JPH02171193A - Ｄ‐アラニンの製造方法 - Google Patents
Ｄ‐アラニンの製造方法Info
- Publication number
- JPH02171193A JPH02171193A JP32366588A JP32366588A JPH02171193A JP H02171193 A JPH02171193 A JP H02171193A JP 32366588 A JP32366588 A JP 32366588A JP 32366588 A JP32366588 A JP 32366588A JP H02171193 A JPH02171193 A JP H02171193A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- acid
- alanine
- reaction
- oxaloacetate
- transaminase
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
［産業上の利用分野］
本発明は、ペプチド性人工甘味料の中間体などとして産
業上有用なり一アラニンの製造方法に関する。
業上有用なり一アラニンの製造方法に関する。
［従来技術］
通常の化学合成法によって、Ｄ−アラニンを高い光学純
度で収率よ（工業的に製造することは困難である。
度で収率よ（工業的に製造することは困難である。
従来、Ｄ−アラニン製造方法としては、発酵法（特公昭
４２−２０６８３ 、特公昭５２−５５９０ 、特公昭
５１−２１０７６、特公昭５１−２２８８１等）、酵素
法（ヒダントイン法；発酵工学６１．、（３） １３９
−１５１（１９８３）など、アシラーセ法； （特公昭
６０−３１４７７ ）など、アミダーゼ法；特開昭６１
−２７４６９０ 、日本農芸化学会誌６２．、（３）
５８ｇ（１９８８）など）等が知られている。
４２−２０６８３ 、特公昭５２−５５９０ 、特公昭
５１−２１０７６、特公昭５１−２２８８１等）、酵素
法（ヒダントイン法；発酵工学６１．、（３） １３９
−１５１（１９８３）など、アシラーセ法； （特公昭
６０−３１４７７ ）など、アミダーゼ法；特開昭６１
−２７４６９０ 、日本農芸化学会誌６２．、（３）
５８ｇ（１９８８）など）等が知られている。
その他り一トランスアミナーゼを用いたＤ−アミノ酸製
造方法として、特開昭６２−２０５７９０記載の方法が
知られている。
造方法として、特開昭６２−２０５７９０記載の方法が
知られている。
また、アスパラギン酸をアミノ基供与体とするトランス
アミナーゼ反応を用いたアミノ酸製造方法において、副
生ずるオキサロ酢酸を脱炭酸して反応効率を高める方法
としては、昭和６１年度日本農芸化学会大会講演要旨集
ｐ、２２０ 、特開昭６１−２１０９１ 、特開昭６０
−９１９９３等記載の方法が知られている。
アミナーゼ反応を用いたアミノ酸製造方法において、副
生ずるオキサロ酢酸を脱炭酸して反応効率を高める方法
としては、昭和６１年度日本農芸化学会大会講演要旨集
ｐ、２２０ 、特開昭６１−２１０９１ 、特開昭６０
−９１９９３等記載の方法が知られている。
［発明が解決しようとする課題］
しかしこれらの発明のうち、発酵法においては転換効率
が低い上、生成するアラニンのラセミ化が起りやすい、
という問題点を有していた。
が低い上、生成するアラニンのラセミ化が起りやすい、
という問題点を有していた。
また酵素法のうち、ヒダントイナーゼ、Ｄ−アシラーゼ
、アミダーゼを用いる方法においては、原料が高価であ
る、基質分子の溶解度が低い、工業生産に耐え得る酵素
の入手が困難である等の問題点を有していた。
、アミダーゼを用いる方法においては、原料が高価であ
る、基質分子の溶解度が低い、工業生産に耐え得る酵素
の入手が困難である等の問題点を有していた。
一方、Ｄ−トランスアミナーゼを用いてＤ−アミノ酸を
製造する方法（前掲；特開昭６２−２０５７９０）は、
複数酵素の共役により構成される二種類の反応系が例示
されているが、そのうちアラニンラセマーゼを系内に含
む場合には、そのままの形ではＤ−アラニンの生産には
適さない、また、例示されているもう一つの系はアラニ
ンラセマーゼを含まないが、製造目的であるＤ−アミノ
酸と等しいモル数だけ対応するα−ケト酸（Ｄ−アラニ
ンの場合は、ピルビン酸）を添加する必要があり、Ｄ−
アラニン生産という観点からは、必ずしも経済的な方法
ではない。
製造する方法（前掲；特開昭６２−２０５７９０）は、
複数酵素の共役により構成される二種類の反応系が例示
されているが、そのうちアラニンラセマーゼを系内に含
む場合には、そのままの形ではＤ−アラニンの生産には
適さない、また、例示されているもう一つの系はアラニ
ンラセマーゼを含まないが、製造目的であるＤ−アミノ
酸と等しいモル数だけ対応するα−ケト酸（Ｄ−アラニ
ンの場合は、ピルビン酸）を添加する必要があり、Ｄ−
アラニン生産という観点からは、必ずしも経済的な方法
ではない。
一方、アスパラギン酸をアミノ基供与体とするトランス
アミナーゼ反応において、副生ずるオキサロ酢酸を脱炭
酸することにより反応効率を向上させる方法として従来
知られていたもの（前掲：昭和６１年度日本農芸化学会
大会講演要旨集ｐ、２２０ 、特開昭６１−２１０９１
、特開昭６０−９１９９３等）は、アラニンが製造の
対象とされていないこともあって、オキサロ酢酸を脱炭
酸することの意義は、専ら副生成物の系外への除去によ
る反応促進という点にのみ求められるものであった。し
たがって、オキサロ酢酸の脱炭酸産物であるピルビン酸
は、必ずしも有効には利用されなかった。
アミナーゼ反応において、副生ずるオキサロ酢酸を脱炭
酸することにより反応効率を向上させる方法として従来
知られていたもの（前掲：昭和６１年度日本農芸化学会
大会講演要旨集ｐ、２２０ 、特開昭６１−２１０９１
、特開昭６０−９１９９３等）は、アラニンが製造の
対象とされていないこともあって、オキサロ酢酸を脱炭
酸することの意義は、専ら副生成物の系外への除去によ
る反応促進という点にのみ求められるものであった。し
たがって、オキサロ酢酸の脱炭酸産物であるピルビン酸
は、必ずしも有効には利用されなかった。
［課題を解決するための手段］
そこで本発明者らは、Ｄ−アラニンを低コストで製造す
る方法に関し鋭意検討の結果、低廉な原料であるし一ア
スパラギン酸およびピルビン酸を原料として、アスパラ
ギン酸ラセマーゼ、Ｄ−トランスアミナーゼ、およびオ
キサロ酢酸の脱炭酸反応を組合わせて使用することによ
り、極めて効率的にＤ−アラニンのみを製造する方法を
新規に見出し、本発明を完成するに至った。
る方法に関し鋭意検討の結果、低廉な原料であるし一ア
スパラギン酸およびピルビン酸を原料として、アスパラ
ギン酸ラセマーゼ、Ｄ−トランスアミナーゼ、およびオ
キサロ酢酸の脱炭酸反応を組合わせて使用することによ
り、極めて効率的にＤ−アラニンのみを製造する方法を
新規に見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、低廉な原料であるし一アスパラギン
酸を出発基質とし、これにアスパラギン酸ラセマーゼを
作用させ、生成するＤ−アスパラギン酸をアミノ基供与
体、ピルビン酸をアミノ基受容体とするＤ−トランスア
ミナーゼ反応によってＤ−アラニンを生成せしめ、同時
に副生ずるオキサロ酢酸を脱炭酸することによって反応
系から駆追するとともに、生成したピルビン酸が原料基
質の一部として同時に供給されることによって、本来平
衡反応であるＤ−トランスアミナーゼ反応をＤ−アラニ
ン生成方向に進行させ、その結果効率よくＤ−アラニン
を蓄積させることを特徴とするＤ−アラニンの製造方法
に関するものである。
酸を出発基質とし、これにアスパラギン酸ラセマーゼを
作用させ、生成するＤ−アスパラギン酸をアミノ基供与
体、ピルビン酸をアミノ基受容体とするＤ−トランスア
ミナーゼ反応によってＤ−アラニンを生成せしめ、同時
に副生ずるオキサロ酢酸を脱炭酸することによって反応
系から駆追するとともに、生成したピルビン酸が原料基
質の一部として同時に供給されることによって、本来平
衡反応であるＤ−トランスアミナーゼ反応をＤ−アラニ
ン生成方向に進行させ、その結果効率よくＤ−アラニン
を蓄積させることを特徴とするＤ−アラニンの製造方法
に関するものである。
以下に、本発明の酵素反応系及び使用酵素について説明
するが、本発明はこれに限定されるものではない。
するが、本発明はこれに限定されるものではない。
本発明の酵素反応系は下記（１）式で表されるものであ
る。
る。
初発原料のＤ−アスパラギン酸を製造するには例えば、
Ｌ−アスパラギン酸を用いるが、Ｌ−アスパラギン酸の
かわりにラセミ体のアスパラギン酸を用いてもよい。も
しくは、さらに低廉な原料であるフマール酸を用いても
よい。
Ｌ−アスパラギン酸を用いるが、Ｌ−アスパラギン酸の
かわりにラセミ体のアスパラギン酸を用いてもよい。も
しくは、さらに低廉な原料であるフマール酸を用いても
よい。
フマール酸を用いる場合には、アスパルターゼによって
、Ｌ−アスパラギン酸を生成させることが必要であるが
、該製造方法に関しては、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、Ｂｉ
ｏｅｎｇ、、１５．６９ （１９７３）などにおいて既
に知られているものである。
、Ｌ−アスパラギン酸を生成させることが必要であるが
、該製造方法に関しては、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、Ｂｉ
ｏｅｎｇ、、１５．６９ （１９７３）などにおいて既
に知られているものである。
ＯＯＨ
嘗
ＯＯＨ
ピルビン酸
オキサル酢酸
（Ｌ）；Ｄ−トランスアミナーゼ
（Ｈ）Ｈオキサル酢酸脱炭酸酵素
（Ｉ）
Ｌ−アスパラギン酸は、アスパラギン酸ラセマーゼの作
用によりＤ−アスパラギン酸となるが、該酵素は例えば
、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２４７ 、（１６）５１
０３ （１９７２）等によって知られている。
用によりＤ−アスパラギン酸となるが、該酵素は例えば
、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２４７ 、（１６）５１
０３ （１９７２）等によって知られている。
該反応によって生成したＤ−アスパラギン酸は共存する
ピルビン酸とともにＤ−トランスアミナーゼの基質とな
り、直ちにＤ−アニランおよびオキサロ酢酸が生成する
。
ピルビン酸とともにＤ−トランスアミナーゼの基質とな
り、直ちにＤ−アニランおよびオキサロ酢酸が生成する
。
Ｄ−トランスアミナーゼは、０体特異的でありピルビン
酸とＤ−アスパラギン酸からＤ−アラニンを生成し得る
ものであればどのようなものでも使用可能であるが、そ
のような酵素としては、例えば種々のバチルス属細菌由
来のもの（Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ １７
Ａ 、ｐ１６７（７０） 、Ｊ、Ｂｉｏｌ。
酸とＤ−アスパラギン酸からＤ−アラニンを生成し得る
ものであればどのようなものでも使用可能であるが、そ
のような酵素としては、例えば種々のバチルス属細菌由
来のもの（Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ １７
Ａ 、ｐ１６７（７０） 、Ｊ、Ｂｉｏｌ。
Ｃｈｅｍ、、２５０．６９８３ （１９７５） 、特開
昭６ｌ−１８７７８７）が知られている他、土壌細菌な
どから比較的容易に入手し調製することが可能である。
昭６ｌ−１８７７８７）が知られている他、土壌細菌な
どから比較的容易に入手し調製することが可能である。
一方、Ｄ−トランスアミナーゼ反応は、本質的に可逆反
応であるため、見掛は上の反応速度を低下させることな
く効率的にＤ−アラニンな生産させるためには、反応生
成物の一部もしくは全部を該反応系外に連続的に除去す
るか、もしくは原料化合物を供給することが必要である
。
応であるため、見掛は上の反応速度を低下させることな
く効率的にＤ−アラニンな生産させるためには、反応生
成物の一部もしくは全部を該反応系外に連続的に除去す
るか、もしくは原料化合物を供給することが必要である
。
この様な条件を実現させるためには、該反応系にオキサ
ロ酢酸脱炭酸酵素を共存させることが有効である。すな
わち、該Ｄ−トランスアミナーゼ反応においては、目的
とするＤ−アラニンのほかにオキサロ酢酸が副生ずるが
、該系にオキサロ酢酸脱炭酸酵素を共存させると、オキ
サロ酢酸は直ちにピルビン酸となって、平衡反応系外に
一旦除去される。さらに、同時に生成したピルビン酸は
、そのままＤ−トランスアミナーゼ反応の一方の基質と
して連続的に供給することができるため、ピルビン酸を
特別に分離することなく、反応平衡を目的とするＤ−ア
ラニン生成方向に偏らせることができるので極めて好都
合である。このことは、同時に、原料基質であるアスパ
ラギン駿をアミノ基供与体として利用するのみならず、
その炭素骨格をも無駄な（有効にＤ−アラニンに転換で
きることを意味するため、オキサロ酢酸脱炭酸酵素を添
加することにより、Ｄ−アラニンの生産効率は相乗的に
高まる。
ロ酢酸脱炭酸酵素を共存させることが有効である。すな
わち、該Ｄ−トランスアミナーゼ反応においては、目的
とするＤ−アラニンのほかにオキサロ酢酸が副生ずるが
、該系にオキサロ酢酸脱炭酸酵素を共存させると、オキ
サロ酢酸は直ちにピルビン酸となって、平衡反応系外に
一旦除去される。さらに、同時に生成したピルビン酸は
、そのままＤ−トランスアミナーゼ反応の一方の基質と
して連続的に供給することができるため、ピルビン酸を
特別に分離することなく、反応平衡を目的とするＤ−ア
ラニン生成方向に偏らせることができるので極めて好都
合である。このことは、同時に、原料基質であるアスパ
ラギン駿をアミノ基供与体として利用するのみならず、
その炭素骨格をも無駄な（有効にＤ−アラニンに転換で
きることを意味するため、オキサロ酢酸脱炭酸酵素を添
加することにより、Ｄ−アラニンの生産効率は相乗的に
高まる。
オキサロ酢酸の脱炭酸は、必ずしも酵素的な方法でのみ
起こるものではな（、酵素のない状態においてもある程
度自然に進行する。また本反応は、マンガン、マグネシ
ウムなど種々２価金属イオンによっても触媒されること
が既に見出されている（特開昭６１−２１０９１ 、
Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ。
起こるものではな（、酵素のない状態においてもある程
度自然に進行する。また本反応は、マンガン、マグネシ
ウムなど種々２価金属イオンによっても触媒されること
が既に見出されている（特開昭６１−２１０９１ 、
Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ。
３６、、３０３−３０５ （１９４２） 、Ａｒｃｈ、
Ｂｉｏｃｈｅｍ、２６．４１８−４２１（１９５０）
）。しかし、上式（Ｉ）に示されたＤ−アラニン生産系
全体において、該脱炭酸は律速となる反応過程であり、
工業的に高い生産性を得るためには、酵素によってでき
るだけ速やかに脱炭酸反応を進行させることが望ましい
。
Ｂｉｏｃｈｅｍ、２６．４１８−４２１（１９５０）
）。しかし、上式（Ｉ）に示されたＤ−アラニン生産系
全体において、該脱炭酸は律速となる反応過程であり、
工業的に高い生産性を得るためには、酵素によってでき
るだけ速やかに脱炭酸反応を進行させることが望ましい
。
オキサロ酢酸脱炭酸酵素は例えば、ミクロコツカス ル
テウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ １ｕｔｅｕｓ） 、
シュードモナス プチダ（Ｐｓｅｄｏｍｏｎａｓ ｐｕ
ｔｉｄａ）、アゾトバクタ−ビネランデ４ （Ａｚｏ
ｔｏｂａｃｔｏｒｖｉｎｅｌａｎｎｄＨ） 、アセトバ
クター ア セ テ ィ（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｏｒ ａ
ｃｅｔＬ） 、ストレブトコッ力スフエー力リス（Ｓｔ
ｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）等から調
製することができる。
テウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ １ｕｔｅｕｓ） 、
シュードモナス プチダ（Ｐｓｅｄｏｍｏｎａｓ ｐｕ
ｔｉｄａ）、アゾトバクタ−ビネランデ４ （Ａｚｏ
ｔｏｂａｃｔｏｒｖｉｎｅｌａｎｎｄＨ） 、アセトバ
クター ア セ テ ィ（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｏｒ ａ
ｃｅｔＬ） 、ストレブトコッ力スフエー力リス（Ｓｔ
ｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）等から調
製することができる。
本発明において使用する酵素は、精製標品を使用するこ
とが必須ではないが、不要な妨害副反応の影響を回避す
るために、少なくともＤ−トランスアミナーゼ及びオキ
サロ酢酸脱炭酸酵素の反応系から、Ｌ−トランスアミナ
ーゼ及びアラニンラセマーゼの両酵素活性を除去もしく
は許容される限度以下にまで低下させることは必須であ
る。その為の方法としては、通常知られている方法によ
り酵素を精製することの他、耐熱性酵素遺伝子を大腸菌
などの常温宿主にクローン化し、目的酵素と不要酵素と
の熱安定性の差異に基づいて加熱部分精製を行なう方法
や、種々 ｐ）Ｉに対する耐性の差異を利用して目的酵
素を簡便に部分精製する方法等を適宜使用することがで
きる。
とが必須ではないが、不要な妨害副反応の影響を回避す
るために、少なくともＤ−トランスアミナーゼ及びオキ
サロ酢酸脱炭酸酵素の反応系から、Ｌ−トランスアミナ
ーゼ及びアラニンラセマーゼの両酵素活性を除去もしく
は許容される限度以下にまで低下させることは必須であ
る。その為の方法としては、通常知られている方法によ
り酵素を精製することの他、耐熱性酵素遺伝子を大腸菌
などの常温宿主にクローン化し、目的酵素と不要酵素と
の熱安定性の差異に基づいて加熱部分精製を行なう方法
や、種々 ｐ）Ｉに対する耐性の差異を利用して目的酵
素を簡便に部分精製する方法等を適宜使用することがで
きる。
反応温度は、本発明において用いられる当該酵素が失活
しない温度範囲であればいずれの温度でもよいが、通常
ｌＯ〜５０℃好ましくは、２０〜４５℃の範囲で実施さ
れる。また反応ｐＨは１通常５〜９好ましくは６．５〜
８．５の範囲で実施される。
しない温度範囲であればいずれの温度でもよいが、通常
ｌＯ〜５０℃好ましくは、２０〜４５℃の範囲で実施さ
れる。また反応ｐＨは１通常５〜９好ましくは６．５〜
８．５の範囲で実施される。
また本発明に使用する酵素類を、微生物から分離した後
そのまま可溶性の状態で用いるのみならず、種々な担体
に固定化した状態で実施する場合にも本発明の節部に属
するものである。
そのまま可溶性の状態で用いるのみならず、種々な担体
に固定化した状態で実施する場合にも本発明の節部に属
するものである。
以下に本発明の実施例について説明するが、なんらこれ
に限定されるものではない。
に限定されるものではない。
Ｃ実施例〕
以下の実施例で使用した諸酵素の調製方法を示す。
Ｄ−トランスアミナーゼは、バチルス スフエリカス（
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｐｈａｅｒＬｃｕｓ） ＩＦＯ３
５２５を、３Ｌ阪ロフラスコ中、ニュートリエンドブロ
ス５００ ｍｌを用いて好気培養し、後期対数増殖期で
集菌後生即食塩水で洗菌した。さらに該菌体を超音波破
砕後、遠心により破砕残渣を除去し、粗酵素抽出液とし
た。該抽出液を硫安分画１＆ Ｄ Ｅ Ａ Ｅセファデ
ックスカラムクロマトグラフィー、セファクリルＳ −
３００クロマトグラフイーにて処理したものを部分精製
標品とし、以下の実施例に供した。
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｐｈａｅｒＬｃｕｓ） ＩＦＯ３
５２５を、３Ｌ阪ロフラスコ中、ニュートリエンドブロ
ス５００ ｍｌを用いて好気培養し、後期対数増殖期で
集菌後生即食塩水で洗菌した。さらに該菌体を超音波破
砕後、遠心により破砕残渣を除去し、粗酵素抽出液とし
た。該抽出液を硫安分画１＆ Ｄ Ｅ Ａ Ｅセファデ
ックスカラムクロマトグラフィー、セファクリルＳ −
３００クロマトグラフイーにて処理したものを部分精製
標品とし、以下の実施例に供した。
ただし、Ｄ−トランスアミナーゼにおいては、３７℃下
１００ ｍＭリン酸ナナトリウム緩衝液 ｐＨｇ、０
） 、 ０．０２５ ｍＭ ピリドキサールリン酸、
２．５ｍＭＤ−アスパラギン酸、２．５ ｍＭ ピル
ビン酸を含む溶液中に酵素溶液を添加した時、１分間に
１μモルのＤ−アラニンを生成する酵素量をＩＵと定義
する。
１００ ｍＭリン酸ナナトリウム緩衝液 ｐＨｇ、０
） 、 ０．０２５ ｍＭ ピリドキサールリン酸、
２．５ｍＭＤ−アスパラギン酸、２．５ ｍＭ ピル
ビン酸を含む溶液中に酵素溶液を添加した時、１分間に
１μモルのＤ−アラニンを生成する酵素量をＩＵと定義
する。
アスパラギン酸ラセマーゼは、ストレプトコッカス サ
ーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｔｈｅｒｍ
ｏｐｈｉｌｌｕｓ ） ＪＡＭ １００６４を５Ｌコル
ベン中２Ｌの乳酸菌接種用培地（８水製薬製）を用いて
静置培養し、後期対数増殖期で集菌後生理食塩水で洗菌
した。更に該菌体な超音波破砕後遠心により破砕残渣を
除去し、粗酵素抽出液とした。該抽出液をトヨバールＨ
Ｗ６５Ｆ セファクリルＳ−２００，ＤＥＡＥ−セフ
ァロースの各クロマトグラフィー処理にかけ、部分精製
標品とし、以下の実施例に供した。
ーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｔｈｅｒｍ
ｏｐｈｉｌｌｕｓ ） ＪＡＭ １００６４を５Ｌコル
ベン中２Ｌの乳酸菌接種用培地（８水製薬製）を用いて
静置培養し、後期対数増殖期で集菌後生理食塩水で洗菌
した。更に該菌体な超音波破砕後遠心により破砕残渣を
除去し、粗酵素抽出液とした。該抽出液をトヨバールＨ
Ｗ６５Ｆ セファクリルＳ−２００，ＤＥＡＥ−セフ
ァロースの各クロマトグラフィー処理にかけ、部分精製
標品とし、以下の実施例に供した。
ただし、アスパラギン酸ラセマーゼにおいては、３７℃
下１００ ｍＭリン酸ナナトリウム緩衝液 ｐ）！ ８
．０ ）、０．０２５ ｍＭ ピリドキサールリン酸
、２．５ｍＭＬ−アスパラギン酸、を含む溶液中に酵素
を添加した時、１分間に１μモルのＤ−アスパラギン酸
を生成する酵素量をｌｔＪと定義する。
下１００ ｍＭリン酸ナナトリウム緩衝液 ｐ）！ ８
．０ ）、０．０２５ ｍＭ ピリドキサールリン酸
、２．５ｍＭＬ−アスパラギン酸、を含む溶液中に酵素
を添加した時、１分間に１μモルのＤ−アスパラギン酸
を生成する酵素量をｌｔＪと定義する。
オキサロ酢酸脱炭酸酵素は、シュードモナス プチダ（
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ） ＩＡＮ １
５０５を３Ｌ阪ロフラスコ中、ニュートリエンドブロス
５００ ｍｌを用いて好気培養し、後期対数増殖期で集
菌後生理食塩水で洗菌した。更に該菌体を超音波破砕後
、遠心により破砕残渣を除去し、粗酵素抽出液とした。
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ） ＩＡＮ １
５０５を３Ｌ阪ロフラスコ中、ニュートリエンドブロス
５００ ｍｌを用いて好気培養し、後期対数増殖期で集
菌後生理食塩水で洗菌した。更に該菌体を超音波破砕後
、遠心により破砕残渣を除去し、粗酵素抽出液とした。
該抽出液をＤＥＡＥセファロース、セファクリルＳ−３
００，ブチルセファロースカラムの各クロマトグラフィ
ー処理にかけ、部分精製標品とし、以下の実験に供した
。
００，ブチルセファロースカラムの各クロマトグラフィ
ー処理にかけ、部分精製標品とし、以下の実験に供した
。
ただし、オキサロ酢酸脱炭酸酵素においては、３７℃下
、 １００ ｍＭリン酸ナナトリウム緩衝液 ｐＨ８，
０）、２．５１１ＩＭ オキサル酢酸、０．５ ｍＭ
塩化マグネシウムを含む溶液中で、１分間に１μモルの
ピルビン酸を生成する酵素量をＩＵと定義する。
、 １００ ｍＭリン酸ナナトリウム緩衝液 ｐＨ８，
０）、２．５１１ＩＭ オキサル酢酸、０．５ ｍＭ
塩化マグネシウムを含む溶液中で、１分間に１μモルの
ピルビン酸を生成する酵素量をＩＵと定義する。
尚、全ての部分精製標品はアラニンラセマーゼおよびＬ
−トランスアミナーゼの両酵素活性を有しないことを＠
誌した。
−トランスアミナーゼの両酵素活性を有しないことを＠
誌した。
実施例１
反応液組成として、１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
８，０） ２０μｌ 、５ ｍＭピリドキサールリン酸
１μｍ 、 ５０ ｍＭ Ｄ−アスパラギン酸ｌＯｕ
ｌ 、１５０ ｍＭピルビン酸１０μ１．Ｄ−トランス
アミナーゼ溶液６０μｌ（４ｍＵ）、精製水１１０μｍ
を含む溶液を３７℃下反応させた。
８，０） ２０μｌ 、５ ｍＭピリドキサールリン酸
１μｍ 、 ５０ ｍＭ Ｄ−アスパラギン酸ｌＯｕ
ｌ 、１５０ ｍＭピルビン酸１０μ１．Ｄ−トランス
アミナーゼ溶液６０μｌ（４ｍＵ）、精製水１１０μｍ
を含む溶液を３７℃下反応させた。
その結果を表１に示す。
次いで反応時間３時間後の反応液より １００μｍを分
取し、該分取液にオキサロ酢酸脱炭酸酵素の１ ｍＭ塩
化マグネシウム溶液１１０ μｍ（４０ｍｕ ）を加
え、分取した残りの反応液には１１０μｍを加え、とも
に３７℃下さらに１．５時間反応させた。
取し、該分取液にオキサロ酢酸脱炭酸酵素の１ ｍＭ塩
化マグネシウム溶液１１０ μｍ（４０ｍｕ ）を加
え、分取した残りの反応液には１１０μｍを加え、とも
に３７℃下さらに１．５時間反応させた。
その結果、各々の場合においてＤ−アスパラギン酸の減
少およびＤ−アラニンの生成を認めたが、オキサロ酢酸
脱炭酸酵素無添加の場合のＤ−アラニン生成収率が７９
％であったのに対し、添加した場合は９１％であった。
少およびＤ−アラニンの生成を認めたが、オキサロ酢酸
脱炭酸酵素無添加の場合のＤ−アラニン生成収率が７９
％であったのに対し、添加した場合は９１％であった。
その結果を表１に示す。
実施例２
実施例１における反応液組成のうち、精製水１１０μｌ
のかわりに、オキサロ酢酸脱炭酸酵素の５ ｍＭ塩化マ
グネシウム溶液１１０ μｌ（４０ｍｌ ）を含む反
応溶液を、実施例１と同様な条件下にインキエベートＬ
４．５時間後に、サンプリングおよび分析を行なった。
のかわりに、オキサロ酢酸脱炭酸酵素の５ ｍＭ塩化マ
グネシウム溶液１１０ μｌ（４０ｍｌ ）を含む反
応溶液を、実施例１と同様な条件下にインキエベートＬ
４．５時間後に、サンプリングおよび分析を行なった。
その結果を表２に示す。
実施例３
反応液組成として、１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
８，０） ２０ｕ １．５ ｍＭピリドキサールリン酸
ｌ μｌ 、 ５０ ｍＭ Ｌ−アスパラギン酸１０
μｌ 、１５０ ｍＭピルビン酸１０μｍ、Ｄ−トラン
スアミナーゼ溶液６０ｕｌ（４ｍＵ）、オキサロ酢酸脱
炭酸酵素の５ ｍＭ塩化マグネシウム溶液２０μｍ（４
０ｍＵ）およびアスパラギン酸ラセマーゼ溶液９０μｌ
（ｌ ｍｕ ） を含む溶液を３７℃下６時間イン
キエベートした後、適当量をサンプリングした。更に５
０％トリクロル酢酸をサンプリング容量に対し１０％添
加して反応を停止し、遠心により除蛋白した後アミノ酸
分析装置により、生成したＤ−アラニンおよびアスパラ
ギン酸（ラセミ体）を定量した。その結果を表２に示す
。
８，０） ２０ｕ １．５ ｍＭピリドキサールリン酸
ｌ μｌ 、 ５０ ｍＭ Ｌ−アスパラギン酸１０
μｌ 、１５０ ｍＭピルビン酸１０μｍ、Ｄ−トラン
スアミナーゼ溶液６０ｕｌ（４ｍＵ）、オキサロ酢酸脱
炭酸酵素の５ ｍＭ塩化マグネシウム溶液２０μｍ（４
０ｍＵ）およびアスパラギン酸ラセマーゼ溶液９０μｌ
（ｌ ｍｕ ） を含む溶液を３７℃下６時間イン
キエベートした後、適当量をサンプリングした。更に５
０％トリクロル酢酸をサンプリング容量に対し１０％添
加して反応を停止し、遠心により除蛋白した後アミノ酸
分析装置により、生成したＤ−アラニンおよびアスパラ
ギン酸（ラセミ体）を定量した。その結果を表２に示す
。
尚、以上の実施例における反応収率の測定は、サンプリ
ング液に、５０％トリクロル酢酸をサンプリング容量に
対し１０％添加して反応を停止し、遠心により除蛋白し
た後アミノ酸分析装置により、生成したアラニンおよび
残存するアスパラギン酸を定量することにより行なった
。
ング液に、５０％トリクロル酢酸をサンプリング容量に
対し１０％添加して反応を停止し、遠心により除蛋白し
た後アミノ酸分析装置により、生成したアラニンおよび
残存するアスパラギン酸を定量することにより行なった
。
また、生成したアラニンの光学活性は、高速液体クロマ
トグラフィーキラルバックＷＥ（ダイセル化学■製）お
よび、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ法により確認した。そ
の結果、生成アラニンは、Ｄ一体１００％であった。
トグラフィーキラルバックＷＥ（ダイセル化学■製）お
よび、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ法により確認した。そ
の結果、生成アラニンは、Ｄ一体１００％であった。
第１図は、Ｄ−アスパラギン酸、ピルビン酸、Ｄ−１ラ
ンスアミナ一ゼ共存時のＤ−アラニン生成反応３時間口
において、オキサロ酢酸脱炭酸酵素を添加した場合と添
加しなかった場合の反応収率の差異を表す図である。 第２図は、反応開始当初よりＤ−アスパラギン酸、ピル
ビンサン、Ｄ−トランスアミナーゼ、オキサロ酢酸脱炭
酸酵素を共存させた場合の生成り一アラニン及び残存Ｄ
−アスパラギン駿の反応収率の経時変化を表す図である
。 第３図は、Ｌ−アスパラギン酸、ピルビン酸、アスパラ
ギン酸ラセマーゼ、Ｄ−１−ランスアミナーゼ、オキサ
ロ酢酸脱炭酸酵素を共存させた場合の生成り一アラニン
および残存Ｄ−アスパラギン酸の経時変化を示す図であ
る。 第 図 及 式
ンスアミナ一ゼ共存時のＤ−アラニン生成反応３時間口
において、オキサロ酢酸脱炭酸酵素を添加した場合と添
加しなかった場合の反応収率の差異を表す図である。 第２図は、反応開始当初よりＤ−アスパラギン酸、ピル
ビンサン、Ｄ−トランスアミナーゼ、オキサロ酢酸脱炭
酸酵素を共存させた場合の生成り一アラニン及び残存Ｄ
−アスパラギン駿の反応収率の経時変化を表す図である
。 第３図は、Ｌ−アスパラギン酸、ピルビン酸、アスパラ
ギン酸ラセマーゼ、Ｄ−１−ランスアミナーゼ、オキサ
ロ酢酸脱炭酸酵素を共存させた場合の生成り一アラニン
および残存Ｄ−アスパラギン酸の経時変化を示す図であ
る。 第 図 及 式
Claims (8)
- （１）Ｄ−アスパラギン酸をアミノ基供与体とし、ピル
ビン酸をアミノ基受容体として、 Ｄ−トランスアミナーゼ存在下に両者を反応させてＤ−
アラニンを製造し、同時にあるいは次いで副生オサキロ
酢酸を脱炭酸してピルビン酸を生成させ、かかるピルビ
ン酸を上記アミノ基受容体として用いることを特徴とす
るＤ−アラニンの製造方法。 - （２）オキサロ酢酸の脱炭酸をオキサロ酢酸脱炭酸酵素
の存在下に行なう、請求項１記載の方法。 - （３）Ｄ−アスパラギン酸の製造をＬ−アスパラギン酸
のラセミ化によって行なう、請求項１記載の方法。 - （４）Ｌ−アスパラギン酸のラセミ化をアスパラギン酸
ラセマーゼの存在下に行なう、請求項３記載の方法。 - （５）Ｄ−アスパラギン酸を、ピルビン酸、オキサロ酢
酸、Ｄ−トランスアミナーゼおよびオキサロ酢酸脱炭酸
酵素あるいはオキサロ酢酸脱炭酸触媒の存在する反応系
中で反応させてＤ−アラニンを製造することを特徴とす
る Ｄ−アラニンの製造方法。 - （６）Ｄ−アスパラギン酸、ピルビン酸および／または
オキサロ酢酸、Ｄ−トランスアミナーゼおよびオキサロ
酢酸脱炭酸酵素あるいはオキサロ酢酸脱炭酸触媒を反応
系に添加し、 Ｄ−アスパラギン酸とピルビン酸よりＤ−アラニンとオ
キサロ酢酸を生成させるＤ−トランスアミナーゼ反応お
よびオキサロ酢酸よりピルビン酸を生成させる脱炭酸反
応を行なうことを特徴とするＤ−アラニンの製造方法。 - （７）Ｌ−アスパラギン酸を、Ｄ−アスパラギン酸、ピ
ルビン酸、オキサロ酢酸、アスパラギン酸ラセマーゼ、
Ｄ−トランスアミナーゼ及びオキサロ酢酸脱炭酸酵素あ
るいはオキサロ酢酸脱炭酸触媒の存在する反応系中で反
応させてＤ−アラニンを製造することを特徴とするＤ−
アラニンの製造方法。 - （８）Ｌ−アスパラギン酸、ピルビン酸および／または
オキサロ酢酸、アスパラギン酸ラセ マーゼ、Ｄ−トランスアミナーゼ、およびオキサロ酢酸
脱炭酸酵素あるいはオキサロ酢酸脱炭酸触媒を反応系に
添加し、Ｌ−アスパラギン酸をＤ−アスパラギン酸に変
換させるラセミ化反応、Ｄ−アスパラギン酸とピルビン
酸よりＤ−アラニンとオキサロ酢酸を生成させるＤ−ト
ランスアミナーゼ反応、およびオキサロ酢酸よりピルビ
ン酸を生成させる脱炭酸反応を行なうことを特徴とする
Ｄ−アラニンの製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63323665A JP2771825B2 (ja) | 1988-12-23 | 1988-12-23 | Ｄ‐アラニンの製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63323665A JP2771825B2 (ja) | 1988-12-23 | 1988-12-23 | Ｄ‐アラニンの製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02171193A true JPH02171193A (ja) | 1990-07-02 |
| JP2771825B2 JP2771825B2 (ja) | 1998-07-02 |
Family
ID=18157243
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63323665A Expired - Fee Related JP2771825B2 (ja) | 1988-12-23 | 1988-12-23 | Ｄ‐アラニンの製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2771825B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101493311B1 (ko) | 2012-12-13 | 2015-02-16 | 연세대학교 산학협력단 | 광학 활성 아민 및 호모알라닌의 제조방법 |
| KR101806873B1 (ko) * | 2016-05-24 | 2017-12-12 | 주식회사 엠에이치투 바이오케미칼 | 융합 효소를 이용한 d-알라닌의 제조방법 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH01285192A (ja) * | 1988-05-12 | 1989-11-16 | Daicel Chem Ind Ltd | Ｄ−アラニンの製造方法 |
-
1988
- 1988-12-23 JP JP63323665A patent/JP2771825B2/ja not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH01285192A (ja) * | 1988-05-12 | 1989-11-16 | Daicel Chem Ind Ltd | Ｄ−アラニンの製造方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2771825B2 (ja) | 1998-07-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Hummel et al. | Dehydrogenases for the synthesis of chiral compounds | |
| JP3717535B2 (ja) | 新規微生物およびＬ−α−アミノ酸の製法 | |
| EP1326993B1 (en) | Production of alpha-hydroxy-carboxylic acids using a coupled enzyme system | |
| JPS62289A (ja) | α−ケト酸からのＬ−α−アミノ酸の酵素学的製造方法 | |
| JPS59198972A (ja) | 微生物学的に製造したＬ−フエニルアラニン−デヒドロゲナ−ゼ、その取得法及びＬ−α−アミノカルボン酸の製法 | |
| JP3905575B2 (ja) | 新規の微生物、Ｌ−α−アミノ酸の製法並びに新規の微生物の突然変異株及び変体の培養法、カルバモイラーゼ及び／又はヒダントイナーゼ及び／又はヒダントインラセマーゼをコードする遺伝子の取得法及びカルバモイラーゼ及び／又はヒダントイナーゼ及び／又はヒダントインラセマーゼをコードする遺伝子の微生物又は細胞への挿入法 | |
| JPH0785718B2 (ja) | Ｄ−アミノ酸の製造方法 | |
| JPH02171193A (ja) | Ｄ‐アラニンの製造方法 | |
| EP0385172A1 (en) | Process for transformation of hydroxyketo acids to hydroxyamino acids | |
| JPS60160891A (ja) | Ｌ‐フエニルアラニンの製造方法 | |
| EP0140503A1 (en) | An efficient process for preparing L-amino acids in bacteria | |
| Yamada | Microbial reactions for the production of useful organic compounds | |
| JP2006067870A (ja) | 新規なアミノアシラーゼおよびその製造方法、並びに新規アミノアシラーゼを利用したアミノ酸誘導体の製造方法 | |
| US5134073A (en) | Microbiologically produced n-acetyl-2,3-didehydroleucine acylase | |
| US5212069A (en) | Method of using N-acetyl-2,3-Didehydroleucine acylase for the preparation of D- or L-tryptophyl glycine, D- or L-tryptophyl-D-methionine or L-tryptophyl-D-cysteine | |
| JPS61274690A (ja) | Ｄ−α−アミノ酸の製造方法 | |
| JP4485734B2 (ja) | ５置換ヒダントインラセマーゼ、これをコードするｄｎａ、組み換えｄｎａ、形質転換された細胞および光学活性アミノ酸の製造方法 | |
| JPH0716428B2 (ja) | Ｌ−アミノ酸の製造法 | |
| JP4650421B2 (ja) | Ｌ体アミノ酸アミド不斉加水分解酵素及びそれをコードするｄｎａ | |
| US20060172393A1 (en) | Process for producing optically active alpha -methylcysteine derivative | |
| JPH0630572B2 (ja) | Ｌ−フエニルアラニン脱水素酵素 | |
| EP0315786A1 (en) | Process for the preparation of a d-alfa-amino acid from the corresponding alfa-keto acid | |
| JPS62205781A (ja) | シユ−ドモナス属菌株の培養方法 | |
| JPS62134094A (ja) | 酵素法によるｌ−トリプトフアンの製造法 | |
| JPS58187198A (ja) | Ｓ−カルボキシメチル−ｌ−システインの製造法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |