JPH01285192A - Ｄ−アラニンの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、抗生物質の修飾剤や合成甘味料の原料等とし
て極めて有用な、Ｄ−アラニンの製造方法に関する。

（従来技術） 従来、酵素法によりＤ−アラニンな製造する方法として
は、５−置換ヒダントインにＤ−しダントイナーゼを作
用させる方法（特公昭５６−１９０９号）やＮ−アセチ
ル−Ｄ−アラニンにＤ−アミノアシラーゼを作用させる
方法（特公昭５３−３６０３５号）、ピルビン酸とＤ−
アミノ酸にＤ−アミノ酸トランスアミナーゼ（Ｄ−アラ
ニンアミノトランスフェラーゼ：ＥＣ２，６，１，２１
；以下、Ｄ−ＡＴＡと示す）を作用させる方法などが知
られている。

（発明が解決しようとする課題） しかしこれらの方法は使用される基質が高価なものであ
り、経済的に優れた方法であるとはいえない。

例えば、Ｄ−ＡＴＡを利用してＤ−アラニンを製造する
場合、基質としてピルビン酸とアミノ基供与体り−アミ
ノ酸が反応に供されるが、そのアミノ基供与体り−アミ
ノ酸はピルビン酸に対し過剰量必要である。

（課題を解決するための手段） 本発明者らは、Ｄ−ＡＴＡを利用し、安価な原料からＤ
−アラニンを製造する方法を確立するべく鋭意研究した
結果、ＤＬ−アスパラギン酸がアミノ基供与体とピルビ
ン酸供給源の二つの役割を果たすものとして利用できる
ことに着目し、本発明を完成させた。

即ち本発明は、微量のピルビン酸の存在下、Ｄ−ＡＴＡ
の作用により、ＤＬ−アスパラギン酸からＤ−アラニン
を製造する方法である。

本発明は次の第１式に示すことができる。

第１式 Ｌ−アスパラギン酸 ＋ つまり、基質のＤＬ−アスパラギン酸のＤ−アスパラギ
ン酸がＤ−ＡＴＡの作用により微量のピルビン酸と反応
し、Ｄ−アラニンとオキサロ酢酸を生成する。生成した
オキサロ酢酸は化学的に不安定なため、自然に脱炭酸さ
れピルビン酸を生じる。従って、Ｄ−ＡＴＡの平衡定数
が約１であるにもかかわらず、生成物のオキサロ酢酸が
蓄積しないため、反応はＤ−アラニンの生成する方向に
進む、さらにオキサロ酢酸の脱炭酸によって生じたピル
ビン酸は、原料ケト酸として再利用される。

本発明に使用されるＤ−ＡＴＡは、Ｄ−ＡＴＡ生産能を
有する微生物、植物などより調製することができ、その
起源は特に限定されないが、具体的にはバチルス−Ｘス
ピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ、　）　ＹＭ−１株（微
工研菌寄第８０５７号）より得られるＤ−ＡＴＡ　（特
開昭６１−１８７７８６号）等を挙げることができる。

これらの起源よりＤ−ＡＴＡを調製して本発明の反応に
使用し、光学純度の高いＤ−アラニンを得るためには、
その微生物、植物がＤ−ＡＴＡ以外に生産している酵素
のうち、Ｄ−アラニンの光学純度を低下させる原因とな
るもの、例えば、Ｌ−アスパラギン酸を脱炭酸しし一ア
ラニンを生成するアスパラギン酸β−説炭酸酵素や、Ｄ
−アラニンをラセミ化するアラニンラセマーゼを精製に
よって除去するか、或いは、阻害剤、熱、ｐＨ等に対す
る感受性の差を利用して失活させる必要がある０例えば
、バチルス・エスピーＹＭ−１株由来のＤ−ＡＴＡをコ
ードする遺伝子を含有するプラスミドｐｌｃＴ１１３（
特願昭６２−３９１７３号）で形質転換したエシェリヒ
ア・コリ（Ｅ　５ｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）を用い
ると、このＤ−ＡＴＡは熱安定性が高いのでエシェリヒ
ア・コリが生産するＤ−アラニンの光学純度を低下させ
る原因となるアラニンラセマーゼ等を熱処理のみで失活
させることができ好適である。

本発明の反応において基質となるＤＬ−アスパラギン酸
は５０〜１０００ｍＭ、好ましくは２００ｍＭ程度、ピ
ルビン酸は０．１〜１０ｍ　Ｍ、好ましくは１ｍＭ程度
、Ｄ−ＡＴＡは０．１〜１０Ｕ　／　ｍｌ、好ましくは
Ｉ　Ｕ　／　ｍｌ程度の濃度で添加される。また、補酵
素であるピリドキサール５−リン酸（以下、ＰＬＰと示
す）は、必要に応じて５０μＭ程度添加される。

反応温度および反応液のｐＨは、用いるＤ−ＡＴＡの至
適温度および至適ＰＨに合わせて調整されるが、２５〜
６０℃、ｐＨ５〜９の範囲が好ましい。

反応は通常４〜４８時間行われるが、他の条件に応じて
適当に変えることもできる。

反応液からのＤ−アラニンの採取は、例えば反応液をト
リクロロ酢酸などにより除タンパクした後、カチオン交
換クロマトグラフィーによりＤ−アラニンを溶出させ、
等電点沈澱により結晶化させる方法により行なうことが
できる。

以下、実施例を以て本発明を説明するが、本発明はこれ
に限定されるものではない。

（実施例） 実施例 （１）Ｄ−ＡＴＡをコードする遺伝子を含有するプラス
ミドｐＩｃＴ１１１の構築 バチルス・エスピーＹＭ−１を表−１に示す培地で５５
℃、６時間培養した後集菌し、菌体６．Ｏｇを得た。

次に得られた菌体より斎藤−三浦法に従って染色体ＤＮ
Ａを抽出し、これをＨｉｎｄＩＩ［（賓酒造製）によっ
て３時間消化して１〜１０Ｋ　ｂのＤＮＡ断片を得た。

続いて、プラスミドｐＢＲ３２２３μｇを旦ｉｎｄ　Ｉ
によって完全消化し、これを先に得られた染色体からの
ＤＮＡ断片と７４ＤＮＡリガーゼ＜＊酒造製）によって
連結し、この反応液をエタノール沈澱により濃縮した。

この濃縮液を用いて、マンデルーヒガ（Ｍ　ａｎｄｅｌ
−Ｈｉｇａ　）の方法（ジャーナル・オブ・モレキュラ
ー・バイオロジー（Ｊ、　Ｍａｔ、　Ｂｉｏｌ、）　、
録。

１５９　（１９７０））によりニジエリしア・コリＣ６
００を形質転換した。

形質転換株の中からＤ−ＡＴＡをコードする遺伝子を含
有するプラスミドを有する株を選択するために、形質転
換株を表−２に示す組成の最少培地の寒天上で培養した
。目的の株は窒素源としてＤ−グルタミン酸資化性を獲
得するため、目的の株のみがこの培地上で生育可能であ
り、生育した株は約１００コロニーであった。

次に＋ｎ　　５ｉｔｕにおけるＤ−ＡＴＡ活性を確認す
るため、ラエツ（Ｒａｅｔｚ）らの方法（プロシーディ
ング・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエン
ス・オブ・ニーニスニー（Ｐ　ｒｏｃ、　Ｎ　ａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ）　、　７２．２２７４　
（１９７５））を一部改変した以下に示す方法に従って
活性染色を行なった。即ち、プレート上に生育させた約
１００コロニーからフィルター上にレプリカを作成し、
リゾチーム処理（リゾチーム溶液（１０■／ｍｌ）２ｍ
ｌ中で室温にて３０分間）し、余分な水分を除去した後
、１ｍｌの呼吸鎖阻害液（２０ｍＭ　　ＮａＮ３．１０
ｍＭＫＦ、１ｍＭ　　Ｎａ　　ＨＡｓ’４．４ｍＭトリ
スー塩酸ＩＪ街液（ｐＨ７，４））を添加し、２度凍結
、融解し、溶菌した。

続いてこれを７０℃で２０分間処理した後、表−３に示
す反応液を１．５ｍｌ添加し、５０℃で１０分間反応さ
せた。これによってＤ−ＡＴＡ活性を有する株は青色を
呈するため、強い青色を呈したコロニーを１株選択した
。この株が含有しているプラスミドをｐｌＣＴｌｌｌと
した。

次に、ｐＩＣＴｌｌｌを才力の方法（ジャーナル　オブ
　バクテリオロジ−（Ｊ　、　Ｂ　ａｃｔｅｒｉｏｌ、
　）、　１３３．９１６（１９７８））　４；ｌ：従い
単離し、ＰｓｔＩ、Ｅｃ。

ＲＩ、ＢａｎＩ［，１回ｄｌ［、Σ旦Ｉ（賓酒造製）に
よりマツピングを行なった。ｐＩｃＴｌｌｌの制限酵素
切断地図を第１図に示す。

（２）ＰＩＣＴＩｏｌｌのサブクローニングＰＩＣＴＩ
ＩＩをエイチ、シー、バーンポイン・アンド・ジェイ、
ドーリ−（Ｈ，ｃ、　Ｂｉｒｎｂｏｉｎ　ａｎｄ　Ｊ　
、　Ｄｏｌｙ）の方法（ヌクレイツク　アシッズ　リサ
ーチ（Ｎｕｃｒｅｉｃ　　Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅ５ｅａｒ
ｃｈ　）　。

ヱ、　１５１３（１９７９）　）に従い単離し、堕ＲＩ
（賓酒造製）で完全消化し、アガロースゲル電気泳動後
、約１．７Ｋｂの江ＲＩ−Ｅ匹ＲＩ断片を含むゲルを切
り出し、ＤＮＡ断片を溶出した。

プラスミドｐＵｃ１８をＥｃｏＲＩで完全消化し、これ
を精製しなｐＩｃＴｌｌｌの１臼ＲＩ−Ｅｃ。

ＲＩ断片とＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結し、この連結
されたプラスミドでエシェリヒア・コリＪＭ１０３を形
質転換し、形質転換株をイソプロピル−１−チオーβ−
Ｄ−ガラクトサイド、５−クロロ−４−ブロモ−３−イ
ンドリル−β−Ｄ−、ｆラクトース及びアンピシリンを
含むし培地上で培養しな、ここでＤ−ＡＴＡ活性を有す
る株は青色を呈さないので青色でない株を選択した。こ
の株が含有しているプラスミドをｐＩｃＴ１１３とした
。

次に、ｐＩｃＴ１１３を才力の方法に従い単離し、Ｐｓ
ｔＩ、ＥｃｏＲＬＢａｎＬＨｉｎｄ　ＬＳａｔ工により
マツピングを行なった。ｐｌｃ７１１３の制限酵素切断
地図を第２図に示す。

ｐＩｃＴ１１３をエイチ、シー、バーンポイン・アンド
・ジェイ、ドーリ−の方法に従い単離した。

（３）ｐｌｃＴ１１３を含むエシェリヒア・コリ；エシ
ェリヒア・コリＨＢＩＯＩ　（ＰＩＣＴ１１３）の創製
および該菌体からのＤ−ＡＴＡ酵素液の採取 ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ　
、　Ｍｏ１．　Ｂ　ｉｏｌ、）　、　５３．１５９−１
６２（１９７０）に記載の方法に従って、０℃付近で塩
化カルシウム処理したエシェリヒア・コリＨＢＩＯＩを
プラスミドｐＩｃＴ１１３と接触させることによって形
質転換しな。

次に菌株をアンピシリン含有ＹＴ培地（ペア５フ１ ンピシリン５ｇ／１００ｍ１、ｐ　Ｈ７，２）　７５０
　ｍｌで３７℃、−晩培養し、遠心分離により菌体を回
収した。

回収した菌体２．２ｇを、１０ｍＭリン酸カリウムｙ１
衝液ｐ　Ｈ７，２、０，０１％２−メルカプトエタノー
ル、５０μＭ　　ＰＬＰ５ｍｌに懸濁した。

超音波により菌体を破砕した後、１５．ＯＯＯｒｐｍで
２０分間遠心分離して上清を回収し、無細胞抽出液を調
製した。

得られた無細胞抽出液を６５℃で３０分間熱処理し、遠
心分離により上清を得、酵素液とした。

この酵素液のＤ−ＡＴＡ活性は、以下の方法により測定
した。

トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，１）５０μｍｏｌ　、　
ｐＬ　Ｐ　５０ｒｖｏｌ、　ａ−ケトグルタルａ１０μ
１ｌｏｌ　、　Ｄ　−アラニン２５μ１０１．乳酸脱水
素酵素（ベーリンガーマンハイム山）内装）５Ｕ、ＮＡ
ＤＨｏ、２　μｌｌ。

１、および酵素を含む１　ｍｌの反応液を５０℃でキュ
ベツト中で反応させ、ＮＡＤＨの減少に由来する３４０
ｎｍにおける吸光度の減少を測定した。尚、ここでＩＵ
は、この条件下１分間に１μｍ０１のＮＡＤＨの減少を
触媒する酵素量とした。

その結果、酵素液のＤ−ＡＴＡの比活性は２３．４Ｕ／
■−タンパク質であった。

（４）得られたＤ−ＡＴＡ酵素液を用いたＤ−アラニン
の製造 Ｄ−ＡＴＡＩＯＵ、Ｈ’ＥＰＥＰ−ＫＯＨＩ衝液（ｐＨ
７，０）　５０ｕｍｏｌ　、　ＤＬ−７スバーｙギン！
２００μ１ｌｏＩ、ピルビン酸１　μｎｏｌ　、　Ｐ　
Ｌ　Ｐ５０ｎｌｌＯｌを含む反応液１ｍｌを５０℃で４
８時間反応させた。

反応液に１２％トリクロル酢酸を１００μ」添加するこ
とにより反応を停止させ、反応液の一部についてアミノ
酸自動分析計にて生成アラニン量を測定した。その結果
、生成したアラニンは、７９．４μｍ０１であり、基質
Ｄ−アスパラギン酸がらのアラニンへの転化率は７９．
４％であった。

得られたアラニンの光学純度を、アラニン中に混在する
Ｌ−アラニンをＬ−アラニン脱水素酵素により選択的に
分解し、生成するＮＡＤＨ量を測定することによって求
めた。その結果、生成したアラニンの９９％以上が９体
であった。

表　　−１ ポリへプトン　　　　　　　　０．５　％酵母エキス　
　　　　　　　　０．２５％肉エキス　　　　　　　　
　　０．２　％グリセロール　　　　　　　　０．５　
　％ＫＨ２ＰＯ４０，２％ に２ＨＰＯ４０，２％ ＮａＣｌ　　　　　　　　　　　０．０５％Ｍｇ５０　
　・７Ｈ，，００，０１％ ＤＬ−アラニン　　　　　　　０．３　％Ｌ−グルタミ
ン酸　　　　　　０．２　％ビオチア　　　　　　　　
　　４　Ｘ　１Ｇ’％００ｍ１ ｐＨ７，２ 表　　−２ チアミン　　　　　　　　　　　　１　　　■Ｌ−ロイ
シン　　　　　　　　　１０　　　　ｒｓｔＬ−スレオ
ニン　　　　　　　　２０　　　■ＭｇＳＯ４・７Ｈ２
０５０■ ＭｎＣｌ２　・４Ｈ２０５ｒａｔ ＦｅＳＯ４−７Ｈ２００゜２５ｎｇ ＣａＣ１２０，５Ｍ 酵母エキス　　　　　　　　　　　０．５　　■リン酸
カリウム緩衝液（ｐＨ７，２）　　　２０　　　　Ｐｌ
ｏ＋アンピシリン　　　　　　　　　２５　　　■Ｄ−
グルタミン酸　　　　　　　　　４ｇピルビン酸　　　
　　　　　　　　１ｇｊ 表　　−３ トリス−塩酸Ｍ荷液（ｐＨ８，３）　　１５０　　　μ
１ＩｏｌＤ−システィンスルフィン酸　　　１．５μｌ
１ｏｌα−ケトグルタル酸　　　　　　１５　　μｍｏ
ｌＰＬＰ　　　　　　　　　　　　　７５　　　ｎｍｏ
ｌフェナジンメトサルフェイト　１５０　　　ｎ１ｏｌ
ニトロブルーテトラゾリウム　９００　　　ｎ１ｌｏｌ
（発明の効果） 本発明により、経済的に優れた方法でＤ−ゲラニンを製
造することが可能になった。

【図面の簡単な説明】

第１図は、プラスミドｐｌｃＴ１１１の制限酵素切断地
図である。 第２図は、プラスミドｐｌｃ７１１３の制限酵素切断地
図である。 図中図７図部分は挿入された部分を表わす。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 微量のピルビン酸の存在下、Ｄ−アミノ酸トランスアミ
   ナーゼの作用により、ＤＬ−アスパラギン酸からＤ−ア
   ラニンを製造する方法