JPH03292884A - 細胞培養方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は細胞を培養するために好適な多孔質中空糸膜を
用いた細胞培養方法に関するものである。

〔従来の技術〕

近年モノクロナール抗体、インターフェロン、インター
ロイキン、ＴＰＡ等の生体由来の生理活性物質の医学、
産業分野での有用性が明らかとなってきている。それに
伴い、これらの有用物質を大量かつ安価に生産するため
の高密度細胞培養方法の必要性が増加している。

特にＫＮＡＺＥＫらによる中空糸膜面に細胞を付着させ
、中空糸の中空部に培地を循環させて、中空糸膜面を介
して細胞に栄養物を供給する方法（特開昭４９−４１５
７９号公報）は効率的に細胞を培養する方法として注目
されている。

この中空系法の利点は、限られた空間内に大きな表面積
を確保することにより、付着性細胞に対し広い付着面を
供給することができ、また、中空糸の膜方向に開いた微
小な孔を通して、細胞の生存、増殖に必要な各種栄養物
、酸素などの供給や細胞の代謝により生成した老廃物の
除去を拡散または中空糸内外に与えた圧力差により生し
る液体の流れに同伴して、極めて容易に行なわＩ、める
ことにある。その結果、細胞の高密度培養か可能となり
、生産物の濃度、生産性を高めることができる。

従来、中空糸性細胞培養に、セルロースアセテート製中
空糸（特公昭５４−６６３４号公報）、ポリスルホン製
中空糸（特開昭６２−１３０６７８号公報）などを使用
した例がみられる。

また、ポリエチレン、ポリプロピレンなどのポリオレフ
ィンからなる多孔質膜を用いる方法（特開昭６３−１７
６８５号公報）が提案されている。

〔発明が解決しようとする課題〕

しかしながら、従来の多孔質膜を用いる細胞培養に利用
されてきた多孔質膜では、細胞の付着性、増殖性、生存
性などにおいて必ずしも充分でない場合が多く、これら
の点に関する改良が望まれていた。

例えば、ポリスルホン中空糸は、セルロース系中空糸に
比較して細胞の付着性および増殖性、伸展性において優
れた特性を有している。しかしながら、現在一般に広く
使用されているポリスチレン製デイツシュに較べると、
細胞の付着性、増殖性、生存性において満足のいくもの
ではない。

さらに、本発明者らの研究によりば、ポリオレフィンか
らなる多孔質膜においても、細胞の付着性、増殖性は必
ずしも充分ではなかった。

一方、培養系の他の微生物による汚染を防ぐためには、
培養器の滅菌処理が必要となる。

滅菌処理は、例えばγ線照射、エチレンオキサイドガス
などの殺菌ガスによるガス殺菌、蒸気殺菌などの方法に
よって行なうことができる。

しかしながら、従来の樹脂性の多孔質膜を用いた培養器
においては、簡便かつ安価な滅菌処理を膜性能を損なう
ことなく行なうことが困難であった。

例えば、γ線照射による方法では、γ線照射装置が高価
である。また、ガス殺菌による方法では、滅菌処理後に
多孔質に付着したガス成分を通気によって除去すること
が困難であるため、培地または水などにより膜面に付着
残存しているガス成分を洗浄除去する必要がある。しか
しながら、滅菌処理後に行なう培養に影響を及ぼさない
程度にまで残存ガスを除去するには長時間の処理を要す
る。

さらに、蒸気殺菌による方法自体は、上述の他の方法よ
りも簡便で安価であるという利点を有するが、高温度条
件下に多孔質膜が曝されるため耐熱性において問題のあ
る多孔質膜の滅菌処理には適用しにくい。例えば、ポリ
エチレンやポリプロピレンなどからなる多孔質膜に蒸気
殺菌を行なうと、多孔質膜が著しく収縮してその膜性能
が大幅に低下する。

本発明の目的は、細胞の付着性、増殖性、伸展性などの
良好な細胞培養に必要な特性に優れ、かつ蒸気殺菌をも
適用可能な多孔質膜を用い低いランニングコストでの良
好な細胞培養を可能とする方法を提供することにある。

〔課題を解決するための手段〕

本発明の細胞培養方法は、他の領域と多孔質膜により仕
切られた培養領域中で細胞を培養する方法において、前
記多孔質膜の少なくとも一部の表面上に官能基としての
酸無水物を有する重合性モノマーとジビニルベンゼンと
を含む組成物から得られた架橋重合体を保持させてなる
ことを特徴とする。

本発明に用いる多孔質膜は、例えばポリエチレン、ポリ
プロピレン、ポリ４−メチルペンテン−１などのポリオ
レフィン系素材：ポリスルホン；ポリビニルアルコール
；ポリメチルメタアクリレート：セルロースアセテート
などからなる多孔質膜に上述の架橋重合体を保持させる
ことにより得ることができる。

例えば、ポリオレフィン系素材からなる多孔質膜の表面
への架橋重合体の保持は、特願昭６３−２２１５８４号
に記載した方法で製造することができる。

本発明で用いられる多孔質膜の孔径は、例えば培地、酸
素などの気体、生産物、排出物なとの移動させるべき物
質の充分な移動量が確保でき、かつ細胞が漏れない程度
の大きさであればよく、培養形態に応じて適宜選択され
る。また、孔の形状は特に限定されない。

多孔質膜の孔径としては、例えば、分画粒子径が０．０
１〜５μｍ程度であることが好ましく、０．１〜２μｍ
程度であることがより好ましい。

多孔質膜が延伸法により多孔質化されたものである場合
は、この分画粒子径は節部とミクロフィブリルとでかこ
まれてなる細孔のフィブリル間のスリット径の平均値で
示される。

さらに、空孔率は、同様に培地等の充分な流れが得られ
、実用上充分な強度が保てる範囲でよく、具体的には１
０〜９０％であればよく、４０〜８０％であることが好
ましい。膜厚は同様に実用上充分な強度が保てる範囲で
よいが、およそ２０〜２００μｍ程度であることが好ま
しい。

本発明に用いる多孔質膜としては、中空糸状、平膜、管
状膜などの任意の形態のものを用いることができる。特
に、延伸法により製造した中空糸は、中空糸の膜面にミ
クロフィブリルと節部とによって形成されるスリット状
の微小空間（細孔）が３次元的に相互に連通した細孔構
造が形成されているため、空孔率が高く、これを用いて
付着性細胞の培養を行なフた場合においては、表面に付
着した細胞に対し、連通した細孔構造部を通して、実質
的に充分に均一に栄養物や酸素などを供給したり、細胞
生産物、代謝産物などを容易に除去でき、かつ、目詰ま
りによる性能低下が少ないという点から好ましい。なお
、その製造は特公昭５６−５２１２３号公報、特開昭５
７−４２９１９号公報などに記載された方法にしたがフ
て行なうことができる。

多孔質膜の少なくとも一部の表面に保持させる架橋重合
体は、官能基として酸無水物構造を有するモノマーから
なるモノマー成分（Ａ）とジビニルベンセンを含む千ツ
マー成分（Ｂ）を含む組成物から得られる。

該モノマー成分（Ａ）としては、例えば、無水マレイン
酸、無水イタコン酸、無水ハイミック酸などが利用でき
る。

該架橋重合体形成用組成物中での千ツマー成分（Ａ）と
モノマー成分（Ｂ）とのモル組成比は、Ｂ／Ａ＝１／１
〜２／１程度、好ましくは１／１〜１．５／１程度であ
ればよい。

なお、千ツマー成分（Ｂ）としては、ジビニルベンゼン
単独、ジビニルベンゼンとスチレンの混合物、ジビニル
ベンゼンとエチルビニルベンゼンの混合物、ジビニルへ
ンゼン、エチルビニルベンゼンおよびスチレンの混合物
などが利用できる。

混合物を用いる場合の混合物中でのジビニルベンゼンの
割合は、３０重量％以上であればよい。

なお、形成される架橋重合体においては、重合性子ツマ
ー単位が、ブロック共重合体を形成することなく、分子
レベルで実質的に均一に分布されていることが好ましい
。

本発明における「多孔質膜の少なくとも一部の表面」と
は、細孔表面および外表面の一部あるいは全部をいう。

すなわち、実質的に架橋重合体が保持されていればよく
、必ずしも全ての表面に架橋重合体が保持されている必
要はなく、少なくとも細胞が付着する側の外表面に保持
されていればよい。表面に保持される架橋重合体の量は
多孔質膜の空孔率や細孔径にも依存するが、多孔質膜の
重量に対しておよそ７〜１５０重量％、好ましくは５〜
１２０％、さらに好ましくは１０〜１００％である。

また、「保持させてなるＪとは保存中や使用中に容易に
脱離しない程度に架橋重合物が多孔質膜細孔表面に結合
ないしは密着されていることをいう。

本発明で用いる多孔質膜は、上述のように少なくともモ
ノマー成分（Ａ）とモノマー成分（Ｂ）とを用いて得ら
れた架橋重合体がその表面に保持されることによって得
られる架橋構造により、多孔質膜の耐熱性が向上し、膜
の構造に変形、損傷などを与えることなく１２０〜１３
０℃の蒸気殺菌処理が可能となり、しかも、例えば、ポ
リオレフィン系の多孔質膜やジビニルベンセンからなる
架橋重合体を表面に保持させた多孔質膜などに比較して
より優れた細胞の付着性、増殖性、伸展性が得られる。

なお、本発明において細胞の付着性などが高まるのは、
極性を有する酸無水物を含む架橋構造が存在することに
よると考えられる。

本発明の培養の具体的な態様は、培養する細胞の種類、
多孔質膜を介して移動させる物質の種類などに応じて適
宜選択される。

本発明によれば、例えばアフリカミドリザル腎細胞（Ｖ
ｅｒｏ細胞）、上皮細胞 （９４０Ｃ３）、マウス繊維芽細胞（３Ｔ３）、チャイ
ニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、チャイニーズハ
ムスター肺繊維芽細胞（Ｖ−７９）、子宮頚部癌細胞（
Ｈｅｌａ）、ヒト胎児肺由来正常２倍体細胞（Ｗｌ−３
８）などの付着性細胞例えばリンパ球細胞、骨髄腫細胞
、白血球細胞など、および、これらと他の細胞との細胞
融合によって得られる雑種細胞（ハイブリドーマ）等の
浮遊性細胞などの種々の細胞の効率よい培養を行なうこ
とができる。

なお、本発明で用いる多孔質膜においては、付着性細胞
を用いた場合に良好な細胞の付着性および伸展性が得ら
れる。

本発明に用いる培地は、培養する細胞に応じて選択すわ
ばよく、例えば、無機塩類、アミノ酸類、糖類、脂肪酸
類、ビタミン類、補酵素類、核酸塩基類、ホルモン類、
アルブミン、トランスフェリン、その他の種々の細胞の
成長因子、血清中の成分などから選択された成分を水に
溶解した液体培地などが用いられる。

本発明の方法の具体的な態様としては、例えば以下のも
のを挙げることができる。

１）第１図に示すように、細胞添加口３を有する培養領
域６と培地人口４および出口５を有する領域７とを多孔
質膜２で仕切フた培養器を用意し、領域６，７中に液体
培地を満たした状態で、細胞添加口３から必要数の細胞
を添加し、培養領域６中の培地を所定の温度に調節して
培養を行なう。その際、培地人口４から培地を流入させ
、また培地出口５から培養液を流出させて、領域７内を
流通させる。なお、培地出口５から流出した培地は培地
人口４にもどして、領域７内を循環するようにして６よ
い。培地中の細胞の成育、維持に必要な栄養物や酸素な
どの物質は領域７内から多孔質膜２を介して領域６内に
供給され、細胞の増殖に利用される。また、領域６中に
細胞の増殖にともなって生じた生産物、老廃物などが膜
壁を通して領域７中に排出され、効率よい培養を行なう
ことかできる。

２）第２図に示すように、細胞添加口３および培地出口
５を有する培養領域６と培地人口４を有する領域を多孔
質膜２で仕切った培養器を用意し、領域６．７に液体培
地をたした状態で、細胞添加口３から細胞の必要数を添
加し、培養領域中の培地の温度を所定の温度に調節して
培養を行なう。その際、培地人口４から培地を領域７に
流入させ、培地出口５から流出させる。培地出口５には
、必要に応じて細胞の流出を除くためのフィルターなど
を設けてもよい。また、培地出口５から流した培地は、
培地人口４へ返送して培養器１内を循環するようにして
もよい。

多孔質膜として中空糸膜を用いる場合には、例えば中空
糸膜の中空部と連通ずる領域と、中空糸膜６外壁と接す
る領域とを形成し、これら２つの領域を第１図および第
２図に示した領域６．７として利用する。

中空糸膜を用い、中空糸膜外壁に接する領域を培養領域
として利用する場合の一例を以下に示す。

第３図は中空糸膜９の両端をボッティング材で固定し、
中空糸の中空部につながる空間に連通した端部導管１０
．１１は栄養物や酸素の供給、老廃物の除去用に用いる
ことができる。

また、側部導管１２．１３は培養開始時の細胞の導入口
であり、培養が長時間行なわれて細胞濃度が高まった時
はここから老廃物や死亡した細胞を含有する培地を抜く
ことかできる。

第４図は、第３図に示した細胞培養器を組み込んだ細胞
培養装置であり、培地貯槽１６より細胞培養器８へ培地
をポンプ１５により循環させるようにしたものである。

以上、多孔質膜により仕切られた２つの領域を利用する
場合について述べたが、培養領域と多孔質膜で仕切られ
る領域の２以上を設け、培地成分や酸素などの気体等を
分割して供給したり、培養液の供給を行なう領域と、生
産物や老廃物を除去するための領域とを分割してもよい
。

また、培養領域も２以上設けでもよい。

〔実　施　例〕

以下、実施例を用いて本発明を説明するが、本発明はこ
れらの実施例で限定されるものではない。

なお、実施例においては多孔質膜としていずれも延伸法
によフて得られるミクロフィブリルと節部とで形成され
るスリット状の空間（空孔）が３次元的に連通した多孔
質膜を用い、該多孔質膜の孔径は該スリット状空間の幅
の平均値と長さの平均値とで表現した。

架橋重合体の保持量はテトラリン還流下、多孔質膜を溶
解させる溶解分別法により求め多孔質膜に対する重量％
で表示した。

実施例１ ポリエチレン多孔質中空糸（スリット状細孔の幅０．８
μｍ、長さ２．２μｍ、空孔率７０％、膜厚５５μｍ、
内径２７０μｍ）を第１表に示す濃度のスチレン（ｓ　
ｔ）　、ジビニルベンゼン（ＤＶＢ）、重合性モノマー
としての無水マレイン酸および０．２重量％の過酸化ベ
ンゾイルを溶解したアセトン溶液中に１０秒間浸漬した
後、室温下で３０分間風乾しアセトンを揮散させ、次い
で６０℃の窒素雰囲気中で２０分間加熱してモノマー類
を重合させ架橋重合体を細孔表面に保持させた。多孔質
膜の重合体保持量を第１表に示す。

このようにして得た多孔質中空糸１５０本を集束してポ
リカーボネート製円筒容器（内径８ｍｍ×有効長１５０
ｍｍ）に充填し、各中空糸の両端部の開口状態を保持す
るように、ウレタン樹脂で両端を固定して、第３図に示
すような細胞培養器８を作成した。

本細胞培養器を１２０℃、３０分の蒸気滅菌後、７０％
エタノールにて湿潤化し、滅菌蒸留水で充分に洗浄した
後、別に蒸気滅菌したシリコンチューブ１４により培地
貯［１６と連結し、第４図に示すような細胞培養装置を
作製した。

この培地貯槽１６に、１０％牛脂児血清を含むＨａｎ’
ｓ　　Ｆ−１２培地２１を入れ、フィルター１７を介し
て５％ＣＯ２含有空気を供給した。

次に、細胞培養装置８の中空糸外側空間部にチャイニー
ズハムスター卵巣由来ＣＨＯ−Ｋｌ（ＡＴＣＣＣＣＬ−
６１）細胞（５×１０５個）を、第３図の側部導管１２
から添加し、密閉後培養を開始した。

培養は、培養器全体を回転させることなどにより培養器
内に細胞を均一に分散させ、３時間静置後装置傘体を３
７℃の恒温槽中に設置し、ポンプ１５より培地を２．５
ｍＩＬ／ｈｒで循環させながら行なった。３日目に培地
貯［１５中の培地を新しい培地と交換後、流速を５　ｍ
　１１　／　ｈ　ｒにあげ６日目にもう１度新鮮培地と
交換後、流速を２５ｍ　ｉｔ　／　ｈ　ｒにあげ培養を
続けた。

培養開始後８日目に、培養器をダルベツコのＰＢＳ　（
−）で洗浄後、トリプシン０．２５％、ＥＤＴＡｏ、０
２％を含むダルベツコＰＢＳ（−）にて、細胞を回収し
、セルカウンターにて細胞数を測定した。また、回収し
た細胞の０．０２５％トリバンブルー染色を行ない、細
胞生存率を求め生細胞数を算出した結果、培養器内の生
細胞数は５．２Ｘ　１０’個であった。

実施例２ 実施例１て用いたのと同様のポリエチレン多孔質中空糸
を第１表に示す濃度のジビニルベンゼン（ＤＶＢ）、重
合性モノマーとしての無水マレイン酸および０．２重量
％の過酸化ベンゾイルを溶解したアセトン溶液に１０秒
間浸漬した後、実施例１と同様の方法によって表面に架
橋重合体を保持させた多孔質中空糸を得た。

得られた中空糸を用い実施例１と同様にして培養装置を
作製し、同様の条件てのＣＨＯ−に１細胞の培養を行な
った。培養開始後８日目の細胞数を実施例１と同様にし
て計測したところ５．４×１０７個であった。

第　　１ 表 比較例１ 実施例１に用いたのと同様なポリエチレン製中空糸（架
橋重合体を保持させていないもの）１５０本を集束して
、ポリカーボネート製円筒容器（８φＸ１５０ｍｍ）に
充填し、ウレタン樹脂をポツティング材として両端を固
定した細胞培養器を作製した。

細胞培養器をエチレンオキサイドガス殺菌後、７０％エ
タノールにて親水化した後、滅菌蒸留水で充分洗浄した
。

本細胞培養器を用いて実施例１と同様にして第４図の構
成の細胞培養装置を作製し同様の条件下でＣＨＯ−Ｋｌ
細胞の培養を行なった結果、８日後の生細胞数は１．７
Ｘ１０７個であった。

実施例３ 実施例１で作製した培養装置を用い、実施例１と同様の
条件でＣＨＯ−Ｋｌ細胞の培養を開始した後、培養を１
７時間で中止し、培養器内から中空糸を取り出し、ＰＢ
Ｓ　（−）緩衝液で洗浄後、中空糸ととキムザ染色して
、中空糸外壁表面に付着した細胞の増殖形態を実体顕微
鏡により観察したところ、中空糸壁表面に細胞が非常に
伸展性よく付着していることが確認された。

比較例２ 比較例１で作製した培養装置を用い、同じ条件でＣＨＯ
−Ｋｌ細胞の培養を開始した。１７時間後、実施例３と
同様に中空糸を取り出してギムザ染色をし、細胞の増殖
形態を観察したところ、細胞が付着しているものの伸展
の程度は少なく、実施例３に比較して、細胞の付着数も
少なかった。

〔発明の効果〕

以上述べたように本発明の細胞培養方法においては、多
孔質膜として、多孔質膜表面上に官能基として酸無水物
をもつ重合性モノマーとジビニルベンゼンとを含む組成
物から得られた架橋重合体を保持せしめた膜を用いてい
るため、培養前の蒸気殺菌が可能であり、しかも他の素
材からなる膜に較べ細胞の増殖性、付着性細胞を用いた
場合の付着性、伸展性に優れるため、本方法によれば良
好な細胞培養が行なえるという特徴を有する。

【図面の簡単な説明】

第１図〜第３図は本発明に用い得る細胞培養器の一例を
示す模式断面図であり、第４図は第３図に示した細胞培
養器を用いた細胞培養装置の一例を示す図である。 図において、１，８：細胞培養器、２：多孔質膜（平服
）、３：細胞添加口、４：培地入口、５：培地出口、６
：培養領域、７：領域、９：多孔質中空糸膜、１０，１
１：端部導管、１２゜１３：側部導管、１４：シリコン
チューブ、１５：チューブポンプ、１６：培地貯槽、１
７゜１８：フィルターをポす。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）他の領域と多孔質膜により仕切られた培養領域中で
   細胞を培養する方法において、前記多孔質膜の少なくと
   も一部の表面上に官能基としての酸無水物を有する重合
   性モノマーとジビニルベンゼンとを含む組成物から得ら
   れた架橋重合体が保持させてなることを特徴とする細胞
   培養方法。 ２）多孔質膜が中空糸形状を有する請求項１に記載の細
   胞培養方法。