにそれぞれ分けて示す、残りの列は左から右へ、
ダコ社のウサギ抗Ｈ３■抗体とバイオラッド社のウサギ
抗１１　Ｓ　Ｖ抗体について得られたデータを、それぞ
れさらに、非誘導化ガラスと３−アミノプロピルガラス
で得られたデータにそれぞれ分けて示す。

臨床的に得られたＨ　Ｓ　Ｖ抗原を３−アミノプロピル
硼ＩＪ−酸ガラス上で固定化すると、陽性サンプルの検
出信号が増大し、陰性サンプルの非特異的信号が低減す
ることが明らかである。このような信号の増大には、ま
さしく本発明によって感度が上昇していることを示すも
う一つの兆候である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）サンプル中のヘルペスウィルスを検出するにあた
   り、 （ａ）上記サンプルを溶解条件に置いて、サンプル中に
   存在するすべてのヘルペスウィルスを破壊し、 （ｂ）上記サンプルをシランで誘導化した固体担体と接
   触させて、上記のようにして破壊したすべてのヘルペス
   ウィルスを疎水性相互作用のみによって固体担体上に、
   固定し、 （ｃ）工程（ｂ）の生成物を、上記の破壊したウィルス
   に特異的な一次抗体と接触させて、免疫複合体を形成し
   、 （ｄ）工程（ｃ）の生成物を、標識を付着させた二次抗
   体と接触させて、標識免疫複合体を形成し、そして （ｅ）上記標識免疫複合体を検出する工程よりなる方法
   。 （２）上記シラン誘導化固体担体が、構造式：▲数式、
   化学式、表等があります▼ を有するアミノトリアルコキシシランで処理された固体
   担体であり、 式中のＲ＾１、Ｒ＾２およびＲ＾３がそれぞれ独立に炭
   素原子数１〜１０のアルキル基であり、そしてＸが炭素
   原子数１０以下のアルキル、アリール、またはアリーロ
   キシアルキル基である請求項（１）記載の方法。 （３）上記アミノトリアルコキシシランが、３−アミノ
   プロピルトリエトキシシラン及びγ−（ｐ−アミノフェ
   ノキシ）プロピルトリエトキシシランよりなる群から選
   ばれる請求項（２）記載の方法。 （４）上記シラン誘導化固体担体が一般構造式：▲数式
   、化学式、表等があります▼ を有するハロトリアルキルシランで処理された固体担体
   であり、 式中のＲ＾１、Ｒ＾２およびＲ＾３がそれぞれ独立に炭
   素原子数１〜１０のアルキル基、そしてＸがハロゲン原
   子である請求項（１）記載の方法。 （５）上記ハロトリアルキルシランがクロロジメチルイ
   ソプロピルシランである請求項（４）記載の方法。 （６）上記のシラン誘導化固体担体が、ソーダ石灰ガラ
   スまたは硼珪酸ガラスである請求項（１）記載の方法。 （７）工程（ａ）が、上記サンプルを、非イオン性洗浄
   剤および双性イオン性洗浄剤よりなる群から選ばれる洗
   浄剤と接触させる工程である請求項（１）記載の方法。 （８）工程（ａ）が、上記サンプルを、尿素、チオシア
   ン酸カリウム、およびグアニジン塩酸塩よりなる群から
   選ばれた化合物と接触させる工程である請求項（１）記
   載の方法。（９）工程（ｄ）の上記の二次抗体が抗グロ
   ブリンである請求項（１）記載の方法。 （１０）工程（ｄ）の上記二次抗体に付着させた上記標
   識が酵素である請求項（１）記載の方法。