JPH02169581A - １，４‐ベンゾオキサジン‐２‐オン誘導体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は蛍光標識試薬として有用な新規１，４−ベンゾ
オキサジン−２−オン誘導体に関する。

（従来の技術） カルボキシル基を有する化合物を高感度に定量する方法
としては、カルボキシル基を有する化合物を定量可能な
誘導体に変換した後、高感度検出器で定量する手法がし
ばしば利用される。そして、その例としてカルボキシル
基を有する化合物を蛍光性誘導体に変換し、蛍光検出器
を利用して高感度に定量する方法がいくつか報告されて
いる。例えば４−ブロモメチル−７−ノドキシクマリン
法〔ダブリュー・デュンゲス（Ｗ、Ｄ　Ｑ　ｎｇｅｓ）
　、アナリティカル・ケミストリー（Ａｎａｌ、Ｃｈｅ
ｍ、）、４９，４４２（１９７７）　）　　；９−アン
スリルジアゾメタン法〔エヌ・ニムラ（Ｎ。

Ｎｉｍｕｒａ）　　ら、アナリティカル・レター（Ａｎ
ａｌ、Ｌｅｔｔ、）、旦、１９１（１９８０）　）　；
４−ブロモメチル−７−アセトキシクマリン法〔エッチ
・ツチャ（Ｈ，Ｔｓｕｃｈｉｙａ）ら、ジャーナル・オ
ブ・クロマトグラフィー（Ｊ。

Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ、）、２３１　、２４７（１９８
２）　　）　　；　３−ブロモメチル−６，７−シメト
キシー１−メチル−２（ＬＨ）−キノキサジノン法〔エ
ム・ヤマグチ（Ｍ、Ｙａｍａｇｕｃｈｉ）ら、ジャーナ
ル・オブ・クロマトグラフィー（Ｊ。

Ｃｈｒｏｍａ　ｔｏｇｒ、）、３４６−１２２７（１９
８５）　　）　　；３−ブロモメチル−６，７−メチレ
ンジオキシ−１−メチル−２（ＩＨ）−キノキサジノン
法〔エム・ヤマグチ（Ｍ、Ｙａｍａｇｕｃｈｉ）ら、ケ
ミカル・アンド・ファーマシューテイカル・プユレティ
ン（Ｃｈｅｍ、Ｐｈａｒｍ、Ｂｕｌｌ、）３６．２２６
３（１９８８））　　ｉｌ−ブロモアセチルピレン法〔
川原ら、特開昭５６−１１３７２８号〕；４−ブロモメ
チル−６，７−メチレンジオキシクマリン法〔川原ら、
特開昭６０−５６９８５号〕などである。

（発明が解決しようとする課Ｂ） しかしながら、カルボキシル基を有する化合物を蛍光性
誘導体に変換するめには水を含まない有機溶剤（例えば
アセトニトリルのようなニトリル類、アセトンのような
ケトン類、酢酸エチルのような有機酸エステル類など）
中で行なわれるが、これらの化合物はいずれも有機溶剤
に対する溶解性が低い。また、これらの化合物から誘導
される蛍光性誘導体の蛍光強度も不十分であった。

本発明者らは下記式（１）を有する化合物が有機溶剤へ
の溶解性に優れ、かつカルボキシル基を有する化合物と
反応して蛍光性の強い蛍光誘導体を形成すること、該Ｂ
Ｍ　導体は低濃度レベル（約１０−　”モル）で定量し
うることを見出して本発明を完成した。

（課題を解決するための手段） 本発明は式 を有する１、４−ベンゾオキサジン−２−オン誘導体に
関する。

式中、 Ｒ１およびＲ２は同一または異なって水素原子、水酸基
、低級アルキル基、低級アルコキシ基、モノもしくはジ
ー低級アルキルアミノ基を示すか、あるいはＲ１とＲ２
が一緒になって低級アルキレンジオキシ基を示す。

Ｒ３はハロゲノ低級アルキル基を示す。

ここに、Ｒ１および／またはＲ２が低級アルキル基であ
る場合、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプ
ロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、Ｓ−ブチル、Ｌ−ブ
チル、ｎ−ペンチル、イソペンチルのような炭素数１乃
至５個を有する直鎖状または分枝鎖状のアルキル基であ
り、特に炭素数１乃至３個を有するアルキル基が好適で
ある。

Ｒ１および／またはＲ２が低級アルコキシ基である場合
、例えばメトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプ
ロポキシ、ｎ−ブトキシ、イソブトキシ、Ｓ−ブトキシ
、ｔ−ブトキシ、ｎ−ペントキシ、イソペントキシのよ
うな炭素数１乃至５個を有する直鎖状または分枝鎖状の
アルコキシ基であり、特に炭素数１乃至３個を有するア
ルコキシ基が好適である。

Ｒ１および／またはＲ２がモノ−もしくはジー低級アル
キルアミノ基である場合、例えばメチル、エチル、ｎ−
プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、Ｓ
−ブチル、ｔ〜ブチル、叶ペンチル、イソペンチルのよ
うな炭素数１乃至５個を有する直鎖状または分枝鎖状の
アルキルを置換分として有する　　　　　　　　　　　
　　　アミノ基であり、特に炭素数１乃至３個を有する
直鎖状または分枝鎖状のアルキルを置換分として有する
孕＃＝４士゛アミノ基が好適である。

Ｒ１とＲ２が一緒になって低級アルキレンジオキシ基で
ある場合、例えばメチレンジオキシ、エチレンジオキシ
、メチルメチレンジオキシ、トリメチレンジオキシ、ジ
メチルメチレンジオキシ、エチルメチレンジオキシ、メ
チルエチレンジオキシ、テトラメチレンジオキシ、１−
メチルトリメチレンジオキシ、２−メチルトリメチレン
ジオキシ、エチルエチレンジオキシ、ｎ−プロピルメチ
レンジオキシ、ペンタメチレンジオキシのような炭素数
１乃至５個を有する直鎖状または分枝鎖状のアルキレン
ジオキシ基であり、特に炭素数１乃至３個を有するアル
キレンジオキシ基が好適である。

Ｒ３がハロゲノ低級アルキル基である場合、ハロゲン原
子としてフルオ）ｖ、クロル、ブロム、ヨードを置換分
として存するメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロ
ピル、ｎ−ブチル、イソブチル、Ｓ−ブチル、ｔ−ブチ
ル、ｎ−ペンチル、イソペンチルのてブロム、ヨードを
置換分として有する炭素数１乃至３個を有する直鎖状ま
たは分枝鎖状のアルキル基が好適であり、更にハロゲン
原子がアルキル基の１位に置換されているハロゲノアル
キル基が最適である。

本発明の前記一般式（１）を有する化合物において、好
適には、 Ｒ＋およびＲχは同一または異なって水素原子、低級ア
ルコキシ基、モノ−もしくはジー低級アルキルアミノ基
を示すか、あるいはＲ１とＲ２が一緒になって低級アル
キレンジオキシ基を示し、Ｒコはハロゲノ低級アルキル
基を示す。

更に好適には、 Ｒ１およびＲ２は同一または異なって水素原子、低級ア
ルコキシ基、七ノーもしくはジー低級アルキルアミノ基
を示すか、あるいはＲ１とＲ２が一緒になって低級アル
キレンジオキシ基を示し、Ｒ３はハロゲン原子としてブ
ロム、ヨードを置換分として有する低級アルキル基を示
し、特にハロゲン原子が１位に置換されているハロゲノ
低級アルキル基を示す。

前記一般式（１）を有する化合物としては、例えば次の
ような化合物を挙げることができる。

１．３−フルオロメチル−１，４−ベンゾオキサジン−
２オン゛ ２．３−クロロメチル−１，４−ベンゾオキサジン−２
オン ３．３−ブロモメチル−１，４＝ベンゾオキサジン−２
−オン ４．３−ヨードメチル−１，４−ベンゾオキサジン−２
オン ５、　３−（１−ブロモエチル）−１，４−ベンゾオキ
サジン２−オン ６、　３−（３−ヨードプロピル）−１，４−ベンゾオ
キサジン−２−オン ７、　３−（５−ブロモペンチル）−１，４−ベンゾオ
キサジン−２−オン ８、　３−７’ロモメチル−７−ヒドロキシ−１，４−
ベンゾオキサジン−２−オン ９．３−ヨードメチル−７−ヒドロキシ−１，４−ベン
ゾオキサジン−２−オン １０、３−（１−ブロモエチル）−６−ヒドロキシ−１
，４−ベンゾオキサジン−２−オン １１、３−（３−ヨードペンチル）−６−ヒドロキシ−
１，４ベンゾオキサジン−２−オン １２、３−（３−クロロブチル）−６，７−シヒドロキ
シー１．４−ベンゾオキサジン−２−オン １３、３−（２−フルオロエチル）−６，７−シヒドロ
キシー１．４−ベンゾオキサジン−２−オン １４．３−ブロモメチル−７−メチル−１，４−ベンゾ
オキサジン−２−オン １５．３−ヨードメチル−６−エチル−１，４−ベンゾ
オキサジン−２−オン １６．３−クロロメチル−６，７−シメチルー１．４−
ベンゾオキサジン−２−オン １７、３−（２−フルオロエチル）−７−イソプロビル
−１，４ベンゾオキサジン−２−オン １８、３−（２−フロモブロピル）−６−プチルー１４
−ベンゾオキサジン−２−オン １９、３−（１−ブロモペンチル）−７−ペンチルー１
４−ベンゾオキサジン−２−オン ２０．３−フロモメチル−７−メトキシ−１，４−ベン
ゾオキサジン−２−オン ２１、３−（１−ブロモエチル）−６−メドキシー１，
４−ベンゾオキサジン−２−オン ２２、３−（２−クロロエチル）−７−メドキシー１，
４−ベンゾオキサジン−２−オン ２３、３−（３−ヨードプロピル）−６−メドキシー１
．４−ベンゾオキサジン−２〜オン ２４、３−（４−フルオロペンチル）−６，７−ジメト
キシ１．４−ベンゾオキサジン−２−オン ２５．３−フロモメチル−７−エトキシ−１，４−ベン
ゾオキサジン−２−オン ２６、３−（３−ヨードプロピル）−６−ブロポキシー
１．４−ベンゾオキサジン−２−オン ２７、３−（１−フルオロプロピル）−７−プトキシー
１．４−ベンゾオキサジン−２−オン ２８．３−ヨードメチル−６−ペントキシ−７−メトキ
シ１．４−ベンゾオキサジン−２−オン ２９、３−（３−クロロプロピル）−７−ピッブトキシ
−１，４−ペンゾオキサジン−２−オン ３０．３−ブロモメチル−７−ｔ−ブトキシ−１，４−
ベンゾオキサジン−２−オン ３１．３−ブロモメチル−７−メチルアミノ＝ＩＩ４−
ベンゾオキサジン−２−オン ３２．３−ヨードメチル−６−メチルアミノ−１，４−
ベンゾオキサジン−２−オン ３３．３−クロロプロピル−７−ブロビルアミノー１，
４−ベンゾオキサジン−２−オン ３４、３−（４−ブロモブチル）−６−ペンチルアミノ
−１，４−ペンゾオキサジン−２−オン ３５、３−（５−フルオロペンチル）−６，７−シメチ
ルアミノー１．４−ベンゾオキサジン−２−オン３６．
３−ブロモメチル−７−シメチルアミノー１，４−ベン
ゾオキサジン−２−オン ３７．３−ヨードメチル−６−シエチルアミノー１，４
−ベンゾオキサジン−２−オン ３８、３−（１−フルオロエチル）−７−ジプロピルア
ミノ１．４−ベンゾオキサジン−２−オン ３９、３−（２−クロロエチル）−６−メチルエチルア
ミノ１．４−ベンゾオキサジン−２−オン ４０、３−（３−フルオロプロピル）−７−メチルブロ
ビルアミノー１，４−ベンゾオキサジン−２−オン４１
．３−ブロモメチル−６，７−メチレンジオキシ−１，
４−ベンゾオキサジン−２−オン ４２、３−（１−フルオロエチル）−６，７−メチレン
ジオキシ−１，４−ベンゾオキサジン−２−オン４３．
３−ヨードメチル−６，７−メチレンジオキシ−１，４
−ベンゾオキサジン−２−オン ４４、３−（１−クロロエチル）−６，７−エチレンジ
オキシ−１，４−ベンゾオキサジン−２−オン４５、３
−（５−ブロモペンチル）−６，７−エチレンジオキシ
−１，４−ベンゾオキサジン−２−オン４６、３−（２
−ヨードプロピル）−６，７−トリメチレンジオキシ−
１，４−ベンゾオキサジン−２−オン本発明の前記一般
式（Ｉ）を有する化合物は例えば以下に示す方法に従っ
て製造することができる。

（ｎ） （ＩＩＩ） （Ｉ） （式中、ｐｌ、　ｐｇおよびＲ２は前述したものと同意
義を示す。Ｒ４は低級アルキル基を示す。）第一工程は
前記一般式（ＩＩＩ）を有する化合物を製造する工程で
あり、前記一般式（Ｉｆ）を有する化合物（特開昭６３
−１４７７７号参照）をα−ケト酸（Ｒ’−ＣＯＣＯＯ
）Ｉ）またはそのエステル誘導体と反応させることによ
って達成される。

反応は例えばＥ、Ｂｉｅｋｅｒｔらの法（Ｃｈｅｍｉｓ
ｃｈｅＢｅｒｉｃｈｔｅ、　９４．１６６４（１９６１
））　、Ｄ、Ｇ、０ｒｐｈａｎｏｓらの法（Ｃａｎａｄ
ｉａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　
％　４４．１９７５（１９６６））　、Ｍａｒｉｅ−Ｔ
ｈ６ｒ４ｓｅ　Ｌａ　Ｂｒ１ｓ法（Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ
　１ｌｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　
、　２２．１２７５　（１９８５）　）に準じて実施さ
れる。即ち、前記一般式（Ｕ）を有する化合物１モルに
対して、α−ケト酸またはそのエステル誘導体１モル乃
至少過剰量を使用することによって好適に行なわれる。

反応は溶剤の存在下で好適に行なわれる。使用される溶
剤としては本反応に関与しないものであれば特に限定は
なく、例えばメタノール、エタノニル、ｎ−プロパツー
ルのようなアルコール類；エチルエーテル、テトラヒド
ロフランのようなエーテル類；塩酸、硫酸などの無機酸
を含む水；ギ酸、氷酢酸のような有機酸類等をあげるこ
とができる。これらは単独で、またはこれらの溶剤を混
和して使用することができる。特にアルコール類または
氷酢酸を含むアルコール類が好適に使用される。反応は
通常室温〜１００’Ｃで好適に行なわれる。反応時間は
主に使用される原料化合物の種類、反応温度などによっ
て異なるが通常１〜３０時間である。

第二工程は前記一般式（１）を有する化合物を製造する
工程であり、前記一般式（Ｉ［ｒ）を有する化合物をハ
ロゲン化剤と反応させることによって達成される。

反応は例えばｒＡｄｖａｎｃｅｄ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ」（Ｊ、Ｍａｒｃｈ著、第２版、５３
７頁（１９８４年）　％　ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌ１社出
版）に記載の方法、Ａ、Ｍａｒｑｕｅｔらの法（Ｔｅｔ
ｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　、９号、２４頁（
１９５９）　）に準じて実施される。即ち、使用される
ノ１０ゲン化剤としては例えばフェニルトリメチルアン
モニウム・トリプロミド、フェニルトリメチルアンモニ
ウム・トリイオダイドのようなハロゲニド類、ブロム、
ヨードのようなハロゲン類をあげることができる。反応
は溶剤の存在下で好適に行なわれる。

使用される溶剤としては本反応に関与しないものであれ
ば特に限定はなく、例えばエチルエーテル、テトラヒド
ロフラン、ジオキサンのようなエーテル頻；氷酢酸、無
水酢酸のような有機酸類等をあげることができる。特に
テトラヒドロフラン、氷酢酸が好適に使用される。反応
は通常Ｏ″Ｃ〜１２０゛Ｃで好適に行なわれる。特にハ
ロゲニド類を使用する場合はＯ℃〜１０’Ｃ位が好まし
く、ハロゲン類を使用する場合は１００°Ｃ位が好まし
い。反応時間は主に使用される原料化合物の種類、反応
温度などによって異なるが通常は３０分〜５時間である
。

特に第二工程は前記一般式（ＩＩ［）を有する化合物１
モルおよびフェニルトリメチルアンモニウム・トリハロ
ゲニド１モルをテトラヒドロフランに溶解し、豹５°Ｃ
で２０時間反応させるのが好ましい。

以上の各工程において得られた中間体および目的化合物
は、必要に応じてカラムクロマトグラフィーや再結晶に
付すことによって精製することができる。

（実施例） 次に実・施例をあげて本発明を更に詳細に説明するが、
本発明はこれらに限定されるものではない。

実施例１３−ブロモメチル−７−メドキシー１．４−ベ
ンゾオキサジン−２−オン ２−アミノ−５−メトキシフェノール２．７８ｇ（０，
０２モル）、エタノール３０ｍ１！および米酢、９７．
５＋ｎβの混合物にピルビン酸エチル２．１４　ｍｌ　
（０，０２モル）を加えて遮光上室温で一夜攪拌した。

反応終了後、反応混合物より黄燈色結晶が析出した。析
出した結晶を分取し、エタノールを用いて再結晶に付す
と融点１３１°Ｃを有する３−メチル−７−メドキシー
１．４ベンゾオキサジン−２−オン１．７７ｇ（収量４
６．５％）が得られた。

核磁気共鳴スペクトル：δｐｐｍ 重クロロホルム中、内部基準にテトラメチルシランを使
用して測定した核磁気共鳴スペクトル（９０ＭＨｚ）は
以下の通りである。

２．５２　（３Ｈ，Ｓ、　−Ｃ８４）　、３．８７　（
３Ｈ，Ｓ、　−０ＣＨ３）　１６．７５　（ＩＨ，ｄ。

Ｊ＝２．６Ｈｚ）　、　６．９０　（ＩＨ，ｄｄ、　Ｊ
＝２．６および８．８Ｈｚ）　、　７．６０（１）１．
ｄ、Ｊ・８．８１１ｚ） 得られた３−メチル−７−メドキシー１．４−ベンゾオ
キサジン−２−オン１．９１ｇ（０，０１モル）をテト
ラヒドロフラン２０ｍｆに溶解し、次いで水冷下でフェ
ニルトリメチルアンモニウム・トリプロミド３．７６ｇ
（０，０１モル）を加えた後、冷所でゆっ（り一夜攪拌
した。反応終了後、反応混合物にエチルエーテル５０ｍ
ｆを加え、次いで順次０．１モル硫酸水素ナトリウム２
５　ｃａｌ、　０．１モル炭酸水素ナトリウム２５ｍ１
および水２０ｎ＋１！、で洗浄した。有機層を分取し、
硫酸ナトリウムで乾燥後、溶剤を窒素ガスを吹きつけて
留去した。得られた残渣をｎ−ヘキサン−ジクロロメタ
ン（１：　１）を移動相としたシリカゲルカラムクロマ
トグラフィーに付して精製した。得られた残渣を更にｎ
−ヘキサン−ジクロロメタン（にｍｌ）を用いて再結晶
に付すと融点１５０　’Ｃを有する所望の３−ブロモメ
チル−７−メドキシー１，４−ベンゾオキサジン−２−
オン１．６１ｇ（収量６２％）が淡黄色プリズム晶とし
て得られた。

核磁気共鳴スペクトル：δｐｐｍ 重クロロホルム中、内部基準にテトラメチルシランを使
用して測定した核磁気共鳴スペクトル（９０ＭＨｚ）は
以下の通りである。

３、９０　（３Ｈ，ｓ、　−０ＣＨ３）　、　４．５４
　（２Ｈ，ｓ　、　−ＣＨｚＢｒ）　、　６．７８（Ｉ
Ｈ。

ｄ、Ｊ＝２．６Ｈｚ）、６．９４（ＩＨ，ｄｄ、Ｊ＝２
．６および８．８８２）　、　７．６７（１）１．ｄ、
Ｊ＝８．８Ｈｚ） 実施例２３−ブロモメチル−６，７−メチレンジオキシ
−１，４−ベンゾオキサジン−２−オン点１５８℃を有
する所望の３−フロ上メチル−６，フーメチレンジオキ
シ−１，４−ベンゾオキサジン−２−オン１．２ｇ　（
収量４２％）が鮮黄色針状晶として得られた。

核磁気共鳴スペクトル：δｐｐｍ 重テトラヒドロフラン中、内部基準にテトラメチルシラ
ンを使用して測定した核磁気共鳴スペクトル（９０Ｍｔ
ｌｚ）は以下の通りである。

４．５３（２８，ｓ、−Ｃ１１２Ｂｒ）、６．１３（２
Ｈ，ｓ、−０ＣＨｚＯ−）、６．７９（ＬＨ，ｓ）、７
．１２（ＩＨ，ｓ） 実施例３３−ブロモメチル−７−シメチルアミノー１．
４−ベンゾオキサジン−２−オン ３−メチル−６，７−メチレンジオキシ−１，４−、ベ
ンゾオキサジン−２−オン（Ｄ、Ｇ、０ｒｐｈａｎｏｓ
ら、’ＣａｎａｄｉａｎＪｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙｊ、　４４．１７９５（１９６６）　）　
２．０５ｇ（０，０１モル）をテトラヒドロフラン３５
０ｍ　ｌに溶解し、次いで水冷下でフェニルトリメチル
アンモニウム・トリプロミド３．７６ｇ　（０，０１モ
ル）を加えた後、冷室でゆっくり一夜攪拌した。反応終
了後、反応混合物を以下、実施例１と同様に処理して融
３〜メチル−７−シメチルアミノー１．４−ベンゾオキ
サジン−２−オン（Ｍａｒｉｅ−Ｔｈ≦ｒｊｓｅ　Ｌａ
　Ｂｒ１ｓ、ｒＪｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｈｅｔａｒｏｃ
ｙｃｌｉｃ　ＣｈｅｙｎｉｓｔｒｙＪ　、２２．１２７
５（１９８５））　２．０８ｇ（０，０１モル）を氷酢
酸２０ｍｊ’に溶解し、次いで無水酢酸ナトリウム２．
３ｇおよび２．０？１ブロムの氷酢酸溶液１０ｍ２を加
えて１００°Ｃで１０分間攪拌した。反応終了後、反応
混合物を放冷し、次いでエチルエーテル６０ｍｊ２を加
え、生成する沈澱を除去した。得られた有機層より溶剤
を留去した。得られた残渣をｎ−ヘキサン−ジクロロメ
タン（１：　１）を移動相としたシリカゲルカラムクロ
マトグラフィーに付して精製すると融点１９２°Ｃを有
する所望の３−ブロモメチル−７−シメチルアミノー１
゜４−ベンゾオキサジン−２−オン０．４６ｇ　　（収
量１６．１％）が鮮黄色プリズム品として得られた。

核磁気共鳴スペクトル；δｐｐｍ 重クロロホルム中、内部基準にテトラメチルシランを使
用して測定した核磁気共鳴スペクトル（９０ＭＨｚ）は
以下の通りである。

２．５０（６Ｈ，ｓ、　（ＣＨ：＋）ｚＮ−）、４．５
５（２Ｈ，ｓ、−ＣＨｚＢｒ）、６．４３（１）１．ｄ
、Ｊ＝２．７Ｈｚ）、６．６６（ＩＨ，ｄｄ、Ｊ＝２．
７および９．０Ｈｚ）。

７．５３（ＩＨ，ｄ、Ｊ＝９．０Ｈｚ）実施例４３−ブ
ロモメチル−７−メチノＸ４−ベンゾオキサジン−２−
オン ２−アミノ−４−メチルフェノール（市販品）２．４６
ｇ（０，０２モル）をエタノール３０ｍｊ２に溶解した
後、ピルビン酸エチル２．１４　ｍｌ　（０，０２モル
）を加え、更に氷酢酸７ｍＩ！、を加えて室温で２日間
撹拌した。

反応終了後、反応混合物より析出した結晶を分取すると
融点１５６°Ｃを有する３、７−シメチルー１．４−ベ
ンゾオキサジン−２−オンの粗結晶０．８２ｇ　　（収
量２２．９％）が得られた。

核磁気共鳴スペクトル＝δｐｐｍ 重クロロホルム中、内部基準にテトラメチルシランを使
用して測定した核磁気共鳴スペクトル（９０ＭＨｚ）は
以下の通りである。

２．４５（３Ｈ，ｓ、−ＣＨｚ）＋２．５６（３Ｈ，ｓ
、−ＣＨＩ）、７．０〜７．７（３Ｌｍ） 上記で得られた粗結晶０．５２５ｇ（０，００３モル）
をテトラヒドロフラン２５ｎ＋４２に溶解し、次いで水
冷下でフェニルトリメチルアンモニウム・トリプロミド
１．１３ｇ（０，００３モル）を加えた後、冷所で一夜
攪拌した。反応終了後、反応混合物を以下、実施例１と
同様に処理して融点１６３°Ｃを有する所望の３−ブロ
モメチル−７−メチル−１，４−ベンゾオキサジン２−
オン０．２３ｇ（収量３０％）が微細白色針状晶として
得られた。

核磁気共鳴スペクトル：δｐｐｍ 重クロロホルム中、内部基準にテトラメチルシランを使
用して測定した核磁気共鳴スペクトル（９０ＭＨｚ）は
以下の通りである。

２．４９　（３Ｈ，Ｓ、　−ＣＩ５）　、　４．５６　
（２Ｈ，ｓ、　−ＣＨ２Ｂｒ）　、　７．０〜７．８（
３８，ｍ） 実施例５３−ブロモメチル−１，４−ベンゾオキサジン
−２−オン ３−メチル−１，４−ベンゾオキサジン−２−オン（Ｅ
。

Ｂｉｅｋｅｒｔ　ら、Ｃｈｅｍｉｓｃｈｅ　Ｂｅｒｉｃ
ｈｔｅ、　９４．１６６４、（１９６１）　）　１．６
１ｇ（０，０１モル）をテトラヒドロフラン４０ｍ１に
溶解し、次いでフェニルトリメチルアンモニウム・トリ
プロミド３．７６ｇ（０，０１モル）を加えた後、冷所
で一夜攪拌した。反応終了後、反応混合物を以下、実施
例１と同様に処理して融点９５，８°Ｃを有する所望の
３−ブロモメチル−１，４−ベンゾオキサジン−２−オ
ン１．２ｇ　（収量５０．２％）が白色針状晶として得
られた。

核磁気共鳴スペクトル：δｐｐｍ ４−５６（２Ｈ＋ｓ＋−ＣＨｚＢｒ）、７．１〜７．９
　（４Ｈ，ｍ）実施例６ 前記一般式（１）を存する化合物において、Ｒ１および
／またはＲ２が水酸基である化合物は例えば４−アミル
ゾルシン塩酸塩（分解点２２０°Ｃ）などを用いること
によって製造できる。

（発明の効果） 本発明の化合物はいずれもカルボキシル基を有する化合
物に対して高い反応性を示し、得られた反応生成物は通
常使用される溶剤中（例えば水；メタノール、エタノー
ルなどのアルコール類；アセトン、メチルエチルケトン
などのケトン頻；エチルエーテノベテトラヒドロフラン
などのエーテル類；ベンゼン、トルエン、キシレンなど
の芳香族炭化水素類；ｎ−ヘキサン、ｎ−オクタンなど
の脂肪族炭化水素類；シクロヘキサンなどの脂環式炭化
水素類；酢酸メチル、酢酸エチルのような存機酸エステ
ル類：またはこれらの有機溶剤と水との混合溶剤）で強
い蛍光性を示す。この特性を利用して、従来微量分析定
量の困難であった各種脂肪酸のフェムトモル・レベルの
蛍光定量分析が可能となった。

以下に試験例を示す。

試験例１ 各種脂肪酸の２０〜１０００ピコモルを含むアセトニト
リル溶液０．５＋ｎｆ！、に、１．０＋＋＋Ｈの３−フ
ロモメチル−７−メトキシ−１，４−ベンゾオキサジン
−２−オンを含むアセトニトリル溶液０．１＋／！を加
え、更に「１８クラウン−６」を５．７ｍＭ含有する炭
酸カリウム飽和アセトニトリル溶液０．５ｍｆを加え４
０°Ｃで３０分間攪拌した。反応終了後、反応混合物の
一定量（２〜１０μりを採取し、高速液体クロマトグラ
フィーに付して各種脂肪酸を分離、定量した。

高速液体クロマトグラフィーの分析条件は次の通りであ
る。

カラム：　ＹＭＣｐａｃｋ　Ａ−３１２（山村化学■製
、６ｍｍφＸ　１５０ｍｍ） 移動相ニアセトニトリル−１％酢酸（８０：２０）流速
：１．５＋ｎｆ／分 蛍光検出器：島津ＲＦ−５０００型（■島津製作所）励
起波長；　３５５ｎｍ 蛍光波長：　４３０ｎｍ 結果を図１に示す。

図１において、横軸は溶出時間（分）を示し、縦軸は相
対的蛍光強度を示す。

また、図中、Ｃ６””ＣＩ４で示されるクロマトピーク
はそれぞれ Ｃ６：カプロン酸 Ｃ７：エナント酸 Ｃ８：カプリル酸 Ｃ１：ペラルゴン酸 Ｃ＋ｏ　　：カプリン酸 Ｃ１１＝ウンデシル酸 Ｃ１２：ラウリン酸 ＣＩ３ニトリデシル酸 ＣＩ４二ミリスチン酸 を示す。

図１から、各種脂肪酸の溶出時間は次の通りで図１から
明らかの通り、各種脂肪酸とも良好に分離され、検出感
度もノイズに対し３倍の感度（３３／Ｎ）を指標に測定
した結果、カプロン酸で１５フ工ムトモルの定量が可能
であった。

また、３−ブロモメチル−７−メドキシー１．４−ベン
ゾオキサジン−２−オンと直鎖飽和脂肪酸との反応生成
物は、保持ファクター（ｋ′）を１！、ｏｇスケールに
とり、炭素数の大きさに応じてプロットすると図２の如
く直線関係となるので、これから各種脂肪酸の種類を予
測することも可能である。

試験例２ ３−ブロモメチル−６，７−メチレンジオキシ−１，４
−ベンゾオキサジン−２−オンを用いて試験例１と同様
に実施して各種脂肪酸を分離、定量した。

高速液体クロマトグラフィーの分析条件は次の通りであ
る。

カラム：　ＹＭＣｐａｃｋ　Ａ−３１２（山村化学■製
、６ｍｍφＸ　１５０ｍｍ） 移動相ニアセトニトリル−１％酢酸（８０：　２０）流
速：　２．Ｏｍ！！、７分 蛍光検出器：島津ＲＦ−５０００型（■島津製作所）励
起波長：　３７６ｎｍ 蛍光波長：　４８０ｎｍ 結果を図３に示す。

図３において、横軸は溶出時間（分）を示し、樅軸は相
対的蛍光強度を示す。

また、図中、Ｃ６〜ＣＩ４は試験例Ｉと同意義を示す。

Ｃ１４はパルミチン酸を示す。

図３から、各種脂肪酸の溶出時間は次の通りで図３から
明らかの通り、各種脂肪酸とも良好に分離され、試験例
１と同様の効果が得られた。

試験例３　蛍光強度の測定 本発明の化合物とカプロン酸との反応生成物を試験例１
に記載の方法に準じて調製し、次いで得られた反応生成
物２　ｎｇ／ｍｌ！のエタノール溶液を蛍光検出器（島
津ＲＰ　−５０００型：　＠島津製作所）を用いてそれ
ぞれの蛍光分光スペクトルおよび蛍光強度を測定した。

結果を表１に示す。

表１ 即ち、本発明の化合物はカルボキシ基を有する化合物と
反応して強い蛍光誘導体を形成し、従来微量分析定量の
困難であったカルボキシル基を有する化合物の蛍光定量
分析が可能となった。

【図面の簡単な説明】

図１は３−ブロモメチル−７−メドキシー１，４−ベン
ゾオキサジン−２−オンを用いての各種脂肪酸の分離・
定量を示す。横軸は溶出時間を示し、縦軸は相対的蛍光
強度を示す。 図２は３−ブロモメチル−７−メドキシー１，４−ベン
ゾオキサジン−２−オンを用いての各種脂肪酸の分離・
定量を示す。横軸は各種脂肪酸を示し、縦軸は保持ファ
クター（ｋ′）を示す。 図３は３−ブロモメチル−６，７−メチレンジオキシ−
１，４−ベンゾオキサジン−２−オンを用いての各種脂
肪酸の分離・定量を示す。横軸は溶出時間を示し、縦軸
は相対的蛍光強度を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、式 ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） を有する１，４−ベンゾオキサジン−２−オン誘導体。 但し、式中 Ｒ＾１およびＲ＾２は同一または異なって水素原子、水
   酸基、低級アルキル基、低級アルコキシ基、モノもしく
   はジ−低級アルキルアミノ基を示すか、あるいはＲ＾１
   とＲ＾２が一緒になって低級アルキレンジオキシ基を示
   す。 Ｒ＾３はハロゲノ低級アルキル基を示す。