JPH0216968A - リボフラビン過剰生産株 - Google Patents
リボフラビン過剰生産株Info
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- JPH0216968A JPH0216968A JP1127989A JP12798989A JPH0216968A JP H0216968 A JPH0216968 A JP H0216968A JP 1127989 A JP1127989 A JP 1127989A JP 12798989 A JP12798989 A JP 12798989A JP H0216968 A JPH0216968 A JP H0216968A
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- riboflavin
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- candida
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/02—Preparation of hybrid cells by fusion of two or more cells, e.g. protoplast fusion
- C12N15/04—Fungi
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P25/00—Preparation of compounds containing alloxazine or isoalloxazine nucleus, e.g. riboflavin
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、リボフラビン生産のためのカンジダ・フラレ
リ、（Ｃａｎｄｉｄａ ｆｌａｒｅｒｉ）のフラビン生
産株に関する。
リ、（Ｃａｎｄｉｄａ ｆｌａｒｅｒｉ）のフラビン生
産株に関する。
最も通常には酵素補因子であるビタミンＢ２として知ら
れているリボフラビンはある程度までほとんどすべての
天然に存在する食物中に見い出されている。リボフラビ
ンは広く薬、食品強化および飼料補強に用いられている
。
れているリボフラビンはある程度までほとんどすべての
天然に存在する食物中に見い出されている。リボフラビ
ンは広く薬、食品強化および飼料補強に用いられている
。
リボフラビンは醗酵によって商業的に生産されてきた。
最も商業的に生産されるリボフラビンは動物飼料を強化
するだめの粗製濃厚物として消費される。リボフラビン
はヒトによる消費に対してもその用途を見い出している
。本発明は有効かつ経済的なリボフラビンの生産に対す
るカンジダ・フラレリ株の開発に関するものである。
するだめの粗製濃厚物として消費される。リボフラビン
はヒトによる消費に対してもその用途を見い出している
。本発明は有効かつ経済的なリボフラビンの生産に対す
るカンジダ・フラレリ株の開発に関するものである。
カンシタ酵母の変種はフラビン生産性生物として魅力的
である。なぜならば、これら変種はよく知られている単
純培地上で迅速に増殖するからである。ピー、アール、
パークホルダー（Ｐ、Ｒ，Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ） 、
ブロク、ナト、アカド、 −’Ｉ−’ｒ、 、ニーニス
、 ｘ −（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ、Ａｃａｄ、 Ｓｃ
ｉ、、Ｕ、Ｓ、Ａ、）（１９４３年Σ本し１６６ 。
である。なぜならば、これら変種はよく知られている単
純培地上で迅速に増殖するからである。ピー、アール、
パークホルダー（Ｐ、Ｒ，Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ） 、
ブロク、ナト、アカド、 −’Ｉ−’ｒ、 、ニーニス
、 ｘ −（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ、Ａｃａｄ、 Ｓｃ
ｉ、、Ｕ、Ｓ、Ａ、）（１９４３年Σ本し１６６ 。
カンジダ・フラレリは多くの年月にわたってそのフラビ
ン生産能について研究されてきた。例えば、エナリ（Ｂ
ｎａｒｉ）およびカラピネン（Ｋａｕｐｐｉｎｅｎ）、
アクタ、ケム、スカンド、（Ａｃｔａ、 Ｃｈｅｍ、
５ｃａｎｄ）（１９６１年）１５：１５１３を参照され
たい。とりわけ、リボフラビン生産への鉄および微量元
素の阻害作用が研究されてきた。タナ−（Ｔａｎｎｅｒ
）等、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ） （１９４５年）
１０１ ：］Ｂ８ｏこれまで、カンジダ・フラレリによ
るリボフラビン生産は極めて変化しやすいということが
証明された。非滅菌単純培養基を用いた初期のパイロッ
トプラント醗酵は３２５＋＋＋ｇ／Ａのリボフラビン収
率を与えた。レヴイン、エイチ、 （Ｌｅｖｉｎｅ、
Ｈ，）等、インダストリアル・アンド・エンジニアリ
ング・ケミストリー（Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ａｎｄ
Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）（１９
４９年）４１：１６６５゜ ある種のカンジダ酵母の変種は実質量のリボフラビンを
生産することが知られている。例えば、新たに単離され
たラクトースおよびエタノール同化性微生物であるカン
ジダ・インターメディア・ヴアラエテ４−−ｘ−（Ｃａ
ｎｄｉｄａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ ｖａｒＡ）を用い
た変法が特公昭箱４８−１９．９５８号明細書に開示さ
れており、４９．２ｍｇ！Ｊボフラビン／１の収率が報
告されている。カンジダＴ−３もメタノールからリボフ
ラビンを生産する。これは時開昭第５１−１９，１８７
号明細書に開示されている。リボフラビン生産に対して
カンジダ・ロブス９ （Ｃａｎｄｉｄａｒｏｂｕｓｔａ
）を開示しているＢＰＡ ０１３７２２６も参照された
い。
ン生産能について研究されてきた。例えば、エナリ（Ｂ
ｎａｒｉ）およびカラピネン（Ｋａｕｐｐｉｎｅｎ）、
アクタ、ケム、スカンド、（Ａｃｔａ、 Ｃｈｅｍ、
５ｃａｎｄ）（１９６１年）１５：１５１３を参照され
たい。とりわけ、リボフラビン生産への鉄および微量元
素の阻害作用が研究されてきた。タナ−（Ｔａｎｎｅｒ
）等、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ） （１９４５年）
１０１ ：］Ｂ８ｏこれまで、カンジダ・フラレリによ
るリボフラビン生産は極めて変化しやすいということが
証明された。非滅菌単純培養基を用いた初期のパイロッ
トプラント醗酵は３２５＋＋＋ｇ／Ａのリボフラビン収
率を与えた。レヴイン、エイチ、 （Ｌｅｖｉｎｅ、
Ｈ，）等、インダストリアル・アンド・エンジニアリ
ング・ケミストリー（Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ａｎｄ
Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）（１９
４９年）４１：１６６５゜ ある種のカンジダ酵母の変種は実質量のリボフラビンを
生産することが知られている。例えば、新たに単離され
たラクトースおよびエタノール同化性微生物であるカン
ジダ・インターメディア・ヴアラエテ４−−ｘ−（Ｃａ
ｎｄｉｄａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ ｖａｒＡ）を用い
た変法が特公昭箱４８−１９．９５８号明細書に開示さ
れており、４９．２ｍｇ！Ｊボフラビン／１の収率が報
告されている。カンジダＴ−３もメタノールからリボフ
ラビンを生産する。これは時開昭第５１−１９，１８７
号明細書に開示されている。リボフラビン生産に対して
カンジダ・ロブス９ （Ｃａｎｄｉｄａｒｏｂｕｓｔａ
）を開示しているＢＰＡ ０１３７２２６も参照された
い。
増大したリボフラビン生産は突然変異したカンジダ株を
用いて達成される。リボフラビン生産性カンジダ株を用
いて出発し、この株を化学的および／または物理的突然
変異誘発処理および突然変異誘発処理株のプロトプラス
ト融合に付して、リボフラビンの有効な生産性を有しか
つプリンおよびリボフラビン生合成の阻害剤右よび鉄に
対して低減された感受性を有する株をつくり出す。突然
変異体ｄｇｒも単離され、増大したフラビン生産活性を
示した。
用いて達成される。リボフラビン生産性カンジダ株を用
いて出発し、この株を化学的および／または物理的突然
変異誘発処理および突然変異誘発処理株のプロトプラス
ト融合に付して、リボフラビンの有効な生産性を有しか
つプリンおよびリボフラビン生合成の阻害剤右よび鉄に
対して低減された感受性を有する株をつくり出す。突然
変異体ｄｇｒも単離され、増大したフラビン生産活性を
示した。
増大したリボフラビン生産に対する方法および生物を提
供する。リボフラビン生産性カンシタ株を選択し、これ
を突然変異誘発処理の過程に付し、この突然変異誘発処
理された株をフラビン生産に関連する特性をもつ変種に
ついてスクリーニング口、所望の突然変異体を融合し、
この融合子孫をスクリーニングして一層の突然変異誘発
処理に付して、安定でかつ再現性のあるレベルにおいて
高い効率でリボフラビンを生産する株を提供する。
供する。リボフラビン生産性カンシタ株を選択し、これ
を突然変異誘発処理の過程に付し、この突然変異誘発処
理された株をフラビン生産に関連する特性をもつ変種に
ついてスクリーニング口、所望の突然変異体を融合し、
この融合子孫をスクリーニングして一層の突然変異誘発
処理に付して、安定でかつ再現性のあるレベルにおいて
高い効率でリボフラビンを生産する株を提供する。
この株は、グリコースによるカタボライトリプレッショ
ンに対する耐性、およびアデニン代謝拮抗物質である４
−アミノピラゾロ（３，４−ｄ）ピリミジン（ＡＰＰ）
およびアデノシン−リン酸によるプリン経路の阻害に対
する耐性によりＢ２経路の低減された抑制を有している
。
ンに対する耐性、およびアデニン代謝拮抗物質である４
−アミノピラゾロ（３，４−ｄ）ピリミジン（ＡＰＰ）
およびアデノシン−リン酸によるプリン経路の阻害に対
する耐性によりＢ２経路の低減された抑制を有している
。
リボフラビン合成がフラビンアデニンジヌクレオチドお
よび／またはアデノシン−リン酸調節に対してもはや感
受性でないかまたは非感受性であり、ホスホリボシルビ
ロリン酸アミドトランスフェラーゼがアデニンおよびア
デノシンによる調節に対して低減された感受性を有し、
およびＡＰＰに対して実質的に非感受性である複数種類
の突然変異体が選ばれる。非感受性または抑制解除とは
。
よび／またはアデノシン−リン酸調節に対してもはや感
受性でないかまたは非感受性であり、ホスホリボシルビ
ロリン酸アミドトランスフェラーゼがアデニンおよびア
デノシンによる調節に対して低減された感受性を有し、
およびＡＰＰに対して実質的に非感受性である複数種類
の突然変異体が選ばれる。非感受性または抑制解除とは
。
突然変異体の生産率が、少なくとも５０％まで生産率を
低下させるであろう普通培地（ｎｕｔｒｉｅｎｔｍｅｄ
ｉｕｍ）中の濃度において影響を受けないことを意味
するのである。さらに、突然変異体は、野生型のカンジ
ダ・フラレリにおいて呼吸を抑制するレベルのデオキシ
グルコースに対する応答の欠如によって証明されるよう
に、カタボライトリプレッションに対して実質的に耐性
である。
低下させるであろう普通培地（ｎｕｔｒｉｅｎｔｍｅｄ
ｉｕｍ）中の濃度において影響を受けないことを意味
するのである。さらに、突然変異体は、野生型のカンジ
ダ・フラレリにおいて呼吸を抑制するレベルのデオキシ
グルコースに対する応答の欠如によって証明されるよう
に、カタボライトリプレッションに対して実質的に耐性
である。
本方法は突然変異誘発および融合の過程を含んでおり、
各段階で、プリンおよびリボフラビン代謝経路に関する
特性と組み合わせたリボフラビン生産の増大についての
スクリーニングを行なう。
各段階で、プリンおよびリボフラビン代謝経路に関する
特性と組み合わせたリボフラビン生産の増大についての
スクリーニングを行なう。
望ましくは、突然変異体は普通培地中でアミノ酸源の存
在において高いリボフラビン収率を提供する。
在において高いリボフラビン収率を提供する。
突然変異誘発処理は物理的または化学的突然変異誘発物
質を用いて実施しフラビン生産刺激培地中で生物を増殖
させる。フラビン生産を維持する添加剤は約０．１〜０
．３％、とりわけ約０．２〜０．２５％のレベルのグリ
シンを含んでいる。さらに、痕跡量のコバル） （ＩＩ
Ｉ）イオンおよび亜鉛イオンが望ましい。コバルト濃度
は一般に約０．５〜２趨／−１好ましくは約１硝／ｍｌ
の範囲であり、亜鉛濃度は一般に約５〜２５Ｎ／ｉｆ、
通常は約５〜１５■／−である。必要により、Ｆ、ｌ−
３が約０．１〜０．３■／ｍｆで存在していてもよい。
質を用いて実施しフラビン生産刺激培地中で生物を増殖
させる。フラビン生産を維持する添加剤は約０．１〜０
．３％、とりわけ約０．２〜０．２５％のレベルのグリ
シンを含んでいる。さらに、痕跡量のコバル） （ＩＩ
Ｉ）イオンおよび亜鉛イオンが望ましい。コバルト濃度
は一般に約０．５〜２趨／−１好ましくは約１硝／ｍｌ
の範囲であり、亜鉛濃度は一般に約５〜２５Ｎ／ｉｆ、
通常は約５〜１５■／−である。必要により、Ｆ、ｌ−
３が約０．１〜０．３■／ｍｆで存在していてもよい。
さらに、炭素源を使用し、大部分の糖質、例えば、グル
コース、スクロース、Ｄ−フルクトースおよびガラクト
ース等が許容され得る。スクロースの場合、その濃度は
一般に約１〜８％、好ましくは約６％である。
コース、スクロース、Ｄ−フルクトースおよびガラクト
ース等が許容され得る。スクロースの場合、その濃度は
一般に約１〜８％、好ましくは約６％である。
他の糖質について同等の濃度を使用することができる。
突然変異誘発および融合処理の種々の段階において、プ
リン生合成経路中の１種またはそれ以上の酵素を阻害す
る１種またはそれ以上の有機化合物を含んでいてもよい
定義された培地（フラビン生産刺激性であり、グリシン
以外のアミノ酸を欠いている）または複合培地（アミノ
酸を含有する富栄養培地）上で突然変異体をスクリーニ
ングする。ＡＭＰおよびＡＰＰに対する耐性がとりわけ
注目される。さらに、プリン生合成経路の抑制解除、と
りわけ経路の前半における、さらにとりわけ最初の３段
階または４段階における抑制解除に基づいて中間の突然
変異体を選択することができる。
リン生合成経路中の１種またはそれ以上の酵素を阻害す
る１種またはそれ以上の有機化合物を含んでいてもよい
定義された培地（フラビン生産刺激性であり、グリシン
以外のアミノ酸を欠いている）または複合培地（アミノ
酸を含有する富栄養培地）上で突然変異体をスクリーニ
ングする。ＡＭＰおよびＡＰＰに対する耐性がとりわけ
注目される。さらに、プリン生合成経路の抑制解除、と
りわけ経路の前半における、さらにとりわけ最初の３段
階または４段階における抑制解除に基づいて中間の突然
変異体を選択することができる。
得られた突然変異誘発処理物は、直前の親株より少なく
とも２０％増加のリボフラビン生産量を有しており、そ
して最終の突然変異体はもとの親株より少なくとも約５
倍、好ましくは少なくとも約１０倍増加のリボフラビン
生産量を有しかつ鉄に対する低減した感受性を有してい
る。
とも２０％増加のリボフラビン生産量を有しており、そ
して最終の突然変異体はもとの親株より少なくとも約５
倍、好ましくは少なくとも約１０倍増加のリボフラビン
生産量を有しかつ鉄に対する低減した感受性を有してい
る。
突然変異誘発は、物理的または化学的手段、例えば、紫
外線またはＸ線を用いた照射によって、または化学的な
突然変異誘発物質、例えば、ニトロソ化合物、例えばニ
トロソグアニジン、アルキル化化合物、例えばエチルメ
タンスルホネート、カラン（ｍｕｓｔａｒｄ）化合物、
ヒドラジンまたは亜硝酸等によって実施することができ
る。突然変異誘発に対する特定の技法は臨界的なもので
なく、通常の技法を用いることもできる。これらの突然
変異誘発の条件は一般的に生存性の低下をもたらす。
外線またはＸ線を用いた照射によって、または化学的な
突然変異誘発物質、例えば、ニトロソ化合物、例えばニ
トロソグアニジン、アルキル化化合物、例えばエチルメ
タンスルホネート、カラン（ｍｕｓｔａｒｄ）化合物、
ヒドラジンまたは亜硝酸等によって実施することができ
る。突然変異誘発に対する特定の技法は臨界的なもので
なく、通常の技法を用いることもできる。これらの突然
変異誘発の条件は一般的に生存性の低下をもたらす。
次いで、得られた突然変異体を、ＡＰＰまたはオキシグ
ルコースに対する耐性、プリン経路における抑制の喪失
、または鉄、ＡＭＰおよび／または複合培地（アミノ酸
を個々にまたはペプチドとして含んでいる）によるＢ２
合成の阻害の喪失についてスクリーニングすることがで
きる。
ルコースに対する耐性、プリン経路における抑制の喪失
、または鉄、ＡＭＰおよび／または複合培地（アミノ酸
を個々にまたはペプチドとして含んでいる）によるＢ２
合成の阻害の喪失についてスクリーニングすることがで
きる。
融合に対して、細胞壁を除去したプロトプラストを用い
る。チモラーゼ（ｚｙｍｏｌａｓｅ） 、とりわけアル
スロバクタ−・ルテウス（八ｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｌ
ｕｔｅｕｓ）からのもの、およびβ−グルクロニダーゼ
、とりわけへワックス・ボマチア（Ｈｅｌｉｘ ｐｏｍ
ａｔｉａ）からのもの、の混合物は効果的であることが
見い出された。望ましくは、突然変異株を栄養要求株と
して選択する。ここで、使用される各株は１種またはそ
れ以上のアミノ酸の生産のための１種またはこれ以上の
代謝経路を欠いている。次いで、形成されたヘテロカリ
オンを原栄養株として選択し、増大したリボフラビン生
産についてスクリーニングすることができる。
る。チモラーゼ（ｚｙｍｏｌａｓｅ） 、とりわけアル
スロバクタ−・ルテウス（八ｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｌ
ｕｔｅｕｓ）からのもの、およびβ−グルクロニダーゼ
、とりわけへワックス・ボマチア（Ｈｅｌｉｘ ｐｏｍ
ａｔｉａ）からのもの、の混合物は効果的であることが
見い出された。望ましくは、突然変異株を栄養要求株と
して選択する。ここで、使用される各株は１種またはそ
れ以上のアミノ酸の生産のための１種またはこれ以上の
代謝経路を欠いている。次いで、形成されたヘテロカリ
オンを原栄養株として選択し、増大したリボフラビン生
産についてスクリーニングすることができる。
突然変異誘発または融合の各段階において、もとの親株
より少なくとも２０％、好ましくは少なくとも約５０％
増加のリボフラビン生産が観察される。突然変異誘発お
よび融合の組み合わせを含む株変形の段階数は、少なく
とも３回で、好ましくは１０回より多くなく、好ましく
は約８回より多くない。
より少なくとも２０％、好ましくは少なくとも約５０％
増加のリボフラビン生産が観察される。突然変異誘発お
よび融合の組み合わせを含む株変形の段階数は、少なく
とも３回で、好ましくは１０回より多くなく、好ましく
は約８回より多くない。
突然変異誘発は任意の培地、例えば、フラビン生産刺激
培地中で行なうことができ、そして得られた生存してい
る突然変異誘発処理物をフラビン生産刺激培地中でスク
リーニングすることができる。本発明に従い、異なる突
然変異誘発剤を用いて突然変異体を得る。ある株につい
てはアデノシン−リン酸の存在下での増大したリボフラ
ビン生産を基準にし、他の株については増大したリボフ
ラビン生産右よびプリン生合成経路の初期段階における
抑制の欠如を基準にして、各突然変異誘発から株を選択
する。
培地中で行なうことができ、そして得られた生存してい
る突然変異誘発処理物をフラビン生産刺激培地中でスク
リーニングすることができる。本発明に従い、異なる突
然変異誘発剤を用いて突然変異体を得る。ある株につい
てはアデノシン−リン酸の存在下での増大したリボフラ
ビン生産を基準にし、他の株については増大したリボフ
ラビン生産右よびプリン生合成経路の初期段階における
抑制の欠如を基準にして、各突然変異誘発から株を選択
する。
次いで、各株を、特定のアミノ酸を欠く培地で増殖せず
かつその特定のアミノ酸を含有する培地で増殖するであ
ろうコロニーを決定することによってアミノ酸栄養要求
性について標識付けする。
かつその特定のアミノ酸を含有する培地で増殖するであ
ろうコロニーを決定することによってアミノ酸栄養要求
性について標識付けする。
本発明において、選択されるアミノ酸はヒスチジンおよ
びメチオニンである。栄養要求性の２つの株の各々をサ
ラカリダーゼ、とりわけチモラーゼおよびβ−グルクロ
ニダーゼの混合物を用いて処理してプロトプラストをつ
くり、これらを非イオン性界面活性剤の存在下に融合さ
せ引き続いてアミノ酸源を欠く普通培地に移す。得られ
る原栄養株をリボフラビン生産について試験し、増大し
たリボフラビン生産を有するものを選択する。
びメチオニンである。栄養要求性の２つの株の各々をサ
ラカリダーゼ、とりわけチモラーゼおよびβ−グルクロ
ニダーゼの混合物を用いて処理してプロトプラストをつ
くり、これらを非イオン性界面活性剤の存在下に融合さ
せ引き続いてアミノ酸源を欠く普通培地に移す。得られ
る原栄養株をリボフラビン生産について試験し、増大し
たリボフラビン生産を有するものを選択する。
次いで、融合した細胞を一層の突然変異誘発処理、この
場合には化学的突然変異誘発処理に付し、そして増大し
たリボフラビン生産について株を選択する。
場合には化学的突然変異誘発処理に付し、そして増大し
たリボフラビン生産について株を選択する。
特に注目される２株を単離した。これらをＧＡ１８Ｙ８
−６＃２ ｄｇｒ （ＡＴＣＣ寄託番号２０７５６）お
よびＧＡ１８Ｙ８−６＃２＃１１ （ＡＴＣＣ寄託番号
２０７５５）と名付けた（これらの株のＡＴＣ（１：へ
の寄託日は１９８５年５月２３日である）。
−６＃２ ｄｇｒ （ＡＴＣＣ寄託番号２０７５６）お
よびＧＡ１８Ｙ８−６＃２＃１１ （ＡＴＣＣ寄託番号
２０７５５）と名付けた（これらの株のＡＴＣ（１：へ
の寄託日は１９８５年５月２３日である）。
定義された培地において、これらの株は６日間で約５ｇ
リボフラビン／Ｉｌより多い量、通常は６日間で約７ｇ
リボフラビン／Ｉ！より多い量のリボフラビンを、５−
の指数増殖培養物を５０ｄの定義された培地に接種する
ことによって生産する〔この培地は４Ｂ＋０．２％グリ
シン＋ｃｏ ＋Ｚｎ ＋Ｆｅ＋１０％ＹＭＧ（２％グル
コース、酵母抽出物、ペプトンおよび麦芽抽出物）であ
る。２４時間毎、２艷の１０Ｘ４Ｂ＋グリシン＋Ｃｏ＋
Ｚｎを培養物に供給する〕。
リボフラビン／Ｉｌより多い量、通常は６日間で約７ｇ
リボフラビン／Ｉ！より多い量のリボフラビンを、５−
の指数増殖培養物を５０ｄの定義された培地に接種する
ことによって生産する〔この培地は４Ｂ＋０．２％グリ
シン＋ｃｏ ＋Ｚｎ ＋Ｆｅ＋１０％ＹＭＧ（２％グル
コース、酵母抽出物、ペプトンおよび麦芽抽出物）であ
る。２４時間毎、２艷の１０Ｘ４Ｂ＋グリシン＋Ｃｏ＋
Ｚｎを培養物に供給する〕。
突然変異誘発
メチルＮ′−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）または紫外
線を用いた突然変異誘発によって突然変異体を得た。カ
ンジダ・フラレリの最初の親株をＮＴＧを用いて突然変
異誘発処理した。この方法を用いて最初の親株であるカ
ンジダ・フラジＩＪ ＮＲＲＬＹ２４５の第１の培養で
突然変異体ＧＲ３を得た。親株の一夜間培養物２０−を
洗浄し、０．２％グリシンを添加した４Ｂ培地（４Ｂ培
地＝［定義された培地」〕２ｏｒｎｌ中に懸濁した〔パ
ークホルダー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ） 、ブロク、
ナトル、アカド、サイ。
線を用いた突然変異誘発によって突然変異体を得た。カ
ンジダ・フラレリの最初の親株をＮＴＧを用いて突然変
異誘発処理した。この方法を用いて最初の親株であるカ
ンジダ・フラジＩＪ ＮＲＲＬＹ２４５の第１の培養で
突然変異体ＧＲ３を得た。親株の一夜間培養物２０−を
洗浄し、０．２％グリシンを添加した４Ｂ培地（４Ｂ培
地＝［定義された培地」〕２ｏｒｎｌ中に懸濁した〔パ
ークホルダー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ） 、ブロク、
ナトル、アカド、サイ。
ニーｘスｘ−（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、 Ｓ
ｃｉ、 ［ｌ５Ａ）（１９４３年）２９：１６６ ）。
ｃｉ、 ［ｌ５Ａ）（１９４３年）２９：１６６ ）。
（グリシンを加えた４Ｂ培地は、１１の水に０．５ ｇ
のＫＨ２ＰＯ，，０，２ｇのＭｇ５Ｏ＜・７Ｈ２０，１
，８４ｇの尿素、６０ｇのスクロース、１ｎのＤ−ビオ
チン、２０■の＋（３ＰＯ４，２ＯｎのＭｎ５Ｏｎ 、
１４ＯＮのＺｎ５Ｏ，，２０ｘのＣＬＩＳＯ４，２０”
のＮ８２ＭｏＯ＜および２．３ｇのグリシンを溶解する
ことによって調製される。コバルトおよび亜鉛が必要な
場合には１ＮのＣｏＣｊ２２および１０ｍｇのＺｎＣｊ
！ ２を添加する。）’ＤＭＳＯ中ＮＴＧ（１０ｍｇ／
彪）を１ｏｏｕ ／ｍｌ！の最終濃度まで培養基に添加
した。この培養物を３０℃で１時間攪拌した後、集菌し
洗浄した。
のＫＨ２ＰＯ，，０，２ｇのＭｇ５Ｏ＜・７Ｈ２０，１
，８４ｇの尿素、６０ｇのスクロース、１ｎのＤ−ビオ
チン、２０■の＋（３ＰＯ４，２ＯｎのＭｎ５Ｏｎ 、
１４ＯＮのＺｎ５Ｏ，，２０ｘのＣＬＩＳＯ４，２０”
のＮ８２ＭｏＯ＜および２．３ｇのグリシンを溶解する
ことによって調製される。コバルトおよび亜鉛が必要な
場合には１ＮのＣｏＣｊ２２および１０ｍｇのＺｎＣｊ
！ ２を添加する。）’ＤＭＳＯ中ＮＴＧ（１０ｍｇ／
彪）を１ｏｏｕ ／ｍｌ！の最終濃度まで培養基に添加
した。この培養物を３０℃で１時間攪拌した後、集菌し
洗浄した。
この処理によって生存細胞は対数的に減少した。
紫外線を用いた突然変異誘発も実施した。この方法を用
いて突然変異体Ａ２２を得た。０．２％グリシンを有す
る４Ｂ培地〔レヴイン、エイチ、（Ｌｅ−ｖｉｎｅ、
Ｈ，）等、インダストリアル・アンド・ケミカル・エン
ジニアリング（Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ａｎｄ Ｃｈｅ
ｍｉｃａｌＢｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ） （１９４９年）
４Ｃ１６６６を参照されたい〕中で増殖させた親株の第
２の一夜間培養物を洗浄しそしてプラスチック製ペトリ
皿中の等容量（３５ｄ）の同じ培地中に懸濁した。次い
で、この培地を攪拌し２００〜２９０ｎｍの紫外線に暴
露した。
いて突然変異体Ａ２２を得た。０．２％グリシンを有す
る４Ｂ培地〔レヴイン、エイチ、（Ｌｅ−ｖｉｎｅ、
Ｈ，）等、インダストリアル・アンド・ケミカル・エン
ジニアリング（Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ａｎｄ Ｃｈｅ
ｍｉｃａｌＢｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ） （１９４９年）
４Ｃ１６６６を参照されたい〕中で増殖させた親株の第
２の一夜間培養物を洗浄しそしてプラスチック製ペトリ
皿中の等容量（３５ｄ）の同じ培地中に懸濁した。次い
で、この培地を攪拌し２００〜２９０ｎｍの紫外線に暴
露した。
この照射のレベルは生存している細胞数を出発の培養物
の１０％まで低下させた。次いで、この細胞を、２５ｍ
Ｍの５′−ＡＭＰを含有する定義された培地上にプレー
トした。突然変異誘発処理、プレート処理およびインキ
ュベーションは暗中で行なった。突然変異体Ａ２２はフ
ラビン生産の阻害剤である５’−ＡＭＰの存在下でリボ
フラビンを生産することが見い出された。
の１０％まで低下させた。次いで、この細胞を、２５ｍ
Ｍの５′−ＡＭＰを含有する定義された培地上にプレー
トした。突然変異誘発処理、プレート処理およびインキ
ュベーションは暗中で行なった。突然変異体Ａ２２はフ
ラビン生産の阻害剤である５’−ＡＭＰの存在下でリボ
フラビンを生産することが見い出された。
ＧＲ３株のスクリーニング方法
前述したＮＴＧ突然変異誘発処理された培養物を生理的
食塩水２０ｍ１中で２回洗浄し同容量のＹＭＧ培地（複
合培地）中に懸濁した。ＹＭＧ培地の成分は、１１当り
、３ｇの酵母抽出物、３ｇの麦芽抽出物、５ｇのペプト
ンおよび使用直前の炭素源例えばグルコース（２％）１
００−である。次いで、この培養物を３０℃で４８時間
震盪培養した。次いで、細胞を集菌し、生理的食塩水２
〇−中で３回洗浄しそして尿素またはグリシンを含まな
い４Ｂ培地中に再懸濁した。−夜間の窒素飢餓後、細胞
を集菌し、アミノ酸を含まず２％グルコースを含有する
イーストナイトロジェンベース培地中に懸濁した。次い
で、この培養物を６時間インキュベーションした。
食塩水２０ｍ１中で２回洗浄し同容量のＹＭＧ培地（複
合培地）中に懸濁した。ＹＭＧ培地の成分は、１１当り
、３ｇの酵母抽出物、３ｇの麦芽抽出物、５ｇのペプト
ンおよび使用直前の炭素源例えばグルコース（２％）１
００−である。次いで、この培養物を３０℃で４８時間
震盪培養した。次いで、細胞を集菌し、生理的食塩水２
〇−中で３回洗浄しそして尿素またはグリシンを含まな
い４Ｂ培地中に再懸濁した。−夜間の窒素飢餓後、細胞
を集菌し、アミノ酸を含まず２％グルコースを含有する
イーストナイトロジェンベース培地中に懸濁した。次い
で、この培養物を６時間インキュベーションした。
１ｍｇのナイスクチンを１ｍｌのエタノール中に溶解し
、引き続いてこれを蒸留水で１０ｍ１まで希釈すること
によって新鮮なナイスクチン溶液を調製した。次いで、
このナイスクチン溶液を２０■／−の最終濃度まで添加
して栄養細胞を殺した。
、引き続いてこれを蒸留水で１０ｍ１まで希釈すること
によって新鮮なナイスクチン溶液を調製した。次いで、
このナイスクチン溶液を２０■／−の最終濃度まで添加
して栄養細胞を殺した。
このナイスクチン処理の後、生存している細胞を生理的
食塩水中１０−４〜１０−５まで希釈し、０．１−サン
プルをＹＭＧプレート （２０ｇ寒天／βのＹＭＧ培地
）上にプレートした。インキュベーションの２日後、Ｙ
ＭＧプレート上のコロニーを定義された培地上にレプリ
カ培養した。
食塩水中１０−４〜１０−５まで希釈し、０．１−サン
プルをＹＭＧプレート （２０ｇ寒天／βのＹＭＧ培地
）上にプレートした。インキュベーションの２日後、Ｙ
ＭＧプレート上のコロニーを定義された培地上にレプリ
カ培養した。
次いで、複合培地上では増殖したが定義された培地上で
は増殖しなかったコロニーを、アデニンを３Ｏｒ／ｍｌ
！で含有する定義された培地上にスフリークした。最少
培地上で白色コロニーとして増殖し、そしてアデニンを
有する最少培地上でピンク色がかった赤色のコロニーと
して増殖する１つのコロニーが検出された。このＧＲ３
と名付けられた分離物は２０〜５０Ｒ／艷のアデニンの
存在下で赤色のコロニーをつくりそして０または１００
ｆｆ ／ｍｊｌ！アデニンの存在下で白色のコロニーを
つくることが見い出された。コロニーの赤色はＰ−リボ
シルアミノイミダゾールカルボキシレート（ＣＡＩＲ）
および／またはＰ−’Ｊボシルアミノイダゾール（＾Ｉ
Ｒ）の蓄積によるものであった。ＧＲ３はプリン経路に
おける第１段階の調節が欠損している突然変異体である
と結論された。このＧＲ３突然変異体において、第１段
階の調節は明らかに欠損している。なぜならば、２０〜
５０Ｒ／−のアデニンの存在下でさえ、たとえその突然
変異体がプリンに対して栄養要求性でないとしてもプリ
ン中間体が蓄積したからである。
は増殖しなかったコロニーを、アデニンを３Ｏｒ／ｍｌ
！で含有する定義された培地上にスフリークした。最少
培地上で白色コロニーとして増殖し、そしてアデニンを
有する最少培地上でピンク色がかった赤色のコロニーと
して増殖する１つのコロニーが検出された。このＧＲ３
と名付けられた分離物は２０〜５０Ｒ／艷のアデニンの
存在下で赤色のコロニーをつくりそして０または１００
ｆｆ ／ｍｊｌ！アデニンの存在下で白色のコロニーを
つくることが見い出された。コロニーの赤色はＰ−リボ
シルアミノイミダゾールカルボキシレート（ＣＡＩＲ）
および／またはＰ−’Ｊボシルアミノイダゾール（＾Ｉ
Ｒ）の蓄積によるものであった。ＧＲ３はプリン経路に
おける第１段階の調節が欠損している突然変異体である
と結論された。このＧＲ３突然変異体において、第１段
階の調節は明らかに欠損している。なぜならば、２０〜
５０Ｒ／−のアデニンの存在下でさえ、たとえその突然
変異体がプリンに対して栄養要求性でないとしてもプリ
ン中間体が蓄積したからである。
融合
突然変異株Ａ２２およびＧＲ３のプロトプラスト融合に
よってＧＡ１８株を得た。前述したナイスクチン処理の
後、生理的食塩水中に希釈した（１０−’〜１Ｏ−５）
各株を複合培地上にプレートした。２日間のインキュベ
ーションの後、細胞を４Ｂ培地上にレプリカ培養した。
よってＧＡ１８株を得た。前述したナイスクチン処理の
後、生理的食塩水中に希釈した（１０−’〜１Ｏ−５）
各株を複合培地上にプレートした。２日間のインキュベ
ーションの後、細胞を４Ｂ培地上にレプリカ培養した。
次いで、４Ｂ上で増殖しなかったコロニーを、３０ｕ／
ｍｌ！のヒスチジンまたはメチオニンを補充した４Ｂ上
にストリークした。定義された培地上では増殖しなかっ
たがいずれかのアミノ酸を補充した培地上で増殖した細
胞は栄養要求株であＺと考えられた。この方法において
、Ａ２２のヒスチジン栄養要求株（Ａ２２ Ｈｉｓ
）およびＧＲ３のメチオニン栄養要求株（ＧＲ３Ｍｅｔ
−）が得られた。
ｍｌ！のヒスチジンまたはメチオニンを補充した４Ｂ上
にストリークした。定義された培地上では増殖しなかっ
たがいずれかのアミノ酸を補充した培地上で増殖した細
胞は栄養要求株であＺと考えられた。この方法において
、Ａ２２のヒスチジン栄養要求株（Ａ２２ Ｈｉｓ
）およびＧＲ３のメチオニン栄養要求株（ＧＲ３Ｍｅｔ
−）が得られた。
融合を実施するために、Ａ２２ Ｈｉｓ−およびＧＲ３
Ｍｅｔ−の４８時間培養物を、グリシンを加えた４Ｂ培
地上で増殖させ、集菌し、２０ｍ１の蒸留水中で１回洗
浄しそしてＩＭソルビ） −ノｖ、 ２５ｍＭＥＤＴＡ
および５０ｍＭジチオトレイトールの溶液２０−中に懸
濁させた。この懸濁液を、時折穏やかに震盪しながら３
０℃で２０分間インキュベーションした。次いで、細胞
を集菌し、２Ｍソルビトール２０ｍ１で１回洗浄し、そ
して各栄養要求株を、１．５Ｍソルビトール、０．１Ｍ
クエン酸ナトリウム、ｐＨ５，８および０．０１ＭεＤ
Ｔへの溶液２０ｍ１ｉ中に懸濁した。次いで、各懸濁液
に対して、０，２艶のβグルクロニダーゼ〔タイプＨ−
２、ヘリックス・ボマチア（Ｈｅｌｉｘ ｐｏｍａｔｉ
ａ）由来、１００．０００単位／艷、ジグ７ （Ｓｉｇ
ｍａ） ］および２２０ｍのチモラーゼ１０（ＩＴ Ｃ
マイルス・ラボラトリ−（Ｍｉｌｅｓ Ｌａｂ。
Ｍｅｔ−の４８時間培養物を、グリシンを加えた４Ｂ培
地上で増殖させ、集菌し、２０ｍ１の蒸留水中で１回洗
浄しそしてＩＭソルビ） −ノｖ、 ２５ｍＭＥＤＴＡ
および５０ｍＭジチオトレイトールの溶液２０−中に懸
濁させた。この懸濁液を、時折穏やかに震盪しながら３
０℃で２０分間インキュベーションした。次いで、細胞
を集菌し、２Ｍソルビトール２０ｍ１で１回洗浄し、そ
して各栄養要求株を、１．５Ｍソルビトール、０．１Ｍ
クエン酸ナトリウム、ｐＨ５，８および０．０１ＭεＤ
Ｔへの溶液２０ｍ１ｉ中に懸濁した。次いで、各懸濁液
に対して、０，２艶のβグルクロニダーゼ〔タイプＨ−
２、ヘリックス・ボマチア（Ｈｅｌｉｘ ｐｏｍａｔｉ
ａ）由来、１００．０００単位／艷、ジグ７ （Ｓｉｇ
ｍａ） ］および２２０ｍのチモラーゼ１０（ＩＴ Ｃ
マイルス・ラボラトリ−（Ｍｉｌｅｓ Ｌａｂ。
ｒａｔｏｒｙ） ）を添加した。この懸濁液を室温で４
５分間インキュベーションした。この間、正常には細長
い細胞が丸い球形を帯びた。このことは、細胞壁の消化
を示す。
５分間インキュベーションした。この間、正常には細長
い細胞が丸い球形を帯びた。このことは、細胞壁の消化
を示す。
酵素処理後、低速度の遠心分離（５０００ｘ ｇ）によ
って各栄養要求株のプロトプラストを集菌し、これを１
０−の２Ｍソルビトール中で２回、１０艷の１．５Ｍソ
ルビトール、１０ｍＭ Ｃａ１ｌ！２および１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ ｆｌｃＡｐＨ７，５中で１回洗浄し、次いで
後者の溶液０．５ｍｌ中に懸濁した。プロトプラストを
融合するために、各栄養要求株の０．１ｍｊ試料を混合
し、２０％ＰＢＧ 〔ジグ” （Ｓｉｇｍａ）、分子
量約６０００〕、１０ｍＭ ＣａＣＡ２および１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ ＨＣｊ２ｐ）１７．４の溶液０．１ｍｌを
添加した。
って各栄養要求株のプロトプラストを集菌し、これを１
０−の２Ｍソルビトール中で２回、１０艷の１．５Ｍソ
ルビトール、１０ｍＭ Ｃａ１ｌ！２および１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ ｆｌｃＡｐＨ７，５中で１回洗浄し、次いで
後者の溶液０．５ｍｌ中に懸濁した。プロトプラストを
融合するために、各栄養要求株の０．１ｍｊ試料を混合
し、２０％ＰＢＧ 〔ジグ” （Ｓｉｇｍａ）、分子
量約６０００〕、１０ｍＭ ＣａＣＡ２および１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ ＨＣｊ２ｐ）１７．４の溶液０．１ｍｌを
添加した。
この混合物を時折震盪させながら室温で２０分間インキ
ニベーションした。次いで、細胞を遠心分離し、アミノ
酸を含まず２％のグルコースおよび１．５Ｍソルビトー
ルを有するイーストナイトロジエンベース培地１０ｒｄ
で１回洗浄し、そして同じ培地０．５ｍｌ中に懸濁した
。次いで、約０．１ｒｎ１．の試料を２．０％の寒天を
含有する同じ培地７ｍ１（約５５℃）に添加しそして同
じ培地上に重層した。
ニベーションした。次いで、細胞を遠心分離し、アミノ
酸を含まず２％のグルコースおよび１．５Ｍソルビトー
ルを有するイーストナイトロジエンベース培地１０ｒｄ
で１回洗浄し、そして同じ培地０．５ｍｌ中に懸濁した
。次いで、約０．１ｒｎ１．の試料を２．０％の寒天を
含有する同じ培地７ｍ１（約５５℃）に添加しそして同
じ培地上に重層した。
この手順中に使用する溶液の大部分は、メソッド・イン
・イースト・ジェネティクス（Ｍｅｔｈｏｃｌ １ｎＹ
ｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、コールド・スプリング
・ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ。
・イースト・ジェネティクス（Ｍｅｔｈｏｃｌ １ｎＹ
ｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、コールド・スプリング
・ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ。
ｒａｔｏｒｙ） 、コールド・スプリング・ハーバ−（
Ｃｏｒｄ Ｓｐｒｉｎｇ ｔ（ａｒｂｏｒ） 、−＝−
ニーヨーク、１９８１年１１５頁に見い出すことができ
る。アミノ酸が存在しない場合には、いずれの栄養要求
株も増殖しないであろう（極めて低い頻度で復帰がある
）。
Ｃｏｒｄ Ｓｐｒｉｎｇ ｔ（ａｒｂｏｒ） 、−＝−
ニーヨーク、１９８１年１１５頁に見い出すことができ
る。アミノ酸が存在しない場合には、いずれの栄養要求
株も増殖しないであろう（極めて低い頻度で復帰がある
）。
３０℃１ごおける６〜９日間のインキュベーションの後
形成されたコロニーは、遺伝的交換の結果として生じた
原栄養株を含んでいた。融合手順から得られた原栄養株
は、ポリエチレングリコール処理で生存した１０３個中
約１個の頻度で生じた。
形成されたコロニーは、遺伝的交換の結果として生じた
原栄養株を含んでいた。融合手順から得られた原栄養株
は、ポリエチレングリコール処理で生存した１０３個中
約１個の頻度で生じた。
低倍率でコロニーを調べ、リボフラビンの結晶を含んで
いるコロニーを再ストリークし定義された培地中でのリ
ボフラビン生産について調べた。１つのコロニーをＧＡ
ｌｇと呼んだ。
いるコロニーを再ストリークし定義された培地中でのリ
ボフラビン生産について調べた。１つのコロニーをＧＡ
ｌｇと呼んだ。
ＧＡ１８Ｙ８−Ｉｎ２を生じる第２の突然変異およびス
クリーニング ＧＡｌｇの４８時間親培養物を前述のＮＴＧ法を用いて
突然変異誘発処理することによって株ＧＡ１８Ｙ８６＃
２を得た。突然変異誘発処理の後、細胞を洗浄し、１０
−４〜１０−５まで希釈し、そして０．１艶をＹＭＧ上
にプレートした。ＧＡｌｇは、黄色のコロニー、すなわ
ち、ＹＭＧ培地上で高いリボフラビン含有を有するコロ
ニーを形成しなかった。このことは、培地中の鉄または
少量の有機成分によるフラビン生産の抑制に原因してい
た。１週間のインキュベーション期間の後、いくつかの
黄色のコロニーが認められた。これを取り出しＹＭＧ上
に数回再ストリークして株を精製した。この精製した株
をＧＡ１８Ｙ８−６８２と名付けた。
クリーニング ＧＡｌｇの４８時間親培養物を前述のＮＴＧ法を用いて
突然変異誘発処理することによって株ＧＡ１８Ｙ８６＃
２を得た。突然変異誘発処理の後、細胞を洗浄し、１０
−４〜１０−５まで希釈し、そして０．１艶をＹＭＧ上
にプレートした。ＧＡｌｇは、黄色のコロニー、すなわ
ち、ＹＭＧ培地上で高いリボフラビン含有を有するコロ
ニーを形成しなかった。このことは、培地中の鉄または
少量の有機成分によるフラビン生産の抑制に原因してい
た。１週間のインキュベーション期間の後、いくつかの
黄色のコロニーが認められた。これを取り出しＹＭＧ上
に数回再ストリークして株を精製した。この精製した株
をＧＡ１８Ｙ８−６８２と名付けた。
突然変異株
現在量も有効なリボフラビン生産者である株は、カンジ
ダ・フラレリＧＡ１８Ｙ８−６＃２ ｄｇｒ （ＡＴＣ
Ｃ寄託番号２０７５６を有する）およびカンジダ・フラ
レリＧＡ１８Ｙ８−６：ＩＩ２＃１１（ＡＴＣＣ寄託番
号２０７５５を有する）として特定される。これらの株
は、前述した実験方法によって得られた。
ダ・フラレリＧＡ１８Ｙ８−６＃２ ｄｇｒ （ＡＴＣ
Ｃ寄託番号２０７５６を有する）およびカンジダ・フラ
レリＧＡ１８Ｙ８−６：ＩＩ２＃１１（ＡＴＣＣ寄託番
号２０７５５を有する）として特定される。これらの株
は、前述した実験方法によって得られた。
ＧＡ１８Ｙ８−６＃２ ｄｇｒは、前述の定義された培
地であって０．２ガのＦｅＣβ３および１０％のＹＭＧ
が補充された培地５０ｒｎｆ！中に５ｍｌの指数増殖培
養物を接種することによって、６日間当りでＩＩ！当り
７．０〜７．５ｇのリボフラビンを生産する。この株は
親株ＧＡ１８Ｙ８−６＄２のＮＴＧ突然変異誘発処理に
よって得られた。デオキシグルコースはグルコースのア
ナローブであり、スクロースが炭素源として使用される
場合に細胞の増殖を阻害する。デオキシグルコースに対
して耐性である黄色のコロニーを取り出し、グリシンお
よびテ°オキシグルコースを加えた４Ｂ上への再ストリ
ークすることによって精製し、そしてフラビン生産につ
いて試験した。
地であって０．２ガのＦｅＣβ３および１０％のＹＭＧ
が補充された培地５０ｒｎｆ！中に５ｍｌの指数増殖培
養物を接種することによって、６日間当りでＩＩ！当り
７．０〜７．５ｇのリボフラビンを生産する。この株は
親株ＧＡ１８Ｙ８−６＄２のＮＴＧ突然変異誘発処理に
よって得られた。デオキシグルコースはグルコースのア
ナローブであり、スクロースが炭素源として使用される
場合に細胞の増殖を阻害する。デオキシグルコースに対
して耐性である黄色のコロニーを取り出し、グリシンお
よびテ°オキシグルコースを加えた４Ｂ上への再ストリ
ークすることによって精製し、そしてフラビン生産につ
いて試験した。
突然変異誘発処理された細胞を、７５に／−の２−デオ
キシグルコースを含有するグリシン添加４Ｂ培地上にプ
レートした。カンジダ・フラレリＧＡ１８Ｙ８−６＃２
ｄｇｒを精製されたコロニーから選んだ。
キシグルコースを含有するグリシン添加４Ｂ培地上にプ
レートした。カンジダ・フラレリＧＡ１８Ｙ８−６＃２
ｄｇｒを精製されたコロニーから選んだ。
ＧＡ１８Ｙ８−６ｊＩ２＃１１ も、ＧＡ１８Ｙ８−６
＃２ ｄｇｒについて前述したと同じ条件を用いて、６
日間当りでＩＩ当り７．０〜７．５ｇのリボフラビンを
生産する。この株も親株ＧＡ１８Ｙ８−６＃２のＮＴＧ
突然変異誘発処理によって得られた。突然変異誘発処理
の後、突然変異誘発処理された培養物２０ｍｆ！、を蒸
留水２０ｍｊ！中で２回洗浄し、次いで、２０−のＹＭ
Ｇ ＋ ＦｅＣβ３（２ｘ／ｍｌり ＋ＡＭＰ（４０ｍ
Ｍ）＋アミノピラゾロピリミジン＋ＡＰＰ （５００■
／ｍｌ）中に懸濁した。この培地によって、ＡＰＰ耐性
コロニーが選択された。
＃２ ｄｇｒについて前述したと同じ条件を用いて、６
日間当りでＩＩ当り７．０〜７．５ｇのリボフラビンを
生産する。この株も親株ＧＡ１８Ｙ８−６＃２のＮＴＧ
突然変異誘発処理によって得られた。突然変異誘発処理
の後、突然変異誘発処理された培養物２０ｍｆ！、を蒸
留水２０ｍｊ！中で２回洗浄し、次いで、２０−のＹＭ
Ｇ ＋ ＦｅＣβ３（２ｘ／ｍｌり ＋ＡＭＰ（４０ｍ
Ｍ）＋アミノピラゾロピリミジン＋ＡＰＰ （５００■
／ｍｌ）中に懸濁した。この培地によって、ＡＰＰ耐性
コロニーが選択された。
この培養物を周期的に震盪させながら３０℃で一夜間イ
ンキニベーションした。次いで、細胞を集菌し、２０ｍ
ｊ！の蒸留水中で２回洗浄し、そしてＹＭＧ ＋ＦｅＣ
１’３（２”／ｍｊ２） ＋ＡＰＰ（１”／顎） ＋Ａ
ＭＰ（４０ｍＭ）上にプレートし３０℃で１週間インキ
ニベーションした。この終了時に、プレートを調べ、黄
色〜オレンジ色のコロニーを取り出しフラビン生産につ
いて試験した。精製したコロニからＧＡ１８Ｙ８−６＃
２１１を得た。
ンキニベーションした。次いで、細胞を集菌し、２０ｍ
ｊ！の蒸留水中で２回洗浄し、そしてＹＭＧ ＋ＦｅＣ
１’３（２”／ｍｊ２） ＋ＡＰＰ（１”／顎） ＋Ａ
ＭＰ（４０ｍＭ）上にプレートし３０℃で１週間インキ
ニベーションした。この終了時に、プレートを調べ、黄
色〜オレンジ色のコロニーを取り出しフラビン生産につ
いて試験した。精製したコロニからＧＡ１８Ｙ８−６＃
２１１を得た。
５００ｍ１バツフル付増殖フラスコ中５０ｍ１の増殖培
地を用いて上記株から高いリボフラビン収率を得た。こ
の増殖培地は、１０％ＹＭＧ ＋ ９０％４Ｂ＋グリシ
ン＋ｃｏ ＋Ｚｎ ＋ＦｅＣｊ’＋（０，２＋ｒ／ｒｎ
ｆ）からなっていた。ＧＡ１ｇ由来のものによる最適の
リボフラビン生産は０．２４／ｉｆのＦｅｃ ｊ２３の
存在下で起こる。野生型のカンジダ・フラレリの場合、
０．２■／ｍｌのＦｅＣ４１！ ３はリボフラビン合成
を抑制する。２４時間毎に、培養物に２ｒｄの１０Ｘ４
Ｂ＋グリシン溶液を供給した。
地を用いて上記株から高いリボフラビン収率を得た。こ
の増殖培地は、１０％ＹＭＧ ＋ ９０％４Ｂ＋グリシ
ン＋ｃｏ ＋Ｚｎ ＋ＦｅＣｊ’＋（０，２＋ｒ／ｒｎ
ｆ）からなっていた。ＧＡ１ｇ由来のものによる最適の
リボフラビン生産は０．２４／ｉｆのＦｅｃ ｊ２３の
存在下で起こる。野生型のカンジダ・フラレリの場合、
０．２■／ｍｌのＦｅＣ４１！ ３はリボフラビン合成
を抑制する。２４時間毎に、培養物に２ｒｄの１０Ｘ４
Ｂ＋グリシン溶液を供給した。
リボフラビン生産の一層の増大および鉄に対する非感受
性は、上述した突然変異誘発処理、選択および融合操作
を繰り返すことによって達成することができる。
性は、上述した突然変異誘発処理、選択および融合操作
を繰り返すことによって達成することができる。
本発明に従って、非能率的なリボフラビン生産性のカン
ジダの株を、栄養基を有効に利用しかつフラビン生産の
鉄抑制に対して改善された耐性を有して多量のリボフラ
ビンを安定す生産するように突然変異させることができ
る。
ジダの株を、栄養基を有効に利用しかつフラビン生産の
鉄抑制に対して改善された耐性を有して多量のリボフラ
ビンを安定す生産するように突然変異させることができ
る。
前述した内容は本発明の完全な記載であるが、特許請求
の範囲の記載を除いては本発明の範囲を限定しようとす
るものではない。
の範囲の記載を除いては本発明の範囲を限定しようとす
るものではない。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、アデノシン一リン酸によるＢ＿２合成阻害に対して
耐性であり、４−アミノピラゾロ−（３，４−ｄ）ピリ
ミジンによる増殖阻害に対して耐性でありそしてスクロ
ースが炭素源である場合にデオキシグルコースの存在に
おけるカタボライトリプレッションに対して耐性である
カンジダ・フラレリ（￥Ｃａｎｄｉｄａ ｆｌａｒｅｒ
ｉ￥）のリボフラビン過剰生産株。 ２、鉄または複合培地によるＢ＿２合成の阻害に対して
耐性である、特許請求の範囲第１項記載のカンジダ・フ
ラレリのリボフラビン過剰生産株。 ３、６日間で１ｌ当り最低約５ｇのリボフラビンを生産
する、特許請求の範囲第１項記載のカンジダ・フラレリ
のリボフラビン過剰生産株。 ４、前記リボフラビン過剰生産株がＡＴＣＣ寄託番号２
０７５６のカンジダ・フラレリＧＡ１８Ｙ８−６＃２ｄ
ｇｒ又は該株から誘導された突然変異株である特許請求
の範囲第１項記載のカンジダ・フラレリのリボフラビン
過剰生産株。 ５、前記リボフラビン過剰生産株がＡＴＣＣ寄託番号２
０７５５のカンジダ・フラレリＧＡ１８Ｙ８−６＃２＃
１１又は該株から誘導された突然変異株である特許請求
の範囲第１項記載のカンジダ・フラレリのリボフラビン
過剰生産株。
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