JPH0216975A - 異成分混交性のプレーｓに富んだｂ型肝炎表面抗原 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈発明の背景〉 本発明は、培養培地（ｃｕｌｔｕｒｅ　ｍｅｄｉｕｍ）
から精製された・異成分混交性（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅ
ｏｕｓ）の、ｐｒｅ−３に富むＢ型肝炎表面抗原（ＨＢ
ｓＡｇ）粒子に、精製法に、また発現系に、関する。本
発明のＨＢｓＡｇ粒子は、実質的な量のｐｒｅ−５１、
ｐｒｅ−８２およびＳ成分を含み、この粒子はＢ型肝炎
感染に対して有効なワクチンの画業的生産に使用するこ
とができる。

毎年、何億もの人々がＢ型肝炎ウィルス（ＨＢ　Ｖ）に
感染している。Ｂ型肝炎ウィルスは、血清肝炎または輸
血性肝炎の病因性因子であって、慢性肝疾患および原発
生（ｐｒｊｎ＋ａｒｙ）肝細胞癌腫への移行進展に関与
している。

Ｂ型肝炎ウィルスの外被（ｃｎｖｅｌｏｐｅ）タンパク
質のサブユニットは、感染に対する防御的免疫応答を惹
起する抗原として用いられてきた。例えば、ウィルスの
表面タンパク質、ＨＢｓＡｇ、を、Ｂ型肝炎ウィルスに
慢性的に感染しているヒトの血漿から精製して、それか
らワクチンを製造していた。表面タンパク質成分は、Ｈ
ＢＶ表面抗原ないしＨＢｓＡｇと呼ばれている。これに
は、免疫応答を生じる能力があるからである。

しかしながら、ヒトキャリアの血清には、活性のある感
染性Ｂ型肝炎ウィルスさらには望ましくない偶発獲得性
の諸因子が含まれている可能性があることから、これを
ＨＢｓＡｇの原材料に用いることは勧められない。精製
のために入手できる血漿由来の抗原には量的な制限があ
り、血漿由来のワクチンを得るためには多くの手間と費
用を要する精製工程を余儀なくされる［例えば、Ｖｎｅ
ｋら（米国特許第３，９５１，９３７号明細書）および
０ｈＩＩＩｕｒａら（米国特許第４，５６５，６７９号
明細書）の方法］。そのために、肝炎が主要な健康問題
となっている開発途上国における使用が阻まれている。

さらに、血漿由来のワクチンの精製においては、例えば
ＢＩｕｍｂｅｒｇら（米国特許第３．６３６，１９１号
明細書）および旧１１ｍａｎら（Ｖｉｒａｌ　　Ｈｅｐ
ａｔｉｔｉｓ：　　５ｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ　
　ｉｎ　　Ｉｍｍｕｎ−ｏｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ　ｏ
ｆ　　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　ｂｙ　ｌ１ｅｐａｔｉｔ
ｉｓ　Ｖｉｒｕｓｅｓ、　３−１２．１９８３）の記載
にみられるように、ペプシン、尿素またはホルマリンな
どの物質で処理して危険な夾雑物を除去する必要がしば
しばあるが、このような処理はワクチンの活性を低下さ
せる。

組換えＤＮＡ　（ｒＤＮＡ）技術によって生産される肝
炎ワクチンは、ヒト血漿に由来するワクチンに伴う問題
を解決する。

ｒＤＮＡ技術を用いてタンパク質を発現するために、三
つのクラスの生物が用いられてきた。すなわち、原核生
物である大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｊ）　、単細胞真核生物で
ある酵母および哺乳動物細胞を、連続培養にて用いる。

大腸菌における発現レベルは低く、産生物の免疫原性は
最も弱い。酵母によって産生される粒子は、分泌されず
、また抗原性が低い。ワクチン生産におけるウィルス抗
原の発現には、培養した哺乳動物細胞がもっとも自然な
好ましいシステムを提供する。なぜならば、ウィルスは
、タンパク質合成、正しい折りたたみ、プロセシング、
グリコシレージョン、マルチマーへの組立ておよび細胞
からの分泌などの機能について、宿主細胞の生合成機構
に完全に依存しているからである。

培養における哺乳動物細胞からのＨＢ　ｓ　Ａ　ｇの合
成および分泌は、公知である（Ｐｉｌｌｓら：米国特許
第４，６９６，８９８号明細書；Ｄａｖｊｓら；Ｐｒｏ
ｃ、　Ｎａ１１．　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、　ＵＳＡ　　
８２．７５８０−７５［１４、Ｊ９Ｂ５；　Ｄｅｎｎｊ
ｓｔｏｎら：　Ｇｅｎｅ　　３２．８５７−３Ｂ８、Ｊ
、９８４゜Ｄｅｊｅａｎら　：　　Ｐｒｏｃ、　　Ｎａ
１１．　　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｌ　　ＵＳＡ　　　８０
．２５０５−２５０９．１９Ｆ３３　ＨＰａｔｚｅｒら
：　Ｖａｃｃｉｎｅ　８５、ｐｐ。

２６１−２［ｉ４．１９８５）。培養培地において哺乳
動物細胞内で合成されてそこから分泌されるＨＢｓＡｇ
粒子は、形態学的、生物化学的および免疫学的に、血漿
由来のＨＢｓＡｇ粒子と同様のものである。

哺乳動物細胞培養物から分泌されるＨＢｓＡｇ粒子は、
Ｓおよびプレー５（ｐｅｒ−８）タンパク質をはじめと
する血漿中のタンパク質成分と同じタンパク質成分を含
むと考えられる。細胞培養物由来のＨＢｓＡｇは、免疫
原性を有しており、血漿由来のワクチンに較べて廉価で
あり、血漿由来のワクチンに付随する多くの危険因子を
排除している。しかし、これらの細胞培養物由来のＨＢ
ｓＡｇワクチンは、天然ＨＢＶ中に認められるプレーＳ
成分のあるものが欠けている。

Ｂ型肝炎ウィルスは、ヒトウィルスについて知られてい
るＤＮＡ配列のうち最も小さいものの一つ、約３２００
ｂｐ、を持っものである。このＩ（ＢＶＤＮＡは、変っ
た構造を持っている。すなわち環状および部分二重鎖で
ある。二重鎖領域の長さは変化する。タンパク質は長鎖
（Ｌ）の５′一端に共有結合するものと信じられている
。このウィルスと会合したポリメラーゼは、インビトロ
反応でウィルスゲノムの一重鎖領域を修復して完全な二
重鎖ＤＮＡにする。ＨＢＶＤＮＡの配列法めによって、
異なったサブタイプのＨＢＶからのゲノムには配列に実
質的な多相性（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｊｔｙ）があるこ
とがわかった。

Ｔｉｏｌ　Ｉａｉｓら（”Ｔｈｅ　　１ｌｅｐａｔｊｔ
ｉｓ　　Ｂ　　ＶｉｒｕｓＮａｔｕｒｅ　　３１７　：
４８９−４９５（１９ｇ５））は、ＨＢＶの構造および
そのプレーＳ］、プレー８２およびＳ遺伝子産物につい
て述べている。

１４ｕｒｒａｙ　（米国特許第４，７１０，４６３号明
細書）は、単細胞宿主たとえばＥ、ｃｏｌｉ中でＨＢＶ
表面抗原を発現することができるＨＢＶＤＮＡ配列を含
んでなる組換ＤＮＡ分子について述べている。

ＫＩＩｌｌら　（Ｃ１ｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　Ｅｘｐｒｅ
ｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｌ１ｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｂ　５ｕｒ
ｆａｃｅ　Ａｎｔｉｇｅｎ　ｇｅｎｅ　　、Ｋｏｒｅａ
ｎ　Ｂｉｏｃｈ−ａｍ、Ｊ、　１７．７０−７９　（１
９８４）は、ＨＢＶＤＮＡ含有ｐＢＲ３２２プラスミド
について述べている（ＯｎＯら、Ｎｕｃｌｅｉｅ　Ａｃ
１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　　１１．１７４７（１９８３）も
同様）。

Ｐａ１ｖａｋｉｓら（’Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｏ
ｆＢｏｖｉｎ　Ｐａｐｊｌ−１ｏｍａ　Ｖｉｒａｌ　ａ
ｎｄ　Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ　Ｖｅｃｔｏｒｓ　　、　
ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、ｐｐ２９−３８
（１９８７））は、哺乳類宿主細胞内でウィルスＤＮＡ
の発現のためのベクターについて検討している。

旧ｌ１ｉｃｈら（米国特許第４，６８３，１３６号明細
書）は、チャイニーズハムスター卵巣細胞の培養物から
ＨＢｓＡｇを得た。このＨＢｓＡｇは、ゲル電気泳動に
よってプレ−８２領域成分の一つを含有しており、また
この領域はＳ領域抗原よりも免疫原性が大きいことがわ
かった。

Ｌｅｖｉｎｓｏｎら（ヨーロッパ特許出願第００７３６
５６号明細書、１９８３年３月９日公開）は、本質的に
Ｓ領域成分のみを含む発現ＨＢｓＡｇ粒子を生成するベ
クターを開示している。

これらの先行文献は、哺乳動物細胞培養物中の、異成分
混交性の（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ）プレーＳに富
むＨＢｓＡｇ粒子を発現することができる発現系を開示
してはいない。

Ｈｅｒｓｈｂｅｒｇ　（米国特許第４，６２４，９１８
号明細書）は、イムノアフィニティ（ｊｍｍｕｎｏａｒ
ｆＮｔｙ）吸着クロマトグラフィーを用いるあるいは用
いないイオン交換クロマトグラフィーを用いて、組換え
細胞培養物からＨＢｓＡｇを精製する方法を開示してい
る。イオン交換クロマトグラフィーによれば、ＨＢｓＡ
ｇ粒子の異成分混交性の電荷分布によってＨＢｓＡｇを
両分に分離することができ、従ってＨＢｓＡｇ粒子標品
の異成分混交性（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉ　ｔｙ）を低
下させることができる。

免疫吸着クロマトグラフィーも勧められない。

これは、モノクローナル抗体を大規模で生産し、精製し
、イムノアフィニティーカラムゲル媒質にカップリング
させる必要があるので高価である。

免疫吸着クロマトグラフィーは、また、下流精製工程に
おいて除去されるべき他の外来性タンパク質であるマウ
スモノクローナル抗体の濾過除去によって、試料を汚染
する可能性がある。

Ｋａｖａｈａｒａら（米国特許第４，５１５，７１４号
明細書）は、硫酸塩化した（ｓｕｌｆａｌｔｅｄ）ゲル
媒質を用いるアフィニティークロマトグラフィー工程を
開示している。ＳｕｇａｈａｒＢら（米国特許第４．６
１２，２８３号明細書）は、酵母由来の組換えＨＢｓＡ
ｇ粒子をハイトロキシルアパタイトカラムクロマトグラ
フィーを用いて精製することは可能であるが、得られる
ＨＢｓＡｇ最終生産物は異成分混交性のものではなく、
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって２４　
ｋｄの単一バンドを唯−示すのみであったことを開示し
ている。

アフィニティクロマトグラフィーは、イオン交換クロマ
トグラフィーと同様に、ＨＢｓＡｇ標品の異成分混交性
を低下させるものと推定することができる。

直径が約２２ｎｌ！１で密度が約１．２ｇ／リットルの
球状ＨＢｓＡｇ粒子を精製するために、超遠心分離法が
用いられてきた。一般に、超遠心分離は、Ｗａｆｌｌｐ
１８ｒの方法（米国特許第４，３４９．５３９号明細書
）、またはアフィニティーカラムクロマトグラフィー、
イオン交換カラムクロマトグラフィーまたはハイトロキ
シルアパタイトカラムクロマトグラフィーなどで最初の
濃縮および分別沈殿を行った後に用いられ、望ましい純
度のＨＢｓＡｇ粒子を分離するためには一般にはいくつ
かの連続した超遠心分離を必要とする。Ｇｅｒｉｎらの
Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、７，５８９（１９７１）ｏｙｏｂｉ　
　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、ｌＩ５　　、１００（１９７５
）を参照されたい。超遠心分離を繰り返すことによって
ＨＢｓＡｇの収率は低下する。

本発明の目的は、プレーＳに富むＨＢｓＡｇ粒子をつく
る完全ＨＢｓＡｇ遺伝子を発現する哺乳動物細胞培養物
を得ることである。

本発明の他の目的は、哺乳動物細胞培養物からプレーＳ
成分に富み異成分混交性電荷を有するＨＢｓＡｇ粒子を
、激しい処理およびＨＢｓＡｇ粒子の異成分混交性を低
下させる分離法を避けて、単離することである。

本発明の目的は、したがってハイトロキシルアパタイト
や免疫吸着クロマトグラフィーを用いることなく、また
タンパク質分解、酸性または他の強烈な処理を行うこと
なく純粋な異成分混交性のＨＢｓＡｇ粒子を高収率で生
産することである。

〈発明の概要〉 本発明は、異成分混交性のＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡ
ｇ）および哺乳動物細胞培養培地から異成分混交性のＨ
ＢｓＡｇを精製する方法に関する。

本発明の方法は、ｐｒｅ−８に富んだ異成分混交性ＨＢ
ｓＡｇ粒子を培養培地に放出するような適当な哺乳動物
細胞株によって始める。

好ましい発現系は、完全なり型肝炎表面抗原遺転子（ｐ
ｒｅ−８ｌおよびｐｒｅ−８２領域を含む）を有してこ
れを発現することができるベクターによってトランスフ
ェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）させた哺乳動
物細胞培養である。細胞株（ｃｅｌｌｌ−１ｎｅ）は、
ＣＶ−１、ＣＨｏ、３Ｔ３およびＨｅＬａなどを用いれ
ばよい。最も好ましい発現系は、ウシバピロマウイルス
（ｐａｐｉｌｌｏｍａ　ｖｉｒｕｓ）。

マウスメタロチオネイン（ｍｅｔａｌ　１ｏｔｈｉｏｎ
ｃｉｎ）遺伝子プロモーター、ヒトメタロチオネイン遺
伝子およびＢ型肝炎表面抗原遺伝子からの遺伝子祠料を
含むベクターによってトランスフェクションさせた、マ
ウス繊維芽細胞である。このような系では、プロモータ
ーはＨＢｓＡｇ遺伝子産生物の発現を誘導的にコントロ
ールし、これによってｐｒｅＳに富んだ異成分混交性Ｈ
ＢｓＡｇ粒子の形成が可能になる。

本発明の組換えＤＮＡ発現ベクターは、ＨＢＶからのｐ
ｒｅ−８ｌ、ｐｒｅ−５２およびＳ領域ＤＮＡからなる
ＨＢｓＡｇの遺伝子決定因子；インデューサーによって
誘導される誘導可能な調節（ｃｏｎｔｒｏｌ）領域：細
胞宿主に抗生物質耐性を付与する遺伝子；適宜、哺乳動
物細胞株を形質転換することができるトランスフォーマ
−（ｔｒａｎｓｆ’ｏｒｍｅｒ）遺伝子；および選択因
子の存在で、トランスフェクションした細胞にトランス
フェクションしない細胞に対する選択的優位性を付与す
る遺伝子、を含んでおり、ＨＢｓＡｇ遺伝子は調節領域
に対してその調節機構が及ぶように位置している。この
ような構成によって、細菌宿主にベクターが導入された
場合には、抗生物質による選択によってクローニングさ
れて、再生産され、多数のコピーを得ることが可能であ
る。さらに、ベクターの導入が哺乳動物細胞株宿主にな
された場合には、トランスフェクションされた細胞は存
在する選択因子によって選択され、調節領域の作用によ
ってｐｒｅ−８に富んだＨＢｓＡｇの産生を存在するイ
ンデューサーに応答して進行することができ、哺乳動物
細胞株宿主はｐｒｅ−８に富んだ異成分混交性ＨＢｓＡ
ｇ粒子を分泌することができる。

本発明による精製法では、まず、ＨＢｓＡｇの粗調製物
を分離する。細胞培養培地を清澄化して、濃縮する。培
養培地は約２５％まで、好ましくは約１０％、の血清を
添加したものでもよい。好ましくは、細胞破壊片を中速
の遠心分離によって除去して、超遠心分離によって上清
液を約１０〜５０倍に濃縮する。これによって、不都合
な粘度の上昇を抑えて容量を減らすことができる。濃縮
は、限外濾過によって、最も好ましくはＨＢｓＡｇ粒子
の分子量よりもやや小さい分子量透過限界（ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ　ｖｅＩｇｈｔ　ｃｕｔ−ｏｆｆ）を有するフ
ィルターを用いて、行うことができる。このためには、
孔サイズは、１，０００，０００以下のものが好ましい
。透過限界は、約３００，０００が最も好ましい。タン
パク質濃度は約２００ｍｇ／ｍ＋を越えないことが好ま
しい。

第二に、ＨＢｓＡｇ粒子を濃縮物から、好ましくはポリ
エチレングリコールを用いて、分別沈殿させる。好まし
くは、ＨＢｓＡｇ粒子を含む沈殿物を中速の遠心分離に
よってペレットにする。この工程によって粗調製物が得
られ、これを次の工程で精製する。

第三に、ＨＢｓＡｇペレットを最小容量の緩衝液に溶解
させて、ゲル濾過クロマトグラフィーカラムにかけて、
ＨＢｓＡｇを含む両分を集める。

第四に、ＨＢｓＡｇ画分を等密度バンディング（Ｉｓｏ
ｐｙｃｎｉｃ　ｂａｎｄｉｎｇ）超遠心分離にて、好ま
しくは約２４％〜２６％の濃度の臭化カリ（ＫＢｒ）を
密度媒質として用いて、処理する。ＨＢｓＡｇを含む両
分を集めて濃縮透析を行う。

第五に、ＨＢｓＡｇを含む両分をショ糖ステップ勾配超
遠心分離で、好ましくは２０％、３０％および４０％（
ｗ／ｗ）のショ糖を用いて、処理して、純粋なＨＢｓＡ
ｇ粒子を含む画分を集めて、透析を行うか、または適当
なゲル濾過カラムクロマトグラフィー媒質を用いて緩衝
液交換を行う。

得られたＨＢｓＡｇは純粋であり、凍結乾燥および肝炎
に対する安全で有効なワクチンの調製に適している。本
発明の方法は、簡単で、経済的で、大規模な産業的使用
に適している。ワクチンは、免疫原性の高いｐｒｅ−８
構成分に富んでいるために有用な抗原的性質を有してお
り、ｄｅｌ　１ｖｅｒｙによって肝炎患者の血流に用い
ることができる。

本発明のＨＢｓＡｇ生産物は、異成分混交性で実質的に
、二型のＳタンパク質、二型のｐｒｅ−８２タンパク質
および二型のｐｒｅ−８ｌタンパク質からなる。５ＤＳ
−ＰＡＧＥおよびゲルの銀染色の染色密度から得られた
量比は、約７０％〜９０％のＳタンパク質、約５％〜２
０％（７）ｐｒｅ〜８２タンパク質および約２％〜１０
％のｐｒｅ〜８１タンパク質である。

〈発明の具体的説明〉 本発明の出発材料は、Ｂ型肝炎ウィルス遺伝子を発現す
る哺乳動物細胞系である。この細胞系は、遺伝子工学的
に調製されたもの、ウィルス感染したもの、あるいは感
染した患者に由来するものである。本発明における好ま
しい出発材料は、輸送手段として組換えウィルスベクタ
ー、および発現宿主として哺乳動物組織培養細胞を用い
て調製されたＨＢｓＡｇである。

本発明によるベクターは、（１）プレー８１、プ２〇　
− レー８２およびＳ領域を含む全ＨＢｓＡｇ遺伝子を発現
し、（２）細菌および哺乳動物宿主細胞の両者において
増殖することができ、（３）形質転換の後、細菌を選択
するための少なくとも１つのマーカーを持っており、（
４）トランスフェクションの後、哺乳動物細胞を選択す
るための少なくとも１つのマーカーを持っており、（５
）高転写レベルを産生ずるために、宿主中において多コ
ピーで存在することができ、（ｆｉ）ＨＢＶ表面抗原遺
伝子の転写を行なうために強力なプロモーターを有して
いる。最も好ましくは、プロモーターが誘導される必要
があるならば、インデューサーが、生産細胞系からＨＢ
ｓＡｇを大量生産するのに費用がかからず適切であるこ
とである。

好ましいベクターは、（１）大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｌ）に
おける複製（ｒｅｐｌｊｃａｔｊｏｎ）の起点（ｏｒｊ
ｇｌｎ）およびアンピシリン耐性遺伝子を供給するｐＢ
Ｒ３２２の部分、（２）マウス細胞系において多コピー
数で増殖するための牛パピローマ（ｐａｐｉ　Ｉ　Ｉｏ
ｍａ）ウィルスＤＮＡ、（３）ＨＢｓＡｇ遺伝子の転写
のための強力なプロモーターとしてマウスメタロチオネ
イン（ｍｅｔａｌ　Ｉｏｔｈｉｏｎｅｉｎ）プロモータ
ー、（４）カドミウム存在下でのマウス細胞の選択可能
マーカーとしてのヒトメタロチオネイン遺伝子、を含む
ものである。両メタロチオネインプロモーターは、カド
ミウムあるいは亜鉛（これらは費用がかからない）によ
って誘導することができる。ヒトメタロチオネイン遺伝
子は、宿主細胞にカドミウム存在下でプラスミドのコピ
ーを増加させ、これによって発現を増加させるような更
なる利点を有している。

哺乳動物細胞培養培地からのＨＢｓＡｇの精製は、人血
からのＨＢｓＡｇの精製とは全く異なっている。第一に
、哺乳動物細胞培養培地は、１０％あるいはそれ以上の
ウシ胎児血清や宿主細胞分泌物を含む外来性タンパク質
を含んでいる。ヒト投与のためのワクチンとして組換え
ＨＢｓＡｇを使用するためには、最終生産物は出発材料
に含まれるいかなる外来性タンパク質をも含んでいては
ならない。

第二に、培養培地中に産生されるＨＢｓＡｇの濃度は、
高力価ヒトキャリア血漿に含まれるものに較べるとずっ
と低い。その結果として、タンパク質濃度および多様性
はヒト血液における方が培養培地におけるよりはずっと
高いにもかかわらず、ＨＢｓＡｇの１ユニット当りの夾
雑物の量は培養培地の方がヒト血液よりもずっと多い。

培養培地からのＨＢｓＡｇ粒子の精製する際の他の難し
さは、ＨＢｓＡｇ粒子の異成分混交性の電荷および密度
分布に由来する。これはＨＢｓＡｇ粒子中にｐｒｅ−８
ｌおよびｐｒｅ−８２構成分が多いことによる。ＨＢｓ
Ａｇの生物化学的および物理化学的な異成分混交性は、
遺伝子構造および培養において用いられる遺伝子発現系
に依存する。

天然のＨＢｓＡｇゾーン（Ｄａｎｅ）粒子は、３つのペ
プチド鎖を含んでいる。Ｓタンパク質はグリコジル化さ
れていない（ｕｎｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）形の分子
量２４，０００ダルトン（ｐ２４）およびグリコジル化
された形の分子ｆｆ１２７，０００ダルトン（ｇ　ｐ　
２７）を有する２２６アミノ酸タンパク質である。プレ
ー８２タンパク質は、分子量３３−３４．０００ダルト
ン（ｇ　ｐ　３４）および３６３７．０００ダルトン（
ｇ　ｐ　３６）の２つのグリコジル化された形で存在す
る２８１アミノ酸タンパク質であり、そのアミノ酸配列
は、アミノ末端（ａｎ＋１ｎｏ−ｔｅｒＩＩｉｎａｌ　
ｅｎｄ）における５５アミノ酸プレー８２領域と同時に
Ｓ領域を含んでいる。プレＳ１タンパク質は、約４００
アミノ酸を含んでおり、分子量的４１，０００　（ｇｐ
４１）および約４４，０００　（ｇｐ４４）の２つのグ
リコジル化された形で存在する。プレー８１タンパク質
は、Ｓ領域、プレー８２領域、およびプレー８１領域を
含んでいる。２２６アミノ酸Ｓ領域は、十分に保持され
る。５５アミノ酸プレー８２領域は、ＨＢＶサブタイプ
中ではより変動性（ｖａｒｉａｂｉ　１ｉ−ｔｙ）を有
している。プレー８１領域は、最も変動し、約１０８〜
約１２８アミノ酸の範囲にわたる異なった長さを有する
可能性もある。チオレイス（Ｔｌｏｌ　Ｉａｌｓ）らの
、「Ｂ型肝炎ウィルス」　（ネイチャー（ｎａｔｕｒｅ
）３１７．４８９−４９５（１９８５年））を参照され
たい。

ＨＢｓＡｇ粒子の集成した四次元構造は、直径約２２ｒ
＋ｍの球形状の中に約９０％のＳタンパク質、８〜９％
のｐｒｅ−８ｌタンパク質および１〜２％のｐｒｅ−８
２タンパク質さらに脂質を含むと考えられている。タン
パク質のアミノ酸構成およびグリコシレージョンの程度
は、ウィルスのサブタイプによって変化し、ＨＢｓＡｇ
粒子の四次元、マルチメリック（ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｃ
）構造における各タンパク質の相対量もまた変化するか
もしれない。

本発明によると、精製の過程においてすべてのｐｒｅ−
８構成分を本質的に保持することが望ましい。なぜなら
ば、これら構成分は、ＨＢＶ感染に対する防御的免疫の
誘導に有効であるからである。出発のＨＢｓＡｇは、主
たるＳ抗原に加えて実質的な量のｐｒｅ−Ｓｌおよびｐ
ｒｅ−８２構成分を含む。本発明によって生産される異
成分混交性のＨＢｓＡｇ粒子は、平均直径約２２ｎｍの
ほぼ球状であって、ヒトキャリアの血漿から分離された
ＨＢｓＡｇ粒子と同様の形態学的および免疫学的な性質
を有する。

２２ｎｍの粒子の正確な生物化学的および生物物理学的
な性質は完全にはわかっていない。しかしながら、本発
明者らは、本発明によって生産されるＨＢｓＡｇ粒子が
広範囲の電荷および密度分布を有していることを見出し
た。これは、おそらく翻訳後の修飾、炭水化物の異成分
混交性およびｐｒｅ−Ｓ１、ｐｒｅ−５２およびＳ遺伝
子産物の複合体の形成によるものと考えられる。本発明
によれば、発現されて培養培地中に分泌される多様な型
を最終生産物、異成分混交性のｐｒｅ−５に富んだＨＢ
ｓＡｇ粒子に望むままに含ませることができる。

本発明によれば、ｐｒｅ−８に富んだ異成分混交性のＨ
ＢｓＡｇ粒子は、電荷およびイムノアフィニティーある
いは他の化学的アフィニティーなどの化学的性質に基づ
いて構成分を分離する技法を採用することなく、サイズ
および密度の物理的な性質に基づいて分離する技法を用
いて、分離される。

本発明者らは、また、塩化セシウムを用いる超遠心分離
を繰り返すことによってほとんどのｐｒｅ−８構成分が
ＨＢｓＡｇ粒子から除去されることを見出した。これは
高塩効果によるものと考えられる。ｐｒｅ−５構成分を
保持することは、それらがＩ（ＢｓＡｇワクチンの十分
な免疫的能力のために重要であると考えられているので
有利であり、従って、本発明における培養ＨＢｓＡｇ粒
子からのＨＢｓＡｇの精製工程は、過度の超遠心分離を
避ける。

精製工程 第１図の工程系統図に示すように、第一の工程では、集
めた細胞培養培地を中速の遠心分離、好ましくは１０，
０ＯＯＧにて１０〜２０分間、して宿主細胞の破壊片を
除去して、清澄にする。本発明者らは、この清澄化工程
の前に、培養培地を２〜８℃で長時間保存してもＨＢｓ
Ａｇ活性の有意の低下は認められないことを見出した。

例えばＢｉｏＲａｄ社の開発になる市販のプロテアーゼ
錠剤を用いて調べた結果、培養培地にはいかなるプロテ
アーゼ活性は見出されなかった。

次いで、清澄化画分を、好ましくは２〜８℃における限
外濾過法によって、濃縮する。血清が存在するときには
、フィルターの透過限界分子量は約３００，０００ダル
トンでなければならない。

Ｎｅｖ　Ｂｒｕｎｓｖｉｃｋ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃに
よって製造された接平面の（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ）　
Ｍｃｇａｆｌｏｖシステムは、Ａｍｌｃｏｎ社によって
製造されたＸＭ−３００膜フイルターを採用しているが
、このシステムは、大量の培養培地を濃縮するのに適し
ている。一方、ＨＢｓＡｇの収率も高める。ＨＢｓＡｇ
の平均収率は、この工程で９５％以上である。約百万以
上の透過限界を有するフィルターは、マイクロフィルト
レージョンとなされて、収率がいくらか低下する。

細胞培養培地が１０％の血清を含む場合には、培地を１
０倍に濃縮しなければならない。細胞培養培地に血清を
含まない場合には、培地の濃縮は５０倍以上にすること
が好ましい、血清無添加の場合には、限外濾過膜の透過
限界分子量は血清添加の場合よりも小さくてよい。どの
場合でも、次の工程のポリエチレングリコールとの均一
混合のために粘性が高すぎないようにタンパク質濃度は
約２００ｍｇ／ｍｌを越えないようにする。

第二の工程では、分別沈殿工程によって、好ましくは一
つの工程で、ＨＢｓＡｇを回収する。好ましい沈殿剤は
、分子ｆｆ１６，０００〜９．　０００ダルトンのポリ
エチレングリコール（ＰＥＧ）である。とくに効果的な
沈殿は、室温で約３０分間型はんしなからＰＥＧ粉末を
徐々に添加して、得られる混合物を２〜８℃でさらに３
時間、好ましくは一晩、放置することによって行う。−
工程沈殿の目的は、最小の夾雑タンパク質を含むＨＢｓ
Ａｇを濃厚富化することにある。したがって、ＨＢｓＡ
ｇをほぼ完全に沈殿させる量をごくわずか下回る程度の
ＰＥＧ濃度を得ることが望ましい。濃度９〜１２％（ｖ
／ｖ）は好ましく、より好ましくは１０％であって、Ｈ
ＢｓＡｇ収率は８０〜９０％である。

１２％以上のＰＥＧを用いると収量は９０％以上になる
が、後の工程において除去がきわめて難しい夾雑タンパ
ク質をも沈殿させる。

上記の目的に合うものであれば、硫酸アンモニウムなど
の他のタンパク質沈殿剤をＰＥＧの代わりに用いてもよ
い。５０％の硫酸アンモニウム添加によって８０％以上
のＨＢｓＡｇを培養培地から沈殿させることができる。

しかしながら、この方法では、上記の１０％ＰＥＧ沈殿
処理に較べてより多くの夾雑物、とくにウシ血清アルブ
ミン、を共沈殿させるようであった。沈殿させたＨＢｓ
Ａｇを中速の遠心分離によって回収する。例えば、１０
．０ＯＯＧで３０分間の遠心分離が適当である。

第三の工程では、沈殿をゲル濾過クロマトグラフィーの
ための緩衝液の最小容量に溶解する。好ましい方法にお
いては、５０ｍ１の１０倍濃縮培養培地から得られた沈
殿に対して各々２〜３ｍｌの燐酸緩衝生理食塩水を用い
る。非溶解物質を清澄化工程によって除去する。これに
は２０，０ＯＯＧでの１０分間の遠心分離が適当である
。

次いで、ｐｒｅ−５構成分を含むＨＢｓＡｇを濃厚富化
するために、試料溶液をゲル濾過カラムクロマトグラフ
ィーに供する。このとき同時に、次の等密度バンディン
グ工程においてタンパク質の過剰負荷を起こすとおもわ
れる夾雑タンパク質を除去することができる。ゲル濾過
は、緩衝液交換の工程としておよび精製処理の最後に不
純物を除去するために使われてきた（Ｉｌｅｒｓｈｂｅ
ｒｇ：米国特許第４，６２４，９１８号明細書）。本発
明によれば、ｐｒｅ−５構成分を含む異成分混交性ＨＢ
ｓＡｇ粒子を、超遠心分離処理の前にゲル濾過カラムク
ロマトグラフィー処理することによって、イオン交換カ
ラム、アフィニティーカラムまたはハイドロオキジルア
ペタイトカラムクロマトグラフィーよりは、高収率で濃
厚富化することができる。フィルターはウシ血清アルブ
ミンのような夾雑物を、おそらく複合体として保持する
ことから、タンパク質夾雑物の除去には限外濾過よりも
ゲル濾過の方が好ましい。

適当な緩衝液をゲル濾過のために選択することができる
。それによって後に続く超遠心分離工程の緩衝液交換ま
たは濃縮透析に備え、必要な超遠心分離の反復回数を少
なくする。ゲル濾過媒質は、大規模な生産に用いられる
長いカラムへの充填に耐えられねばならず、かつ高分子
量のＨＢｓＡｇ粒子をウシ血清アルブミンのような低分
子量の夾雑成分から分離せねばならない。クロマトグラ
フィー媒質は、ＨＢｓＡｇを他の低分子量および高分子
量分子から分離することができて、任意のカラムの長さ
で高分子量領域において所望のカラム分離能を有するも
のである。例えば、分子量で約１．２００，０００〜１
００．０００ダルトンなどである。

適当な範囲を選択することによって、粒子の一部を排除
体積（ｖｏｉｄ　ｖｏｌｕｍｅ）部に、一部を溶出体積
（Ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ　ｖｏｌｕｉｌｅ）部に溶出させ
ることができ、排除限界（ｃｘｃｌｕｓｉｏｎ　１ｉＩ
ｏｉｔ）の上限はほぼＨＢｓＡｇ粒子の分子量であり、
好ましくは約１００〜２００万である。下限は、適宜の
長さのカラムにおいてＨＢｓＡｇ粒子を他の成分から効
集的に分離するのに適当な大きさでなければならないが
、好ましくは約１００，０００ダルトンである。適当な
媒質は、ＬＫＢから入手が可能なｕｌｔｒｏｇｅｌ　Ａ
ｃＡ２２であり、これは２％アガロースおよび２％アク
リルアミドからなるゲルである。

ゲル濾過工程によって、高分子量および低分子量のタン
パク質から高度に濃厚富化されたＨＢｓＡｇ画分が単一
のピークとして分離される。夾雑物が少ないことから、
ＨＢｓＡｇは次の工程のＫＢｒ等密度バンディング処理
によって純度および収率の高い単一ピークとして分離さ
れる。

クロマトグラフィー媒質、例えばｕｌｔｒｏｇｅｌ＾ｃ
Ａ２２、の量は、限外濾過前の培養培地の出発量の５リ
ツトル（これには約５０ｍｇのＨＢｓＡｇが含まれてい
る）に対して約１リツトルの樹脂量が適当である。カラ
ムを、例えばＰＢＳで、平衡にして、ゲル濾過クロマト
グラフィーを２〜８℃または室温で行う。

次いで、ゲル濾過カラムクロマトグラフィーからの両分
をＨＢｓＡｇの存在について還元条件で５ＤＳ−ＰＡＧ
Ｅにて調べる。５ＤＳ−ＰＡＧＥの可視化をＭｅｒｒｉ
ｌ　（Ｓｃｉｅｎｃｅ　２１１．１４３７−１４３８．
１９８１）の開発した銀染色にて行う。ゲルの厚さ０．
５＋ａｎ＋以下のミニ−ゲル電気泳動システムによると
２〜４時間以内の短時間で高い分離能が得られる。銀染
色されたゲルパターンの結果にしたがって、ＨＢｓＡｇ
を含む画分を集める。高分子量のタンパク質およびウシ
血清由来のタンパク質の少ない両分のみを集めて一緒に
することが好ましい。工程３の後の全体の収率は、約７
０〜８０％であって、単一の工程によると、収率は８５
％以上である。

その後、ＨＢｓＡｇ粒子を密度に基づいて超遠心分離に
よって、好ましくは等密度超遠心分離およびそれに続く
ショ糖ステップ勾配超遠心分離によって、分離する。こ
のように工程４では、巣めたＨＢｓＡｇを含む試料を等
密度超遠心分離によってさらにほぼ均質になるように精
製する。

等密度超遠心分離によって、ＨＢｓＡｇ粒子はそれら密
度範囲に基づいてよって広いピークに分離される。ウシ
血清アルブミンのようなより高密度の夾雑物および細胞
培養産生物のようなより低密度の夾雑物は別々のピーク
に分離される。適当な物質は臭化セシウムまたは塩化セ
シウム、および臭化カリまたは酒石酸カリなどがある。

ＫＢｒは、最高の収率および裔い純度をもたらすので、
ＣｓＣｌよりも優れている。ＫＢｒは、約１，１から１
．４の密度範囲を有しており、約１．１から１．７の密
度範囲を有するＣｓＣ１よりも浅い密度勾配を提供する
。ＫＢｒバンドによって分画されたＨＢｓＡｇ画分は、
Ｃｓ　Ｃｌバンドによる試料よりも夾雑物の含量が少な
いようである。さらに、ＫＢｒはＣｓＣＩよりも経済効
率がよい。

好ましい実施態様においては、ゲル濾過カラムクロマト
グラフィーから集めたＨＢｓＡｇを含む両分をまとめて
透析を行って、これに固体のＫＢｒを加える。好ましい
ＫＢｒ濃度は、２４〜２６％（Ｖ／Ｖ）である。試料溶
液を適当なチューブに分注して、平衡になるまで、例え
ば、１５０，０００Ｇで２０〜２４時間で１０〜１５℃
で、遠心分離する。精製の規模に応じての、遠沈管の選
択、ローターの大きさまたはｒｐｍなどの変更は、当業
者には明らかであろう。

等密度超遠心分離の結果得られる直線密度勾配を、適当
な勾配分画システムを用いて分画して、画分を５ＤＳ−
ＰＡＧＥおよび銀染色法にて同定する。工程４の後の収
率は約５０〜６０％である。

工程４の後のＨＢｓＡｇ生産物の純度は、８５％以上の
はずである。

精製画分を５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した結果、Ｓ＜
、ｐｒｅ−８ｌおよびｐｒｅ−８２抗原の存在が明らか
になる。他の少量の夾雑タンパク質、例えば高分子量の
タンパク質やウシ血清アルブミンなども検出される。し
かしながら、夾雑タンパク質が全タンパク質の２０％を
越える場合には、最初の超遠心分離で集めた両分につい
て、Ｉ＜Ｂｒ濃度を再び２４〜２６％（Ｖ／Ｖ）に調整
してもう一度超遠心分離を行うことが好ましい。

集めた画分を透析またはｄｉａＮＩｔｒａｔｊｏｎして
、同時にＡｍ１ｃｏｎ膜フイルタ−ＸＭ−３００などの
約３００．０００ダルトンの分子量限界を有するフィル
ターを用いてＰＢＳ中に濃縮する。ｄｉａｆｉｌｔ−ｒ
ａｔｉｏｎおよび濃縮は４℃で行う。試料溶液を最小容
量にまで濃縮して、次いで透析に用いる所望の緩衝液、
好ましくはＰＢＳ、を加えてＫＢｒを除去する。なぜな
ら、ＫＢｒはショ糖密度勾配超遠心分離を阻害するから
である。溶液を再び最小容量に濃縮する。このサイクル
を約３〜５回繰り返して、ＫＢｒを完全に除去する。

処理の規模によっては、生産物の濃度はきわめて高くな
る。このための好ましい方法としては、当業者に公知の
方法にて、試料溶液を４℃にてＰＢＳに対して透析する
か、低い排除範囲（ｃｘｃｌｕｓｉｏｎ　ｒａｎｇｅ）
、好ましくは３０，０００またはそれ以下の範囲、を有
し、適当なカラム様物質を用いたゲル濾過カラムクロマ
トグラフィーによってそれを脱塩する方法がある。ファ
ルマシア製のセファデックスＧ−２５またはＧ−５０を
用いることができる。

第五の工程では、透析した試料溶液をシヨ糖スチップ勾
配超遠心分離に供する。本発明による適当なショ糖ステ
ップ勾配は、２０％、３０％および４０％（Ｗ／Ｗ）か
らなる。しかしながら、工程４のＫＢｒ超遠心分離の後
の試料に多量の夾雑物がまだ含まれている場合には、１
０％のショ糖勾配ステップを加える必要があろう。試料
溶液を重層して、４℃で、例えば１５０，０ＯＯＧで１
６〜１８時間遠心分離する。用いるローターの型および
遠心分離の時間は、ＨＢｓＡｇ試料の量および試料溶液
中のＨＢｓＡｇの濃度、さらには処理の規模によって、
適当に選択すればよい。そのような応用は、当業者には
明らかであろう。

超遠心分離の後、勾配を勾配分画システムを用いて分画
する。勾配分画中に光学密度を２８０ｎ１１でモニター
した結果、ＨＢｓＡｇ粒子を含む単一のピークとその前
に位置するほとんどが夾雑タンパク質で占められる小ピ
ークが得られる。５ＤＳ−ＰＡＧＥの結果、これらはほ
とんどが分子量６６．０００ダルトン以上の高分子量の
タンパク質であることが明らかになる。単一ピークに含
まれるＨＢｓＡｇ生産物（すべてのｐｒｅ−３構成分を
含む）の純度は、９８％以上であって、実質的に他のタ
ンパク質あるいは現在用い得る方法で測定した限りでは
ＤＮＡを含まない。工程６の後の収率は約３０〜４０％
である。

純粋の生産物を含む両分を集めて、適当な緩衝液に対し
て透析する。これをワクチンの生産に用いてもよい。

ＨＢｓＡｇ生成物 第２図は５Ｌ出発培養物から得られた最終ＨＢｓＡｇ生
成物の５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示すものである。銀着色
ゲルパターンは、分子量的２４．２７．３４．３７．４
１および４４キロダルトンの蛋白質の存在を示し、Ｓ％
プレー８２、およびプレー８１遺伝子生成物に相当する
ものである。これら遺伝子生成物の免疫同定は、各種モ
ノクローナルおよびポリクローナル抗体を用いてイムノ
プロット染色法により行う。

５ＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシープル−Ｒ−２５０ま
たは銀染色法のいずれかの後に行ったゲル走査デンシト
メトリー分析によると生成物は少なくとも９８％純粋で
あることが判る。本発明生成物は６成分の相対染色強度
によって終始良好に同定できる。Ｓ蛋白質の相対染色強
度は約７０％〜９０％、プレー８２蛋白質は約５％〜２
０％、プレー８１は約２％〜１０％である。銀染色後の
プレー８２およびプレ−８１成分の相対染色強度は化学
量論上予想されるパーセンテージより高い。

プレー８２に関して報告された数値は約８％、染色強度
は約５％〜２０％である。プレー８１に関して報告され
た数値は約１％、染色強度は約２％〜１０％である。本
発明の範囲を限定することなく、この矛盾は、多分、精
製中のプレーＳ成分の選択濃度によるものと説明できる
が、本発明に従って用いられる銀染色法においてはグリ
コジル化プレーＳ成分の方がＳ成分より強く選択的に染
色されるものと思われる。

最終ＨＢｓＡｇ生成物をＰＢＳ　（ｐＨ７，４）中で４
℃で貯蔵すると、プレーＳ成分は急激に分解するがＳ遺
伝子生成物はそのまま変化しないこ＝　４０ とが判る。僅かにアルカリ性（ｐＨ８，５，５０１トリ
ス塩酸緩衝液）または酸性（ｐＨ５，０、ＰＢＳ）条件
下では、更に急激なプレーＳ成分の分解が観察される。

本発明者等は、最良のプレー成分保存法は生成物を凍結
乾燥し、４℃で貯蔵することであることを見出した。−
年後でさえ、プレーＳ生成物の安定性に大きな減少は見
られない。

ＤＮＡが存在するとしても、その量は例２に記載の５Ｌ
法によって生産される異種の、プレーＳ富化ＨＢｓＡｇ
ｌミリグラム当り６ピコグラムより少ない。この値は、
ドツト・プロット・ノ＼イブリダイゼーション法により
最終生成物中のＤＮＡを直接測定する検出の限界である
。

精製異種ＨＢｓＡｇをワクチンにするには、生成物を先
ず、たとえばプリンスの米国特許明細書箱４，６３９，
３７１号による２段階熱失活および強化法に付せばよい
。第１段階は、最終生成物液を圧力下１０２℃で２分４
０秒間加熱することよりなる。このフラッシュ加熱段階
はＨＢｓＡｇ＝４２ 免疫強化およびウィルス失活のために行うものである。

フラッシュ加熱した試料は更に６５℃で１０時間加熱す
る。最後に、加熱処理したＨＢｓＡｇを燐酸アルミニウ
ム等のアジュバントと混合してゲル状にする。これらの
処理の結果、極めて有効なワクチンができる。各投与量
のアジュバントワクチンはＨＢｓＡｇ３ミクロダラムお
よびチメロサール０．０１％（ｗ／ｖ）を含有する。

哺乳動物細胞培養用発現ベクター 本発明によれば、ＨＢｓＡｇ遺伝子を活発に且つ安定し
て発現させ、異種の、プレーＳ富化ＨＢＳＡｇ粒子を生
産することができる。プロモーター強度および遺伝子の
コピー数の他に、発現はエンハンサ−の有無、５′非翻
訳領域の大きさおよび３′非翻訳領域の大きさにもよっ
ている。

本発明によると、発現システムにおける不要の情報を最
小限にし、またＤＮＡを操作し易くするため、発現レベ
ルを犠牲にすることなくできる限り少量のＤＮＡを発現
ベクターに挿入する。

本発明によれば、哺乳動物の細胞培養物、たとえばマウ
スＣ１２７細胞、をトランスフェクションまたは形質転
換するために異なる構成を作製し、使用することができ
る。安定な形質転換体をクロン化することができ、各ク
ローンからの表面抗原の生産をラジオイムノアッセイ（
ＲＩ　Ａ）および酵素結合イノムサンドイツチアッセイ
（ＥＬＩＳＡ）の双方によって分析することができる。

本発明による好ましい構成はｐＨＰｓｌであり、関連構
成ｐＨＰＳ３、ｐＨＰＳ５、ｐＨＰＳ？およびｐＨＰｓ
ｌｌを第１５〜１９図に示す。これらのプラスミドは公
知の方法で得られる。

要するに、ｐＨＰｓｌは標準長さの（ｆｕｌｌ　Ｉｅ−
ｎｇｔｈ）　Ｂ　Ｐ　Ｖゲノム、完全な、しかし中断さ
れたマウスメタロチオネイン（ｍ　Ｍ　Ｔ　）遺伝子お
よびＨＢ　Ｖ　Ｄ　Ｎ　Ａ　８６　％を有しティる。Ｈ
ＢｓＡｇ部位のポリアデニル化は、ＨＢＶゲノムによっ
て規定される。第１５図。この構成中にはプロモーター
を含有しない完全マウスメタロチオネイン遺伝子も存在
する。

ｐＨＰＳ３はｐ）ＩＰＳＩの誘導体であり、３′非翻訳
領域、ＨＢＶＤＮＡのポリアデニル化部位および余分の
ｍ　Ｍ　Ｔ　Ｄ　Ｎ　Ａの大半が除去されたものである
。第１６図。

ｐＨＰＳ５は更に短いｐＨＰＳ３の変形であり、ＢＰＶ
ＤＮＡは６９％に過ぎない。第１７図。

ｐＨＰＳ７においては、５′非翻訳領域が除去されてお
り、従って、プレーＳコード化領域の始点の直前で転写
が開始する。第１８図。

ｐＨＰｓｌｌはｐＨＰＳ５と同一であるが、ｐＨＰｓｌ
ｌにおいては５Ｖ４０ＤＮＡからのポリアデニル化信号
は表面抗原コード化領域の直後にある。第１９図。

ｐＨＰＳ７を除くすべての上記構成において、転写はか
なり遠くから（表面抗原のコード化領域の始点から４５
０塩基）開始する。

本発明のベクターは細菌の培養において選択、複製でき
るので、哺乳動物の細胞培養物をトランスフェクション
するために相当量のベクターが得られ、使用される。

本発明によれば、ＨＢＶＳ遺伝子を発現できるベクター
が哺乳動物の細胞培養物をトランスフェクションするた
めに使用され、該細胞は、プレー８１、プレー８２およ
びＳ遺伝子生成物を転写、翻訳し、グリコジル化のよう
な翻訳後改変を行い、ポリペプチドを集合させて粒子と
し、プレーＳ富化、異ｉＴｉＨＢｓＡｇ粒子を分泌させ
るよう誘導されるのである。該細胞は、また本発明の異
種ＨＢｓＡｇ粒子が生産される限り、プレーＳ領域を含
むＳ遺伝子の未集合ポリペプチド遺伝子生成物を生産し
、分泌することもある。

本発明に従って哺乳動物の細胞培養物をトランスフェク
ションする重要な効果は、プレーＳ富化、異種ＨＢ　ｓ
　Ａ　ｇ粒子を分泌し得る細胞培養物を作製することで
ある。細胞は形質転換遺伝子で形質転換してもよく、そ
れによってＨＢｓＡｇ粒子が高率で生産でき、高い細胞
密度が得られるが、本発明によれば、細胞が異種のプレ
ーＳ富化ＨＢｓＡｇ粒子を分泌できるようになる限り、
如何なる哺乳動物の細胞培養物も宿主として使用でき、
如何なるベクターもトランスフェション化剤として使用
できるのである。

ｐＨＰｓｌ、ｐＨＰＳ３、ｐＨＰＳ５、ｐＨＰＳ７およ
びｐＨＰＳｌｌの詳細は下記例１〜６に提示する。哺乳
動物の細胞培養細胞をトランスフェクションする方法は
実施例７に示す。本発明生成物の精製法は下記例８に記
載する。

本発明は以下の諸例に示される通りであるが、これらは
発明の範囲を限定するものではない。

例１ ｐＴＨＢｌの構築（第１図および第３図を参照されたい
） Ｂ型肝炎つィルスＤａｎｅ粒子をａｄｒ−サブタイプＨ
ＢＶキャリアの血清から得て、完全な二本鎖ＤＮＡ配列
物を得るためにポリメラーゼとインキュベートした。Ｄ
ＮＡを単離して、ＢａｍＨｌで消化して、ｐＢＲ３２２
プラスミドのＢａｍＨ１制限部位にクローニングして、
プラスミドｐＨ８１を得た。第３図。

第４図に示すように、２０マイクログラムのｐＢＢｌを
ＢａｍＨｌで消化して、３゜２ｋｂのＨＢＶ特異性ＤＮ
Ａフラグメントをアガロースゲル上で精製して、プラス
ミドｐＴＨＢ１を構築した。ＨＢＶＤＮＡをＴ４リガー
ゼを用いて環状にして、次いで、ＢｇｌｌＴで消化して
、２．８ｋｂのフラグメントおよび小さい方のフラグメ
ントを得た。大きい方の２．８ｋｂＢ　ｇ　Ｉ　ＩＩフ
ラグメントをｓｅａ　ｐｌａｑｕｅアガロースゲルで精
製した。次いで、このフラグメントをＴ４リガーゼを用
いてプラスミドｐｃｓ１ベクターＤＮＡのＢｇｌＩＩ部
位に挿入した。

プラスミドｐｃｓ１は、ｐＢＲ３２２に由来するｐＭＬ
ベクター中のＳＶ４０およびマウスメタロチオネイン遺
伝子（ｍＭＴ）を含むものである（第１０図）。ｐｃｓ
ｌのＢｇｌＩＩ部位は、マウスメタロチオネイン（ｍ　
Ｍ　Ｔ　）プロモーターの下流、ＭＴ遺伝子のＡＵＧ開
始コードンの上流に位置している。したがって、ＨＢｖ
フラグメントの発現は、メタロチオネイン遺伝子の一節
下になった。

連結の後に、反応産物をエタノール沈殿させて、ＤＮＡ
をＴＥ倍地（１０ＩＩＩＭトリス、ｐＨ８，ｏ；１ｍＭ
ＥＤＴＡ）に移した。

次いで、ｐＴＨＢＩＤＮＡで、コンピテントにしたＨＢ
ＩＯＩ細菌細胞を形質転換させて、得られた形質転換体
をアンピシリンプレートで選択した。個々のコロニーを
とり上げて、−晩増殖させた。各コロニーについてミニ
プラスミド調製を行って、挿入物のサイズおよび位置方
向を調べるためにＤＮＡを種々の酵素で消化した。正し
い位置方向を有する一つのコロニーをとり上げ、このク
ローンをｐＴＨＢｌと称した。ｐＴＨＢｌの構造を第１
４図に示す。

クローンｐＴＨＢ１を増殖させて、塩化セシウム勾配に
てプラスミドＤＮＡを精製して、これをＣＶ−１細胞株
の形質転換に用いた。形質転換２日後に、上清液を、Ｅ
ＬＩ　ＳＡによって、細胞によって培地に分泌されたＨ
ＢｓＡｇについてアッセイした。低レベルの表面抗原の
存在が認められた。

例２ ｐＨＰｓｌの構築（第５図および第１５図を参照された
い） ｐＴＨＢｌを二つの制限酵素、ＥｃｏＲ５および５ａｌ
Ｉ、にて消化し、細菌アルカリホスファターゼとインキ
ュベートして脱燐酸して、得られた８、９ｋｂフラグメ
ントをＳｅａ　ｐ１ａｑｕｅアガロースで精製した。こ
のフラグメントを、ｐＣ８２をＥｃｏＲＶおよび５ａｌ
ｌで消化して得られた１０．２５ｋｂフラグメントと連
結させた。ｐＣＢ２は、第１１図に示された通りである
。ＨＢｌｏｌを形質転換させた後、ミニプラスミド調製
を行って、得られたプラスミドを種々の酵素で消化して
分析した。

例３ ｐＨＰＳ３の構築（第６図および第１６図を参照された
い） ｐＴＨＢｌをＢａｍＨｌおよび細菌アルカリホスファタ
ーゼ（ＢＡＰ）で消化した。フェノール抽出およびエタ
ノール沈殿の後、ＤＮＡをＳａｌ■およびＥｃｏＲ５で
さらに消化して、６．４ｋｂのＳａ　Ｉ　Ｉ／ＢａｍＨ
Ｉフラグメントをｓｅａ　ｐｌａ−ｑｕｅアガロースで
精製した。プラスミドｐＣ８２（第１１図）もまたＢａ
ｍＨｌで消化して、次いでアガロースゲルにかけて、２
．Ｏｋｂのヒトめた（ＨｕＭＴ）遺伝子および１４．５
ｋｂフラグメントを精製した。後者をＢＡＰで消化して
、フェノール抽出して、エタノール沈殿した後、５ａＩ
ＩおよびＸｈｏｌで消化した。得られた７、９ｋｂＳａ
ｌＩ／ＢａｍＨ１フラグメントを精製して、２、Ｏｋｂ
ＨｕＭＴフラグメントおよびｐＴＨＢｌからの６．４ｋ
ｂフラグメントと混合した。これらフラグメントは連結
されて、プラスミドをＨＢ１０１細胞の形質転換に用い
た。

ミニプラスミド調製を行って、制限酵素を用いてプラス
ミド中における種々のフラグメントの位置方向およびコ
ピー数を調べた。正しい位置方向およびコピー数を有す
るものから一つをとり上げて、ｐＨＰＳ３と称した。こ
の方法では、フラグメントの片方のみでいくらかの脱燐
酸が起きて、正しい位置方向での連結およびマルチマー
の形成のチャンスを増やした。

例４ ｐＨＰＳ５の構築（第７図および第１７図を参照された
い） ｐＴＩ（ＢｌおよびｐＣ５３（第１２図）を各々に、Ｂ
ａｍＨｌ、ＢＡＰ、次いで５ａｃＩで消化した。ｐＣ５
３の９．８ｋｂＳａｃ　Ｉ／ＢａｍＨＩフラグメントお
よびｐＴＨＢｌの２．４ｋｂのＢａｍＨＩ／５ａｃＩフ
ラグメントをアガロースゲルで精製した。２ｋｂＨｕＭ
Ｔフラグメントもまた例３に記載のようにして精製した
。これら三つのフラグメントを全部混合して、例３のよ
うに連結させる。フラグメントの正しい位置方向および
コピー数を有するプラスミドを選択してこれをｐＨＰＳ
５と称した。

例５ ｐＨＰＳ７の構築（第８図および第１８図を参照された
い） ｐＨＢ１をＢｇｌｌおよびＨｈａｌで消化して、アガロ
ースゲルにかけて、大きい方のバンド、１．３５ｋｂ、
を精製した。ｐｃｓ２　（第１１図）もまたＸｈｏＩ部
位で消化して、脱燐酸処理した。

等モル量のＸｈａＩフラグメントおよびＸｈｏＩ消化ｐ
Ｃ３２を混合して、全四種のデオキシリボヌクレオチド
の存在下でＴ４ポリメラーゼとともに３７℃で３０分間
インキュベートした。

Ｈｈａｌは３′突出を、ＸｈｏＩは５′突出を、それぞ
れ生じさせるが、Ｔ４ポリメラーゼとのインキュベーシ
ョンによって両種の末端を平滑にした。次いで、試料を
６５℃で１０分間加熱して、フェノールで抽出して、エ
タノールでエタノール沈殿を行って、ライゲーション緩
衝液に移して、−晩ライゲーションさせた。

当業者に公知の方法を用いて、リゲーション混合物でＨ
ＢＩＯＩを形質転換させた。個々のコロニーをとり上げ
て、ミニプラスミド調製を行って、制限酵素を用いて、
正しい位置方向に単一の挿入物を有するプラスミドを同
定した。このようにしてプラスミドを選択し、これをｐ
ＨＰｓ７と称した。

例６ ｐＨＰｓｌｌの構築（第９図および第１９図を参照され
たい） ｐＴＨＢｌをＢａｍＨｌおよびＰｓｔｌで消化して、６
１７ｂｐＤＮＡを精製した。このフラグメントをＳ　ａ
　ｕ　３Ａで消化して、２３７ｂｐの５ａｕ３Ａ／Ｂａ
ｍＨＩ　　ＳＶ４０　　ＤＮＡフラグメントを得た。ｐ
ＨＰｓ５のＢａｍＨ１／ＢａｍＨ１フラグメント（１２
，２ｋｂ）を調製して、２３７ｂｐフラグメントと連結
する。正しい位置方向で得られたプラスミドを単離して
、これをｐＨＰｓ９と称した。ＢａｍＨ１末端および５
ａｕ３Ａ末端は、互いに連結された。これは、これらは
相補的な突出末端を有するが、両部位を連結部で消失し
ているからである。しかしながら、他の連結部（Ｂａｍ
Ｈ１／ＢａｍＨ１末端）は、ＢａｍＨＩで消化できるよ
うに残っている。この部位を再びＢａｍＨｌで開裂して
、ｐＣ９２（第１１図、例３）からの２ｋｂＢａｍＨ１
／ＢａｍＨＩＨｕＭＴフラグメントをここに挿入させた
。最終プラスミドをｐＨｐｓ　１１と称する。

例７ ｐＨＰｓｌ、ｐＨＰｓｌ、ｐＨＰＳ３、ｐＨＰＳ７およ
びｐＨＰｓｌｌの構築物をマウスの単層Ｃ１２７繊維芽
細胞のトランスフェクションに用いて、２０ｍｉｃｒｏ
ｍｏｌａｒのカドミウムイオン）Ｃｄ　　、のチャレン
ジ処理を行った。細胞が過剰のメタロチオネインを産生
ずることができなければ、通常、Ｃｄ　　はチャレンジ
された細胞に対して毒性である。なぜならば、メタクロ
チオネインを産生ずることができる構築物によってトラ
ンスフェクトされているからである。メタロチオネイン
がＣｄ　　と結合することから、トランスフェクション
された細胞はＣｄ　　の存在下で選択的優位性を有する
。したがって、ＭＴ遺伝子を服務ベクター構築物をとり
込んでいる細胞のみが生存できることになる。また、Ｃ
ｄ　　の存在は、この構築ではメタロチオネインプロモ
ーターの調節下にあるＨＢＶ表面抗原遺伝子を誘導する
。

マウスＣ１２７細胞を、１０％ウシ胎児血清を加えたＤ
ｕ　Ｉ　ｂｅｃｃｏ　ミニマルエッセンシャル培地（Ｇ
ＩＢＣＯからＤＭＥＭとして市販されている）中で、径
１０ｃｍのプレートで単層に増殖させた。

ＣｓＣ１勾配法で２回精製したプラスミドＤＮＡを１プ
レート当り３０ｇｇ用いた。燐酸カルシウム法を用いて
細胞のトランスフェクションを行った。トランスフェク
ションの４時間後に、培地を新鮮培地に交換した。

次の日に、細胞をに３の割合で二つに分けた。

プレートに付着した後、１０ｇＭのＣｄＣｌ２を加えた
新鮮培地に培地を交換した。次の３〜４日の間に、多く
の細胞が死滅した。３〜４日毎に増殖培地を交換して、
細胞をカドミウムのチャレンジ条件下においた。そのよ
うなチャレンジを２〜３回繰り返した後に、カドミウム
濃度を２０１１１ｉｃ−ｒｏｎ＋ｏｌａｒに上げた。２
〜３週間の後、２０　ｉｊｃｒｏ−ｍｏｌａｒのＣｄ　
　に耐性の目で見えるコロニーが形成された。

これらを各々にクローニングして、小ベトリ皿に別々に
増殖させた。各クローンからの培地をＲＩＡキット（Ａ
ｂｂｏｔｔ）を用いてＨＢｓＡｇについてアッセイした
。各構築物から４個から５個のクローンを選択して、各
クローンについて、２４時間で１０６個の細胞が放出す
るＨＢｓＡｇの量を決定した。その結果は表１に示され
る通りである。

表１から、プラスミドＨＰＳＩがＨＢｓＡｇを最もよく
産生じたことがわかる。プラスミドｐＨＰｓ１１もまた
よく産生じたが、プラスミドｐＨＰＳ３、ｐＨＰＳ５お
よびｐＨＰＳ７は微量しか産生じなかった。

例８ ｐｒｅ−５に富んだ異成分混交性のＨＢｓＡｇの精製 本例は、ｐｒｅ−８１，：富んだ異成分混交性のＨＢｓ
Ａｇを第１図に示した方法によって細胞培養培地から精
製する方法を説明するものである。

培養培地は１０％ウシ胎児血清を含み、ローラーボトル
での例７のマウス上皮細胞の細胞培養物から得た。発現
ベクターはｐＨＰｓｌであった。

例２および７と同様に５リツトルの培養培地を１０．０
ＯＯＧで３０分間遠心分離して、細胞および細胞破壊片
を除去した。次に、清澄化した培養培地を、透過限界分
子量値が３００．０００ダルトンである、Ａｍ１ｅｏｎ
膜フイルターを備えたＭｅｇ−ａｆｌｏｗ濾過システム
（Ｎｅｖ　Ｂｒｕｎｓｖｌｃｋ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ
）によって、４℃で１０倍に濃縮した。容量を３００〜
４００ｍ１に濃縮した後に、システムを１００〜２００
ｍ１の蒸留水で１回洗浄して、ＨＢｓＡｇを効率よく回
収した。

濃縮した培養培地を、１０％の分子量６０００〜９００
０のポリエチレングリコール（ＰＥＧ６０００〜９００
０）による−工程分別沈殿処理に供した。沈殿処理は、
最初は室温で行い、１０倍濃縮の培養培地の５００ｇに
５０ｇの粉末ＰＥＧを徐々に加えて、次いで４℃にして
一晩行った。次に、形成された沈殿を１０，０ＯＯＧで
３０分間遠心分離して、ペレットを約２５ｍ１のＰＢＳ
に溶解した。不溶性の物質を除去するための２０．０Ｏ
ＯＧで１０分間の簡単な清澄化遠心分離の後、粗試料溶
液を予めＰＢＳにて平衡にしておいた旧ｔｒｏｇｅｌ　
ＡｃＡ２２カラム（直径５ｃｍ、高さ５０印）１こ供し
た。

試料を載せた後、カラムを３〜４ｃｍ／時１８１の流速
で室温で流した。典型的な溶出プロフィールでは、ＨＢ
ｓＡｇは広いピークの先頭に部分的に変形した（　ｒｅ
ｓｏｌｖｅｄ）最初のピークとして溶出されることが示
された。ＨＢｓＡｇを含むピークは部分的に重複してい
ることから、最初のピークの後縁および二番目のピーク
の前縁の両分を（たとえＨＥｓＡｇ分子を含んでいても
）集めないように留意した。

ゲル濾過カラムクロマトグラフィーからの１（ＢｓＡｇ
画分を集めて、ＫＢｒ等密度超遠心分離による次の工程
処理をした。５リツトルの細胞培養培地を処理した結果
、集まった両分は１５０〜２００ｍ１であった。次いで
、固体のＫＢｒをＨＢｓＡｇを含む集めた画分に加えて
、ＫＢｒの最終濃度を２４〜２６％（ν／ｖ）にした。

試料溶液を二つのクイックシール管（Ｑｕｉｃｋ−８ｅ
ａｌ　ｔｕｂｅ　）（Ｂｅｃｋｍａｎｓ各１００ｍ１容
量）に分注して、Ｂｅｃｋｍ−ａｎｏ−夕−のＴｉ４５
を用いて４５．ＯＯＯｒｐｍで２０〜２４時間で１５°
σで遠心分離した。

超遠心分離の結果形成されたＫＢｒの直線勾配を、勾配
分画システム（Ｉｓｃｏ）およびＵＶモニターを用いて
分画した。２８０膜ｍでモニターした勾配分画プロフィ
ールによって、それぞれよく分離した三つのピークが示
された。屈折率測定および５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析によっ
て、まん中の広いピークは、はぼ純粋なＨＢｓＡｇ粒子
を含んでおり、これはＫＢｒ超遠心分離によって１．２
ｇ／ｍ１付近のバンドに位置していた。まん中のピーク
の両分を集めた試料の粒子の純度をＳＤＳ　−ＰＡＧＥ
によって非還元条件下で測定して得たところ９５％以上
に達した。しかし、ゲル走査やイムノブロッティング染
色などの最近の技術を用いた測定に゛よるとタンパク質
の純度は８５〜９０％であるようである。

ショ糖ステップ勾配超遠心分離を行うために、集めたＨ
ＢｓＡｇ画分の約５０ｍ１を、２０ｐｓ＋の圧力下で、
ＸＭ−３００膜を用いる攪はんセル（Ａｍｉｃｏｎンを
備えた濃縮透析に供した。最初の濃縮の後で、ＰＢＳを
３〜５回加え、続いて濃縮して、ＨＢｓＡｇに含まれて
いるＫＢｒを各回効果的に除去した。この加圧透析操作
の結果、約１０ｍ１の濃縮ＨＢｓＡｇ溶液が得られた。

次いで、濃縮したＨＢｓＡｇ分画を、２０％、３０％お
よび４０％（ＷＯＷ）からなるショ糖ステップ勾配に載
せた。上記のショ糖ステップの各１０ｍ１を３５ｍ１容
量の遠沈管（９ｅｃｋｍａｎ）中に重層して、試料溶液
の５ｍｌを勾配の最上部に載せた。超遠心分離をＢｅｃ
ｌｖａｎローター５Ｗ−２８を用いて２５００Ｏｒｐｍ
で１６時間で４℃で行った。ショ糖ステップ勾配超遠心
分離の後で２８０　ｎｍでモニターして得た勾配分画プ
ロフィールは、主たる単一ピークとそれに続く分離性の
よい小さいピークの存在を示した。この小さいピークに
は６６．０００ダルトンを越える高分子量の夾雑物が含
まれることが、５ＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色によって
示６〇　− された。

ショ糖ステップ勾配遠心分離からの最終生産物を、ＸＭ
−３００膜を備えたＡｎ＋１ｃｏｎ攪はんセルを用いる
透析および／または濃縮に供した。顕微鏡観察によって
、はぼ球形の直径が２２ｎ１の粒子の存在が認められた
。濃縮された溶液を２２ミクロンフィルターを通して濾
過し、凍結乾燥して、使用時まで４℃で保存した。

５リツトルの処理による収率および収量は表２に示す通
りである。精製されたＨＢｓＡｇ生産物の純度は９８％
以上である。

餞−旦 ヒト血漿からＨＢｓＡｇを精製するために、二工程処理
を用いた。すなわち、フイブリノゲンを含むある量のタ
ンパク質を最初の沈殿工程で除去して、次いで最大量の
ＨＢｓＡｇを第二工程で回収した。このような連続的沈
殿は、細胞培養培地からのＨＢｓＡｇの精製では必要で
ない。これは、培養培地とヒト血漿との間の組成の違い
による。

二工程処理（３％ＰＥＧとそれに続＜１２９６ＰＥＧ沈
殿）または−工程処理（１０％ＰＥＧ沈殿）によって得
られたタンパク質沈殿物を、本発明の方法によるゲル濾
過カラムクロマトグラフィーに供した。ＨＢｓＡｇを含
む両分を、夾雑物の量ならびに組成およびＨＢｓＡｇの
収率について比較した。これら二つの調製物の間には実
質的には相違は認められなかった。したがって、より簡
単な一工程沈殿処理が好ましい。

例１０ 精製ＨＢｓＡｇ生産物を例７のようにして調製した。次
いで、ＨＢｓＡｇの各構成分の量を決定した。ＨＢｓＡ
ｇの試料をＳＤＳポリアクリスアミドゲル電気泳動によ
って分離した。次いで、ゲルをＭｃｒｒｉｌの銀染色法
にて処理した。染色ゲルの一つをデンシトメトリー解析
に供した。デンシトメーターは、ゲルのバンド中の光の
伝達を測定して、染色の強度を示す。その結果は、表３
午示される通りである。

本例のｐｒｅ−５２構成分は、二つの別々のピークには
分かれずに、肩部を有する一つのピークとなって表れた
。５Ｓｐｒｅ−８ｌおよびｐｒｅＳ２構成物の各々の染
色強度の総和は、試料毎に異なる。さらに、銀染色の染
色強度は、クマシーブルーによる染色の強度とは比例し
ないことが観察された。このことは、表２に示された数
量が化学量論的ではないことを示唆している。むしろ、
銀染色の強度は、おそらく、グリコシレージョンの程度
を含む、タンパク質の組成に左右される。

しかしながら、比較的な染色強度は、任意のタンパク質
混合物では再現性があることから、本発明の異成分混交
性ＨＢｓＡｇのようなタンパク質混合物の構成分の量的
な分析には有用である。

ｐ）ＩＰＳＩ ＨＰＳ３ ＨＰＳ５ ＨＰＳ７ ＨＰＳ１１ １０倍濃縮物 ＰＥＧ沈殿 ＡｃＡ２２カラムクロ マトグラフィー ｕｇ／ｍ１ ５５．４５ ９１ｇ、７５ ６６．７ ｇ ２３．９ ２０．３ ノ１：、マゴシ）離 ショ糖密度超遠心　　１９ 分離 ４８９．５ ９．３

【図面の簡単な説明】 第１図は、組換え細胞培養からのＨＢｓＡｇの精製工程
のフローチャートを示す。 第２図は、精製されたＨＢｓの、銀染色されたドデシル
硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動パタ
ーンを示す。 第３図は、ＨＢＶゲノムをｐ　Ｂ　Ｒ３２２１；１ｍク
ロロ５ ニングしてｐＨＢ１を作成するためのフローチャートを
示す。 第４図は、ＨＢＶのＳ−遺伝子を発現ベクターｐｃｓ１
にクローニングしてｐＴＨＢｌを作成するためのフロー
チャートを示す。 第５図は、発現クローンｐＨ５１の構築のためのフロー
チャートを示す。 第６図は、ｐＨＰＳ３の構築のためのフローチャートを
示す。 第７図は、ｐＨＰＳ５の構築のためのフローチャートを
示す。 第８図は、ｐＨＰＳ７の構築のためのフローチャートを
示す。 第９図は、ｐＨＰｓｌｌの構築のためのフローチャート
を示す。 第１０図は、ベクターｐｃｓ１の詳細を示す。 第１１図は、ベクターｐＣ８２の詳細を示す。 第１２図は、ベクターｐＣ８３の詳細を示す。 第１３図は、ベクターｐＨ８１の詳細を示す。 第１４図は、ベクターｐＴＨＢ１の詳細を示す。 第１５図は、 第１６図は、 第１７図は、 第１８図は、 第１９図は、 す。 ベクターｐＨＰｓ１の詳細を示す。 ベクターｐＨＰＳ３の詳細を示す。 ベクターｐＨＰＳ５の詳細を示す。 ベクターｐＨＰＳ７の詳細を示す。 ベクターｐＨＰｓ１１の詳細を示

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、哺乳動物細胞培養培地（ｃｕｌｔｕｒｅ　ｍｅｄｉ
   ｕｍ）から異成分混交性ＨＢｓＡｇ粒子の粗調製物を分
   離して、ゲル電気泳動にて決定される実質的な量のＳ、
   ｐｒｅ−Ｓ１およびｐｒｅ−Ｓ２構成分からなるｐｒｅ
   −Ｓに富んだ異成分混交性ＨＢｓＡｇを精製する、こと
   からなり、精製工程は電荷または化学的親和性（ａｆｆ
   ｉｎｉｔｙ）に基づくＨＢｓＡｇ粒子の分離作用による
   ものではなく、粒子をサイズ分離または密度分離に基づ
   いた方法を用いる、異成分混交性肝炎表面抗原の精製法
   。 ２、請求項１に記載の精製法であって、分離工程が以下
   のようになり、 （ａ）異成分混交性ＨＢｓＡｇ粒子を含む、哺乳動物細
   胞培養培地を得て、次いで、 （ｂ）該培地から異成分混交性ＨＢｓＡｇ粒子を分別沈
   殿する。 精製工程は次のようになる。 （ｃ）ゲル濾過クロマトグラフィーによって異成分混交
   性ＨＢｓＡｇ粒子の画分を分離し、次いで、 （ｄ）超遠心分離によって異成分混交性ＨＢｓＡｇ粒子
   を分離する。 ３、工程（ｂ）が等密度バンディング（ｉｓｏｐｙ−ｃ
   ｎｉｃ　ｂａｎｄｉｎｇ）超遠心分離およびショ糖ステ
   ップ勾配超遠心分離からなることを特徴とする、請求項
   ２に記載の精製法。 ４、工程（ａ）がさらに細胞培養培地を清澄化すること
   および約１０〜５０倍に濃縮することからなることを特
   徴とする、請求項２に記載の精製法。 ５、清澄化を遠心分離によって行い、かつ濃縮を限外濾
   過によって行うことを特徴とする、請求項４に記載の精
   製法。 ６、限外濾過において約３００，０００ダルトン以下の
   公称分子量通過限界（ｃｕｔ−ｏｆｆ）を有するフィル
   ターを用いることを特徴とする、請求項５に記載の精製
   法。 ７、細胞培養培地が２５％の血清を含むことを特徴とす
   る、請求項２に記載の精製法。 ８、工程（ｂ）における分別沈殿が約９〜１２％ポリエ
   チレングリコール６０００〜９０００を用いる一工程処
   理であることを特徴とする、請求項２に記載の精製法。 ９、ゲル濾過カラムクロマトグラフィーがより多いおよ
   びより少ない分子量の成分からのＨＢｓＡｇ粒子の分離
   を可能にする分子ふるい的（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｓｉ
   ｅｖｉｎｇ）媒質を用いることを特徴とする、請求項２
   に記載の精製法。 １０、等密度バンディング超遠心分離において密度勾配
   を形成することＫＢｒ濃度が約２４％〜２６％（ｗ／ｗ
   ）であることを特徴とする、請求項３に記載の精製法。 １１、ショ糖ステップ勾配が約２０％、３０％および４
   ０％（ｗ／ｗ）のショ糖を含むステップを含むことを特
   徴とする、請求項３に記載の精製法。 １２、精製したＨＢｓＡｇ生産物を凍結乾燥する工程を
   さらに加えてなる、請求項２に記載の精製法。 １３、精製したＨＢｓＡｇ生産物を加熱不活化し、賦活
   化する工程をさらに加えてなる、請求項２に記載の精製
   法。 １４、ＨＢｓＡｇ生産物をアジュバントと混合してワク
   チンを生産する工程をさらに加えてなる、請求項２に記
   載の精製法。 １５、ＨＢＶからのプレーＳ１、プレーＳ２およびＳ領
   域ＤＮＡからなるＨＢｓＡｇを決定する遺伝子、インデ
   ューサーによって誘導することができる誘導可能制御領
   域、細菌性宿主に抗生物質耐性を与える遺伝子、および
   選択剤存在下にトランスフェクションされた細胞に非形
   質転換細胞に対する選択的優位性を与える遺伝子を含ん
   でなる組換えＤＮＡ発現ベクターであって、該ＨＢｓＡ
   ｇ遺伝子は該制御領域に関して、次のように、すなわち
   該制御領域の制御に服するように、位置しており、それ
   によって、このベクターを細菌性宿主に導入したときに
   抗生物質による選択によってクローニングすることがで
   き、またこのベクターを哺乳動物細胞株宿主に導入した
   ときに該選択剤の存在下にトランスフェクションされた
   細胞を選択することができかつ該制御領域はプレーＳに
   富むＨＢｓＡｇの産生がインデューサーの存在に応答し
   て進行するようにすることができるものであり、該哺乳
   動物細胞系宿主は異成分混交性のプレーＳに富むＨＢｓ
   Ａｇ粒子を分泌させることができるものである、ことを
   特徴とする、組換えＤＮＡ発現ベクター。 １６、プラスミドｐＨＰＳ１。 １７、哺乳動物細胞系を形質転換させることができるト
   ランスフォーマー遺伝子をさらに含んでなる、請求項１
   ５に記載のベクター。 １８、制御領域がカドミウムまたは亜鉛で誘導すること
   ができるマウス・メタロチオネイン遺伝子ＤＮＡ配列で
   あり、抗生物質耐性を与える遺伝子がアンピシリン耐性
   を与えるものであり、選択的優位性を与える遺伝子がメ
   タロチオネイン遺伝子であり、トランスフォーマー遺伝
   子がウシパピローマウイルスである、請求項１７に記載
   のベクター。 １９、請求項１５に記載のベクターでトランスフェクシ
   ョンした哺乳動物細胞系。 ２０、請求項１８に記載のベクターでトランスフェクシ
   ョンしかつ形質転換されたマウス繊維芽細胞株。 ２１、下記の工程からなる、プレーＳに富む、異成分混
   交性のＨＢｓＡｇ粒子の製造法。（ａ）請求項１５に記
   載のベクターで哺乳動物細胞系細胞をトランスフェクシ
   ョンすること。 （ｂ）トランスフェクションされた細胞を、選択剤で選
   択すること。 （ｃ）インデューサーでＨＢｓＡｇの発現を誘導して、
   該細胞系に異成分混交性のプレーＳに富むＨＢｓＡｇ粒
   子を分泌させること。